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stérilisation

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La stérilisation est une technique destinée à détruire tout germe microbien d'une préparation (souvent alimentaire) en la portant à haute température, c'est-à-dire de 100 °C à 180 °C. Elle a été inventée par Nicolas Appert à la fin du XVIIIe siècle (appertisation). L'explication théorique a été fournie par Louis Pasteur au XIXe siècle.
Dans le domaine bio-industriel, la stérilisation est un procédé utilisé pour détruire les germes viables ou revivifiables, potentiellement infectieux, des médicaments ou des dispositifs médicaux.
La stérilisation est une technique destinée à détruire tout germe microbien d'une préparation (souvent alimentaire) en la portant à haute température, c'est-à-dire de 100 °C à 180 °C. Elle a été inventée par Nicolas Appert à la fin du XVIIIe siècle (appertisation). L'explication théorique a été fournie par Louis Pasteur au XIXe siècle.
Dans le domaine bio-industriel, la stérilisation est un procédé utilisé pour détruire les germes viables ou revivifiables, potentiellement infectieux, des médicaments ou des dispositifs médicaux.

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Sommaire

Introduction ..................................................................................................................................... 02 Chapitre I. Stérilisation Et Stérilité ................................................................................................. 03 I. Rappels Historiques ..................................................................................................................... 03 I.1 définition de la stérilité .............................................................................................................. 03 I.2 Définition de la stérilisation ....................................................................................................... 04 I.3 Efficacité de la stérilisation ........................................................................................................ 04 I.4 Conservation de l’état de stérilité ............................................................................................... 04 II. Nature Des Agents Infectieux ..................................................................................................... 04 II.2 Les spores ................................................................................................................................. 05 II.3 Les levures et champignons ...................................................................................................... 06 II.3.1 Bactéries, nos amies ou ennemis ........................................................................................... 06 II.3.2 Les virus................................................................................................................................. 06 II.4 Nature du virus ......................................................................................................................... 06 II.5 Les ATNC ou prions ................................................................................................................. 07 II.6 Croissance Et Mort Des Micro-Organismes ............................................................................. 08 Chapitre II. Loi de stérilisation........................................................................................................ 10 I. Les Deux Lois De La Stérilisation ............................................................................................... 10 I.1 Première loi, destruction en fonction du temps .......................................................................... 10 I.2 Deuxième loi, destruction en fonction de la température........................................................... 10 II. Evaluation Des Deux Lois De La Stérilisation ........................................................................... 11 II.1 1ière loi : efficacité du temps : temps de réduction décimale ..................................................... 11 II.2 2ième loi : efficacité de la température, loi d’Arrhenius, valeur d’inactivation thermique ......... 11 II.3 Synthèse : la règle des « trois dix » .......................................................................................... 12 III. Le Couple Température / Temps ............................................................................................... 12 Chapitre III. Types de stérilisation .................................................................................................. 13 I. Stérilisation par les méthodes physiques...................................................................................... 13 I.1 stérilisation par la chaleur .......................................................................................................... 13 I.1.1 le flambage .............................................................................................................................. 13 I.1.2 le four pasteur.......................................................................................................................... 13 I.1.3 l’autoclave ............................................................................................................................... 14 I.1.4 Autres méthodes...................................................................................................................... 14 I.2 Pasteurisation ............................................................................................................................. 14 I.3. Tyndallisation............................................................................................................................ 15 I.4. flambage à l’alcool .................................................................................................................... 15 I.4.1 Stérilisation par filtration ........................................................................................................ 15 I.4.2 Stérilisation par les radiations ................................................................................................. 16 II. Stérilisation par des agents chimiques ........................................................................................ 16 II.1 Les antiseptiques liquides ......................................................................................................... 16 II.2. Les antiseptiques gazeux ......................................................................................................... 16 Conclusion ....................................................................................................................................... 18

