LAI5965

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE MENTOURI CONSTANTINE INSTITUT DE LA NUTRITION, DE LALIMENTATION ET DES TECHNOLOGIES ARGO-ALIMENTAIRES (I.N.A.T.A.A)
Dpartement des Technologies Alimentaires

N dordre : N de srie :
Mmoire prsent pour lobtention du diplme de Magister en Sciences Alimentaires
Option : Technologie alimentaire Thme :
Etude des activits antioxydante et antifongique de lhuile essentielle des fleurs sches de Lavandula officinalis sur les moisissures des lgumes secs
Prsent par : Melle LAIB Imne
Soutenu le: 16 / 06 / 2011 Devant le jury : Prsident : Encadreur : Pr. NAMOUNE H. Dr. BARKAT M. Professeur M.C.A M.C.A M.C.A U.M.C. U.M.C. U.M.C. U.M.C.
Examinatrices : Dr. AMOURACHE L. Dr. KHARROUB K.
Anne universitaire : 2010/2011
Remerciements
Jexprime mes remerciements et mes sincres gratitudes au Dr BARKAT M. pour ses orientations et aides durant llaboration de ce travail. A Monsieur le professeur NAMOUNE H., pour avoir lhonneur de prsider ce jury, quil soit
assur de mes remerciements.
A Dr : AMOURACHE L. et Dr. KHARROUB K. pour avoir accept de faire partie de ce
jury.
Mes remerciements vont galement Monsieur BRAHIMI responsable du Laboratoire du
complexe GLK1/K, Skikda. A Messieurs : FOUFOU A. Chef de Dpartement dAgronomie, universit Skikda, LAIB M.,
Chef de Dpartement de biologie, universit Skikda.
Enfin, toutes les personnes qui ont contribu la ralisation de ce travail veuillent bien accepter ici lexpression de ma gratitude.
Ddicaces
A ma mre, mon pre.
A mes trs chers frres : Djamel eddine et Zinou.
A ceux, qui me sont chers, Je ddie ce travail. Melle LAIB Imne
SOMMAIRE Introduction ..1 Partie 1 : Synthse bibliographique Chapitre 1 : Les lgumes secs 1. Gnralits.3 2. Composition biochimique.4 3. Stockage.....5 3.1. Mthodes de stockage traditionnel..5 3.2. Le stockage en sac5 3.3. Le stockage en vrac.6 3.4 Le stockage en silos..6 4. Microbiologie des lgumes secs6 4.1. La flore du champ...6 4.2. La flore intermdiaire.....6 4.3 La flore de stockage.....7 5. Altrations des lgumes secs....7 5.1. Les altrations dorigine biologique...7 5.1.1. Les microorganismes....7 5.1.2. Les prdateurs......8 5.2 Altrations dorigine physicochimique8 5.2.1. Le facteur temps.......8 5.2.2. Les facteurs temprature et hydratation.8 5.2.3. Le facteur composition de latmosphre ...9 5.3. Les altrations dorigine endogne..9 5.3.1. Par action des enzymes...9 5.3.2. Par respiration..10 5.3.3. Par fermentation anarobie..10 5.3.4. Par germination.......10 6. Consquences des altrations sur la composition biochimique et la valeur marchande des lgumes secs10 6.1. Dgradation des lipides11 6.2. Dgradation des protines11 6.3. Dgradation des glucides.12 6.4. Biosynthse des mycotoxines..12
7. Procds de traitement des lgumes secs..13 7.1. Produits chimiques....13 7.2. Traitements physiques.......14 7.3. Lutte biologique14 7.4. Produits naturels15 Chapitre II : Moisissures 1. Caractres gnraux..16 2. Classification....16 3. Mode de dveloppement et reproduction..17 3.1. Facteurs nutritifs....17 3.1.1. Source de carbone......17 3.1.2. Source dazote...17 3.1.3 Source dlments minraux et vitamine...17 3.2. Modes de reproduction..17 3.2.1. La reproduction sexue.18 3.2.2. La reproduction vgtative....18 3.3. Isolement et identification des moisissures...18 3.4. Identification des moisissures...19 3.4.1. Identification morphologique....19 3.4.2. Identification gntique....19 Chapitre III : Les huiles essentielles 1.Dfinition...21 2. Localisation des huiles essentielles dans la plante....21 3. Rles et proprits des huiles essentielles.....22 4. Composition chimique .22 5. Proprits physicochimiques.23 6. Facteurs de variabilit de la composition des huiles essentielles..........24 6.1. Les facteurs intrinsques...24 6.2. Les facteurs extrinsques...24 7. Toxicit des huiles essentielles.....25 8. Activits biologiques des huiles essentielles....25 8.1. Activit antioxydante........26 8.2. Activit antibactrienne.....26 8.3. Activit antifongique.........27
9. Mthodes dextraction et didentification des composs des huiles essentielles28 9.1. Mthodes dextraction.....28 9.1.1. Extraction entranement la vapeur deau28 9.1.2 Extraction par hydro distillation dhuile essentielle..28 9.1.3 Expression froid......28 9.1.4 Extraction par solvants organiques.....28 9.1.5 Extraction par fluide ltat supercritique....29 9.2 Mthodes didentification des composs des huiles essentielles.........29 9.2.1 Chromatographie en phase gazeuse(CPG)... .................................................30 9.2.2 Le couplage CG/SM.......30 Partie 2 : Partie pratique Matriel et mthodes 1. Matriel et mthodes.32 1.1 Matriel vgtal....32 1.1.1 Description de la plante..32 1.1.2 Collecte...32 1.1.3 Dtermination de lhumidit..32 1.1.4 Schage et conservation.33 1.2 Mthodes danalyse..............33 1.2.1. Extraction de lhuile essentielle............33 1.2.1.1. Description du dispositif dextraction..................33 1.2.1.2. Procd dextraction34 1.2.1.3 Dtermination de la cintique et du rendement dextraction...34 1.2.1.4 Conservation de lhuile essentielle obtenue.34 2.Dtermination de la composition chimique de lhuile essentielle par chromatographie en phase gazeuse..35 3.Evaluation de lactivit antioxydante..35 3.1 Mesure du pouvoir de pigeage du radical DPPH* .35 3.1.1 Principe35 3.1.2 Mode opratoire..36 3.2 Dtermination du pourcentage dinhibition.36 3.3 Dtermination du temps dquilibre TEC50............36 3.4 Dtermination de lefficacit antiradicalaire EA.............37 4. Recherche et identification moisissures des lgumes secs............................................37
4.1 Prsentation des chantillons....37 4.2 Triage des grains...37 4.3. Mesure de lhumidit des grains..............................37 4.4. Dnombrement des moisissures.......38 4.4.1. Observation et repiquage des mycliums....38 4.4.2. Purification...38 4.4.3. Identification............38 4.4.4. Etude des caractres macroscopique..39 4.4.5 Etude des caractres microscopiques et de la sexualit...........39 4.4.6. Conservation des souches.....40 5. Evaluation de lactivit antifongique de lhuile essentielle de Lavandula officinalis..........................40 5.1 Utilisation de souches tests...........40 5.1.1 Choix et origine des souches tests........40 5.2. Test antifongique.41 5.2.1 Prparation des solutions de lhuile essentielle........41 5.2.2. Technique de dilution en milieu solide.......41 5.2.3 Technique de dilution en milieu liquide..42 5.2.3.1 Dtermination des CMI...............................................................................42 5.2.3.2 Dtemination des CMF et CFS.....................................................................43 6. Traitement statistique............................................................................................................43
Rsultats et discussion 1. Huile essentielle..44 1.1 Taux dhumidit de la matire vgtale..44 1.2.Cintique dextraction de lhuile essentielle et rendement en huile
essentielle.............................................44 1.2.1 Cintique dextraction de lhuile essentielle.................................44 1.3 Rendement en huile essentielle.....45 1.4. Principaux composs de lhuile essentielle dtects par la chromatographie en phase gazeuse.45 1.5Activit antioxydante 48 1.5.1Cintique de la raction.........48 1.5.2 Dtermination du pourcentage dinhibition..........49
1.5.3. Dtermination dIC50..50 1.5.4. Dtermination de TC50...........51 1.5.5. Paramtre defficacit antiradicalaire.51 2. Taux dhumidit et les principaux genres de moisissures dtects dans les chantillons de lgumes secs tudis.........................................53 2.1.Taux dhumidit des chantillons des lgumes secs..........................53 2.2. Isolement..53 2.3 .Identification des genres..54 2.4. Discussion ....63 3. Activit antifongique de lhuile essentielle de Lavandula officinalis 65 3.1 Sur les souches tests..65 3.1.1 Taux dinhibition65 3.1.2 Concentrations minimales inhibitrices(CMI).67 3.1.3 Activits fongistatique et fongicide.. .68 3.2 Sur les souches isoles des lgumes secs..68 3.2.1 Taux dinhibition....68 3.2.2 Concentrations inhibitrices minimales(CMI).73 3.2.3 Activits fongistatique et fongicide.74 3.3 Discussion....75 3.4 Conclusion. ...80 Rfrences bibliographiques..82 Annexes Rsum
LISTE DES TABLEAUX

Tableau1 : Superficie et production des lgumes secs en Algrie (2006-2009).....4 Tableau 2 : Concentration en% et temps de rtention des diffrents composs obtenus par analyse chromatographique en phase gazeuse de lhuile essentielle de Lavandula officinalis..........46 Tableau 3 : Les paramtres de calcul de lactivit antioxydante......52 Tableau 4 : Taux dhumidit des grains des diffrents chantillons des lgumes secs53 Tableau 5: Caractres macroscopiques des souches isoles des haricots.....55 Tableau 6: Caractres macroscopiques des souches isoles des pois chiches..56 Tableau 7: Caractres macroscopiques des souches isols des fves...57 Tableau8 : Caractres macroscopiques des souches isoles des petits pois.....58 Tableau 9: Caractres microscopiques des souches isoles des lgumes secs..59 Tableau 10: CMI (g/ml) des extraits en milieu liquide...67 Tableau 11: Activits fongistatique (CFS) et fongicide (CMF) en g/ml de lhuile essentielle de Lavandula officinalis sur les micromyctes filamenteux....68 Tableau 12 : CMI (g/ml) de lhuile essentielle de Lavandula officinalis en milieu liquide....73 Tableau 13: Activits fongistatique (CFS) et fongicide (CMF) en g/ml de lhuile essentielle de Lavandula officinalis sur les souches isoles. 74
LISTE DES FIGURES

