TransgenicMice 2009

TIKUS TRANSGENIK (TRANSGENIC MICE)
DARI KONSEP MENJADI SALAH SATU METODA UNTUK MEMPELAJARI FUNGSI GEN All images in this document is removed due to copyright restriction
Ahmad Aulia Jusuf Bagian Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia 2009
Agenda
Pendahuluan Definisi Tujuan
Metoda
Persiapan Tahapan pembuatan Penutup
Thursday,November 05, 2009
Transgenic Mice/AAJ/Histo
Pendahuluan
Penelitian menyingkap fungsi suatu gen
Invitro
Transfeksi

Gen ditransfeksikan kedalam sel tertentu pada media kultur Belum tentu sesuai dengan fungsinya pada individu
Invivo1
Transgenik

Eksogen Endogen (overekspresi) Gen endogen dibuat tidak aktif
Gene disruption / gene knock out
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ____1Aguzzi A, Brandner S, Isenmann S, Steinbach JP, and Sure U : Transgenic and gene disruption techniques
in the study of neurocarcinogenesis. Glia 1995: 15: 348-364
Pendahuluan
Sejarah2,3,4,5,6
Palmitter dan Brinster (1981)
membuat transgenic mice
Insersi gen thymidine kinase dari virus herpes kedalam sel telur tikus yang telah dibuahi
Palmitter (1986), Jaenisch (1988) dan Hanahan (1989) Gordon dkk pada tahun 1983, Hogan dkk 1994
Penyuntikan gen ke dalam pronukleus zigot
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ _____2Jusuf, A.A : Transgenic and gene disruption techniques from a concept to a tool in studying the basic pathogenesis of various human
disease. Medical Journal Of Indonesia. 1998: 7; 2 : 55-64 R, Chen H, Trumbauer M et al : Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell 1981: 27: 223-231 4Palmitter R.D and Brinster R.L: Germ-line transformation of mice. Annu. Rev. Genet 1986: 20; 465-499 5Jaenisch R : Transgenic animals. Science 1988: 240; 14681474 6Hanahan D. : Transgenic mice as probes into complex system. Science 1989: 246; 1265-1275 7Hogan B, ConstantiniF, Lacy E. : Manipulating the mouse embryos: A laboratory manual.2nd Ed .New York : Cold Spring Harbor: 1994
3Brinster
Definisi
Tikus transgenik (Transgenic mice)1,2
Suatu organisma (tikus) yang genom (susunan gen) nya telah dimodifikasi secara artifisial yaitu dengan cara rekayasa genetik (genetic engineering) dan dapat diturunkan expression of exogenous gene over-expression of endogenous gene
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ____1Aguzzi A, Brandner S, Isenmann S, Steinbach JP, and Sure U : Transgenic and gene disruption techniques in the study of neurocarcinogenesis. Glia 1995:
15: 348-364 2Jusuf, A.A : Transgenic and gene disruption techniques from a concept to a tool in studying the basic pathogenesis of various human disease. Medical Journal of Indonesia. 1998: 7; 2 : 55-64
Definisi
Tikus transgenik (Transgenic mice)
Fragmen DNA atau gen yang dimasukkan kedalam suatu sel
diligasikan secara ujung ke ujung (end to end) kesuatu tempat tertentu di dalam suatu kromosom secara acak oleh ensim ligasi intraselular sehingga gen atau fragmen DNA itu akan tersusun secara tandem2,9
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ _____2Jusuf, A.A : Transgenic and gene disruption techniques from a concept to a tool in studying the basic pathogenesis of various human disease.
Medical Journal of Indonesia. 1998: 7; 2 : 55-64 9Albert, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D. (1994), Cellular Mechaninsm of development in Molecular Biology of The Cell., 3rd Ed., Garland Publishing, New York and London, pp.
Definisi
Gen yang tersusun secara tandem
gene gene gene gene
Definisi
Tikus transgenik (Transgenic mice)
Integrasi transgen pada genom sel telur yang dibuahi (zigot)2,3