Ecologie Appliquée 2 Stérilisation

Introduction
La stérilisation est une technique destinée à détruire tout germe microbien d'une préparation (souvent alimentaire) en la portant à haute température, c'est-à-dire de 100 °C à 180 °C. Elle a été inventée par Nicolas Appert à la fin du XVIIIe siècle (appertisation). L'explication théorique a été fournie par Louis Pasteur au XIXe siècle. Dans le domaine bio-industriel, la stérilisation est un procédé utilisé pour détruire les germes viables ou revivifiables, potentiellement infectieux, des médicaments ou des dispositifs médicaux. Par définition, l'état stérile d'un produit se traduit par la probabilité d'au plus 1 / 106 de trouver un germe viable ou revivifiable sur (ou dans) un produit. Les procédés les plus courants sont:  Le traitement thermique (Pasteurisation, Appertisation, Tyndallisation ou à la vapeur d'eau : autoclavage)  le traitement chimique (souvent: l'oxyde d'éthylène)  le traitement par ionisation (par exposition à un rayonnement gamma émis notamment par le cobalt-60 de synthèse, ou à un faisceau d'électrons accélérés). La radiostérilisation du matériel médico-chirurgical par rayonnement gamma est réalisé avec une dose de l'ordre de 25 kGy et peut s’effectuer sur le matériel déjà placé dans son emballage définitif.  Ces procédés font l'objet d'importants travaux de normalisation, au niveau international, afin notamment de définir les règles précises de leur maîtrise.

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Chapitre I. Stérilisation Et Stérilité I. Rappels Historiques « Si j’avais l’honneur d’être chirurgien, pénétré comme je suis des dangers auxquels exposent les germes des microbes répandus à la surface de tous les objets, particulièrement dans les hôpitaux, non seulement, je me servirais d’instruments d’une propreté parfaite et après les avoir soumis à un flambage rapide…, je n‘emploierais que de la charpie, des bandelettes et des éponges préalablement exposées à un air porté à la température de 130 à 150°, je n’emploierais qu’une eau qui aurait subi la température de 110 à 120° » On connaît tous cette phrase de PASTEUR, père fondateur de la bactériologie et de la stérilisation, mais on connaît moins Nicolas APPERT qui fut un précurseur. Ce fut lui, le premier qui eut l’idée de passer les conserves alimentaires dans l’eau bouillante pour en assurer la conservation (le procédé est encore nommé « appertisation ») Ce procédé permit à un certain général BONAPARTE de disposer d’une armée bien nourrie et exempte de scorbut lors de la campagne d’Italie en 1795. (Un prix avait été proposé par le Directoire pour cette recherche) De là à imputer la victoire plus à APPERT qu’au génie militaire Corse… C’est d’ailleurs l’Empereur qui, en 1810, remit le prix de 12.000 F à Nicolas Appert. On savait empiriquement que des procédés comme les fumigations permettaient la conservation des aliments et empêchaient la putréfaction. On savait aussi que l’incinération des cadavres d’animaux empêchait de même les propagations de maladies, mais c’est seulement à partir de Pasteur et de l’identification des « microbes » (de « micros » et « bios », respectivement « petit » et « vie ») On se rappelle l’extraordinaire expérience montrant l’inexistence du concept de « génération spontanée » que Pasteur décrivit dans le grand amphithéâtre de la Sorbonne. Voici en quoi a consisté cette expérience : Un ballon était pourvu d’un mélange nutritif limpide (eau de levure sucrée) puis, porté à ébullition. Pasteur introduisit ensuite de l’air chaud calciné et scella le ballon au moyen d’un chalumeau. La solution est restée limpide. Pasteur, deux mois après, a ouvert le ballon en y admettant de l’air calciné, mais en plongeant simultanément un petit tube ouvert avec un bouchon de coton, évidemment plein de particules et de poussières, puis rescella le ballon. Le liquide alors s’est troublé et a fermenté. La fermentation ne se produit donc pas « Spontanément », mais en présence de « germes » en suspension dans l’air…La microbiologie était née. I.1 définition de la stérilité «La stérilité est l’absence de microorganismes viables» La norme EN 285 définit l’état stérile comme « l’état d’un dispositif médical exempt de microorganismes » Par extension, en raison de l’existence d’autres agents infectieux, on considère que les levures et champignons sont des « microorganismes » et pour les autres agents considérés comme non vivants, on dira que la stérilité est l’absence d’agents actifs. Du fait qu’il est impossible de vérifier la stérilité d’un objet sans lui faire perdre son caractère stérile, la stérilité est en réalité une notion de probabilité. On verra que l’absence absolue de microorganismes et autres agents n’existe pas, mais que les conditions pratiques de stérilisation ne laissent un nombre d’agents infectieux tellement faible qu’ils ne peuvent se développer et recouvrer leur pouvoir pathogène. Selon la norme EN 556, il doit y avoir une chance sur un million seulement que l’objet soit contaminé.