Figure1 : Classification des champignons16 Figure 2 : Dispositif de lhydro distillation.......33 Figure 3 : Taux dhumidit de Lavandula officinalis...44 Figure 4 : Cintique dextraction dhuile de la lavande....44 Figure 5 :Chromatogramme de lHE de Lavandula officinalis obtenu par CPG..47
Figure 6 : Cintique de rduction du DPPH*......48
Figure 7: Pourcentage dinhibition pour lhuile essentielle et la vitamine E....49 Figure 8: Calcul dIC50 pour lhuile essentielle de la lavande.....50 Figure 9: Valeurs dIC50..50 Figure 10: Valeurs de TC50......51 Figure11 : Taux de contamination des lgumes secs....62 Figure 12 : Taux dinhibition des extraits vis--vis des quatre souches testes....65 Figure 13 : Taux dinhibition de lhuile essentielle de Lavandula officinalis vis--vis dAspergillus niger...........................66 Figure 14 : Taux dinhibition de lhuile essentielle de Lavandula officinalis vis--vis dAspergillus fumigatus..67 Figure 15 : Taux dinhibition des moisissures isoles des lgumes secs .....69 Figure 16: Taux dinhibition de lhuile essentielle de Lavandula officinalis vis--vis de Penicillium isol des haricots secs....70 Figure 17: Taux dinhibition de lhuile essentielle de Lavandula officinalis vis--vis dAspergillus isol des pois chiches..70 Figure18 : Taux dinhibition de lhuile essentielle de Lavandula officinalis vis--vis de Aspergillus isol des petits pois....71 Figure 19: Taux dinhibition de lhuile essentielle de Lavandula officinalis vis--vis de Penicillium isol des fves....71
LISTE DES ABREVIATIONS ET SYMBOLES % :Pourcentage C : Degr CELSIUS g : Microgramme A : absorbance AFNOR : la norme de lAssociation Franaise de Normalisation Aw : Activit deau CFS : concentration fongistatique cm : centimtre CMF : concentration minimales fongicide CMI : concentration minimale inhibitrice CPG : Chromatographie en phase gazeuse dC = Diamtre de colonies dans les botes tmoins positifs dE = Diamtre de colonies dans les botes contenant lextrait de plante DPPH : Diphenylpicrylhydrazine DPPH+ : 1,1-Diphenyl-2-picryhydrazyl DSASI : Direction des statistiques agricoles et des systmes dinformation EA : Efficacit antiradicalaire FAO : Organisation des Nations unies pour l'alimentation et l'agriculture g : Gramme H (%) : Taux dhumidit exprim en pourcentage h : Heure H (%) : Taux dhumidit dchantillon de lgume sec exprim en pourcentage. HE : Huile essentielle I% : Pourcentage dinhibition I(%) = Taux dinhibition des moisissures exprim en pourcentage IC50: Concentration d'antioxydant requise pour diminuer la concentration du DPPH initiale de 50%. ITGC : Institue nationale des technologies grandes cultures KGy : kilogray, unit de mesure de dose absorbe du Systme international, valant 103 grays. Km : Kilomtre M' : Masse dhuile essentielle en gramme partir des fleurs sches
M : Masse de la matire vgtale sche utilise en gramme M : Masse de la matire vgtale sche utilise en gramme m : Mtre m/m : Masse par masse M1 Poids de lchantillon en gramme (plante frache) M1= Poids de lchantillon de lgume sec en gramme avant schage. M2 = Poids de lchantillon de lgume sec en gramme aprs le schage. M2 : Poids de lchantillon en gramme aprs le schage ml : Millilitre mn : Minute nm : Nanomtre OMS : Organisation mondiale de la Sant PCR : Polymerase chain reaction R : Radical libre RESALA : Recherche en Sciences Appliques lAlimentation RH : Antioxydant RHE : Rendement en Huile Essentielle TEC50 : Temps d'quilibre avec une concentration d'antioxydant gale IC50.
Introduction
Introduction En Algrie, les lgumineuses occupent une place importante et constituent avec les crales lpine dorsale du systme alimentaire. De nombreuses espces de lgumineuses sont utilises comme ressources dalimentation humaine (fve, soja, haricot, pois chiche, lentille, etc.) (Khelil, 1977). En effet, les grains des lgumes secs saltrent rapidement sils sont stocks dans conditions dfavorables. Plusieurs phnomnes en sont la cause (insectes, microorganismes, oxydation, etc.) (Terrain et Grallet, 2003). Avec la rvolution dans le domaine agro-alimentaire, lespce humaine doit maximiser sa production alimentaire afin dassurer une alimentation adquate pour la population mondiale. Pour ce faire elle doit rduire labondance des espces qui sont en comptition alimentaire avec elle et mettre ces produits labri de toutes altrations. (Khelil, 1977). Parmi les microorganismes, les moisissures reprsentent le groupe le plus diversifi et le plus riche en nombre despces. Les moisissures des lgumes secs stockes peuvent causer des pertes importantes en rduisant la qualit et/ou la quantit des lgumes secs stocks (Terrain et Grallet, 2003). Daprs la FAO, les pertes correspondent 35% de la production agricole mondiale des lgumes secs (Khelil, 1977). En raison de son efficacit et de son application facile et pratique, lutilisation des produits chimiques constitue lheure actuelle la technique la plus utilise pour lutter contre les moisissures nuisibles (Magan et Olsen, 2004). Cependant, lemploi intensif et inconsidr de ces produits a provoqu une contamination de la biosphre et de la chaine alimentaire, une radication des espces non cibles telles que la faune auxiliaire et lapparition des microorganismes rsistants. Ces dangers ont conduit lOMS interdire lusage de certains fongicides chimiques, dautres vont tre prohibs dans un futur proche (Khelil, 1977). Il est devenu trs indispensable la recherche de molcules nouvelles en prenant en compte dautres critres que lefficacit. Cette recherche sest oriente vers la lutte biologique par lutilisation de substances naturelles antioxydantes et antifongiques pouvant constituer
une solution alternative aux produits chimiques. Parmi ces substances naturelles figurent les huiles essentielles extraites des plantes aromatiques. Les plantes aromatiques constituent une richesse naturelle trs importante dont la valorisation demande une parfaite connaissance des proprits mettre en valeur. Les proprits des plantes dpendent de la prsence dagents bioactifs varis et appartenant diffrentes classes chimiques (Mailhebiau, 1994).
Introduction LAlgrie, par sa situation gographique, offre une vgtation riche et diverse. Un grand nombre de plantes aromatiques y pousse spontanment. Lintrt port ces plantes na pas cess de crotre au cours de ces dernires annes. . A cet effet, on sest intress lune des espces de la famille des Lamiaces : la lavande (Lavandula officinalis), celle-ci est utilise comme source mondiale dpices et dextraits fort pouvoir antimicrobien et antioxydant ( Bouhdid et al., 2006). Dans ce contexte, lobjectif de ce travail est de mettre en vidence lactivit antioxydante et antifongique de lhuile essentielle de Lavandula officinalis et dtudier leur action sur la croissance des moisissures de dtrioration des lgumes secs (haricots, pois chiches, fves et petits pois). Ce travail est structur en deux parties importantes : La premire partie est consacre une synthse bibliographique mettant laccent sur trois chapitres : le premier chapitre traite les lgumes secs, les causes et les consquences daltrations et les moyens de lutte. Le second chapitre est consacr ltude des moisissures, leur mode de dveloppement et de reproduction, leur isolement et leur identification. Le troisime chapitre prsente les huiles essentielles, leur localisation dans la plante, leurs rles et leurs proprits, leur composition chimique, les facteurs de variabilit, la toxicit, les activits biologiques et les principales mthodes de leur extraction et lidentification de leurs composants. La deuxime partie illustre le matriel et les mthodes utiliss ainsi que les rsultats obtenus. En ce qui concerne les principales analyses effectues, elles ont port sur: -Lextraction de lhuile essentielle de Lavandula officinalis par hydro distillation ; -Lvaluation du rendement et la cintique dextraction ; -Lanalyse de lhuile essentielle par chromatographie en phase gazeuse ; -Lvaluation de lactivit antioxydante de lhuile essentielle par la mthode de pigeage du radical libre DPPH ; -La recherche et lidentification des principaux genres fongiques contaminants des quatre lgumes secs ; lvaluation lactivit antifongique de lhuile essentielle sur des souches tests et sur les souches fongiques isoles des quatre lgumes secs (haricots, pois chiches, petits pois et fves) avec la dtermination des paramtres suivants : taux dinhibition, concentration minimale inhibitrice, concentrations minimales fongicides (CMF) et les concentrations fongistatiques(CFS). Enfin, une conclusion gnrale qui rsume lensemble des rsultats obtenus.
Partie I : Synthse bibliographique
Chapitre I : Les lgumes secs
Synthse bibliographique
1. Gnralits Les lgumineuses ou Fabaces constituent une vaste famille de plantes cultives pour lalimentation humaine et animale. Sur le plan botanique, elles ont souvent des fleurs en forme de papillons (Papilionaces) voluant vers un fruit de type gousse ou lgume. Les lgumineuses sont utilises des fins alimentaires et/ou industrielles
(Siret, 2000). Ces graines sont caractrises par : Une faible teneur en eau ce qui permet un stockage facile et long ; une forte teneur en protines do le terme de protagineux. Les graines de lgumineuses regroupent : Les lgumes secs qui sont des graines sches de lgumineuses dshydrates par schage : fves, haricots (avec de nombreuses espces), lentilles, pois chiches, pois secs ; Les graines utilises en tant que matire premire en industrie agro alimentaire : soja, fverole, lupin et arachide (Frdot, 2005). Toutefois, en raison de siccit, les grains lgumes vivent normalement dans un tat mtabolique extrmement ralenti ; lorsque les conditions deviennent favorables, il y a acclration du rythme vital, dont laboutissement physiologique normal est la germination. Les grains lss (cassures, fissures) ou morts (tus par un schage excessif par exemple), ont perdu ces dfenses et sont beaucoup plus vulnrables (Multon, 1982). En Algrie, les lgumineuses alimentaires (lgumes secs), font partie du paysage agricole depuis des millnaires. Ces cultures sont utilises dans la rotation avec les crales car elles enrichissent le sol en azote. Les lgumes secs sont aussi cultives parce quils constituent une source protique importante susceptible de remplacer les protines animales difficilement accessibles pour une large couche de la population. Ils sont aussi calorifiques et riches en glucides que le bl. La superficie en hectares ainsi que la production des lgumes secs en quintaux sont indiques dans le tableau 1.
Tableau1 : Superficie et production des lgumes secs en Algrie (2006-2009) (DSASI, 2009).
2006/2007
Superficie (ha) Production (Qx)
2007/2008
2008/2009
Fve/ fveroles Pois secs Lenticelles Pois chiches Haricots secs Gesses guerfales Total des et
31284 9184 873 20681 1394 94 63510
279735 62430 5605 142940 9170 950 500830
30688 7556 1309 20361 1040 197 61151
235210 36175 10809 112110 5441 1980 401725
32278 8487 2588 22274 1616 205 67448
364949 59692 26932 178404 11588 1325 642890
lgumes secs
La place des lgumineuses alimentaires dans le systme agraire nest pas toujours importante. Leur superficie totale entre 2008 et 2009 avoisine 67448 hectares. Les espces les plus cultives sont dordre dimportance : la fve et la fverole, le pois chiche et le pois sec. Bien que les lgumineuses alimentaires cultives aient bnfici de quelques programmes de dveloppement, la production nationale en lgumes secs na pas connu lamlioration escompte, tant sur le plan de la superficie que production de graines. Au contraire, toutes les espces ont connu une rgression et instabilit de leur rendement. Les raisons de cette situation sont dordre technique mais aussi socio-conomique (ITGC, 1999). 2. Composition biochimique Sur le plan biochimique et nutritionnel, les lgumes secs sont caractriss par : un taux des protines compris entre 20 et 25 % ; ces protines sont surtout des globulines caractrises par un dficit en acides cystine) ; des glucides constitus damidon parfaitement digestible (45 50 %), et de fibres (8 18%) ; par contre, on y trouve aussi des -galactosides (raffinose, stachyose, amins soufrs (mthionine et
verbascose, etc.) non digestibles, hydrolyss et mtaboliss par des bactries intestinales en hydrogne, mthane, et autres gaz responsables de flatulence ; la prsence de facteurs antinutritionnels (inhibiteurs de la trypsine, lectines) ; mais ceux-ci de nature protique (donc thermolabiles) sont dtruits lors de la cuisson (Siret, 2000).
3. Stockage Aujourdhui, le problme de stockage des grains se pose en termes trs diffrents suivant le niveau technologique des pays. Selon une estimation de la FAO, les pays ayant une technologie avance de stockage ne subissent que de faibles pourcentages de pertes. Il existe plusieurs mthodes de stockage (Khelil, 1977).
3.1. Mthodes de stockage traditionnel Dans ce type de stockage, les graines sont conserves dans des greniers et des cases dhabitation mal entretenues o se trouvent les restes des rcoltes prcdentes fortement contamines par les insectes. Les greniers sont gnralement en terre. De forme ronde ou carre, ces greniers en terre plus ou moins additionne de fibres vgtales (pailles...) reposent gnralement sur une ou plusieurs pierres qui vitent les remontes d'humidit. Linconvnient majeur de cette mthode de stockage est la trs forte humidit et les eaux dinfiltration qui favorisent le dveloppement des moisissures et les phnomnes de fermentation bactrienne (Huignard ,1985). . 3.2. Le stockage en sac La solution de stockage en sacs au magasin est la plus frquemment utilise, car elle permet d'employer des btiments existants et, dans le cas de constructions neuves, exige un investissement plus faible que le stockage en vrac. Les sacs sont dposs par terre et sont exposs aux oiseaux, rongeurs, et insectes (Jard, 1995). Les principaux facteurs de dgradation des stocks sont la temprature, l'humidit et les diffrents prdateurs (insectes, rongeurs, oiseaux). Les magasins doivent tre conus et grs de faon limiter l'influence de chacun de ces facteurs (Cruz et a.l, 1988).
3.3. Le stockage en vrac Le stockage en vrac est encore peu rpandu dans les pays en dveloppement alors qu'il est gnralis dans les pays dvelopps. Les grains en tas sont laisss lair libre sous des hangars ouverts charpente mtallique. Malheureusement les contaminations sont possibles dautant plus que dans ce type de construction, il demeure toujours des espces entre les murs et les toits et le libre passage des insectes est permis Dans ce type de stockage, la hauteur du tas ne doit pas tre assez grande pour pouvoir traiter le produit stock par fumigation (Doumandji, 1977).
3.4 Le stockage en silos Ce sont des enceintes cylindriques en mtal ou en maonnerie couvertes sur les parois internes dune couche daluminium pour viter les phnomnes de condensation. Cest une nouvelle mthode de stockage des grains efficace qui diminue les dgts et limite lattaque des ravageurs (Jard, 1995). La conservation en silos tanches lair entrane la destruction des insectes par asphyxie (Doumandji ,1981).
4. Microbiologie des lgumes secs 4.1 La flore du champ Les grains la rcolte sont porteurs de moisissures champtres, surtout adaptes aux conditions extrieures. Il sagit essentiellement de Fusarium, qui peuvent dans certaines conditions produire au champ des mycotoxines toxiques. Ces dernires sont
thermorsistantes, donc le schage ne les dtruit pas. Les prcautions prendre pour les viter sont dordre agronomique en privilgiant les varits rsistantes, lutilisation du labour avant le semis, un programme antifongique adapt et une rotation des cultures (Terrain et Grallet, 2003).
4.2 La flore intermdiaire Elle regroupe les germes capables dun dveloppement limit en dbut de stockage, en conditions particulires et notamment sur grains suffisamment secs. Cladosporium, Trichoderma, et surtout les Mucorales comme Rhizopus, Absidia, Mucor, avec les levures Candida, Torulopsis, etc, sont les reprsentants habituels de cette flore intermdiaire, dont la
mise en vidence rvle, trs souvent, un stockage en conditions confines et trop humides (Blanc, 1982).
4.3 La flore de stockage La flore de stockage est compose despces xrophiles adaptes des substrats relativement secs, qui peuvent prolifrer au cours du stockage (Feillet, 2000). Penicillium et Aspergillus ne se trouvent quen faible proportion sur les grains la rcolte, mais, adapts aux substrats relativement secs, ils peuvent prendre leur essor au cours du stockage, alors que les autres espces, plus hydrophiles, se multiplient moins activement ou rgressent. Les origines du peuplement microbien sont multiples. Une grande partie des lments qui le composent proviennent de la plante sur pied : cest ainsi que des plantes fusaries peuvent donner des grains riches en Fusarium (Multon, 1982).
5. Altration des lgumes secs Au cours du stockage, la qualit des grains saltre rapidement sils sont conservs trop humides. Cette altration de la qualit saccompagne dune perte de poids. Plusieurs phnomnes en sont la cause (Terrain et Grallet, 2003) : 5.1 Les altrations dorigine biologique Ce sont essentiellement les insectes, les acariens et les microorganismes qui sont la cause. Leur prsence constitue un risque considrable, car leur action se traduit par dcomposition du milieu dont ils vivent et par la libration de substances nouvelles dans le grain : enzymes, toxines et autres rsidus de leurs mtabolites (Multon, 1982). 5.1.1Les microorganismes Par leur activit, les microorganismes contribuent la dgradation de la valeur dutilisation des grains. Il est trs difficile dvaluer, dans un processus daltration, la part revenant respectivement au grain et la microflore considre isolment (Multon, 1982). De plus, le mtabolisme des microorganismes modifie le comportement glucidique, lipidique et protique du grain (Tabuc, 2007).
Plus encore que laction des bactries, cest celle des moisissures et plus particulirement celle des Penicillium et des Aspergillus qui est craindre en cours du stockage (Flamini et Luigi Cioni, 2003). 5.1.2Les prdateurs Les insectes et les acariens qui vivent dans les grains posent des problmes souvent sous estims. Ils sont une cause daltration grave par la consommation des denres et par la contamination dont ils sont les vecteurs (Seri-Kouassi et al., 2004). Il existe une troite interrelation entre microflore et la microfaune de stockage. En effet, beaucoup dacariens consomment non seulement des dbris de grains, mais galement des moisissures, prfrant dailleurs des espces les plus abondantes et ceci peut favoriser la pullulation de ces acariens. Inversement les spores fongiques sont largement dissmines par les acariens et les insectes (Prevett, 1975).
5.2 Altrations dorigine physico-chimique 5.2.1 Le facteur temps Il introduit la notion de la vitesse de raction dont la connaissance permet destimer une dure probable de stockage. Gnralement, le stockage de courte dure, dans les conditions favorables de temprature et dhumidit amliore la valeur dutilisation des lgumes secs. Ces derniers ne sont utiliss couramment quaprs 2 3 mois aprs rcolte. Pomeranz (1971) confirme quun long stockage des grains saccompagne dune diminution de la qualit. 5.2.2 Les facteurs temprature et hydratation Roberts (1972) note que le degr de dtrioration des grains durant le stockage et dpendant de trois facteurs majeurs, la temprature, lhumidit et la composition de latmosphre inter granulaire. Pertruzelli (1986) confirme que les modifications physiques et mtaboliques dans les grains stocks sont probablement toutes acclres, quand la temprature augmente. Alors
que le comportement des grains une augmentation de la teneur en eau parait tre plus complexe. 5.2.3 Le facteur composition de latmosphre La prsence doxygne en quantit suffisante permet le dveloppement de la flore arobie et les oxydations des substances biochimiques. Les ractions de dgradations qui font appel loxygne permettent de stimuler lactivit respiratoire des grains et des microorganismes, provoquant aussi un appauvrissement de la teneur en oxygne et un enrichissement en gaz carbonique de latmosphre (Multon, 1982). Le gaz carbonique bloque le dveloppement des moisissures, mais pas celui des bactries anarobies. Ds que lon atteint une teneur de 10%, une fermentation apparait et donne au produit des effets indsirables (Terrain et Grallet, 2003). 5.3 Les altrations dorigine endogne 5.3.1 Action des enzymes Les protases, les amylases et les lipases dont les actions ont t particulirement tudies, interviennent en donnant des produits aisment dgradables (Multon, 1982). La lipase libre des acides gras qui sont ensuite oxyds plus facilement que les triglycrides dont ils proviennent (Alais et al., 2003). Les enzymes lipolytiques sont les seules enzymes susceptibles dtre actives aux faibles Aw, zones qui sont prcisment les plus favorables aux oxydations chimiques (Thiam et al.,1976). Il en rsulte que des grains prouve que lactivit possdant leurs activits lipasiques intactes, et relativement secs, runissent toutes les conditions de sensibilit loxydation. Lexprience de la lipase et la lipoxygnase des grains reste en absence de
germination trs limite tant que les structures cellulaires demeurent intactes (Multon, 1982). Bon nombre de grains possdent des lipases propres.La part de responsabilit des grains eux-mmes et des microorganismes dans les processus d'acidification ont t longtemps controverss. Des tudes ralises sur grains artificiellement dcontamins permettent
aujourd'hui de conclure au rle prpondrant, quasi exclusif, des moisissures, dans ces processus d'acidification (Milner et al., 1947 ; James et Lejeune, 1955 ; Thiam et al., 1976).
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Une corrlation troite existe entre la
croissance des moisissures et lapparition de ces
composs volatils odeur de moisi qui peuvent tre considrs comme spcifiques et indicateurs dune activit des moisissures. Selon toute vraisemblance, ces composs rsultent d'une activit lipoxygnasique de ces moisissures (Richardmolard et al., 1979). 5.3.2 Par respiration En prsence doxygne, le grain respire et lamidon se dgrade : il se forme de la vapeur deau et du gaz carbonique qui se rpandent spontanment dans latmosphre qui entoure chaque grain. Dans le cas dune cellule tanche, le gaz carbonique produit remplace progressivement loxygne de lair et la raction de dgradation tend sinterrompre. En cas de ventilation ou dentre dair, loxygne est renouvel et la raction perdure tant quil reste de lamidon. La respiration augmente la temprature du grain. On sait que lintensit de la raction double pour une augmentation de temprature de 5C. La teneur en eau leve des grains favorise galement la raction (Terrain et Grallet, 2003). 5.3.3 La fermentation anarobie En absence doxygne, lamidon du grain humide se dgrade par fermentation. Il se forme de lalcool et du gaz carbonique. Cette raction chimique produit galement de la chaleur, mais en quantit moindre que la respiration (Terrain et Grallet, 2003). 5.3.4 La germination Elle se produit spontanment si le grain est suffisamment humide et ds que sa temprature est assez leve. Lapparition des germes et des radicelles, dans les tas de grains, rduit la capacit des grains rouler les uns sur les autres. Ds lors, leur descente gravitaire dans les silos et les schoirs, et leur manutention en vrac sont difficiles, voire impossibles. La germination est un prolongement de la respiration (Terrain et Grallet, 2003).
6. Consquences des altrations sur la composition biochimique et la valeur marchande des lgumes secs
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Sur les normes quantits cultives ou collectes, une partie importante est dtruite ou altre chaque anne pendant lentreposage (Multon, 1982), do les graves consquences que pouvaient avoir les ressources alimentaires mondiales avec une limination ou mme une rduction sensible des pertes aprs rcolte que subissent les denres vivrires (Prevett, 1975). La contamination microbienne des lgumes secs, destines lhomme ou lanimal, est le principal dommage qui va entraner de nombreux problmes. Il y a donc une rduction quantitative et qualitative de la valeur alimentaire de la denre, et une baisse du rendement des rcoltes (Bulter et Day, 1998). Les mtabolites produits par les champignons lors de leur croissance sont aussi des lments majeurs dans laltration des denres alimentaires. Des manifestations dans la qualit organoleptique (en modifiant le got de la denre par exemple) mais aussi de graves problmes sanitaires surgissent, comme par exemple des risques dintoxication due la prsence de mycotoxines (Krogh, 1987).