integrasi fragmen DNA linier satu sama lain secara tandem oleh ensim ligase fragmen DNA yang telah tersusun secara tandem ini akan terintegrasi di suatu tempat tertentu pada suatu kromosom tertentu secara random Bila kromosom yang telah dimodifikasi ini terdapat pada sel-sel benih (spermatozoa atau ovum), maka transgen ini akan dapat diturunkan ke generasi tikus selanjutnya Tikus yang mengandung transgen ini dikenal sebagai transgenic mice
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ _____2Jusuf, A.A : Transgenic and gene disruption techniques from a concept to a tool in studying the basic pathogenesis of various human disease.
Medical Journal Of Indonesia. 1998: 7; 2 : 55-64 3Brinster R, Chen H, Trumbauer M et al : Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell 1981: 27: 223-231
Definisi
Kegunaan Tikus transgenik (Transgenic mice)2,3,10
Model Hewan coba

mempelajari regulasi gen-gen yang terkait dengan perkembangan jaringan tubuh mempelajari regulasi gen-gen yang berperan dalam oncogenesis mempelajari gen-gen yang spesifik yang berperan dalam pertumbuhan jaringan tubuh tertentu mempelajari fenotif gen pada jaringan tubuh mempelajari efek zat atau senyawa tertentu dalam terapi penyakit
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ___ 2Jusuf, A.A : Transgenic and gene disruption techniques from a concept to a tool in studying the basic pathogenesis of various human disease. Medical
Journal Of Indonesia. 1998: 7; 2 : 55-64 3Brinster R, Chen H, Trumbauer M et al : Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell 1981: 27: 223-231 10Nagy A, Gertsenstein M, Vintersen K, Behringer R, Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. 3rd Ed New York: Cold Spring Harbor: 2003
Metoda Pembuatan Tikus Transgenik

Metoda pronuclear microinjection dan Metoda insersi transgen kedalam ES cells
____________________________________________________________________________________________________________________________________ __ 18 Hanahan, D., Wagner, E.F., Palmiter, R.D. The origins of oncomice: a history of the first transgenic mice genetically engineered to develop
cancer. Genes & Dev. 2007:21:2258-2270

19
Transgenic mice, diunduh dari htpp://cancer ucsd.edu/tgm/pronuclear.asp
10
Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik
Pembuatan tikus transgenik merupakan proses yang sulit dan membutuhkan waktu yang lama Serangkaian persiapan yang harus dilakukan adalah
Persiapan gen (transgen) yang akan dimasukkan ke dalam pronukleus telur tikus yang telah dibuahi (zigot) Persiapan tikus yang akan digunakan Persiapan alat dan bahan Persiapan sistem deteksi ada tidaknya transgen dalam susunan genom calon tikus transgenik (tikus yang berkembang dari zigot yang disuntikkan transgen)
11

Persiapan gen (transgen)
Fragmen
DNA atau gen (transgen)
Promoter, complete protein coding region, sedikitnya satu intron dan polyadenylation site11 Panjang DNA pada transgen tidak dibatasi, bisa dari beberapa kilo base pair (Kbp) hingga 1000 kb (Lamb et 1999)13
Hal yang harus dipertimbangkan adalah vektor yang digunakan dan cara konstruksinya
______________________________________________________________________
11 Brinster
R, Allen J, BehringerR, Gelimas R et al.: Intron s increase transcriptional efficiency in transgenic mice. Proc Natl. Acad.Sci.USA 1988: 85; 836-40 12 Chada K, Magram J, Raphael K, Radice G, Lacy E and Constantini F. Spesific expression of a foreign beta globin gene in eryrthroid cells of transgenic mice. Nature.1985: 314: 377-380 13 Lamb B.T, Bardel K.A, Kulnane L.S. Anderson J.J, Holtz G, Wagner S.L, Sisodia S.S, and Hoeger E.J. Amyloid production and deposition in mutant amyloid precursor protein and presenilin-1 yeast artificial chromosome transgenic mice. Natl. Neurosci. 1999: 2; 695-697
12