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On peut prendre des images de guerre pour illustrer la stérilisation : l’attaque d’un fortin. Plus il y aura d’assaillants, plus il y aura de survivants au tir des mitrailleuses. Cependant, même si les assaillants sont repoussés ou tués, il est impossible de « garantir » que TOUS les assaillants ont été tués. Il reste (heureusement) quelques survivants, mais en trop petit nombre pour retenter un assaut. Il en est de même des bactéries et autres agents infectieux… I.2 Définition de la stérilisation La stérilisation consiste à soumettre les agents infectieux à un procédé physique en vue de leur élimination et à rendre « stérile » (selon la définition précédente) la charge du stérilisateur (ou synonyme, d’un autoclave) I.3 Efficacité de la stérilisation Comme déjà écrit, le procédé choisi doit être tel qu’il n’y ait plus que une chance sur un million de trouver un objet non stérile, soit, de façon un peu ésotérique, une réduction à 6 logs I.4 Conservation de l’état de stérilité Une fois qu’un objet a été stérilisé, il faut qu’il soit dans un emballage qui lui conserve cet état de stérilité. (C’est la très grande différence entre la stérilisation et la désinfection) Ce dernier procédé ne permet pas de conserver l’état de « stérilité » immédiatement obtenue par l’action du désinfectant C’est pourquoi, la plupart des objets à stériliser sont au préalable conditionnés dans un emballage perméable à l’agent stérilisant, mais imperméable à l’air dans les conditions normales de conservation. Lorsque les produits à stériliser sont dans des emballages étanches (ex, conserves domestiques ou dans l’industrie pharmaceutique, les flacons de verre, emballages polyéthylène ou poche PVC) c’est, en quelque sorte l’emballage qui devient son propre autoclave et qui doit reproduire à l’intérieur les conditions de la stérilisation (temps, température et/ou pression, absence de spores)

II. Nature Des Agents Infectieux Les agents infectieux sont  les bactéries ;  les levures et champignons ;  les virus (N.B. (Les virus n’étant pas considérés comme des êtres vivants, on parlera dans ce cas d’inactivation).  les prions (syn. : ATNC (Agents Transmissibles Non Conventionnels) responsables des maladies dégénératives du type CREUTZFZLD-JAKOB chez l’homme et chez l’animal de type EBS (Encéphalopathie bovine spongiforme), plus connue sous le nom de « maladie des vaches folles »

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II.1 Notions sommaires sur les bactéries Commençons par rappeler deux synonymes : « microbes » ou « germes » Il s’agit de cellules autonomes, composées comme les cellules « classiques » d’une paroi, (facultativement) d’une capsule, et d’un cytoplasme. Les bactéries sont dépourvues de noyau, mais sont pourvues d’ADN nucléaire (les bactéries sont dites « protocaryotes », par opposition aux êtres plus évolués pourvus de noyau et dits « eucaryotes » du grec eu = bien) La figure 1 ci-dessous comprend tous les éléments constitutifs d’une bactérie mais ici, tous ne sont pas indispensables pour comprendre l’action des agents stérilisants. On distingue les bacilles (en formes de bâtonnets, cf. étymologie latine bacillus) et les cocci, en forme de sphère. Pour l’antibiothérapie, ces notions sont importantes, notamment par rapport à la coloration que peuvent prendre les bactéries en présence de colorants pour leur identification (on connaît la classification en Gram + ou Gram -)

Figure 1 : structure d’une bactérie, (avec tous ses éléments « facultatifs ») II.2 Les spores C’est une propriété exclusive des bacilles. Le bacille « se replie sur lui-même » et s’entoure d’une barrière résistante à la chaleur. Le bacille ainsi sporulé diminue ses besoins métaboliques et notamment son besoin en eau et ses échanges avec l’extérieur. Si on peut se permettre la comparaison, les microbes sont comme les individus « repliés sur eux mêmes », ils sont peu coopérants… Les micro-organismes sont sensibles à la chaleur (compris les formes sporulées, mais à haute température) mais cette sensibilité varie d’une espèce à l’autre. Le procédé de stérilisation choisi devra évidemment tenir compte des variations entre les espèces microbiennes et avoir l’efficacité souhaitable pour éliminer les espèces les plus résistantes.