6.1 Dgradation des lipides Les premires modifications biochimiques que subissent les grains en cours du stockage mal conduit sobservent le plus souvent au niveau des lipides (Daftary et al., 1970 ; Pomeranz, 1974). La dgradation dbute par lhydrolyse des glycrides sous laction des lipases microbiennes conduisant une augmentation de la teneur en acides gras libres. Les lipases microbiennes provoquent souvent une dgradation partielle des triglycrides en di et mono glycrides (Guenot, 1975). Le dveloppement sur les grains stocks de certaines moisissures, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, etc., s'accompagne d'une formation de composs volatils spcifiques comme le l-octne-3-ol et 2-octne-1-o 1 (Kaminski et al., 1974 ; Abramson et al., 1980). Laccroissement des moisissures a une action nfaste sur la qualit des grains, elle se traduit par une dtrioration organoleptique et par une formation potentielle de mtabolites toxiques (Daftary et Pomeranz, 1965).
6.2 Dgradation des protines
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La plupart des microorganismes prsents sur les grains stocks montrent, des degrs divers, des activits protolytiques. Lhydrolyse des protines en polypeptides et en acides amins assimilables par les microorganismes ne se fait que trs lentement dans les conditions habituelles de stockage (Pomeranz, 1974).
6.3 Dgradation des glucides Les grains ne contiennent gnralement que de faibles quantits de sucres directement assimilables par les microorganismes. Il faut donc lintervention denzymes extracellulaires, cellulases, amylases par exemple, pour rduire les macromolcules glucidiques en fragments assimilables comme le glucose. Les sucres simples, aprs transport dans la cellule, sont dgrads par glycolyse, suivant les voies classiques, voie EMBDEN-MEYERHOF et voie des pentoses phosphates pour ne citer que les principales reconnues chez les moisissures (Cochrane, 1976). Bien entendu, le grain est lui-mme un organisme vivant, qui respire en mme temps que les microorganismes dont il est porteur, et il a t longuement discut de la part de responsabilit revenant au grain et aux microorganismes, dans les processus dchauffement. Les donnes exprimentales paraissent suffisantes pour affirmer que la plupart des cas, ce sont les microorganismes et principalement les moisissures qui sont responsables, par leur respiration, de lchauffement des stocks de grains (Christensen et Kaufmann, 1969).
6.4 Biosynthse des mycotoxines Plusieurs moisissures notamment les genres Aspergillus, Penicillium et Fusarium sont connus pour tre des contaminants des lgumes secs et/ou pour leur capacit produire des mtabolites secondaires toxiques (Cahagnier et al., 1998 ; Doyle et al., 1998 ; Meyer et al., 2004). Les mycotoxines sont des mtabolites secondaires labors par plusieurs souches de champignons certains stades de leur dveloppement (Reboux, 2006). Les mycotoxines sont produites dans les matires alimentaires, leur dcontamination est trs difficile. Ces molcules ne sont pas dtruites au cours dun stockage prolong et sont souvent rsistantes aux traitements thermiques ou chimiques (Langseth et al., 1993 ; Cahagnier et al., 1998). La production des mycotoxines peut seffectuer depuis le champ jusqu lassiette. Cependant, le type de mycotoxines contaminant les aliments ainsi que la quantit de
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mycotoxine produite dpendent de plusieurs lments comme les espces fongiques, les conditions cologiques dans lesquelles les champignons se dveloppent. Il dpend galement de la stabilit de ces toxines dans le milieu alimentaire (Langseth et al., 1993 ; Cahagnier et al., 1998).
7. Procds de traitement des lgumes secs Mettre les grains l'abri daltrations, c'est prendre un ensemble de mesures qui sont applicables toutes les tapes de la vie des grains, depuis la rcolte (et mme avant) jusqu' leur utilisation (Multon, 1982) Qualit initiale des grains, matrise de la temprature, de l'humidit et de la composition du milieu ambiant, traitements physiques et chimiques, sont la cl du contrle de l'activit microbienne (Multon, 1982). Il existe plusieurs mthodes de traitement des lgumes secs
7.1 Produits chimiques Des acides organiques de faible poids molculaire (acide propionique, acide actique et acide formique) et leurs sels sont les plus employs pour conserver les grains (Magan et Olsen, 2004). Cependant, ils ont beaucoup d'inconvnients : leur efficacit dpend du temps ; ils sont corrosifs ; les traitements de l'acide dtruisent la viabilit de la graine ; et, surtout, le soin spcial doit tre pris par l'utilisateur pour viter l'inhalation. Dans quelques cas, la production des mycotoxines accrue est observe dans le grain trait l'acide. Quelques myctes peuvent utiliser ces acides comme source de carbone (Tatsadjieu, et al., 2009).. Actuellement, il ya une tendance mondiale de rduire au minimum, ou mme interdiction de l'utilisation des pesticides dans les produits agricoles, ce qui donne l'urgence la recherche des mthodes alternatives de conservation des grains (Bankole, 1997 ; Tatsadjieu, et al., 2009). Les traitements des grains humides par l'ammoniac gazeux ou en solution dans le but d'inhiber le dveloppement de leur microflore suscite actuellement un certain intrt (Multon, 1982). Certaines substances chimiques utilises pour faire face aux dgradations prsentent un risque toxique non ngligeable : cest le cas de loxyde dthylne, du bromure de mthyle (Leyral et Vierling, 2003). Ces produits causent l'induction des phnomnes de rsistance
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des genres mycotiques pathognes et l'accumulation des rsidus (Flamini et Luigi Cioni, 2003). Laldhyde formique a t utilis avec succs pour lutter contre le dveloppement des moisissures des grains, mais son emploi pose galement de nombreux problmes (odeur, couleur, perte dactivit enzymatique). 7.2 Traitements physiques Des mthodes physiques se sont gnralement appliques dans le stockage de grain. Les atmosphres modifies et l'irradiation gamma devraient tre mentionnes. Laction ltale de l'irradiation sur les organismes vivants rsulte de modifications chimiques, mme quantitativement infimes, induites dans leurs molcules vitales. Les champignons producteurs de toxines sont plus sensibles que d'autres lirradiation (Magan et Olsen, 2004). Les moyens physiques rduisent ou liminent lutilisation des produits chimiques, cependant, beaucoup de facteurs pratiques, techniques aussi bien que biologique, continuent limiter l'utilisation des atmosphres modifies et l'irradiation gamma (Magan et Olsen, 2004). Les doses de rayonnements ionisants suffisantes pour remplacer les produits chimiques sont trs faibles : 0.4 1 KGy (Leyral et Vierling, 2003).
7.3 Lutte biologique Des levures, et des bactries nombreuses se sont avres efficaces dans le contrle du produit agricole frais aprs rcolte. Les mcanismes par lesquels la croissance fongique et la production des mycotoxines peuvent tre empches dans l'environnement concurrentiel incluent : la concurrence pour les nutriments et l'espace ; linduction des mcanismes de dfense ; les interactions hyper parasitiques. Bien que le contrle biologique ne semble pas encore tre faisable sur les grains, un avantage important qui pourrait merger des tudes sur les myctes antagoniques serait la dcouverte des composs inhibiteurs la production de myctes et/ou de mycotoxine de stockage (Magan et Olsen, 2004) La grande majorit des antifongiques naturels est dorigine microbienne et prs de la moiti est synthtise par les actinomyctes, en particulier par les Streptomyces, le genre le plus rpandu dans lenvironnement ( Eckwall et Schottel, 1998) . Les recherches actuelles tiennent beaucoup plus compte des actinomyctes peu frquents ou rares, provenant de diverses niches cologiques ignores ou peu exploites. Ces actinomyctes, dits rares dont
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le genre Actinomadura, se sont rvls tre une source intressante dantibiotiques (Lazzarini et al., 2001, Maskey et al., 2003).
7.4 Produits naturels Nombreux constituants des plantes montrent une activit antifongique contre des
myctes de stockage. De telles plantes incluent l'origan, le clou de girofle, la cannelle, l'ail, le thym et la lavande (Nguefacka et al ., 2004). Cependant, des rsultats contradictoires ont t rapports dans beaucoup des cas, puisque plusieurs paramtres doivent tre considrs quand ces rsultats sont compars : le milieu de culture, la source botanique de matire vgtale ou la priode de la moisson (qui pourrait affecter la composition dhuile) ; les techniques dextraction et lespce examines (Lis-Balchin, 2002). Il y a des diffrences dans la sensibilit lhuile, entre diffrents espces appartenant aux mmes genres et entre les diverses structures fongiques: spores, sclrotites et fragments mycliens (Magan et Olsen, 2004). tant
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Chapitre II : Moisissures
Chapitre II : Moisissures 1. Caractres gnraux
Les moisissures sont des champignons microscopiques. Ce sont des organismes pluricellulaires dont lappareil vgtatif, le thalle, est form de longs filaments ramifis et souvent cloisonns que lon appelle des hyphes. Lorsque la croissance est suffisamment avance, lensemble des hyphes constitue un myclium visible lil nu qui se prsente comme une sorte de feutrage la surface colonise (Nicklin et al., 2000). Non photosynthtiques, les moisissures ne peuvent se dvelopper que sur des substrats organiques. La structure filamenteuse du thalle les rend particulirement aptes coloniser des substrats solides. En raison de leurs aptitudes cologiques et physiologiques ; les moisissures sont de loin les microorganismes les plus redoutables pour les grains stocks (Multon, 1982). 2. Classification La classification des champignons est essentiellement base sur des caractres purement morphologiques (Meyer et al., 2004). La classification de Kwon Chung et Bennett (1992) est la plus utilise actuellement (Figure 1). On estime plus de 100 000 le nombre despces fongiques, plus de 1000 dentre elles pouvant contaminer les aliments (Castegnaro et Pfohl- Leskowicz, 2002). Deuteromycotina Chytrimycotina Champignons Zygomycotina Oomycotina Figure1 : Classification des champignons (Kwon Chung et Bennett, 1992) Ascomycotina
Basidiomycotina
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Chapitre II : Moisissures 3. Physiologie et reproduction 3.1 Facteurs nutritifs 3.1.1 Source de carbone
Les myctes utilisent des matires organiques comme source de carbone et nergie. Ils tirent ce carbone par saprophytisme, symbiose ou parasitisme. Les myctes utilisent la glycolyse comme mtabolisme arobie pour dgrader les hydrates de carbone. Certains peuvent utiliser des fermentations des taux bas doxygne. Rcemment, des myctes anarobies vrais ont t dcouverts dans le rumen du btail. Ces myctes prsentent un mtabolisme nergtique proche de certains Protozoaires parasites (Nicklin et al., 2000). 3.1.2 Source dazote Les myctes incorporent lazote par htrotrophisme. Ils ne peuvent assimiler lazote gazeux mais peuvent utiliser le nitrate, lammonium et certains acides amins par absorption directe travers la membrane. Des sources complexes dazote, comme les peptides et les protines, ne sont utilisables par les hyphes quaprs leur dgradation par des protases en acides amins (Nicklin et al., 2000). 3.1.3 Source dlments minraux et vitamines Le phosphore, le potassium, le magnsium, le calcium et le soufre constituent des sels minraux requis par les myctes. Les myctes ont la possibilit daccder des rserves de phosphore en scrtant dans le milieu extracellulaire des enzymes phosphatases. Le fer est relativement insoluble et donc pas facilement assimilable ; mais les myctes sont capables de synthtiser des sdrophores ou des acides organiques qui peuvent chlater le fer ou modifier sa solubilit. Certains myctes peuvent avoir besoins de vitamines prformes, comme par exemple de la thiamine et de la biotine, ainsi que des strols, de la riboflavine, de lacide nicotinique et folique (Nicklin et al., 2000). 3.2 Modes de reproduction Lappareil vgtatif des champignons est un thalle compos de filaments (hyphes) ramifis dont lensemble constitue le myclium. Ils se reproduisent grce des spores (Nguyen Minh Tri, 2007).
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Aprs un certain temps de dveloppement, les moisissures comme tous les champignons et autres tres vivants doivent se reproduire, puis se propager pour aller coloniser dautres substrats (Roquebert, 1997). Les champignons se reproduisent de deux manires : Par voie sexue : suite la fusion de deux cellules gamtiques ; Par voie asexue ou vgtative, la plupart dentre eux tant rencontrs dans le groupe des imparfaits (Champion, 1997).
3.2.1. La reproduction sexue Des moisissures se reproduisent selon un cycle de reproduction sexue. La reproduction sexue implique la production dorganes sexus et de gamtes, la fusion des gamtes ou des organes sexus suivie par la fusion nuclaire ou caryogamie et la miose, le dveloppement des organes de fructification ( Larpent et Larpent-Gourgaud, 1990). Ce type de reproduction permet la recombinaison des caractres hrditaires. La sexualit nexiste que chez certaines espces, pour dautres elle na jamais t mise en vidence, pour dautres elle est inconstante ou rare (Guiraud, 1998).
3.2.2 La reproduction vgtative Elle est beaucoup plus rpandue que la prcdente, et si elle ne fait pas intervenir de transformation gntique, elle joue un grand rle dans la dissmination des espces. Elle se fait, soit par une fragmentation du thalle, soit par la production de spores asexues (Branger et al., 2007). Chez les moisissures, plusieurs types de spores de reproduction vgtative peuvent tre produites :arthrospores(issues de la septation de la paroi cellulaire), sporangiospores ( formes dans un sporange lextrmit dun hyphe), conidiospores (produites la priphrie des hyphes), blastospores (formes par un bourgeonnement de surface dune cellule vgtative) ( Branger et al., 2007).
3.3 Isolement des moisissures Le choix des milieux de culture est aussi dterminant dans lisolement et le dnombrement de la microflore du produit analyser. Trois catgories de milieux peuvent tre distingues : les milieux de routine, peu slectifs, permettant lisolement dun grand nombre de moisissures ; les milieux slectifs adapts la recherche dune espce ou dun groupe despces cologie
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particulire et difficile mettre en vidence avec un milieu ordinaire ; les milieux diffrentiels utiliss pour la dtermination de champignons appartenant le plus souvent des genres difficiles 3.4 Identification des moisissures Lidentification des trs nombreuses espces fongiques susceptibles de coloniser les aliments et den altrer les qualits, voire de produire des mycotoxines est une tape indispensable lvaluation du risque mycotoxique. Cette identification a pendant longtemps t exclusivement base sur lobservation des caractres culturaux et morphologiques de lespce. Les progrs rcents de la biologie molculaire ont permis de proposer des outils daide lidentification. Toutefois, la complexit du rgne fongique fait, qu lheure actuelle, ces outils ne peuvent pas encore remplacer compltement lexamen morphologique, qui reste la base de lidentification (Tabuc, 2007).
3.4.1 Identification morphologique Lidentification dune espce fongique repose sur lanalyse de critres culturaux (temprature et vitesse de croissance, milieux favorables) et morphologiques. Ces derniers sont constitus des paramtres macroscopiques (aspect des colonies, de leur revers) et microscopique (aspect du myclium, des spores, des phialides, des conidiophores,) (Cahagnier et RichardMolard, 1998).
3.4.2 Identification gntique L'identification d'espces fongiques est traditionnellement fonde sur les caractristiques culturales et morphologiques macroscopiques et microscopiques. Cette identification ncessite donc, en gnral, plusieurs jours de culture (7 10 jours le plus souvent). La culture sur des milieux spcifiques peut tre ncessaire pour obtenir la formation de conidies et, dans certains cas, labsence dapparition de conidies rendra impossible lidentification du myclium. Par consquent, de nombreuses tudes ont vis dvelopper des mthodes outils didentification reposant sur ltude des acides nucliques (ADN et ARN) et ne ncessitant plus obligatoirement un examen morphologique (Reiss et al., 1998 ;Jin et al., 2004 ; Feuilhade de Chauvin, 2005 ;Hinrikson et al., 2005 ; Peterson, 2006 ). Les mthodes les plus intressantes sont bases sur lamplification par PCR (polymerase chain reaction). Cette mthode est aussi utilise pour diffrencier et identifier les moisissures
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responsables de laltration des aliments, principalement les espces de Penicillium (Boysen et al., 2000 ; Hageskal et al., 2006). De nombreux travaux visent aussi utiliser les progrs de la biologie molculaire afin de dpister rapidement les souches fongiques toxinognes (Niessen, 2007). Si lheure actuelle les outils didentification molculaire ne semblent pas en mesure de remplacer lidentification morphologique classique, il est probable que dans les annes venir, ces mthodes reprsenteront des outils particulirement utiles pour la dtection et lidentification fongique dans les aliments (Niessen, 2007).
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Chapitre III : Les huiles essentielles
Chapitre III : Les huiles essentielles 1. Dfinition
Il sagit dun mlange de composs lipophiles, volatils et souvent liquides, synthtiss et stocks dans certains tissus vgtaux spcialiss. Extraites de la plante grce des procds physiques tels lhydro distillation, lentranement la vapeur ou par expression froid dans le cas des agrumes, les huiles essentielles sont responsables de lodeur caractristique de la plante. Les produits obtenus par extraction avec dautres procds ne sont pas repris dans la dfinition dhuile essentielle donne par la norme de lAssociation Franaise de Normalisation (AFNOR) (Bruneton, 1993 ; AFNOR, 2000). Contrairement ce que le terme pourrait laisser penser, les huiles essentielles ne contiennent pas de corps gras comme les huiles vgtales obtenues avec des pressoirs (huile de tournesol, de mas, d'amande douce, etc.). Il s'agit de la scrtion naturelle labore par le vgtal et contenue dans les cellules de la plante, soit dans les fleurs (ylang-ylang, bergamotier, rosier), soit dans les sommits fleuries (tagte, lavande), soit dans les feuilles (citronnelle, eucalyptus), ou dans lcorce (cannelier), ou dans les racines (vtiver), ou dans les fruits (vanillier), ou dans les graines (muscade) ou encore autre part dans la plante (Anton et Lobstein, 2005). Le terme huile sexplique par la proprit que prsentent ces composs de se solubiliser dans les graisses et par leur caractre hydrophobe. Le terme essentielle fait rfrence au parfum, lodeur plus ou moins forte dgage par la plante.
2. Localisation des huiles essentielles dans la plante Les huiles essentielles sont produites dans des cellules glandulaires spcialises recouvertes dune cuticule. Elles sont alors stockes dans des cellules huiles essentielles (Lauraceae ou Zingiberaceae), dans des poils scrteurs (Lamiaceae), dans des poches scrtrices (Myrtaceae ou Rutaceae) ou dans des canaux scrteurs (Apiacieae ou Asteraceae). Elles peuvent aussi tre transportes dans lespace intracellulaire lorsque les poches essences sont localises dans les tissus internes. Sur le site de stockage, les gouttelettes dhuile essentielle sont entoures de membranes spciales constitues desters dacides gras hydroxyls hautement polymriss, associs des groupements peroxydes. En raison de leur caractre lipophile et donc de leur permabilit extrmement rduite vis--vis des gaz, ces membranes limitent fortement lvaporation des huiles essentielles ainsi que leur oxydation lair (Bruneton, 1993 ; Anton et Lobstein, 2005).
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Chapitre III : Les huiles essentielles 3. Rles et proprits des huiles essentielles
Le rle des huiles essentielles dans la physiologie de la plante reste encore mal connu. Toutefois, les parfums mis jouent un rle attractif pour les insectes pollinisateurs (Deroin, 1988). De plus, en rgle gnrale, les huiles essentielles constituent un moyen de dfense naturel contre les insectes prdateurs et les microorganismes. Les substances mises sont dans ce dernier cas appeles phytoalexines . Ce type de toxine nest produit quen cas dinfection et nentre donc pas dans la composition dune huile essentielle provenant dune plante saine (Mann, 1987). La sauge Salvia leucophylla libre quant elle des substances dans latmosphre telles du cinole, du camphre et dautres composs voisins afin dinhiber la germination et le dveloppement despces prairiales en concurrences. Ces composs agissent par absorption dans un sol sec (Guignard et al., 1985). Lintrt pour les produits naturels dans lalimentation et dans lindustrie pharmaceutique est grandissant. Baratta et al. (1998), ont ralis une exprience visant mettre en vidence les proprits antimicrobiennes, antifongiques et antioxydantes de plusieurs huiles essentielles.
4 .Composition chimique Le nombre des molcules chimiquement diffrentes qui constituent une huile essentielle est variable (Belaiche, 1979). A ct des composs majoritaires (entre 2 et 6 gnralement), on retrouve des composs minoritaires et un certain nombre de constituants sous forme de traces (Pibiri, 2006). Les huiles essentielles sont des mlanges complexes et variables de constituants qui appartiennent, de faon quasi exclusive, deux groupes : le groupe de terpnodes ; le groupe des composs aromatiques drivs du phnylpropane. Daprs Pibiri (2006), la structure des composs des huiles essentielles est constitue dun squelette hydrocarbon, constituant une chane plus ou moins longue. Sur ce squelette de base est souvent prsent un ou plusieurs sites fonctionnels semblables ou diffrents. La majorit des sites fonctionnels sont des sites oxygns avec un ou plusieurs atomes doxygne, pour quelques groupes fonctionnels azots ou soufrs. Selon Mailhebiau (1994), cette structure varie en fonction : Du nombre datomes de carbone qui les constitue : Les monoterpnes ;
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Chapitre III : Les huiles essentielles Les sesquiterpnes ; Rarement les diterpnes. Du caractre satur ou insatur des liaisons ; De leur agencement : linaire ou cyclique ;
De la configuration spatiale (forme de chaise, de bateau, de tridre) ; De la nature des groupes fonctionnels savoir : Terpnes : R1-HC=CH-R2 ; Alcools terpniques : R-OH ; Ctones : R1-CO-R2 ; Phnols : C6H6-OH ; Aldhydes : R-CHO ; Esters : R1-COO-R2 ; Ethers : R1-O-R2.
5. Proprits physico-chimiques En ce qui concerne les proprits physico-chimiques, les huiles essentielles forment un groupe trs homogne (Bernard et al., 1988 ; Bruneton, 1993). Les principales caractristiques sont : Liquides temprature ambiante ; Nont pas le toucher gras et onctueux des huiles fixes ; Volatiles et trs rarement colores ; Une densit faible pour les huiles essentielles forte teneur en monoterpnes ; Un indice de rfraction variant essentiellement avec la teneur en monoterpnes et en drivs oxygns. Une forte teneur en monoterpnes donnera un indice lev, cependant une teneur leve en drivs oxygns produira leffet inverse ; Solubles dans les alcools titre alcoomtrique lev et dans la plupart des solvants organiques mais peu solubles dans leau ; Doues dun pouvoir rotatoire puisquelles sont formes principalement de composs asymtriques ; Trs altrables, sensibles loxydation et ont tendance se polymriser donnant lieu la formation de produits rsineux, il convient alors de les conserver labri de la lumire et de lair.
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Chapitre III : Les huiles essentielles 6. Facteurs de variabilit de la composition des huiles essentielles
Etant formes de mlanges gnralement complexes, les huiles essentielles prsentent une trs grande variabilit, tant au niveau de leur composition, quau plan du rendement des plantes dorigine. Cette variabilit peut sexpliquer par diffrents facteurs, que nous pouvons regrouper en deux catgories : Facteurs intrinsques, lis lespce, au type de clone, lorgane concern, linteraction avec lenvironnement (type de sol ou climat, ) et au degr de maturit du vgtal concern, voire au moment de la rcolte au cours de la journe ;
facteurs extrinsques, en lien avec ou la mthode dextraction (Besombes, 2008).