Persiapan gen (transgen) Fragmen DNA atau gen (transgen)
Amplifikasi fragmen DNA menggunakan PCR Metoda biologi molekular Harus dipurifikasi dan bebas dari sekuens vektor prokariotik12
Tidak mengganggu proses integrasi tetapi ekspresi dari transgen
______________________________________________________________________
11 Brinster
R, Allen J, BehringerR, Gelimas R et al.: Intron s increase transcriptional efficiency in transgenic mice. Proc Natl. Acad.Sci.USA 1988: 85; 836-40 12Chada K, Magram J, Raphael K, Radice G, Lacy E and Constantini F. Spesific expression of a foreign beta globin gene in eryrthroid cells of transgenic mice. Nature.1985: 314: 377-380 13Lamb B.T, Bardel K.A, Kulnane L.S. Anderson J.J, Holtz G, Wagner S.L, Sisodia S.S, and Hoeger E.J. Amyloid production and deposition in mutant amyloid precursor protein and presenilin-1 yeast artificial chromosome transgenic mice. Natl. Neurosci. 1999: 2; 695-697
13

14

Bila gen yang diinsersikan adalah gen endogen (endogenous transgene)
Penyisipan oligonukleotida pada daerah transgen yang tidak ditranslasikan (untranslated region)14,15 Menginsersikan gen kecil yang mengkode RNA yang pendek pada transgen tersebut16
______________________________________________________________________
14Peschon
J.J, Behringer R.R, Brinster R.L, and Palmiter R.D. Spermatide-specific expression of protamine 1 in transgenic mice. Proc Natl.Acad.Sci.USA. 1987:84; 5316-5319 15Shi Y, Son H.J, Shahan K, Rodriguez M, Constantini F and Derman E. Silent genes in the mouse major urinary protein gene family. Proc Natl.Acad.Sci.USA. 1989:86; 4584-4588 16Krumlauf R, Hammer R.E, Tilghman S.M, and Brinster R.L Developmental regulation of alpha-fetoprotein genes in transgenic mice. Mol. Cell. Biol. 1985:5; 1639-1648.
15

Bila gen yang diinsersikan adalah gen endogen (endogenous transgene)
Fusi epitope/peptida yang pendek dengan protein dari transgen
mempermudah pengenalan protein yang dikode oleh transgen menggunakan epitope-specific antibodi fusi antara protein yang dikode oleh transgen dengan protein green fluorescent Protein (GFP) yang dikode oleh gen reporter alkaline phosphatase17 protein kecil yang mendompleng pada protein yang dikode oleh transgen mungkin berpengaruh terhadap fungsi protein yang dikode oleh transgen
______________________________________________________________________
17
van Roessel P and Brand A.H. Imaging into the future: visualizing gene expression and protein interactions with fluorescent proteins.Nat.Cell.Biol. 2002:4; 15-20
16
Efisiensi transgen yang ditransfer dipengaruhi oleh beberapa faktor8
Bentuk DNA
Bentuk linier dari DNA transgen akan meningkatkan efisiensi integrasi transgen Konsentrasi DNA yang rendah akan menurunkan efisiensi pengintegrasian transgen Konsentrasi yang terlalu tinggi bersifat toksik bagi zigot Konsentrasi DNA yang dianjurkan adalah 1.5-2 nanogram/mikroliter DNA yang diinsersikan harus bebas dari kontaminasi (sisa phenol, etanol atau ensim) Buffer berperan dalam meningkatkan efisiensi pengintegrasian transgen pada hostnya Pelarut yang sering dipakai adalah TE buffer yang mengandung 1mM EDTA.
Konsentrasi DNA