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Il y a lieu d’éviter la formation de spores qui compromettent l’efficacité de la stérilisation Pour cela, le maintien de l’atmosphère humide est souhaitable, ce qui est le cas de la stérilisation par la chaleur humide. Dans le cas de stérilisations « sèches » comme la radiostérilisation et l’oxyde d’éthylène, il faut alors travailler à basse température. II.3 Les levures et champignons Les deux termes sont pratiquement synonymes. Les champignons et levure sont « eucaryotes » Si on connaît les champignons « à chapeau » ou en lamelle (genre cèpes ou girolles), on sait aussi qu’il existe des micro-champignons, non visibles à l’oeil nu. Ces micro-champignons sont tout simplement des cellules identiques à celles des champignons « classiques » mais qui n’ont pas réussi à se regrouper pour créer un appareil végétatif comme les champignons communs. Ils peuvent être responsables de maladies infectieuses redoutables comme certaines mycoses viscérales, notamment chez les sujets immuno-incompétents. (SIDA, greffés, cancers…) II.3.1 Bactéries, nos amies ou ennemis Ce titre provoquant avait été choisi par un chirurgien de Boucicaut dans les années 1970, le Pr. Raymond VILLAIN, pour rappeler, dans un dessin animé, que nous devions respecter les bactéries « utiles » (il ajoutait classiquement « paix sur les plaies aux germes de bonne volonté ! ») Que deviendrait le jus de raisin pressé, si des levures ne favorisaient pas la transformation des sucres en alcool, pour la plus grande joie de nos palais ? Si l’homme sain sait résister naturellement aux bactéries, il n’en est pas de même de l’homme malade ; celui-ci, affaibli par la maladie est plus facilement agressé par les agents infectieux. Autre cause d’affaiblissement des patients, l’intervention chirurgicale. En effet, l’ouverture de la peau casse la première carapace naturelle et a fortiori lors d’interventions viscérales avec des déséquilibres écologiques considérables (bactéries anaérobies au contact de l’air) Il est donc nécessaire, pour ne pas re-contaminer le malade, que celui-ci soit opéré et soigné avec du matériel stérile (d’où la célèbre phrase de Pasteur mise en introduction) II.3.2 Les virus (Du latin, virus = poison) C’est Pasteur qui leur a donné ce nom ; les mots grecs « toxon »ou « pharmakon » étant largement utilisé avec « toxique»… et pharmacie, Pasteur s’est servi du terme latin jusqu’alors inusité. A la suite de l’identification régulière des « germes », on comprit vite qu’il existait des maladies infectieuses « sans germes » Comme il était évidemment impossible de revenir à la théorie de la génération spontanée, Pasteur émit l’hypothèse d’agents responsables de trop petite taille pour être visibles au microscope, mais qui seraient identifiables par des moyens plus puissants que le microscope de la fin du XIXe siècle. C’est précisément ce qui arriva avec le microscope électronique du XXe siècle. II.4 Nature du virus Le virus est à la frontière du vivant et de l’organique. (Figure 2) Leur caractère inclassable a fait dire à André Lwoff « les virus sont les virus » Il s’agit pour l’essentiel d’une capsule protéique, facultativement entourée d’une enveloppe lipoprotéique emprisonnant des ARN ou ADN qui peuvent infecter le noyau d’une cellule.

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Les virus soit d’ailleurs soit à ADN, soit à ARN ; il n’existe pas de cohabitation entre les deux formes d’acide nucléique

Figure 2 : Coupe transversale d’un virus (retirer l’enveloppe pour les virus « nus »)

Il en résulte plusieurs conséquences :     Le virus est un « être » frustre, ne pouvant que se développer sur des cellules ou tissus (les cultures en laboratoires sont sur oeuf incubé ou cultures de cellule) Il n’agit que s’il est entier. Un virus ayant perdu son enveloppe perd son pouvoir infestant (l’enveloppe est son « talon d’Achille ») Sa reproduction n’est pas de type sexué (encore que celle des bactéries ne l’est pas non plus) Son mécanisme d’action est très intimiste (brins d’ADN ou d’ARN qui pénètrent le noyau d’une cellule et prennent la place de l’ADN ou ARN de la cellule) Les antiviraux (quand ils existent) ne doivent pas être toxiques pour la cellule infectée par le virus, mais pour le seul virus lui-même, et ce n’est que très récemment que l’on a mis au point des médicaments antiviraux, guère avant les années 1980 et l’épidémie de SIDA.