6.1 Les facteurs intrinsques Les cellules productrices dhuile essentielle pouvant se situer dans diffrents organes, il est possible dobtenir diffrentes huiles selon les parties slectionnes dune mme plante. Ainsi les huiles essentielles extraites partir des baies et des feuilles de piment ne sont pas identiques. Les travaux de Maffei et Sacco (1997), ont montr des diffrences de composition des huiles essentielles en raison dorganes diffrents (feuilles et fleurs) et de sous-espces diffrentes. Le stade vgtatif au moment de la rcolte est un facteur dterminant pour le rendement et la composition de lhuile essentielle des plantes de Lavandula obtenus par clonage (Fantino, 1990).
6.2 Les facteurs extrinsques Huang et al. (1995) ont montr linfluence des mthodes dextraction sur la composition des huiles essentielles. Le stockage des matires premires avant distillation peut galement influencer la composition et le rendement des huiles essentielles. Fantino(1990) a not des pertes considrables dhuile essentielle lors dun stockage prolong au conglateur, mais peu dvolution de la composition. Par ailleurs le temps de stockage des huiles essentielles aprs extraction tend aussi modifier la composition de ces huiles. Daprs Carette (2000), les huiles essentielles se conservent entre 12 et 18 mois aprs leur obtention, car, avec le temps, leurs proprits tendent dcrotre.
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Dautres travaux ont mis en vidence linfluence de lorigine gographique de la matire premire (Verzele et al., 1988)
7. Toxicit des huiles essentielles Alors que de nombreux ouvrages font rfrence la toxicit de nombreux produits sur le march, la toxicit des huiles essentielles est moins investigue. La plupart du temps, sous le terme de toxicit sont dcrites des donnes exprimentales accumules en vue dvaluer le risque que reprsente leur emploi. Les interactions de ces produits avec les mdicaments sont aussi peu mentionnes (Pibiri, 2006). Cependant quelques informations sur certaines toxicits sont dcrites par la littrature : En rgle gnrale, les huiles essentielles dusage commun ont une toxicit par voie orale faible ou trs faible avec des DL50 suprieures 5g/kg. En ce qui concerne la lavande la toxicit est faible autour des 5g/kg (donne observe chez lanimal) (Bruneton, 1993). Chez lhomme des intoxications aigues sont possibles. Les accidents graves, les plus souvent observs chez les petits enfants, sont provoqus par lingestion en quantit importante dhuiles essentielles. Certains auteurs (Franchomme et al., 1990 ; Mailhebiau, 1994) se basent sur la composition des huiles essentielles et les toxicits relatives des familles biochimiques auxquelles elles appartiennent. Certaines huiles essentielles se rvlent cytotoxique selon la phase dans laquelle elles sont mises en contact (la toxicit du thym est augmente par contact en phase liquide et rduite en phase gazeuse, alors que cest linverse pour la lavande (Inouye, 2003). 8. Activits biologiques des huiles essentielles Les huiles essentielles sont connues pour tre doues de proprits antiseptiques et antimicrobiennes. Beaucoup d'entre elles, ont des proprits antitoxiques, antivenimeuses, antivirales, anti-oxydantes, et antiparasitaires. Plus rcemment, on leur reconnat galement des proprits anticancreuses (Valnet, 2005). L'activit biologique d'une huile essentielle est mettre en relation avec sa composition chimique et les possibles effets synergiques entre ses composants. Sa valeur tient son totum ; c'est--dire, l'intgralit de ses constituants et non seulement ses composs majoritaires (Lahlou, 2004).
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Chapitre III : Les huiles essentielles 8.1 Activit antioxydante
Le pouvoir antioxydant de ces huiles est dvelopp comme substitut dans la conservation alimentaire. Ce sont surtout les phnols et les polyphnols qui sont responsables de ce pouvoir (Richard, 1992). Lorsque lon parle dactivit antioxydante, on distingue deux sortes selon le niveau de leur action : une activit primaire et une activit prventive (indirecte). Les composs qui ont une activit primaire sont interrompus dans la chane autocatalytique de loxydation (Multon, 2002). En revanche, les composs qui ont une activit prventive sont capables de retarder loxydation par des mcanismes indirects tels que la complexation des ions mtalliques ou la rduction doxygne etc (Madhavi et al., 1996). Des tudes de lquipe constituant le Laboratoire de Recherche en Sciences Appliques lAlimentation (RESALA) de lINRS-IAF, ont montr que lincorporation des huiles essentielles directement dans les aliments (viandes haches, lgumes hachs, pures de fruit, yaourts) o lapplication par vaporisation en surface de laliment (pice de viande, charcuterie, poulet, fruits et lgumes entiers) contribuent prserver laliment des phnomnes doxydation (Caillet et Lacroix, 2007).
8.2 Activit antibactrienne Du fait de la variabilit des quantits et des profils des composants des HES, il est probable que leur activit antimicrobienne ne soit pas attribuable un mcanisme unique, mais plusieurs sites daction au niveau cellulaire (Carson et al., 2002). De faon gnrale, il a t observ une diversit dactions toxiques des HES sur les bactries comme la perturbation de la membrane cytoplasmique, la perturbation de la force motrice de proton, fuite d'lectron et la coagulation du contenu protique des cellules (Davidson, 1997). Le mode daction des HES dpend en premier lieu du type et des caractristiques des composants actifs, en particulier leur proprit hydrophobe qui leur permet de pntrer dans la double couche phospholipidique de la membrane de la cellule bactrienne. Cela peut induire un changement de conformation de la membrane (Cox et al., 2000; Carson et al., 2002). Une inhibition de la dcarboxylation des acides amins chez Enterobacter aerogenes a aussi t rapporte (Wendakoon et Sakaguchi, 1995). Les HES peuvent aussi inhiber la synthse de DNA, ARN, des protines et des polysaccharides (Cox et al., 1991).
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Nanmoins, certains composs phnoliques de bas poids molculaire comme le thymol et le carvacrol peuvent adhrer ces bactries par fixation aux protines et aux lipopolysaccharides paritales grce leurs groupes fonctionnels et atteindre ainsi la membrane intrieure plus vulnrable (Dorman et Deans, 2000).
8.3 Activit antifongique Dans le domaine phytosanitaire et agro alimentaire, les huiles essentielles ou leurs composs actifs pourraient galement tre employs comme agents de protection contre les champignons phytopathognes et les microorganismes envahissant la denre alimentaire (LisBalchin, 2002). Les huiles essentielles les plus tudies dans la littrature pour leurs proprits antifongiques appartiennent la famille des Labiatae : thym, origan, lavande, menthe, romarin, sauge, etc... Etant donne la grande complexit de la composition chmotypique des huiles essentielles, malgr de possibles synergies certains auteurs prfrent tudier leffet dun compos isol pour pouvoir ensuite le comparer lactivit globale de lhuile. Ainsi lactivit fongistatique des composs aromatiques semble tre lie la prsence de certaines fonctions chimiques (Voukou et al., 1988). Ils concluent que les phnols (eugnol, chavicol 4-allyl-2-6dimthoxyphnol) sont plus antifongiques et que les aldhydes tests (cinnamique et hydro cinnamique). Ils prsentent galement des proprits fongistatiques trs marques. Les groupements mthoxy, linverse, ne semblent pas apporter ce type de molcules une fongitoxicit significative. Cette activit est estime selon la dure dinhibition de la croissance dtermine par simple observation macroscopique. Lactivit antifongique dcrot selon le type de fonction chimique : PhnolsAlcoolsAldhydesCtonesEthersHydrocarbures Parmi les aldhydes aliphatiques, le cinnamaldhyde sest rvl le plus actif. En ce qui concerne les composs phnoliques, lactivit antifongique augmente avec lencombrement strique de la molcule (p-n-propylphnol thymol isoeugnol eugnol) (Ultree et al., 2002). Laddition de groupements alkyls au noyau benzne du phnol augmente le caractre antifongique. Par consquent, un certain degr dhydrophobicit des composs phnoliques ou aldhydes aromatiques parait donc requis pour exprimer une caractristique antifongique optimale. Lactivit des terpnes des huiles essentielles est en corrlation avec leur fonction chimique. Les travaux de Chao et al. (2000), ont montr limportance de la spcification du genre et de lespce, ainsi que de la varit de la plante do provient lextrait.
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9. Mthodes dextraction et didentification des composs des huiles essentielles 9.1 Mthodes dextraction Le procd dobtention des HE intervient dune faon dterminante sur sa composition chimique (Garnero, 1977). Diffrentes mthodes sont mises en uvre pour lextraction des essences vgtales, cette diversit est due la varit des matires premires et la sensibilit considrable de certains de leurs constituants. 9.1.1 Extraction par entranement la vapeur deau Dans ce systme dextraction, le matriel vgtal est soumis laction dun courant de vapeur sans macration pralable. Les vapeurs satures en composs volatils sont condenses puis dcantes. Linjection de vapeur se fait la base de lalambic (Richard et Peyron, 1992). 9.1.2 Extraction par hydro distillation dhuile essentielle Ce mode dextraction a t propos par Garnier en 1891, cest la mthode la plus utilise pour extraire les HE et pouvoir les sparer ltat pur mais aussi de fournir de meilleurs rendements. Le principe consiste immerger directement la matire vgtale traiter dans un ballon rempli deau qui est ensuite port bullition, les vapeurs htrognes vont se condenser sur une surface froide et lHE sera alors spare par diffrence de densit (Bruneton, 1993). . 9.1.3 Expression froid Lexpression froid est rserve lextraction des composs volatils dans les pricarpes. Il sagit dun traitement mcanique qui consiste dchirer les pricarpes riches en cellules scrtrices (Basil et al., 1998).
9.1.4 Extraction par solvants organiques Lextraction par solvant organique volatil reste la mthode la plus pratique. Les solvants les plus utiliss lheure actuelle sont lhexane, le cyclohexane, lthanol moins frquemment le dichloromthane et lactone (Legrand, 1993 ; Dapkevicius et al., 1998 ; Kim et Lee, 2002). En fonction de la technique et du solvant utilis, on obtient (AFNOR, 2000) : Des hydrolysats : extraction par solvant en prsence deau Des alcoolats : extraction avec de lthanol dilu
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Des teintures ou solutions non concentres obtenues partir de matires premires traites par lthanol ou des mlanges thanol/eau. De rsinodes ou extraits thanoliques concentrs Lemploi restrictif de lextraction par solvants organiques volatils se justifie par son cot, les problmes de scurit et de toxicit, ainsi que la rglementation lie la protection de lenvironnement (Lagunez Rivera, 2006). 9.1.5 Extraction par fluide ltat supercritique Lextraction par gaz liqufi ou par fluide ltat supercritique met en uvre gnralement le dioxyde de carbone (Aghel et al., 2004). Dautres travaux de recherche de Luque de Castro et Jimnez (1998) ; Gmiz-Gracia et Luque de Castro (2000) ; Ozel et al.(2003) ; Deng et al. (2005) montrent lutilisation de leau dans son tat supercritique. Dans ce systme, le solvant est utilis en boucle par interposition dchangeurs de chaleur, dun compresseur et dun dtendeur afin de porter le solvant ltat dsir chaque stade du processus. La sparation de lextrait a lieu en phase gazeuse par simple dtente. Lavantage de cette mthode est la possibilit dliminer et de recycler le solvant par simple compression dtente. De plus, les tempratures dextraction son basses dans le cas de dioxyde de carbone et non agressives pour les constituants les plus fragiles. A ces diffrents avantages sajoutent ceux de linnocuit, dinertie et dininflammabilit de CO2 (Lagunez Rivera, 2006). Le frein du dveloppement de cette technologie est le cot lev des appareillages li lapplication de pressions de plusieurs centaines de bars (Lagunez Rivera, 2006). 9.2 Mthodes didentification des composs des huiles essentielles Selon la Pharmacope Franaise et Europenne, le contrle des huiles essentielles seffectue par diffrents essais, comme la miscibilit lthanol et certaines mesures physiques : indice de rfraction, pouvoir rotatoire et densit relative. La couleur et lodeur sont aussi des paramtres importants (Pibiri, 2006). La meilleure carte didentit quantitative et qualitative dune huile essentielle reste cependant le profil chromatographique en phase gazeuse. Il permet de connaitre trs exactement la composition chimique.
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Chapitre III : Les huiles essentielles 9.2.1 Chromatographie en phase gazeuse(CPG)
La CPG sest montre une mthode approprie pour la sparation et lidentification des composants dune HE, elle ralise la fois une analyse qualitative et quantitative (Paris et Godon, 1979). Lchantillon est vaporis et inject en tte de colonne. Llution est assure par un flux de gaz inerte qui sert de phase mobile. La CPG est base sur le partage de produit analys entre une phase gazeuse mobile est une phase (liquide ou solide) immobilise sur la surface dun support inerte (Skoog et al., 2003).
Les constituants des mlanges appels gnralement soluts sont ingalement retenus par la phase stationnaire lors du transit dans la colonne. De ce phnomne appel rtention , les soluts injects se dplacent avec une vitesse ingale entre eux et infrieure celle de la phase mobile, ceci les conduit sortir de la colonne les uns aprs les autres. On enregistre dabord un signal dit ligne de base en prsence du gaz vecteur seul, puis un pic au passage de chaque solut spar (Tranchant ,1995).
9.2.2 Le couplage Chromatographie phase gazeuse/Spectromtrie de masse (CPG/SM) Dans le secteur particulier des huiles essentielles, le couplage CPG/SM est, aujourdhui, la technique de rfrence (Longevialle, 1981 ; Constantin, 1996). Lorsquon soumet un compos molculaire cette analyse, on dclenche un processus plusieurs tages (Pradeau et Cohen, 1992). Ionisation : les molcules prsentes dans lchantillon se volatilisent sous leffet du vide et de la haute temprature (200C), il en rsulte un mlange dions issus de la fragmentation de lchantillion de dpart ; Acclration : Les ions forms se dirigent vers le dispositif de sparation sous leffet dun champ magntique augmentant ainsi leurs nergies cintiques. Sparation : Les ions seront distribus suivant leur rapport masse/charge ; Dtection : aprs sparation, les ions sont recueillis par un dtecteur sensible aux charges lectriques transportes ; Traitement du signal : le signal de sortie de lappareil conduit au spectre de masse qui constitue la reprsentation conventionnelle de labondance des ions en fonction de leurs rapports : masse/charge.
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Lappareillage CPG/SM permet de fournir un chromatogramme accompagn dun ensemble de spectres de masse correspondants chaque pic chromatographique, ce qui permet lidentification prcise de la majorit des constituants spars par la CPG.
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Partie II : Partie pratique
Matriel et mthodes
Matriel et mthodes 1. Matriel et mthodes 1.1 Matriel vgtal Lhuile essentielle tudie est extraite partir des fleurs sches de Lavandula officinalis (la lavande). 1.1.1 Description de la plante La lavande est un arbrisseau buissonnant pouvant atteindre 1 m de hauteur. Les feuilles, linaires et de couleur gris vert, ont une longueur variant entre 3 et 5 cm. Lors de la floraison, la plante dveloppe de longs pdoncules non ramifis termins par des pis dont la couleur varie du mauve ple au violet (Lis-Bachlin, 2002). Selon Quezel et Santana (1963), la classification de cette plante est la suivante : Rgne Sous rgne Embranchement Sous embranchement Classe Sous classe Ordre Famille Genre Espce Plantes plantes vasculaires Spermaphytes Angiospermes Dicotyldones Dialyptales Lamiales (Labiales) Lamiacees Lavandula Lavandula officinalis 1.1.1. Collecte Les fleurs de Lavandula officinalis ont t rcoltes de lInstitut de la Nutrition, de lAlimentation et des Technologies Agro-alimentaires (INATAA), Universit de Constantine, situ au septime Kilomtre du centre ville. La rcolte tait entreprise manuellement au mois de juin 2009 durant laquelle la plante tait en pleine floraison. 1.1.2. Dtermination de lhumidit Le taux dhumidit est la quantit deau contenue dans la matire vgtale. Le contenu en humidit des plantes a t dtermin par le procd de schage ltuve 105C 5C (Twidwell et al., 2002). Le taux dhumidit est exprim en pourcentage et calcul par la formule suivante :
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Matriel et mthodes
H (%) = (M1 M2)/ M1 x 100
H % = taux dhumidit exprim en pourcentage. M1= Poids de lchantillon en gramme aprs la rcolte (plante frache). M2 = poids de lchantillon en gramme aprs le schage (plante sche).
1.1.4 Schage et conservation Les fleurs, frachement rcoltes, sont sches lombre dans un endroit sec et ar pendant environ 10 jours. Devenues sches, elles sont rcupres dans des sacs propres pour servir ultrieurement lextraction de lhuile essentielle. 1.2. Mthodes danalyse 1.2.1. Extraction de lhuile essentielle 1.2.1.1.Description du dispositif dextraction Lappareil utilis pour lhydrodistillation est de type Clevenger, il est constitu dun chauffe ballon qui permet la distribution homogne de la chaleur dans le ballon, un ballon en verre pyrex o lon place les fleurs sches et leau distille, une colonne de condensation de la vapeur (rfrigrant) qui vient de lchauffement du ballon, un collecteur (erlen) en verre pyrex galement qui reoit les extraits de la distillation (figure 2 ).
Figure 2 : dispositif de lhydro distillation
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Matriel et mthodes
1.2.1.2 Procd dextraction 10 g des fleurs sches sont mises dans un ballon fond rond de 250 ml, additionnes de 100ml deau distille. Lensemble est port bullition pendant environ 2 heures. Lhuile essentielle est alors entraine par la vapeur deau. Elle est ensuite condense en passant par le condensateur. Le liquide recueilli rsulte en un distillat avec une couche dhuile mince la surface qui sera par la suite spare, aprs repos du liquide. Lhuile essentielle obtenue est garde au rfrigrateur 4 C et lobscurit. 1.2.1.3 Dtermination de la cintique et du rendement dextraction Pour tudier la cintique dextraction de lhuile essentielle des fleurs de Lavandula officinalis ltat sec, nous avons rcupr des quantits de lhuile essentielle correspondantes des intervalles de temps de 10 mn qui stalent de 0 90 minutes. Les quantits des huiles essentielles obtenues vont tre exploites dans le but de calculer le rendement chaque intervalle de temps. Selon la norme AFNOR (1986), le rendement en huile essentielle (RHE) est dfini comme tant le rapport entre la masse dhuile essentielle obtenue aprs lextraction (M') et la masse de la matire vgtale utilise (M). Le rendement est exprim en pourcentage, et il est donn par la formule suivante :
RHE (%) = M/M x 100
RHE : rendement en huile essentielle des fleurs sches ; M' : masse dhuile essentielle en gramme partir des fleurs sches ; M : masse de la matire vgtale sche utilise en gramme et qui vaut 10 g. 1.2.1.4 Conservation de lhuile essentielle obtenue La conservation des huiles essentielles exige certaines prcautions indispensables. C'est pour cela nous les avons conserves une temprature voisine de 4 C, dans un flacon en verre brun ferm hermtiquement pour la prserver de l'air et de la lumire.
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Matriel et mthodes 2. Dtermination de la composition chimique de lhuile essentielle par
chromatographie en phase gazeuse Ltude analytique de lhuile essentielle de Lavandula officinalis a t ralise au complexe GL1/K dpartement ADM/Soc service Laboratoire, Skikda par chromatographie en phase gazeuse type VARIAN CHROMPACK-CP 3800 par injection de 0.2l dextrait laide dune micro-seringue. Le mode dinjection (Split) doit tre rapide pour viter les largissements des pics. Le gaz vecteur est lhlium (He) dun dbit de 0.3ml/min ; La colonne utilise est une colonne capillaire de type CP-Chirasil-Dex CB fusedsilica WCOT, de 25m de longueur et de 0.25mm de diamtre intrieur. Epaisseur de la phase stationnaire : 0.25m ; La programmation de la temprature de la colonne est comme suit : la temprature initiale dinjection est de 70C pendant 2.50mn, puis slve par palier de 15C/mn 240C pendant 20mn ; Le dtecteur utilis pour cette analyse est de type FID, temprature 250 C. Lappareil est pilot par un ordinateur menu dun logiciel appropri pour ce genre danalyse et dune banque de donnes NIST qui permet lidentification des composs .Le temps de sortie de chaque pic, le temps de rtention , caractrise qualitativement la substance concerne. Laire limite par ces pics permet de mesurer la concentration de chaque compos spar. 3. Evaluation de lactivit antioxydante Lactivit antioxydante in vitro a t value par la mesure du pouvoir de pigeage du radical DPPH*. Le pouvoir antioxydant de lhuile essentielle teste a t estim par comparaison avec un antioxydant naturel (-tocophrol). Tous les tests ont t raliss avec 3 rptitions pour chaque concentration. 3.1 Mesure du pouvoir de pigeage du radical DPPH * 3.1.1 Principe La capacit de donation des lectrons par les huiles essentielles est mise en vidence par une mthode spectrophotomtrique, en suivant la disparition de la couleur violette dune solution mthanolique contenant le radical libre DPPH+ (1,1-Diphenyl-2-picryhydrazyl) (Burits et Bucar, 2000).
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Matriel et mthodes 3.1.2 Mode opratoire Le test de DPPH est ralis en suivant la mthode dcrite par Burits et Bucar, (2000) ;o 50l de chacune des solutions mthanoliques des HE testes diffrentes
concentrations (200g/ml, 400 g/ml, 600 g/ml, 800 g/ml et 1000g/ml) sont mlanges avec 5ml dune solution mthanolique de DPPH(0.004%). Aprs une priode dincubation de 30minutes la temprature de laboratoire, labsorbance est lue 517nm. L'inhibition du radical libre DPPH par la vitamine E a t galement analyse la mme concentration pour la comparaison. On dtermine la cintique de la raction et les paramtres de calcul de lactivit antioxydante pour la vitamine E et lhuile essentielle. 3.2 Dtermination du pourcentage dinhibition Selon Sharififar et al., (2007), linhibition du radical libre de DPPH en pourcentage (I%) est calcule de la manire suivante :
I% = (A blanc A chantillon) x100/A blanc