Kemurnian DNA
Buffer DNA

____________________________________________________________________
8Hogan 10Nagy A,
B, ConstantiniF, Lacy E. : Manipulating the mouse embryos: A laboratory manual.2nd Ed .New York : Cold Spring Harbor: 1994 Gertsenstein M, Vintersen K, Behringer R, Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. 3rd Ed New York: Cold Spring Harbor: 2003
17
Persiapan tikus
Superovulated female mice
Kelompok tikus betina yang dibuat superovulasi (superovulated female mice)

Menghasilkan telur yang dibuahi (zigot) dalam jumlah banyak Pregnant Mares Serum Gonadotrophin (PMSG) serupa dengan hormon FSH stimulasi perkembangan dan pematangan telur tikus dalam jumlah banyak Human Chorionic Gonadotrophin (HCG) menstimulasi ovulasi Tikus dewasa dengan umur 4-8 minggu Dikawinkan dengan tikus jantan kelompok fertile stud male mice cek plug kopulasi (copulation plug) besok paginya
18
Persiapan tikus
Fertile stud male mice

Kelompok tikus jantan pengawin (fertile stud male mice) mengawini tikus betina superovulated female mice berumur 6-8 minggu dan mempunyai penampilan reproduksi yang baik kelompok tikus jantan yang telah disterilkan dengan cara vasektomi dikawinkan dengan tikus betina pseudopregnant female mice berumur sediktinya 2 bulan Sebelum dipakai dicek ke steril annya
Sterile male mice

19
Vasektomi Pada Sterile Male Mice
20
Persiapan tikus
Pseudopregnant mice
kelompok tikus betina yang dibuat hamil palsu (pseudopregnant female mice) menerima zigot yang telah mengandung transgen dalam pronukleusnya dikawinkan dengan tikus kelompok sterile male mice berumur 6-8 minggu dengan berat badan antara 25-35 gram Untuk mempermudah transfer zigot disarankan untuk menggunakan tikus yang mempunyai infundibulum yang besar
strain ICR
21
Persiapan alat dan bahan
Alat dan bahan untuk mengumpulkan telur tikus yang dibuahi (zigot)
Spuit disposible Hormon Pregnant Mares Serum Gonadotrophin (PMSG) Hormon Human Chorionic Gonadotrophin (HCG) Larutan kultur
larutan D-PBS atau larutan lainnya ditambahkan bovine serum albumin (BSA), asam piruvat dan antibiotik (penisilin dan streptomisin)
Larutan kultur yang mengandung ensim hyaluronidase Inkubator (temperatur 37C, dengan kelembaban 95% dan mengandung 5% CO2) Surgical set termasuk watchmakers forceps Alkohol 70% Stereomikroskop Mouth controlled pipette 35 mm petri dish
Transgenic Mice/AAJ/Histo 22
Mouth controlled pipette
23
Alat dan bahan yang dipakai untuk menginsersikan transgen ke pronukleus zigot
Holding pipette
pipet yang dipakai untuk memegang zigot selama proses penyuntikan transgen ke dalam pronukleus zigot Borosilicate glass capilary mechanical pipette puller pipet yang dipakai untuk memasukkan transgen kedalam pronukleus zigot Glass capillary tubing dengan internal glass filament mechanical pipette puller
Injection pipette

24
Holding dan injection Pipette
25
Alat dan bahan yang dipakai untuk menginsersikan transgen ke pronukleus zigot

Mikroskop yang mempunyai mikromanipulator Paraffin oil Petri dish injection chamber Transgen yang dilarutkan dalam buffer TAE
26
identifikasi ada tidaknya transgen pada tikus host