Les virus (et plus particulièrement les virus à enveloppe) sont toutefois sensibles à la chaleur et à des températures beaucoup plus basses que les microbes. Les procédés de stérilisation sont réputés « inactiver » les virus et non les « tuer » dans la mesure où ce ne sont pas des organismes vivants.

II.5 Les ATNC ou prions

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Si les maladies dégénératives étaient connues depuis longtemps à des stades endémiques chez l’animal (tremblante du mouton) et chez l’homme, (maladie de Creutzfekld-Jakob) c’est évidemment l’épidémie de «vaches folles» qui a remis cette question à l’ordre du jour. Les « prions » sont mal connus. Il s’agit de petites protéines, assez curieusement dépourvues de pouvoir antigénique (parce que probablement protégées par une protéine enveloppante qui les masques aux anticorps anti-prions) Les prions résistent aux agents mécaniques classiques et ne sont « détruits » (ou inactivés) que dans des conditions drastiques de température ou de trempage dans des solutions corrosives comme la soude normale ou l’eau de javel fortement concentrée. On pensait que le prion infestait seulement les tissus nerveux ou ophtalmiques. On estime aujourd’hui qu’il existe des « nouveaux variants » pouvant se loger dans les ganglions, le tube digestif… II.6 Croissance Et Mort Des Micro-Organismes Les phénomènes de croissance et de mort des agents infectieux est capital pour comprendre l’objectif recherché par la stérilisation. La croissance des bactéries est du type exponentiel (cf. annexe) et répond à la formule générale

    

N : nombre de bactéries présentes ; N0 : nombre de bactéries initiales au début de l’observation (au temps t = 0) ; e : 2,721828… base des fonctions exponentielles ; k : coefficient, fonction de l’espèce bactérienne ; t : temps de croissance observé.

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Figure 3 : Croissance des bactéries On s’intéresse classiquement, pour évaluer la croissance bactérienne, au nombre de générations à l’heure, (ainsi Escherichia Coli à 37° a une croissance de 3 générations à l’heure) ce qui correspond à peu près à un doublement de la population toutes les 28 minutes. Toutefois, la croissance des bactéries n’est pas infinie et la population arrive à un plateau où on aune décroissance exponentielle des bactéries, mais qui sont elles-mêmes remplacées à une vitesse exponentielle par de nouvelles générations.

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Chapitre II. Loi de stérilisation
I. Les Deux Lois De La Stérilisation Nous aurons deux mêmes lois symétriques à la croissance des germes : Une décroissance exponentielle selon les paramètres :  Temps.  Chaleur (ou équivalent) I.1 Première loi, destruction en fonction du temps Si on étudie la stérilisation en fonction du temps (chaleur constante) on aura une destruction exponentielle du type :

     

N représente le nombre de bactéries survivantes après un cycle de stérilisation ; N0 représente le nombre de bactéries survivantes au départ. e = 2,721828… base des fonctions exponentielles. k un coefficient tenant compte des autres paramètres (entre autres de la température affichée). t le temps d’exposition à l’agent stérilisant. le signe (-) pour indiquer qu’il va s’agir d’une décroissance.

I.2 Deuxième loi, destruction en fonction de la température. Cette deuxième loi, (dite loi d’Arrhenius) est parfaitement symétrique à la première. Si nous nous intéressons maintenant à la destruction en fonction de la température, on aura une destruction exponentielle du type :

      

N représente le nombre de bactéries survivantes après un cycle de stérilisation. N0 représente le nombre de bactéries survivantes au départ. e = 2,721828… base des fonctions exponentielles. k un coëfficient tenant compte des autres paramètres (entre autres du temps d’exposition à l’agent stérilisant). q (lire théta) la température d’exposition à l’agent stérilisant. le signe – pour indiquer qu’il va s’agir d’une décroissance.