A blanc : Absorbance du blanc (DPPH dans le mthanol) ; A chantillon : Absorbance du compos d'essai. Tous les essais ont t effectus en triple La cintique des ractions de lhuile essentielle et de la vitamine E avec le DPPH a t inscrite chaque concentration examine. Les concentrations en huile essentielle et en vitamine E, en fonction des pourcentages du DPPH inhibs, ont t traces la fin de la raction afin d'obtenir l'index IC50. Ce paramtre est dfini comme la concentration d'antioxydant requise pour diminuer la concentration du DPPH initiale de 50% (Sharififar et al., 2007). 3.3 Dtermination du temps dquilibre TEC50 Le paramtre TEC50 est dfini comme le temps atteint l'quilibre avec une concentration d'antioxydant gale IC50. Ce temps est (Sharififar et al., 2007). dtermin graphiquement
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Matriel et mthodes 3.4 Dtermination de lefficacit antiradicalaire EA Les deux facteurs IC50 et TE50 peuvent tre combins afin dobtenir le paramtre d'efficacit anti-radicalaire. EA = 1/IC50 TEC50 ml/g x mn
4. Recherche et identification des moisissures des lgumes secs 4.1 Prsentation des chantillons Les lgumes secs utilises pour cette tude sont : Les haricots (Phaseolus vulgaris), Les Pois chiches (Cicer arietinum), Les Fves (Vicia faba) Les Pois secs (Pisum sativum). Ces lgumes secs sont vendus au march de Skikda, sans emballage adquat dans des sacs de 25 kg, stocks temprature ambiante. Les prlvements ont t raliss le 15/05/2010, 2kg de chaque type de lgumineuse sont pris au hasard et sont mis dans un sachet propre et amens au laboratoire pour tre analyss.
4.2 Triage des grains Pour chaque chantillon, une sparation pralable des grains supposs contamins et des grains supposs sains a t ralise. La sparation seffectue en se basant sur les critres suivants : Couleur des grains ; Volumes et tailles des grains ; Formes des grains ; Etat des grains (cicatrice, blessure).
Tout changement de taille, de couleur, ou daspect gnral de la graine permet de suspecter la contamination de cette dernire (Botton et al., 1990). 4.3. Mesure de lhumidit des grains Lhumidit est dtermine par schage des lgumes secs broys une temprature de 110C jusqu un poids constant (Franois ,2004). Le taux dhumidit est exprim en pourcentage et calcul par la formule suivante :
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Matriel et mthodes
H (%) = (M1 M2)/ M1 x 100
H (%) = taux dhumidit exprim en pourcentage. M1= Poids de lchantillon en gramme avant schage. M2 = poids de lchantillon en gramme aprs le schage. 4.4. Dnombrement des moisissures Cinq graines ont t alatoirement choisies, plaques (une graine au centre et une dans chaque quart de cercle) dans des botes de Ptri contenant l'agar de dextrose de pomme de terre (PDA) et incubes 28C pendant sept jours. Cinq rpliques ont t faites par
chantillon. L'identification de diffrentes espces des myctes a t faite selon Pitt et Hocking (1999) et Houssou et al. (2009).
4.4.1. Observation et repiquage des mycliums Des observations quotidiennes sont effectues ds la germination des graines et apparition des mycliums. Ces derniers sont repiqus sur milieu PDA (Botton et al., 1990 ; Guiraud, 1998).
4.4.2. Purification La purification des souches est effectue par prlvement dun hyphe terminal aprs culture en boite de Ptri sur un milieu neuf. La souche est ensemence au centre de la boite. Le prlvement a lieu lorsque le dveloppement de la souche est suffisant. Ltude approfondie dune souche est effectue partir dune culture issue dune seule spore (Guiraud, 1998).
4.4.3. Identification Lidentification des moisissures est ralise par examen de la culture sur milieux solides en boite de Ptri. Lexamen est effectu lil nu, la loupe et au microscope. Il est relativement facile didentifier le genre mais il est beaucoup plus dlicat de dterminer avec certitude lespce (Guiraud, 1998).
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Matriel et mthodes 4.4.4. Etude des caractres macroscopique Les caractres culturaux sont tudis par prfrence sur un milieu PDA car les milieux trop riches en sucre et en peptone entranent des phnomnes de plomorphisme, les colonies peuvent perdre leur aspect caractristique et ne pas sporuler (Guiraud, 1998). Les caractres culturaux ainsi tudis sont : Vitesse de croissance ; Couleur des colonies et variation des couleurs en fonction du temps ; Structure du thalle ; Couleur de lenvers des colonies ; Couleur et changement de couleur du milieu ; Prsence de gouttes de transpiration sur le myclium arien (exsudat) ; Odeurs. 4.4.5 Etude des caractres microscopiques et de la sexualit La dtermination des moisissures fait appel aux caractres morphologiques. Elle ncessite le montage de prparations microscopiques, parfois une coloration du matriel examiner et des mesures micromtriques sont ncessaires (Botton et al., 1990, Guiraud,1998). Lexamen microscopique permet dtudier les caractres suivants : Hyphes cloisonns ou non ; Myclium diffus, pais, color, incolore ; Prsence et type de spores sexuelles : oospore, zygospore, ascospores et basidiospores ; Prsence de spores asexues : type et apparence ; Agencement des conidiophores et sporangiophores ; Lexamen microscopique seffectue sur des prparations ltat frais, aprs fixation au lactophnol et aprs coloration diffrents grossissements(x10, x40 et x100 pour ltude des spores) (Guiraud, 1998 ; Smith, 2002).
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Matriel et mthodes Montage sans coloration La mthode utilise est celle de Moreau (1991), Sur une lame porte objet est dpose une goutte deau sur laquelle on y place dlicatement un fragment de thalle observer, que lon recouvre dune lamelle pour tre observ au microscope. Pour claircir les prparations, un meilleur milieu de montage est utilis cest le lactophnol dAMANN dont la composition est la suivante : Phnol pur cristallis..20g Acide lactique20g Glycrine40g Eau distille.20ml A conserver en flacon color labri de la lumire. Montage avec coloration La mthode utilise est celle de Guiraud (1998). Le colorant utilis est le bleu de mthyle (bleu coton C4B poirier qualifi de meilleur colorant pour les champignons). Il est utilis en mlange avec un autre milieu de montage, le lactophnol 0.5%.
4.4.6. Conservation des souches Les souches isoles sont conserves en tube sur glose incline. Aprs repiquage, les cultures sont maintenues pendant une semaine 30C puis stockes 4C pour favoriser la viabilit et limiter les possibilits de variations, ou par conglation en prsence de substances cryoprotectrices telles que le glycrol (Bouchet et al., 1999). 5. Evaluation de lactivit antifongique de lhuile essentielle de Lavandula officinalis Lvaluation de lactivit antifongique de lHE tudie sur des souches tests et des souches isoles des lgumes secs, a t apprcie selon la mthode de Moulari (2005).
5.1 Utilisation de souches tests 5.1.1 Choix et origine des souches tests Lactivit antifongique de lHE tudie a t teste sur quatre souches pures issues de Laboratoire de Gnie Microbiologique et Applications de la Facult des Sciences de la nature, Universit Mentouri, Constantine. Les souches sont :
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Matriel et mthodes Aspergillus niger CIP 1431; Aspergillus fumigatus CIP 1082.74; Trichoderma ruburum CIP 2043.92; Fusarium oxypouim CIP 625.72. Ces souches ont t choisies parce quelles figurent parmi les genres les plus
contaminants des lgumes secs et principaux producteurs de mycotoxines. 5.2. Test antifongique Lactivit antifongique a t value par la mthode de dilution en milieu solide pour dterminer les taux dinhibition et en milieu liquide pour dterminer les CMI, CMF et CFS (Baba-Moussa, 1999 ; Ngono Ngane, 1999 ; Batawila, 2002 ; Moulari, 2005 ). 5.2.1 Prparation des solutions de lhuile essentielle En se basant sur des essais pralables, une gamme de solutions de concentration allant de 250 g/ml 4000 g/ml a t prpare par lajout de 2500 40000 g de lhuile essentielle dans 10ml de solvant constitu de 50% deau et 50% dthanol (pour viter des gnes de prcipits lors de la culture sur milieu liquide).
5.2.2. Technique de dilution en milieu solide Cette technique a t applique dans des botes de Ptri de 9mm pour dterminer les taux de croissance et les taux dinhibition. 1000 ml de Sabouraud solide ont t prpars, striliss et conservs. Au dbut de lapplication de cette mthode, ce milieu de Sabouraud solide strilis a t plac dans de leau bouillante puis introduit au bain-Marie pour ramener sa temprature 45 C. Pour tous les tubes contenant 20ml de Sabouraud, 0.5ml de lhuile essentielle est ajout. Chaque tube est homognis instantanment par agitation manuelle puis son contenu est vers dans une bote de Ptri. Le mlange ainsi vers et laiss au repos jusqu refroidissement et solidification. Lensemencement est fait par piqre puis, les botes de Ptri (tmoins et essais) sont mises incuber respectivement pour 7 jours. Quotidiennement, la croissance de filaments sur chaque bote est releve et il est procd, la fin du temps appropri dincubation, une mesure des diamtres de diffrentes colonies de champignons filamenteux pour calculer le taux dinhibition (I%) (Kordali et al., 2003)
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Matriel et mthodes Pour cette mthode, la technique consiste mesurer les diamtres des diffrentes colonies de champignons aprs le temps dincubation requis puis rsoudre lquation : I(%) =100 x (dC-dE)/dC
I(%) = Taux dinhibition exprim en pourcentage dC = Diamtre de colonies dans les botes tmoins positifs dE = Diamtre de colonies dans les botes contenant lextrait de plante Lhuile essentielle est dite : trs active lorsquelle possde une inhibition comprise entre 75 et 100 % ; la souche fongique est dite trs sensible ; active lorsquelle possde une inhibition comprise entre 50 et 75 % ; la souche fongique est dite sensible ; moyennement active lorsquelle possde une inhibition comprise entre 25 et 50% ; la souche est dite limite ; Peu ou pas active lorsquelle possde une inhibition comprise entre 0 et 25% ; la souche est dite peu sensible ou rsistante. A lissue de cette tude prliminaire, toutes concentrations ayant prsentes un pourcentage dinhibition > 50% sur une souche fongique sont slectionnes pour la dtermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) par la mthode de dilution en milieu liquide (Alcamo, 1984 ;Rotimi et al., 1988 ). De mme, on peut valuer lefficacit de lHE sur une ou des souche(s) donne(s) en exprimant la proportion de celles ayant prsentes un taux dinhibition suprieur ou gal 50%.
5.2.3 Technique de dilution en milieu liquide Cette technique comporte deux tapes : la premire permettant de dterminer les CMI et la seconde les CMF et CFS. La technique suivie se fonde sur celles des travaux d Alcamo (1984) et de Rotimi et al. (1988).
5.2.3.1 Dtermination des CMI Pralablement, le Sabouraud liquide est prpar et strilis lautoclave puis conserv dans desflacons de 250ml. Les diverses solutions (250 4000 g/ml) ayant eu des pourcentages dinhibition suprieur 50% sont effectues.
42
Matriel et mthodes Juste avant la manipulation, la suspension de technique se fait dans des tubes essais. Cinq types dessais successifs sont raliss : -Essai 1 : 100 l dhuile essentielle dans 900 l du milieu Sabouraud liquide ; -Essai 2 : souches tester dans 1000 l du milieu Sabouraud liquide (sans lhuile essentielle) ; -Essai 3 : 100 l du solvant (thanol et eau) dans 900 l du milieu Sabouraud liquide ; -Essai 4 : souches tester plus 100l de fongicide chimique (Malotox 50) dans 900l du milieu Sabouraud liquide ; -Essai 5 : 100 l dhuile essentielle avec diffrentes concentrations, la souche spores est prpare. Lapplication de la
tester dans 900 l du milieu Sabouraud liquide. Les tubes ainsi prpars sont incubs 28 C pendant 7 jours. Aprs lincubation, on repre les tubes dans lesquels on ne note aucune croissance de moisissures et on passe la seconde tape de cette technique : la dtermination des CMF et des CFS.
5.2.3.2 Dtermination des CMF et CFS Aprs avoir repr les tubes dans lesquels aucune croissance nest constate, on poursuit lexprimentation dans des nouveaux tubes identifis. Dans chaque tube, on introduit 950l de Sabouraud liquide strile puis 50l dun essai dtermin ayant prsent une inhibition totale. On en fait de mme dans les tubes tmoins. On introduit les subcultures ainsi ralises dans une bote et on passe lincubation comme prcdemment. Les subcultures sont observes chaque jour. Aprs 7 jours, on note les subcultures dans lesquelles il ny a aucune reprise de croissance : on dtermine ainsi les concentrations minimales fongicides (CMF) (Al-Awad, 1993). On note les concentrations des extraits des subcultures pour lesquelles il y a croissance comme tant les concentrations fongistatiques (CFS).
6. Traitement statistique Les moyennes plus ou moins lcart type des trois essais ainsi que les reprsentations graphiques ont t ralises par le logiciel Excel 2007.
43
Rsultats et discussion
Rsultats et discussion 1. Huile essentielle 1.1 Taux dhumidit de la matire vgtale La dtermination de lhumidit des fleurs sches de Lavandula officinalis a rvl un taux gal approximativement la moiti du poids des fleurs fraches. Ce taux correspond environ 52,77% (figure 3). Ce qui signifie que 47.23% reprsente le taux de matire sche ayant servi rellement lextraction des huiles essentielles.
47,23%
52,77%
eau(%) matire sche(%)
Figure 3 : Taux dhumidit de Lavandula officinalis 1.2.Cintique dextraction de lhuile essentielle et rendement en huile essentielle 1.2.1 Cintique dextraction de lhuile essentielle Daprs la formule du RHE(%), nous avons obtenu les rsultats illustrs dans la figure 4.
1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
RH(%)
Temps (minutes)
Figure 4 : Cintique dextraction dhuile de la lavande La cintique dextraction consiste dterminer le rendement en fonction du temps dextraction. Cette tude a pour but de fixer le temps ncessaire pour extraire le maximum dhuile et pour viter les pertes de temps et dnergie. La cintique dextraction de lhuile essentielle des fleurs sches de Lavandula officinalis, indique que le rendement augmente en fonction du temps puis il se stabilise. Ce rendement augmente rapidement puis il tend vers un palier partir de 80mn.
44
1.3 Rendement en huile essentielle On a pu rcuprer une quantit huileuse voisine de 1.360.2%. Bouguerra et Zeghou (2009) ont trouv que les fleurs de Lavandula officinalis collect du mme lieu ont prsent un rendement de 3.41% De mme, les rsultats obtenus par Sidi Boulenouar et Ziane (2003) indiquent que les fleurs sches de la lavande provenant de la rgion d'Ouchba et Zarifet ont donn des teneurs en huile essentielle quivalentes respectivement 0.94% et 0.70%. Ces variations de teneurs peuvent tre dues plusieurs facteurs cits dans la
bibliographie notamment
le degr de maturit des fleurs de Lavandula officinalis,
linteraction avec lenvironnement (type de climat, sol), le moment de la rcolte et la mthode dextraction (Besombes, 2008). 1.4. Principaux composs de lhuile essentielle dtects par la chromatographie en phase gazeuse Lanalyse de lhuile essentielle de Lavandula officinalis par chromatographie en phase gazeuse a permis didentifier 49 composs terpniques cits dans le tableau 2 par ordre dlution.
45
Rsultats et discussion Tableau 2 : Concentration en (%) et temps de rtention des diffrents composs obtenus par analyse chromatographique en phase gazeuse de lhuile essentielle de Lavandula officinalis
Compos Temps de rtention (mn) Tricyclene 3-octanol Camphne Pinne Octen-3-ol Bornyle acetate Myrcene Camphor -phellandrene - 3-carene 1,4-Cineole Limonene 3-octanone o-cymene p-cymene (z)--ocimene (E)--ocimene Hexyl-iso butyrate - Campolenal1 trans sabinene hydrate Perillene -terpinene 1,8-cineole trans-pinocarveol Lavandulyl isobutyrate Isoborneol Carvacrol Cis-chrysantheol Borneol Lavandulol Terpinen-4-ol m- cymen-8-ol p-cymen-8-ol Neoisomenthol - Terpineol Hexyl butyrate Mytenol Cis- carveol Dihydro carveol Isobornyl formate Hexyl-2-methyl butyrate 6.101 13.201 15.711 18.330 19.178 21.882 22.202 22.365 25.337 26.490 28.210 29.990 30.112 30.995 40.114 42.151 43.571 43.622 47.911 48.700 50.160 52.339 53.064 54.129 55.624 57.430 58.008 58.027 59.855 60.235 61.751 63.015 64.899 70.367 73.205 74.496 76.469 78.409 78.917 81.382 81.254 tr 1.7 0.37 0.25 0.41 0.7 0.51 11.25 tr 0.32 0.35 tr 0.65 tr 0.49 0.87 0.75 0.95 tr 0.1 tr 11.20 10.25 0.24 0.35 0.6 0.9 0.49 tr 0.7 0.7 0.6 1.25 0.15 0.5 0.3 0.75 tr tr tr 0.13 (m/m) % Carvone Dihydro linalool acetate Linalool Lavandulyl acetate Linalyl acetate - cis bergamotene Pinne - Cadinene Compos Temps de rtention (mn) 82.354 83.622 86.970 87.950 88.390 89.292 89.997 90.700 tr tr 10.68 0.08 15.26 0.07 0.3 0.02 (m/m)%
46
Figure 5 :Chromatogramme de lHE de Lavandula officinalis obtenu par CPG Daprs ces rsultats, 82.59% des composants de lhuile essentielle de Lavandula officinalis reprsentant la somme des pourcentages des composants obtenus ont t identifis dont 67.29% sont des drivs monoterpniques oxygns et 15.3% sont des hydrocarbures monoterpniques. Il semble que les composants de lhuile essentielle de Lavandula officinalis sont des mono terpnes. Les composants majeurs de cette huile sont :Linalyl actate (15.26 %), Linalool(10.68%), 1,8- cineole(10.25%),-terpinene(11.2%) et camphor(11.25%) . Ces rsultats sont diffrents de ceux obtenus par Kulevanova et al .(2000) qui ont examin la composition chimique des huiles essentielles des fleurs de Lavandula officinalis collectes de la montagne de KOZJAK(MACEDONIA). Ils ont trouv 32 constituants avec une
prdominance de Linalool (25.7%), Linalyl actate (23.2% ) et lavandulyl acetate(12.4%) avec une dominance des composants monotrpniques et et la prsence des hydrocarbures sesqueterpniques et ses drivs oxygns. Verma et al. (2009), ont analys la composition des fleurs de Lavandula officinalis cultives Uttarakand(Inde), ils ont identifis 37 composs monoterpniques : les composs majeurs taient :Linalyl actate(47.56%), linalool(28.06%), lavandulyl actate(4.34%) et terpineol(3.7%). Sun kim et Sun lee(2002) ont compar la composition chimique des huiles essentielles de Lavandula officinalis obtenues par diffrentes mthodes dextraction. Ils ont trouv que le
47
Rsultats et discussion linalyl actate (35.44%) et le linalool(18.70%) sont prdominants dans les huiles essentielles obtenues par distillation la vapeur tandis que leurs valeurs taient respectivement de 2.63 et 4.04% dans le cas dextraction par solvants ; 36.80 et 43.47% dans le cas dextraction par micro-ondes. Daprs ces rsultats, on remarque que la composition chimique de lhuile essentielle de lespce Lavandula officinalis cultive Constantine est diffrente de celle obtenue dans de nombreux travaux sur la mme espce dans les diffrentes rgions dans le monde, avec une prdominance des composs monoterpniques dans la plupart des cas mais des proportions diffrentes. Cette diffrence de composition est due probablement diverses conditions notamment lenvironnement, le gnotype, lorigine gographique, la priode de rcolte, le lieu de schage, la temprature et la dure de schage, les parasites et la mthode dextraction (Svoboda et Hampson, 1999).
1.5Activit antioxydante 1.5.1Cintique de la raction La cintique de rduction du radical libre DPPH obtenue pour chaque concentration de vitamine E et dhuile essentielle est indique dans la figure 6.
0,35
Absorbance 517nm
0,3 0,25 0,2 0,15 200g/ml 400g/ml 600g/ml
0,1
0,05 0 0 5 10 15 Temps(minutes) 20 25 30
800g/ml
1000g/ml
0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 -0,05
Absorbance 517nm
200g/ml 400g/ml 600g/ml 800g/ml 0 5 10 15 Temps(minutes) 20 25 30 1000g/ml
Figure 6 : cintique de rduction du DPPH. : (a) : vitamine E ;(b) : huile essentielle de la lavande
48
Rsultats et discussion Pour les deux composs examins (vitamine E et huile essentielle), la raction est biphase, avec une baisse rapide dans l'absorbance dans les premires minutes, suivies d'une tape plus lente, jusqu' ce que l'quilibre soit atteint (figure 6), alors on distingue deux zones : Zone forte cintique de pigeage du radical observe au bout des cinq premires minutes pour la vitamine E pour toutes les concentrations et au bout des 10 minutes pour la concentration 1000 g/ml. Cette zone est observe au bout des 15premires minutes pour lHE. Zone faible cintique de pigeage du radical DPPH ou zone de tendance vers lquilibre constate aprs les 5 minutes pour toutes les concentrations de la vitamine E, excepte la concentration 1000 g/ml.Pour lhuile essentielle, cette zone est constate aprs les et 15minutes. Lorsquon effectue la raction entre le DPPH et la vitamine E donneuse dhydrogne, on constate que la raction atteint un quilibre au bout dun temps court par rapport lhuile essentielle de Lavandula officinalis . Lactivit antioxydante est tributaire de la mobilit de latome dhydrogne du groupement hydroxyle des composs phnoliques de lhuile essentielle. En prsence dun radical libre DPPH, latome H est transfr sur ce dernier alors transform en une molcule stable DPPH, ceci provoque une diminution de la concentration du radical libre et galement labsorbance au cours du temps de raction jusqu lpuisement de la capacit dantioxydant donneur dhydrogne. 1.5.2 Dtermination du pourcentage dinhibition Les rsultats obtenus lors du test de mesure de pourcentage dinhibition du radical DPPH (1,1- Diphenyl-2-picryhydrazyl) sont enregistrs dans la figure 7.
120 100 80 I(%) 60 40 20 I%vitamine E I%huile essentielle
0
200 400 600 Concentrations(g/ml) 800 1000
Figure 7: Pourcentage dinhibition pour lhuile essentielle et la vitamine E
49
Rsultats et discussion Il semble que le pourcentage dinhibition du radical libre augmente avec laugmentation de la concentration soit pour la vitamine E ou pour lhuile essentielle de la lavande. On remarque que le pourcentage dinhibition du radical libre pour lhuile essentielle est inferieur celui de la vitamine E pour toutes les concentrations utilises. Pour une concentration de 1000g/ml, lhuile essentielle a rvl un pourcentage dinhibition de DPPH de 63.015.26% tandis que la vitamine E est de 90.942.66% 1.5.3. Dtermination dIC50 IC50 est inversement li la capacit antioxydante d'un compos, car il exprime la quantit d'antioxydant requise pour diminuer la concentration du radical libre de 50%. Plus la valeur dIC50 est basse, plus l'activit antioxydante d'un compos est grande, un exemple de calcul est schmatis dans la figure 8.
80 70 60 50 40 30 20 10 0 200 400 y = 6,754x + 29,09 R = 0,984
I(%)
600 Concentrations(g/ml)
800
100 1000
Figure 8: Calcul dIC50 pour lhuile essentielle de la lavande Les valeurs dIC50 pour lhuile essentielle de la lavande et la vitamine E sont indiques dans la figure 9
700 600 IC50(g/ml) 500 400 300 200 100 0 Vitamine E Antioxydants Huile essentielle
. Figure 9: Valeurs dIC50