Southern blot Northern blot Western Blot
27
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik
28
Penyuntikan hormon PMSG dan HCG
29
Isolasi dan pengumpulan telur tikus yang dibuahi (zigot) dari superovulated female mice dengan plug kopulasi positif
30
31
32
33
34
Penyuntikan transgen kedalam pronukleus telur tikus yang dibuahi (zigot)
35
36
37
38
39
40
41
42
Transfer zigot yang telah mengandung transgen ke saluran telur (oviduct) pseudopregnant female mice
43
Transfer zigot yang telah disuntikkan transgen ke saluran telur (oviduct) pseudopregnant female mice
44
Transfer zigot yang telah disuntikkan transgen ke saluran telur (oviduct) pseudopregnant female mice
45
Pemeliharaan Calon Tikus Transgenik
46
Deteksi Transgen Pada Calon Tikus Transgenik
47
Penutup

Telah diuraikan tehnik pembuatan tikus transgenik (transgenic mice) Pembuatan tikus transgenik membutuhkan proses yang panjang dan waktu yang lama Kegunaan tikus transgenik
mempelajari regulasi gen-gen yang terkait dengan perkembangan jaringan tubuh dan gen-gen yang spesifik pada jaringan tertentu Mempelajari fenotif gen pada jaringan tubuh
48
Penutup
49
50
51
52
53
Penutup
Dan Allah telah meratakan bumi untuk kehidupan mahlukNya
Dibumi itu ada keaneka ragaman buah-buahan Dan pohon kurma yang mempunyai kelopak mayang Dan biji-bijian yang berkulit Dan bunga-bunga yang harum baunya Maka nikmat Tuhanmu yang manakah yang kamu dustakan? (QS : Ar-Rahman (55) : 10-13)
54
55
56

TransgenicMice 2009

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

TransgenicMice 2009

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

TIKUS TRANSGENIK (TRANSGENIC MICE)

Penelitian menyingkap fungsi suatu gen

Eksogen Endogen (overekspresi) Gen endogen dibuat tidak aktif

Gene disruption / gene knock out

in the study of neurocarcinogenesis. Glia 1995: 15: 348-364

Thursday,November 05, 2009

Palmitter dan Brinster (1981)

membuat transgenic mice

Penyuntikan gen ke dalam pronukleus zigot

Thursday,November 05, 2009

Tikus transgenik (Transgenic mice)1,2

Thursday,November 05, 2009

Tikus transgenik (Transgenic mice)

Fragmen DNA atau gen yang dimasukkan kedalam suatu sel

Thursday,November 05, 2009

Thursday,November 05, 2009

Tikus transgenik (Transgenic mice)

Integrasi transgen pada genom sel telur yang dibuahi (zigot)2,3

Thursday,November 05, 2009

Kegunaan Tikus transgenik (Transgenic mice)2,3,10

Model Hewan coba

Thursday,November 05, 2009

Metoda Pembuatan Tikus Transgenik

cancer. Genes & Dev. 2007:21:2258-2270

Transgenic mice, diunduh dari htpp://cancer ucsd.edu/tgm/pronuclear.asp

Thursday,November 05, 2009

Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik

Thursday,November 05, 2009

Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik

DNA atau gen (transgen)

Thursday,November 05, 2009

Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik

Tidak mengganggu proses integrasi tetapi ekspresi dari transgen

Thursday,November 05, 2009

Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik

Thursday,November 05, 2009

Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik

Bila gen yang diinsersikan adalah gen endogen (endogenous transgene)

Thursday,November 05, 2009

Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik

Bila gen yang diinsersikan adalah gen endogen (endogenous transgene)

Fusi epitope/peptida yang pendek dengan protein dari transgen

Thursday,November 05, 2009

Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik

Persiapan gen (transgen)

Efisiensi transgen yang ditransfer dipengaruhi oleh beberapa faktor8

Thursday,November 05, 2009

Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik

Superovulated female mice

Kelompok tikus betina yang dibuat superovulasi (superovulated female mice)

Thursday,November 05, 2009

Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik

Fertile stud male mice

Sterile male mice

Thursday,November 05, 2009

Vasektomi Pada Sterile Male Mice

Thursday,November 05, 2009

Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik

Thursday,November 05, 2009

Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik

Persiapan alat dan bahan

Thursday,November 05, 2009

Mouth controlled pipette