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PRACTICA N 10: PRUEBAS IMUNOLGICAS EN EL DIAGNOSTCO DE PARASITOSIS.

PRUEBA DE DOBLE DIFUSION ARCO 5 (DD5)

El diagnostico serologico de la Echinococosis quistica (EQ) durante los ltimos aos se enfoco a mejorara la sensibilidad y la especificidad de los mtodos de diagnostico utilizados, que van a variar de acuerdo a la naturaleza, pureza y calidad de los antigenos empleados, la sensibilidad y especificidad intrnseca de las tcnicas serologicas y de las respuesta del husped.

La fuente mas importante de antgeno para el diagnostico de esta parasitosis ha sido el liquido hidatdico (LH). El estudio por SDS PAGE del LH total demuestra que se trata de un mosaico antignico donde se destacan ms de 10 antgenos parasitarias derivados del metabolismo del parsito y del husped intermediario, algunos de los cuales son comunes con otras enfermedades parasitarias. Entre estos componentes se destacan dos antgenos mayoritarios el antgeno 5; lipoproteina termolabil de 400 kDa y el antgeno B; lipoproteina termoestable de 150 kDa. En condiciones de no reduccin estas lipoprotenas presentan bandas 55-65 kDa y 8-12-16 kDa respectivamente.La lipoproteina de aproximadamente 65 kDa tiene asociada la Fosforilcolina, hapteno muy comn en la naturaleza y responsable de numerosas reacciones cruzadas. La tcnica mas empleada en los ltimos aos para el diagnostico de EQ es la doble difusin 5 (DD5). Sin embargo esta tcnica tiene limitaciones en cuanto a su sensibilidad que es de 50 a 80% para el caso de localizacin heptica. En 1978, Coltorti y Varela- Daz describieron la reaccin de doble difusin en agar con deteccin del arco 50. (DDS). Con esta prueba se logr confirmar inmunolgicamente la infeccin hidatdica. La tecnologa simple de la DD5 permite que laboratorios de hospitales perifricos o de zonas endmicas cuenten con un examen de fcil ejecucin. El rendimiento de la DD5 est influido por factores dependientes del husped y el parsito; entre ellos, la localizacin y nmero de los quistes y, posiblemente, la presencia de diferentes especies y cepas. En la prctica, la aplicacin de la DD5 al diagnstico serolgico rutinario de la hidatidosis permite contar con una prueba de elevada especificidad; es decir, los resultados positivos confirmaran la presencia de la infeccin.

En cambio, los resultados negativos no invalidan la existencia de quistes hidatdicos en el paciente, sobre todo en los casos pulmonares, donde la sensibilidad de la DD5 fue baja. Doble difusin (DD) Es una tcnica que consiste bsicamente en colocar en un gel, al cual se le han hecho perforaciones, el antgeno, un suero testigo y el suero que se va a analizar. Las muestras van a difundirse en forma concntrica y los anticuerpos van a unirse con los antgenos correspondientes, formando bandas de precipitacin. Cuando las concentraciones del antgeno y del anticuerpo son equivalentes y sus pesos moleculares similares, las bandas de precipitacin tienen forma recta y se encuentran equidistantes de los reservorios del antgeno y del suero.

Cuando no existe equivalencia en la concentracin, los sistemas precipitantes se forman ms cerca del reactivo de menor concentracin.Es de fcil separacin del resto de las fracciones por tener una doble incurvacin, se conoce actualmente con el nombre de arco 5. El arco 5 es especfico para el E. granulosus. Diferentes antgenos de helmintos, no producen el arco 5. Incluso el E. multilocularis no produce esa banda de precipitacin, lo cual confirma la especificidad antignica del arco 5. PROCEDIMIENTO:

En una lamina portaobjetos limpia y seca, distribuir 3.5 ml utilizando una pipeta de agar previamente fundido y dejarlo solidificar a temperatura ambiente.

Colocar sobre el diagrama y cortar el agar en orificios para el antigeno, el suero control y el suero en estudio. SUERO PROBLEMA

ANTIGENO

SUERO CONTROL El suero en estudio se coloca en el orificio de 10 mm de dimetro; el suero control en el de 6 mm y el antigeno en el de 1 mm. Estos orificios contienen aproximadamente un volumen de 150 ul, 50 ul y 30ul, respectivamente.

El orificio del antigeno llenarlo con una pipeta Pasteur.

Una vez llenados los orificios, llevar la lmina a una cmara hmeda y dejar difundir a temperatura ambiente durante 40 48 horas.

NOTA: La prctica no se concluyo pero el objetivo era conocer y realizar parte del procedimiento.