50
Rsultats et discussion Lhuile essentielle de la lavande pouvait ramener le radical libre stable 2.2 diphenyl-1picrylhydrazyl (DPPH) au diphenylpicrylhydrazine jaune-color avec un IC50 5840.58g/ml montrant une activit antioxydante infrieure celle de la vitamine E. Il semble daprs ces rsultats que la vitamine E est lantioxydant le plus efficace avec un IC50 de 3840.76g/ml par rapport lhuile essentielle tudie. de
1.5.4. Dtermination de TC50 On a choisi l'tat d'quilibre comme priode de mesure o il s'avre que la raction ne progresse pas plus loin. Le temps l'tat d'quilibre dpend de la ractivit des antioxydants et des concentrations utilises. Le paramtre TEC50 est dfini comme le temps atteint l'quilibre avec une concentration d'antioxydant gale IC50. Ce temps est dtermin graphiquement. On constate que la vitamine E ragit d'une faon plus rapide avec DPPH. Le TEC50 pour lHE tudie est de 171mn, alors que la vitamine E a besoin seulement de 80.66 minutes pour diminuer la concentration du radical libre de 50%.
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Vitamine E Antioxydants Huile essentielle
TC50(minutes)
Figure 10: Valeurs de TC50 Pour caractriser lefficacit de ces antioxydants, on calcule lEA (paramtre defficacit antiradicalaire). 1.5.5 Paramtre defficacit antiradicalaire Un nouveau paramtre a t dfini, l'efficacit antioxydante, qui combine les deux paramtres (IC50 et TC50) afin de caractriser facilement le comportement d'une substance en tant qu'antioxydant. Les paramtres de calcul de lactivit antioxydante sont rsums dans le tableau 3.
51
Rsultats et discussion Tableau 3 : Les paramtres de calcul de lactivit antioxydante IC50(g/ml) Vitamine E HE 3840.76 5840.58 TEC50 (mn) 80.66 171 AE(ml/gxmn) 0.320.06 0.10.66
Daprs ces rsultats, il semble que lhuile essentielle de Lavandula officinalis a une activit antioxydante mais elle est moins efficace que celle de la vitamine E (Tableau 3). Il semble aussi que cette activit est lie la prsence des composs phnoliques dans lhuile essentielle. Le rle principal des composs comme rducteurs des radicaux libres est soulign dans plusieurs rapports (Villano et al., 2007). Le camphor qui est un compos majoritaire de notre huile essentielle avec une
concentration de 11.25% possde une forte activit antioxydante (Svoboda et Hampsen, 1999). Ce nest pas uniquement les composs majoritaires des HE qui sont responsables de cette activit antioxydante, mais il peut y avoir aussi dautres composs minoritaires qui peuvent interagir dune faon synergique ou antagoniste pour crer un systme efficace vis--vis des radicaux libres (Lu et Foo, 2001 ; Sing et al., 2006). La prsence de carvacrol mme faible concentration dans lhuile essentielle de Lavandula officinalis (0.9%) peut lactivit de pigeage du radical DPPH. Par ailleurs, Economou et al. (1991) ont trouv une activit antioxydante des huiles expliquer
essentielles des fleurs du genre Lavandula contre la dtrioration oxydante du saindoux.
De mme, Hui et al .(2010) ont analys la capacit antioxydante d'huile essentielle de la lavande sur l'inhibition de la peroxydation d'acide linolique et l'inhibition de la peroxydation d'acide linolique par la vitamine E la mme concentration pour la comparaison. Ils ont constat que l'huile essentielle de la lavande a prsent une activit antioxydante plus forte que la vitamine E contre la peroxydation des lipides. Cependant, ces constatations ne concordent pas avec les rsultats de Wiesenfeld (1999), qui a montr que les extraits des fleurs de la lavande antioxydante. Ces rsultats contradictoires sont dus probablement la diffrence de la composition chimique entre ces huiles essentielles (Lis- Balchin, 2002). collectes de diffrentes rgions ne possdent pas une activit
52
Rsultats et discussion Dans deux autres tudes ralises par Lis-Balchin et Deans (1997) et Lis-Balchin et al. (1998), ils ont prouv quil n'y avait aucune corrlation entre le pourcentage des composants principaux, linalol et linalyl acetate et lactivit antioxydante des huiles essentielles extraites de la lavande. 2. Taux dhumidit et les principaux genres de moisissures dtects dans les chantillons de lgumes secs tudis 2.1 Taux dhumidit des chantillons des lgumes secs Les taux dhumidit des diffrents chantillons des lgumes secs sont indiqus dans le tableau4. Tableau 4 : Taux dhumidit des grains des diffrents chantillons des lgumes secs Echantillon de lgume sec Taux dhumidit (%) La dtermination de lhumidit des chantillons des lgumes secs rvl des taux suprieurs 15%. Ces taux correspondent respectivement 15.590.22%, 16.260.45%, 17.650.56% et 16.280.7% pour les haricots secs, les pois chiches, les petits pois et les fves. Daprs le diagramme de dveloppement des moisissures de Burgers et Burrel (1964) cit in Terrain et Grallet (2003), ces lgumes secs regroupent toutes les conditions pour les quelles les moisissures se multiplient. 15.590.22 16.260.45 17.650.56 16.280.7 Haricots secs Pois chiches Petits pois Fves
2.2 Isolement Malgr lapparence saine des lots des lgumes secs analyss, leurs taux de contamination se sont rvls trs levs. Lisolement des moisissures ralis sur les lots des lgumes secs analyss, nous a permis dobtenir : 9 souches partir des pois chiches : PP1, PP2, PP3, PP4, PP5, PP6, PP7, PP8, PP9 ; 12 souches partir des fves : F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, F10, F11, F12 ; 14 souches partir des petit pois : PC1, PC2, PC3, PC4, PC5, PC6, PC7, PC8, PC9, PC10, PC11, PC12, PC13, PC14 ;
53
Rsultats et discussion 15 souches partir des haricots secs : H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15.
2.3 Identification des genres Lidentification des genres fongiques a t ralise selon les cls de dtermination de Botton et al .(1990), Malloch (1997), Guiraud (1998) et Bouchet et al. (1999). Etude macroscopique Les caractres macroscopiques des diffrentes souches isoles des lgumes secs cultives sur le milieu PDA sont regroups respectivement dans les tableaux : 5, 6, 7, 8. Ces derniers rsument laspect du myclium des souches isoles, la surface et la consistance des colonies, ainsi que la prsence ou labsence de pigments caractristiques de chaque souche. Etude microscopique Au terme de lanalyse mycologique, 5 genres diffrents ont pu tre isols et identifis partir des chantillons des lgumes secs analyss : Les rsultats sont indiqus dans le tableau 9.
54
Rsultats et discussions Tableau 5: Caractres macroscopiques des souches isoles des haricots.
Code des chantillons Hl H2 H3 Myclium arien Noir Blanc Vert Myclium de substrat (le revers de la colonie) Gris Marron vert Aspect de la colonie et sa consistance Granuleuse Cotonneuse plane Surface Plane Concave plane
H4 H5,H6
Vert fonc Vert
Blanc Noir
Velout Granuleuse
Lisse, plane En dme
H7, H8, H9 H10 Hll H12 H13 H14 H15
Noir Blanc Vert olive Vert fonc Vert Blanc Vert fonc
Noir Crme Blanc Noir Jaune Crme Noir
Granuleuse plisse Granuleuse Velout Granuleuse Cotonneuse Velout
Concave Plane Concave Lisse, plane plane Cotonneuse Lisse, plane
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Rsultats et discussions Tableau 6: Caractres macroscopiques des souches isoles des pois chiches .
code des chantillons Myclium arien Myclium de substrat (le revers de la colonne) Aspect de la colonie et sa consistance Surface
PCI PC2 PC3 PC4 PC5 PC6 PC7 PC8 PC9 PC10, PC11, PC12 PC13, PC14
Noir Vert fonc Beige Vert Gris Noir avec un centre blanc Vert olive Blanc tend vers le jaune Vert Crme jaune clair Noir
Noir Blanc Crme Vert Blanc Jaune Blanc Jaune Blanc Crme Noir
Poudreuse Velout Laineuse Granuleuse Laineuse Laineuse Velout Velout Granuleuse Cotonneuse Granuleuse
Concave En dme Plane, lisse Plane Cotonneuse plane Plane Bombe En dme concave Concave
56
Rsultats et discussions Tableau 7: Caractres macroscopiques des souches isols des fves.
Code des chantillons Myclium arien Myclium de substrat (le revers de la colonie) Aspect de la colonie et sa consistance Surface
Fl F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12
Vert olive Vert fonc Noir Blanc Beige Vert fonc Jaune tend vers le vert Blanchtre Blanc Blanc Jaune tend vers le vert Vert fonc
Vert fonc blanc Noir Jaune orange crme Vert fonc Jaune Grise Jaune orange Jaune orange Jaune tend vers le marron Noir
Granuleuse Cotonneuse Laineuse plisse Duveteuse Laineuse Laineuse Duveteuse Duveteuse plane Laineuse Granuleuse
Plane plane Concave plane plane Bombe Plane Plane, lisse Bombe plane Concave Concave
57
Rsultats et discussions Tableau8 : Caractres macroscopiques des souches isoles des petits pois.
Code des chantillons PP1, PP2 PP3 PP 4 PP5 PP6 PP7 PP8 PP9 Myclium arien Vert fonc Vert Noir Vert fonc Blanc Vert olive Noir avec un centre blanc Noir Myclium de substrat (le Aspect de la colonie et sa revers de la colonie) consistance Noir granuleuse plane Jaune Noir Noir Jaune fonc blanc jaune Noir Duveteuse Laineuse Velout Duveteuse Laineuse Laineuse Granuleuse Surface
Plisse et peu cotonneuse aux extrmits En dme En dme au centre et plane aux extrmits En dme Lisse, plane En dme Plane
58
Rsultats et discussions Tableau 9: Caractres microscopiques des souches isoles des lgumes secs
Code de la souche H5 Etude microscopique -Conidiophore sept, noir, lisse, croissance sympodiale ; -Conidies pluricellulaires en chanes brunes irrgulires ; souvent en forme de massue, cloisonnes longitudinalement et transversalement. PC5 Identification du genre Alternara Photox(100)
F12
PP1
H1, H2, H4, H6, H12, H13, H14 -Thalle myclium cloisonn portant de nombreux Aspergillus conidiophores dresss, non ramifis, termins en vsicule ; -Phialides formes directement sur la PP7, PP8, PP9, PP6 vsicule ou sur des mtules ; -Ttes conidiennes unisries ou bisries ; -Masse conidienne rayonnante, les conidies en chanes unicellulaires. PC1, PC6, PC8, PC3, PC7, PC4 F1, F3, F5, F7, F8
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Rsultats et discussions
H3, H7, H8, H10
-Myclium cloisonn ; -Conidiophores isols, ramifis, termins par un pnicille ;
Penicillium
PC9, PC11, PC12, PC13, PC14
-Penicille constitue de phialides branchs directement l'extrmit du
F2, F9, F10, F4
conidiophore.
PP3, PP4, PP5, PP2
H9
-Thalle croissance rapide ; Sporosystophores gnralement trs grands, termins en entonnoir, en bouquet de 26 prsentant la base de rhizodes ;
Rhizopus
PC10
-Columelles brunes, globuleuses ou semi globuleuses.
60
Rsultats et discussions
H11, H15 Mucor
myclium non cloisonn ; PC2 sporocytophore dresse, termin par un sporocyste globuleux ; F6, F11 -collumelles multisphores ; - spores cylindriques.
61
Lchantillon dharicot sec sest rvl contamin par 5 genres de moisissures, le genre Aspergillus domine avec plus de 46.66% des grains contamins. 26.66% par le genre Penicillium puis viennent les genres Mucor, Alternaria et Rhizopus avec respectivement 13.33%, 6.66% et 6.66% de contamination des grains de lchantillon dharicot sec. Cinq genres se sont rvls contaminants de lchantillon de pois chiche. Le genre Aspergillus a contamin 42.85% des grains. Les genres Penicillium, Mucor, Rhizopus et Alternaria ont contamin respectivement 35.71%, 7.14%,7.14% et 7.14% des grains de pois chiche. Lchantillon de petit pois sest rvl contamin par 3 genres diffrents de moisissures. Penicillium et Aspergillus avec un pourcentage de 44.44 % pour chaque genre, ils sont les plus dominants puis vient le genre Alternaria qui a contamin 11.11% des grains de cet chantillon. Lchantillon des fves est contamin par 5 genres. Le genre Aspergillus est le plus
dominant avec plus de 41.33% et Penicillium a contamin 33.33 % des grains de cet chantillon. Les genres Mucor et Alternaria ont contamin respectivement 16.66%, et 8.33% des grains. La figure 11 montre le taux de contamination des grains de chaque genre dans les chantillons analyss.
13,33% 6,66 % 26,66%
6,66%
Alternaria Aspergillus 46,66 %
7,14%
7,14%
7,14%
Alternaria Aspergillus
Penicillium
Rhizopus Mucor
35,71%
42,85%
Penicillium
Rhizopus Mucor
(c)
11,11%
44,44% Alternaria
(d)
16,66% 8,33% Alternaria 33,33% 41,33% Aspergillus Penicillium Mucor
44,44%
Aspergillus
Penicillium
Figure11 : Taux de contamination des lgumes secs : (a) : Haricots ; (b) : Pois chiches ; (c) : Petits pois ; (d) : Fves.
Rsultats et discussion 2.4 Discussion Les lgumes secs sont des denres alimentaires frquemment contamines par les
moisissures. La contamination peut avoir lieu avant la rcolte, au champ, au cours du schage, ou au cours du stockage des grains. Si de trs nombreuses tudes sont disponibles concernant la contamination mycotoxique des grains, les enqutes sur la contamination fongique de ces matires premires sont plus rares. De manire schmatique, elles mettent en vidence une relation entre la flore fongique et les conditions climatiques pendant le dveloppement et/ou le stockage des grains (Tabuc, 2007).
On remarque que les grains des chantillons des lgumes secs tudies contiennent suffisamment deau pour entraner des altrations (chauffement et moisissures). Les genres dominants dans tous les chantillons des lgumes secs sont Aspergillus et Penicillium. Ces deux genres prolifrent principalement pendant le stockage sur des substrats dont lhumidit est assez basse (10 15%) (Pitt et Miscamble, 1995).
Les moisissures appartenant aux genres Aspergillus et Penicillium sont gnralement capables de se dvelopper des Aw voisines de 0,7 25C ; elles peuvent donc se dvelopper dans les aliments pauvres en eau comme les lgumes secs au cours du stockage et les produits dont lactivit hydrique a t rduite (Castegnaro et Pfohl-Leszkowicz, 2002). Par comparaison, les genres de moisissures les plus hydrophiles se multiplient moins activement ou rgressent. Selon Riba et al. (2005), le manque de ventilation coupl une temprature leve, favorise la croissance des champignons dits : xrotolrantes, comme les Aspergillus et Penicillium et cest le cas pour des grains vendus sur le march. Botton et al. (1990) ont soulign quau cours du stockage, se dveloppe une flore
compose de champignons moins cellulolytiques et plus osmophiles, qui provoquent une acidification de substrat ;ce sont essentiellement des Aspergillus et des Penicillium dont lvolution est fonction de la teneur en eau des graines et des interactions spcifiques. Ces genres, en prenant de lextension, liminent peu peu les champignons du champs . Sur les graines trs altres on trouve, au terme de cette volution, des champignons peu cellolulytiques et non osmophiles, appartenant surtout aux Mucorales (Mucor, Rhizopus).
63
Rsultats et discussion Les genres Rhizopus et Mucor tmoignent une conservation en conditions mdiocres des grains. Elles sont alors considres comme appartenant la mycoflore daltration avancs (Bourgeois et Larpent , 1996). Les genres Alternaria et Rhizopus sont des genres hygrophiles, leur existence est due laugmentation de la teneur des grains en eau au moment de la rcolte. Daprs nos rsultats, nous remarquons la prsence de ces genres dans nos chantillons, cela est du aux conditions dfavorables de stockage des grains vendus au march, les lgumes secs sont vendus au march sans emballage adquat expos un environnement chaud et humide. Lhumidit et la temprature leves sont des facteurs favorisant la croissance des moisissures, productrices de mycotoxines. Daprs Bourgeois et Larpent (1996), les Mucorales, les Aspergillus et les Penicillium sont les htes habituels des grains qui se dveloppent gnralement au cours de stockage dfectueux. Tandis que des tudes sur la flore fongique des lgumineuses ont montr que les myctes de stockage des haricots (Phaseolus vulgaris) en Inde a inclus Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Colletotrichum, Fusarium, Penicillium, Rhizoctonia, Stemphylium et Trichoderma (Sud et al., 2005). Les espces de Penicillium et Eurotium taient communes pour les Haricots taiwanais, mais, dans les haricots canadiens, les myctes rpandus taient Alternaria, Fusarium et Rhizoctonia (Tseng et al., 1995). Pour les fves, les myctes les plus rpandues taient Eurotium rubrum, Eurotium
amstelodami, Aspergillus flavus, A. niger, Fusarium, Rhizopus, Mucor et Cladosporium (Bhat et al., 2007).
Selon Ahmad et Singh (1991), les myctes de stockage des pois chiches comportent principalement A. flavus, A. niger, A.ochraceus., Emericella nidulans et espces de Penicillium. Dans les Pois chiches australiens, Sarantinos et al. (1996) ont trouv que les myctes dominantes taient Stemphylium botryosum et Botrytis cinerea, suivies d'A. flavus, Alternaria alternata, Eurotium chevalieri et E. amstelodami. La microflore fongique la plus commune des petit pois est provoque par Botrytis cinerea (Ryall et Lipton, 1979 ; Snowdon, 1991). Les petit pois sont galement susceptibles dtre contamins par Colletotrichum, Ascochyta et Alternaria alternata (Snowdon, 1991). Daprs Riba et al. (2005), la diffrence des pourcentages de contamination des grains par les genres isols peut tre due aux provenances diffrentes des chantillons. Cette diffrence
64
Rsultats et discussion est due lorigine de contamination des grains par ces moisissures, qui apparat difficile prciser (champ, transport, lieu de stockage....). Selon Molini et Pfohl-Leszkowicz (2003), en plus de l'origine qui est mal connue, les spores dissmines par l'air peuvent provenir du champ ou de la poussire prsente dans les infrastructures de stockage. Si les conditions de stockage sont dfavorables, ces moisissures constituent des facteurs de bio dtrioration des lgumes secs affectant la qualit des matires premires, ou la qualit sanitaire par la scrtion des mycotoxines. 3. Activit antifongique de lhuile essentielle de Lavandula officinalis 3.1 Sur les souches tests 3.1.1 Taux dinhibition Les taux dinhibition de lhuile essentielle de Lavandula officinalis sont consigns dans la figure12.
120 100 Taux d'inhibition(%) 80 60 40 20 0 -20 -40 -60 Concentrations de l'huile essentielle (g/ml) 250 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Aspergillus niger Fusarium oxypouim Trichophyton rubrum Aspergillus fumigatus
Figure 12 : Taux dinhibition des extraits vis--vis des quatre souches testes
Les huiles essentielles ont eu des activits variables sur les souches filamenteuses testes. Aspergillus niger et Aspergillus fumigatus sont les moisissures les plus sensibles lhuile essentielle tudie. Concernant Aspergillus niger, lhuile essentielle de Lavandula officinalis a donn des taux dinhibition suprieurs 50% pour des concentrations dhuile essentielle allant de 1000g/ml 4000g/ml dont deux inhibitions totales dans les boites de ptri contenant 3500g/ml et 4000g/ml (Figure 13). Pour Aspergillus fumigatus, les six concentrations ont donn des taux dinhibition
suprieurs 50% (Figure 14). Quant lespce Trichophyton ruburum, elle sest rvle moins sensible lensemble des huiles essentielles essentielle).
65
avec deux cas dabsence dinhibition
(250 et 500g/ml dhuile
Rsultats et discussion Fusarium oxypouim se rvle particulier: les essais ont donn des taux dinhibition ngatifs. Tout se passe comme si lhuile essentielle stimulait la croissance de la souche. Les croissances les plus remarquables par rapport au tmoin sans huile essentielle sont obtenues avec des concentrations de 250, 500et 1000g/ml. Cest partir de 1500 g/ml que lhuile essentielle sest rvle efficace pour linhibition de cette souche.
(c)
(d)
Figure 13 : Taux dinhibition de lhuile essentielle de Lavandula officinalis vis--vis dAspergillus niger :( a) : Tmoin, (b) :2000g/ml, (c) : 2500g/ml, (d) : 3000g/ml
66
(c)
(d)
Figure 14 : Taux dinhibition de lhuile essentielle de Lavandula officinalis vis--vis dAspergillus fumigatus :( a) : Tmoin, (b) :2000g/ml, (c) : 2500g/ml, (d) : 3000g/ml
3.1.2 Concentrations minimales inhibitrices (CMI) Pour tous les essais dont le taux dinhibition est infrieur 50%, les CMI correspondantes sont suprieures 4000 g/ml et nont pas t tudis. Pour les autres cas, la recherche sest accentue sur deux souches (Aspergillus niger et Aspergillus fumigatus) qui ont t inhibs par la majeure partie des huiles essentielles plus de 50%. Les rsultats sont consigns dans le Tableau 10.
Tableau 10: CMI (g/ml) des huiles essentielles en milieu liquide Souches Fongiques Aspergillus niger CMI(g/ml) 1000 Aspergillus fumigatus 3000
Daprs le tableau 10, les CMI obtenues varient en fonction des extraits et de la souche fongique. Elles sont de 1000 et 3000 g/ml respectivement pour Aspergillus fiumigatus.
67
Aspergillus niger et
Rsultats et discussion 3.1.3 Activits fongistatique et fongicide Les activits fongistatiques(CFS) et fongicide(CMF) sont prsentes dans le tableau 11. Tableau 11: Activits fongistatique (CFS) et fongicide (CMF) en g/ml de lhuile essentielle de Lavandula officinalis sur les micromyctes filamenteux. Souches Fongiques Aspergillus niger Aspergillus fumigatus
CFS -
CMF 1000
CFS 3500
CMF 4000
Les subcultures ralises suite lobtention des CMI ont permis dobserver seulement une activit fongicide (CMF) sur Aspergillus niger (avec une concentration de 1000 g/ml). Lhuile essentielle de Lavandula officinalis a prsent, la fois, une activit fongicide et une activit fongistatique sur Aspergillus fumigatus (fongistatique 3500 g/ml et fongicide 4000g/ml). 3.2 Sur les souches isoles des lgumes secs 3.2.1 Taux dinhibition Les taux dinhibition de lhuile essentielle Lavandula officinalis de certaines souches isoles des diffrents lgumes secs sont consigns dans -les figures 15, 16, 17,18 et 19.
68
120 100 Taux d'inhibitions(%) 80 60 40 20 0 -20 -40 -60 Concentrations de l'huile essentielle(g/ml) 250 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Aspergillus Penicillium Alternaria Mucor Rhizopus
120 Taux d'nhibitions(%) 100 80 60 40 20 0 -20 250 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Aspergillus Penicillium Alternaria Mucor Rhizopus
Concentrations de l'huile essentielle (g/ml)
100 Taux d'inhibitions(%) 80 60 40 20 0 -20 250 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Aspergillus Penicillium Alternaria
Concentrations de l'huile essentielle(g/ml) 120 100 Taux d'inhibitions(%) 80 60 40 20 Aspergillus Penicillium Alternaria 250 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Mucor
0
-20 -40 -60 -80 Concentrations de l'huile essentielle(g/ml)
Figure 15 : Taux dinhibition des moisissures isoles des lgumes secs : (a) : Haricots secs ; (b) : Pois chiches ; (c) : Petits pois ; (d) : Fves.
69
(c)
(d)
Figure 16: Taux dinhibition de lhuile essentielle de Lavandula officinalis vis--vis de Penicillium isol des haricots secs :( a) : Tmoin, (b) :2000g/ml, (c) : 2500g/ml, (d) : 3000g/ml
(c)
(d)
Figure 17: Taux dinhibition de lhuile essentielle de Lavandula officinalis vis--vis dAspergillus isol des pois chiches :( a) : Tmoin, (b) :2000g/ml, (c) : 2500g/ml, (d) : 3000g/ml.
70
(c)
(d)
Figure18 : Taux dinhibition de lhuile essentielle de Lavandula officinalis vis--vis de Aspergillus isol des petits pois :( a) : Tmoin, (b) :2000g/ml, (c) : 2500g/ml, (d) : 3000g/ml
(c)
(d)
Figure 19: Taux dinhibition de lhuile essentielle de Lavandula officinalis vis--vis de Penicillium isol des fves :( a) : Tmoin, (b) :2000g/ml, (c) : 2500g/ml, (d) : 3000g/ml.
71
Rsultats et discussion Comme dans le cas des souches tests, lactivit inhibitrice de lhuile essentielle de Lavandula officinalis est trs varie sur les souches isoles des lgumes secs. Pour les haricots, Penicillium sest rvl trs sensible lhuile essentielle. Au total les six taux dinhibition suprieurs ou gaux 50% ont t rvls dans les boites de Ptri contenant des concentrations de lhuile essentielle de : 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 et 4000g/ml. Deux cas dinhibition totale sont observs pour les concentrations de 3500 et 4000g/ml. Avec Aspergillus, lhuile essentielle de Lavandula officinalis a donn des taux dinhibition suprieurs 50% pour des concentrations dhuile essentielle allant de 2500 g/ml 4000g/ml. Le genre le moins sensible est Alternaria sur le quel sont observs les plus faibles taux dinhibition : il semble tre rsistant vis--vis de lhuile essentielle de Lavandula officinalis. Lhuile essentielle de la lavande semble stimuler la croissance des filaments de Mucor, ce qui donne pour ce genre des taux dinhibition ngatifs. Les pois chiches Lhuile essentielle de Lavandula officinalis prsente des taux dinhibition variables sur les souches filamenteuses isoles des pois chiches. Les activits remarquables sont enregistres sur Penicillium et Alternaria. Les inhibitions totales de la croissance de filaments sont obtenues avec des concentrations allant de 3000 4000g/ml pour le genre Penicillium. Le genre Rhizopus est aussi sensible lhuile essentielle pour une concentration de 4000g/ml. Le genre Aspergillus sest rvl moins sensible lensemble des concentrations. Le cas de Mucor se rvle particulier: des croissances remarquables par rapport au tmoin sans huile essentielle sont obtenues avec des concentrations de 250, 500 et 1000g/ml. Les petits pois Les genres Aspergillus et Penicillium ont paru sensibles lhuile essentielle : cinq concentrations ont donn des taux dinhibition suprieurs 50% pour Aspergillus et deux pour Penicillium. Lhuile essentielle na eu aucun effet sur Alternaria pour des concentrations allant de 250 1000 g/ml ; ce dernier est moins sensible la plupart des concentrations testes.
72
Rsultats et discussion Les Fves Lhuile essentielle rvle une activit varie sur les quatre souches filamenteuses isoles des lgumes secs. Des activits nulles sont obtenues sur Alternaria et Mucor pour des concentrations de 1500 2500g/ml pour Alternaria et de 1000 1500 g/ml pour Mucor. Des inhibitions ngatives ont t enregistres pour ces derniers genres pour des concentrations allant de 250 1000g/ml pour Alternaria et 250g/ml jusqu 500 g/ml pour Mucor. Les genres Penicillium et Aspergillus demeurent les genres les plus sensibles dans lensemble des moisissures testes avec inhibition totale de Penicillium la concentration de 4000g/ml.
3.2.2 Concentrations inhibitrices minimales(CMI) Pour les autres cas, la recherche sest accentue sur les genres qui ont t inhibs par la majeure partie des huiles essentielles plus de 50% pour tous les essais dont le taux dinhibition est infrieur 50%. Les CMI correspondantes sont suprieures 4 000g/ml et nont pas t tudies. Les rsultats sont reprsents dans le Tableau12. Tableau 12 : CMI (g/ml) de lhuile essentielle de Lavandula officinalis en milieu liquide
Souches isols des lgumes secs Souches isoles des haricots secs CMI
Aspergillus Penicillium Rhizopus Penicillium
Souches isoles des pois chiches

Alternaria Rhizopus
Souches isoles des petits pois

Aspergillus Penicillium
Souches isoles des fves

Aspergillus Penicillium
(g/ml) 2000 2000 3000 2000 3000 >4000 2000 4000 1500 1000
Daprs le tableau12, les CMI obtenues varient en fonction des genres fongiques et des lgumes secs dont ils proviennent. Elles sont comprises entre 1000 et 4000 g/ml presque pour tous les genres slectionns. Haricots secs Lhuile essentielle a prsent une CMI de 2000 g/ml sur deux genres isols (Aspergillus et Penicillium). Le genre Rhizopus a t inhib 3000g/ml par lhuile essentielle de
Lavandula officinalis.
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Rsultats et discussion Pois chiches Le tableau montre galement que particulirement active lhuile essentielle de Lavandula officinalis est
sur la croissance de deux souches fongiques (Penicillium et
Alternaria ) avec des CMI comprises entre 2000 et 3000 g/ml. Lhuile essentielle de Lavandula officinalis na pas eu dactivit sensible sur Rhizopus ce qui indique sa faible activit (CMI>4000 g/ml) sur cette souche. Petits pois Lhuile essentielle de la lavande sest rvle active sur les deux souches isoles des petits pois avec des CMI de 2000g/ml pour Aspergillus et 4000g/ml pour Penicillium. Fves Les meilleures CMI de lhuile essentielle de Lavandula officinalis sont obtenues avec les souches isoles des fves avec des CMI de 1500g/ml pour Aspergillus et 1000g/ml pour Penicillium.
3.2.3 Activits fongistatique et fongicide Les activits fongistatiques(CFS) et fongicide(CMF) sont prsentes dans le tableau 13. Tableau 13: Activits fongistatique (CFS) et fongicide (CMF) en g/ml de lhuile essentielle de Lavandula officinalis sur les souches isoles.
Souches isols des lgumes secs
Souches isoles des haricots
Souches chiches
isoles
des
pois
Souches isoles des petits pois
Souches isoles des fves
Aspergillus
Penicillium
Rhizopus
Penicillium
Alternaria
Rhizopus
Aspergillus
Penicillium
Aspergillus
Penicillium
CFS (g/ml)
3000
2500
3500
2500
4000
2000
4000
1500
2000
CMF (g/ml)
3000
2000
3500
- : aucune activit
Les subcultures ralises suite lobtention des CMI ont permis dobserver
des
activits varies de lhuile essentielle de Lavandula officinalis sur les souches isoles des lgumes secs :
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Les haricots secs Lhuile essentielle de Lavandula officinalis a rvl des activits fongistatiques sur les souches isoles des haricots secs 3000g/ml pour Aspergillus, 2500g/ml pour Penicillium et 3500g/ml pour Rhizopus. Les pois chiches Lhuile essentielle de Lavandula officinalis est fongistatique 2500g/ml sur Penicillium et 4000g/ml sur Alternaria. Les petits pois Les subcultures ont rvl, la fois, une activit fongicide et fongistatique sur le genre Aspergillus isol des petits pois (CFS=2000g/ml et CMF=3000g/ml) et une activit fongistatique sur Penicillium 4000g/ml. Les fves Lhuile essentielle de la lavande a rvl la fois, une activit fongicide et une activit fongicide et fongistatique sur les souches isoles des fves : Avec Aspergillus on a obtenu des valeurs de CFS=1500 g/ml, CMF=2000 g/ml et des CFS=2000g/ml et CMF=3500 g/ml avec Penicillium.
3.3 Discussion Lvaluation de lactivit par la mthode de dilution en milieu solide a rvl linhibition de croissance des filaments pour la plupart des souches testes. Cela est d lempchement de la germination des conidies par les composs volatils de lhuile de la lavande. La germination des conidies est la premire tape essentielle dans la squence d'oprations menant l'tablissement d'un tube germinatif et d'un hyphe, par la suite. Le processus commence par l'hydratation suivie de laction des enzymes lytiques telles que le chitinase et et - glucanases. Ceci dcompose la paroi cellulaire des conidies paissie pour permettre l'apparition du tube digestif initial. Une fois que cet vnement a lieu, il y a un quilibre entre les systmes lytiques et synthtiques d'enzymes ncessaires pour la prolongation normale des hyphes. Un dsquilibre dans l'un ou l'autre systme d'enzymes mne l'inhibition et/ou lempchement de croissance (McEwan, 1994). Il s'avrerait que ces vnements sont fortement susceptibles la rupture par les composants dhuile volatile de la lavande (Deans,
75
Rsultats et discussion 2002). En dfinitive, lhuile essentielle de la lavande a eu des activits variables sur les souches fongiques testes. La dtermination des CMI de lhuile essentielle sur les souches fongiques par la mthode de dilution en milieu liquide confirme les rsultats obtenus en milieu solide. Cette activit antifongique est due probablement au type et la structure molculaire des composants actifs prsents dans lHE. Ainsi in vitro, une activit antimicrobienne plus leve des terpnes oxygns en comparaison des terpnes hydrocarbures a t observe (Oh et al., 1967; Griffin et al., 1998; Dorman et Deans, 2000; Cox et al., 2000). Lactivit biologique dune huile essentielle est mettre en relation avec sa composition chimique, les groupes fonctionnels des composs majoritaires (alcools, phnols, composs terpniques et ctoniques) et les possibles effets synergiques entre les composants. Ainsi la nature des structures chimiques qui la constituent, mais aussi leurs proportions jouent un rle dterminant. Il est cependant probable que les composs minoritaires agissent de manire synergique. De cette manire, la valeur dune huile essentielle tienne son totum , cest dire dans lintgralit de ses composants et non seulement ses composs majoritaires (Lahlou, 2004). Les molcules rputes actives sont des terpnodes, car les hydrocarbones saturs et les actates ioniques sont inactifs, par la nature mme de leur faible capacit de liaisons hydrogne et de leur faible solubilit (Griffin, 1999 ; Wyllie et al., 1999). Des composs chimiques qui ont une grande efficacit et plus large spectre sont prsents dans lhuile essentielle de Lavandula officinalis , ce qui explique lactivit de cette dernire sur les myctes , phnols (1,8 cinole, carvacrol, octanol, ..) des alcools, (-
terpineol, terpinen-4-ol, linalol),des aldhydes, des ctones (Camphor, etc. ) (Dorman et Deans, 2000). Chu et kemper(2001) ont montr que le pouvoir antifongique est li aux composants volatils dhuile de la lavande et qui sont : l pinne, pinne, P cimne et 1,8 Cinole. Ces composants sont prsents dans lhuile essentielle de Lavandula officinalis prdominance de 1,8 cineole avec une concentration de 13.25%. Le linalool qui est un composant majeur de lhuile essentielle de Lavandula officinalis est connu par son activit antifongique (Svoboda et Hampsen, 1999) Il rsulte alors que leffet antifongique vis--vis des moisissures des lgumes secs montr dans cette tude est d aux composants qui sont dmontrs majoritaires dans lhuile avec la
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Rsultats et discussion esssentielle de camphor (7.10%). Ainsi lactivit fongistatique ou fongicide des composs aromatiques de lhuile Lavandula officinalis : le linalool(26.73%), 1,8 cineole(13.25%) et le
essentielle semble tre lie la prsence de certaines fonctions chimiques. Chaumont et Leger(2001) ont test 12 composs aromatiques vis--vis de huit souches pathognes Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Microsprum canis et Trichophyton spp. Ils concluent que les phnols sont plus antifongiques. Ils prsentent galement des proprits fongistatiques trs marques ce qui explique lactivit fongistatique de lhuile essentielle de Lavandula officinalis sur toutes les souches tests. Daprs Dorman et Deans (2000), quelques composs aromatiques possdent des activits fongistatiques dont certains sont des composants de lhuile essentielle de Lavandula officinalis (le Limonne, pinne et le comphor). Certains composants de lhuile essentielle de Lavandula officinalis sont connus par leurs effets fongicides comme carvacrol, et linalol (Dorman et Deans, 2000), ce qui explique leffet fongicide de cette huile vis--vis le genre Aspergillus isol des petits pois et les genres Aspergillus et Penicillium isols des fves. Un des facteurs intervenant sur lintensit de laction antifongique de lHE est la dose applique : ceci a t gnralement observ in vitro (Do Amaral et al., 1998; Evans et Martin, 2000; Castillejos et al., 2006).Ceci a t vident dans notre tude, on a remarqu que le taux de rduction des moisissures par rapport au tmoin a t augment avec laugmentation des concentrations en huile essentielle de Lavandula officinalis. Un autre paramtre important dterminant lactivit antifongique de lHE est le type des microorganismes cibls. En gnral, les diffrents genres isols des lgumes secs nont pas une sensibilit similaire vis vis lHE. Lactivit de lhuile essentielle de la lavande teste a t remarquable surtout sur les genres Aspergillus et Penicillium isols de tous les lgumes secs alors certaines ont prsent une rsistance cette dernire ou une absence deffet. Certains champignons sont plus rsistants vis--vis de lhuile essentielle de Lavandula officinalis par rapport aux autres. De mme, lhuile essentielle a prsent des effets diffrents sur les souches isoles des lgumes secs, elle est fongistatique pour certains et rvle la fois une activit fongistatique et fongicide pour dautres mme si elles appartiennent aux mmes genres (par exemple une activit la fois fongicide et fongistatique sur les Aspergillus fumigatus et niger ; une activit fongistatique de lhuile essentielle sur les Aspergillus isols des petit pois et enfin une activit la fois fongistatique et fongicide sur les Aspergillus isols des haricots secs ont t constates). Mango et Olsen (2004) ont montr lexistence
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Rsultats et discussion de cette diffrence de sensibilit lhuile entre diffrentes espces appartenant aux mmes genres et entre les diverses structures fongiques du mme genre: spores, sclrotites et fragments mycliens. Sachant que cette activit nest pas gnrale pour tous les types des moisissures isols des lgumes secs, certains dentre eux peuvent mme consommer les terpnes en tant que source de carbone, les dgrader ou les transformer, ce qui peut expliquer linefficacit de certaines de ces molcules vis vis de certains microorganismes (Heyen et Harder, 1995) et cest le cas de Fusarium oxypouim, les genres Mucor isols des haricots secs et des pois chiches et Alternaria et Mucor isols des fves. Labsence dactivit antifongique dune molcule sur un microorganisme peut avoir diffrentes explications. Lune dentre elles est la biodgradation plus ou moins pousse de cette molcule, ce qui a t observ avec plusieurs microorganismes (Heyen et Harder, 1995; Misra et al. , 1996; Foss et al., 1998) et cest le cas dAlternaria isol des petits pois et Alternaria et Mucor isols des fves. Cette diffrence de lactivit antifongique dhuile essentielle de la lavande vis--vis des moisissures t rapporte dans la littrature. Pepeljnjak et al.(2007) ont montr la diffrence de sensibilit entre les diffrents genres lhuile de la lavande. Dans leur tude, lactivit antifongique de lhuile essentielle vis-vis aux diffrentes moisissures est classe comme suit : Penicillium cyclopium>Penicillium puberurum>Penicillium urticae>Penicillium viridicatum>Aspergillus flavus>Penicillium camenberti>Aspergillus clavatus>Penicillium roqueforti>Rhisopus nigricans>Aspergillus niger>Aspergillus nidulans>Aspergillus versicolor>Fusarium oxysporium. Lhuile a rvl une activit fongicide sur touts les genres tests, dans leur tude ils ont trouvs des CMF comprise entre 250 et 1000g/ml. Les rsultats obtenus par Lis-Balchin (2002) ont prouv quAspergillus niger, Aspergillus ochraceus et Fusarium culmorum ont ragi diffremment lhuile de la lavande et que Fusarium culmorum est moins affecte que les deux aspergillus cela est bien vident pour les aspergillus utiliss dans notre exprience qui ont rvl une sensibilit lhuile essentielle de la lavande. Daferera et al. (2000) ont prouv que l'huile de la lavande tait modrment
inhibitrice de la croissance radiale et la germination conidiale de Penicillium digitatum, dans leurs tude ils ont obtenu une CMI de 1000g /ml tandis que lhuile de la lavande a rvl une CMF de 4000g/ml.
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Rsultats et discussion Ces rsultats contradictoires sont dus plusieurs paramtres qui doivent tre considrs quand ces rsultats sont compars avec lactivit de lhuile essentielle extraite des fleurs de Lavandula officinalis cultives Constantine : Le milieu de culture, La source botanique de matire vgtale ou la priode de la moisson (qui pourrait affecter la composition dhuile) ; Les techniques dextraction lespce de la moisissure tant examine (Lis -Balchin, 2002).
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Conclusion
Conclusion Ce travail a t men dans le cadre de ltude de lactivit antioxydante et antifongique de lhuile essentielle extraite des fleurs de Lavandula officinalis et son effet sur la croissance des moisissures des lgumes secs. Les rsultats obtenus indiquent que le taux de matire sche (fleurs de Lavandula Le
officinalis) ayant servi rellement lextraction des huiles essentielles est de 48.23%.
rendement dextraction de lhuile essentielle par hydro distillation est de 1.36 0.2%. La cintique dextraction a montr que la quasi- totalit de lhuile essentielle est extraite au bout des 80 premires minutes. Lanalyse de la composition chimique par CPG a permis didentifier 49 composants mono terpniques dont 67.29% sont des drivs mono terpniques oxygns et 15.3% sont des hydrocarbures mono terpniques. Cinq constituants majoritaires ont t determins : le linalyl actate (15.26%) suivi ensuite par le camphor(11.25%), le terpinene( 11.2%) et le linalol (10.68%). Lhuile essentielle a prsent une activit antioxydante mais moins efficace par comparaison la vitamine E. Les analyses mycologiques effectues sur les chantillons des lgumes secs ont permis disoler 15 souches partir des haricots ; 14 souches partir des pois chiches ; 12 souches partir des fves et 9 souches partir des petits pois. La purification et lidentification des souches isoles ont donn la possibilit didentifier cinq genres de moisissures: Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus et Alternaria ; avec une dominance des genres Aspergillus et Penecillium. Pour la mise en vidence de lactivit antifongique de lhuile essentielle de Lavandula officinalis, il sest avr quelle possde des activits variables vis vis les souches tests et que Aspergillus niger et Aspergillus fumigatus sont les moisissures les plus sensibles. Lhuile essentielle ces deux genres. tudie a prsent une activit fongistatique et fongicide la fois pour La troisime espce teste Trichophyton ruburum sest rvle moins
sensible lensemble des concentrations avec des cas dabsence dinhibition. Pour Fusarium oxypouim les essais ont donn des croissances remarquables par rapport aux tmoins pour des faibles concentrations dhuile essentielle.
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Conclusion Les diffrents genres isols des lgumes secs nont pas une sensibilit similaire vis--vis de lhile essentielle de Lavandula officinalis. Certaines ont montr une sensibilit lhuile essentielle : Aspergillus, Penicillium et Rhizopus isoles des haricots, Alternaria , Penicillium et Rhizopus isoles du pois chiches, Aspergillus et Penicillium isoles des petits pois et des fves. Pour la plupart des genres isols, lhuile essentielle a prsent un effet fongistatique sauf pour les Aspergillus isols des petits pois. Par ailleurs, elle a rvl une activit fongicide et fongistatique la fois chez les Aspergillus et les Penicillium isols des fves. A certaines concentrations de lhuile essentielle, une absence dactivit ou une inhibition ont t enregistres pour les genres Alternaria isols des petits pois et Alternaria et Mucor isols des fves. Cette activit antifongique peut tre attribue la composition chimique de lhuile essentielle. La diffrence de la sensibilit des genres lhuile essentielle peut tre due certains facteurs, savoir la dose applique et lespce cibl. Afin de mieux apprhender les activits de cette huile essentielle sur les lgumes secs, il serait intressant de : -dterminer les fractions les plus actives et ventuellement de caractriser les molcules responsables de ces activits ; -dterminer les espces des souches isoles des lgumes secs ; -Pour une tude beaucoup plus approfondie, on pourra envisager dautres investigations telles que lapplication lhuile essentielle de Lavandula officinalis ou ses vapeurs directement sur les lgumes secs durant le stockage.
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94
Annexes
Annexes Annexe1 :Chromatographie en phase gazeuse

(a) (b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a) :Lappareil utilise pour la chromatographie type
VARIAN CHROMPACK-CP 3800,(b) : un
ordinateur menu dun logiciel Nist,(c) :les bouteilles de gaz vecteurs utilises pour la chromatographie en phase gazeuse,(d) tableau des paramtres de la colonne,(e) La colonne capillaire type CP-Chirasil-Dex CB fused silica WCOT,(f) micro-seringue dinjection.
Annexes Annexe 2 : Diagramme de dveloppement des moisissures (Daprs BURGERS et BURREL 1964 Doc. ARVALIS-Institut du Vgtal et FFCAT)
Annexes Annexe 3 : Composition des milieux Milieu PDA
Extrait de pomme de terre........................................1000ml Glucose......................................................................20g Agar ...........................................................................20g Ce milieu est strilis lautoclave 120 C pendant 15mn. Sabouraud glos
Peptone.......................................................................40g Agar.............................................................................20g Eau distille..................................................................1000ml Ce milieu est strilis lautoclave 120 C pendant 15mn. Sabouraud liquide
Nopeptone.....................................................................10g Glucose............................................................................20g pH=5-5.6 Ce milieu est strilis lautoclave 120 C pendant 15mn.
Annexes Annexe 4 : Isolement des moisissures des lgumes secs
Incubation 28 C pendant 7jours
Rsum Cette tude a pour objectif lvaluation de lactivit antioxydante et antifongique des huiles essentielles de la lavande.Lextraction des huiles essentielles de Lavandula officinalis a t ralise par hydrodistillation. Le rendement en HE augmente en fonction du temps puis se stabilise. Ce rendement est de 1.36 0.2%et tend vers un palier aprs 80 minutes. Lanalyse de lhuile essentielle de Lavandula officinalis par CPG a permis didentifier 49 composs terpniques. Linalyl actate(15.26 %), Linalool(10.68%), 1,8- cineole(10.25%),terpinene(11.2%) et camphor(11.25%) ont t les principaux composants. Ltude du pouvoir antioxydant par la mthode de DPPH a montr lexistence dune activit antioxydante de lhuile essentielle des fleurs sches de Lavandula officinalis .La dtermination de lhumdit des chantillons des lgumes secs a montr que ces grains sont favorables pour le dveloppement des moisissures. La purification et ltude microscopique des souches isoles ont donn la possibilit didentifier 5 genres de moisissures savoir : Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus et Alternaria. Ltude de la contamination montre une dominance des genres Penicillium et Aspergillus Lvaluation de lactivit antifongique a rvl linhibition de croissance des moisissures pour la plupart des souches testes. Les souches tests et les diffrents genres isols des lgumes secs nont pas une sensibilit similaire vis--vis de lHE. Mots cls : Huiles essentielles ; Lavandula officinalis ; Rendement ; CPG ; Activit antioxydante ; Activit antifongique ; Humidit ; Moisissures ; Hydrodistillation Abstract The aim of this study is the evaluation of Antioxydant activity and Antifungal activity of essential oils of lavender. The extraction of essential oils of Lavandula officinalis was carried out by hydrodistillation. The HE yield increases according to time then is stabilized. This yield is of 1.36 0.2% and tends towards a stage after 80 minutes. The analysis of the essential oil of Lavandula officinalis by CPG made it possible to identify 49 terpenic compounds. Linalyl acetate (15.26%), Linalool (10.68%), 1.8 - cineole (10.25%), -terpinene (11.2%) and camphor (11.25%) were the main components. The study of the antioxydant power by the method of DPPH showed the existence of an antioxydant activity of the essential oil of the dry flowers of Lavandula officinalis. The determination of moisture of the samples of dry vegetables showed that these grains are favorable for moulds growth. The purification and the microscopic study of the isolated stocks gave the possibility of identifying 5 kinds of moulds namely: Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus and Alternaria. The study of the contamination shows a predominance of the kinds Penicillium and Aspergillus the evaluation of the antifungal activity revealed the inhibition of growth of the moulds for most stocks tested. The stocks tests and the various kinds isolated from dry vegetables do not have a similar sensitivity with respect to the essential oil. Key words: Essential oils; Lavandula officinalis; Yield ; CPG; Antioxydant activity; Antifungal activity; Moisture; Moulds; Hydrodistillation
. . Lavandula officinalis CPG . 63.12.0% 08 . .Terpniques 94

Linalool (10.68%), 1.8 - cineole (10.25%), -terpinene (11.66) : Linalyl acetate(15.26%), .
Lavandula officinalis . DPPH

, Mucor, Rhizopus ,Alternaria Aspergillus, Penicillium
. Aspergillus, Penicillium .

, CPG Lavandula officinalis .

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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Dpartement des Technologies Alimentaires

Mmoire prsent pour lobtention du diplme de Magister en Sciences Alimentaires

Option : Technologie alimentaire Thme :

Examinatrices : Dr. AMOURACHE L. Dr. KHARROUB K.

Anne universitaire : 2010/2011

assur de mes remerciements.

A Dr : AMOURACHE L. et Dr. KHARROUB K. pour avoir accept de faire partie de ce

Mes remerciements vont galement Monsieur BRAHIMI responsable du Laboratoire du

Chef de Dpartement de biologie, universit Skikda.

A mes trs chers frres : Djamel eddine et Zinou.

A ceux, qui me sont chers, Je ddie ce travail. Melle LAIB Imne

LISTE DES TABLEAUX

LISTE DES FIGURES

Partie I : Synthse bibliographique

Chapitre I : Les lgumes secs

Chapitre I : Les lgumes secs

Chapitre I : Les lgumes secs

31284 9184 873 20681 1394 94 63510

279735 62430 5605 142940 9170 950 500830

30688 7556 1309 20361 1040 197 61151

235210 36175 10809 112110 5441 1980 401725

32278 8487 2588 22274 1616 205 67448

364949 59692 26932 178404 11588 1325 642890

Chapitre I : Les lgumes secs

Chapitre I : Les lgumes secs

Chapitre I : Les lgumes secs

Chapitre I : Les lgumes secs

Chapitre I : Les lgumes secs

Chapitre I : Les lgumes secs

Une corrlation troite existe entre la

croissance des moisissures et lapparition de ces

Chapitre I : Les lgumes secs

6.2 Dgradation des protines

Chapitre I : Les lgumes secs

Chapitre I : Les lgumes secs

Chapitre I : Les lgumes secs

Chapitre I : Les lgumes secs

Chapitre II : Moisissures 1. Caractres gnraux

Chapitre III : Les huiles essentielles

Chapitre III : Les huiles essentielles 1. Dfinition

facteurs extrinsques, en lien avec ou la mthode dextraction (Besombes, 2008).

Chapitre III : Les huiles essentielles

Chapitre III : Les huiles essentielles 8.1 Activit antioxydante

Chapitre III : Les huiles essentielles

Chapitre III : Les huiles essentielles

Chapitre III : Les huiles essentielles

Chapitre III : Les huiles essentielles 9.2.1 Chromatographie en phase gazeuse(CPG)

Chapitre III : Les huiles essentielles

Partie II : Partie pratique

H (%) = (M1 M2)/ M1 x 100

Figure 2 : dispositif de lhydro distillation

RHE (%) = M/M x 100

Matriel et mthodes 2. Dtermination de la composition chimique de lhuile essentielle par

I% = (A blanc A chantillon) x100/A blanc

H (%) = (M1 M2)/ M1 x 100

eau(%) matire sche(%)

le degr de maturit des fleurs de Lavandula officinalis,

0,3 0,25 0,2 0,15 200g/ml 400g/ml 600g/ml

0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 -0,05

200g/ml 400g/ml 600g/ml 800g/ml 0 5 10 15 Temps(minutes) 20 25 30 1000g/ml

Figure 7: Pourcentage dinhibition pour lhuile essentielle et la vitamine E

. Figure 9: Valeurs dIC50

essentielles des fleurs du genre Lavandula contre la dtrioration oxydante du saindoux.