Dans les deux cas, on constate que :  On n’atteint jamais la valeur zéro bactéries restantes. Il reste toujours un petit nombre, si symbolique soit-il. C’est pourquoi, la stérilité rejoint la notion de probabilité déjà décrite.  Le nombre de bactéries détruites est proportionnel au nombre initial de bactéries.  Comme déjà dit, on doit avoir une destruction réduisant au millionième la population initiale, soit une réduction à 106 .Comme log 106 = 6, on parle de réduction de 6 logs…

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Autrement dit, une stérilisation sera d’autant plus efficace que le matériel à stériliser sera propre. « On ne stérilise bien que ce qui est propre »… tout comme un lave-vaisselle est plus efficace quand la vaisselle est au départ… propre. Nous le verrons dans la troisième partie, « place et organisation de la stérilisation dans l’hôpital » II. Evaluation Des Deux Lois De La Stérilisation On peut mesurer les deux paramètres, temps et température et évaluer leur efficacité. II.1 1ière loi : efficacité du temps : temps de réduction décimale Lorsque l’on, utilise de l’eau pour stériliser, on constate qu’à température constante, le temps nécessaire pour diviser par dix la population bactérienne initiale est toujours le même. Ce qui est prévisible si on transforme la courbe exponentielle en droite et qu’on représente ce facteur temps sur un papier semi-logarithmique. (Figure. 4)

Figure 4 : Temps de réduction décimal Ce temps de réduction décimale est symbolisé par la lettre D et ne dépend que de la nature de l’agent infectieux. Pour la bactérie réputée la plus résistante à la chaleur, bacillus stearothermophilus, ce temps de réduction D à 121° C est de 1,5 mn. II.2 2ième loi : efficacité de la température, loi d’Arrhenius, valeur d’inactivation thermique On a, ce qui est prévisible une loi symétrique (étudiée par le savant hollandais) Expérimentalement, on a constaté qu’une élévation de 10°C réduisait de 1/10e la population bactérienne.

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On s’intéresse à un paramètre symétrique, noté Z, valeur d’inactivation thermique (exprimé en degrés Celsius) qui est caractéristique de chaque espèce bactérienne. Toujours pour bacillus stearothermophilus, cette valeur d’inactivation thermique Z est de 10°C. On a une représentation similaire sur papier semi-logarithmique à celle du temps de réduction D (figure 5)

Figure 5 : Valeur d’inactivation thermique II.3 Synthèse : la règle des « trois dix » On peut résumer ces deux lois d’inactivation (thermique et décimale) par la phrase unique suivante : « Tous les dix degrés ou toutes les dix minutes, la population bactérienne est réduite à 10% de sa valeur d’origine »

III. Le Couple Température / Temps
Cela a été vérifié au départ empiriquement, puis de façon plus scientifique. Ainsi, on a des valeurs équivalentes comme l’indique le tableau suivant : TEMPERATURES 120° 125° 130° 134° 140° 60 mn 19 mn 6 mn 2,4 mn 0,6 mn TEMPS

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Chapitre III. Types de stérilisation
La destruction des micro-organismes ou stérilisation est indispensable lors de la préparation du matériel et des milieux destinés aux manipulations, ainsi qu'avant le lavage ou l'élimination du matériel et des milieux utilisés. Dans le premier cas, il est indispensable d'utiliser des méthodes qui ne sont pas susceptibles de gêner la prolifération ultérieure des germes étudiés : on utilise essentiellement des méthodes physiques. Dans le deuxième cas, il sera possible d'utiliser des méthodes plus variées et à effet plus durable (méthodes physiques ou chimiques). Il faut opposer la stérilisation qui est la destruction totale des germes, à la désinfection qui est une destruction plus grossière. La loi de destruction des micro-organismes est de type logarithmique. Le nombre d'individus tués est lié à la population et au temps d'exposition. Du fait de la loi de destruction, il est nécessaire de réduire au maximum le nombre de germes présents avant stérilisation par l'emploi de matériel propre et peu pollué, de stériliser pendant un temps relativement long, de vérifier la destruction des germes, d'établir et d'utiliser éventuellement un barème de stérilisation.

I. Stérilisation par les méthodes physiques
I.1 stérilisation par la chaleur I.1.1 le flambage Il est basé sur l'emploi du bec Bunsen. Cette méthode est utilisée pour la stérilisation extemporanée (pour utilisation immédiate) du matériel de manipulation : extrémité de l'öse, extérieur des pipettes Pasteur et pipettes graduées, col des tubes à essai, tubes contenant des milieux de culture, erlenmeyers et flacons divers, étaloirs ... Il est à noter que le bec Bunsen, réglé avec une flamme bleue, la plus chaude, crée une zone de stérilité d'un diamètre d'environ 20 cm, par ascendance de l'air de cette zone. Toutes les manipulations d'ouverture de tubes et boîtes de culture, d'ensemencement, devront être réalisées dans ce diamètre. Pour que cette zone soit effectivement stérile, les courants d'air et déplacements de personnes sont à proscrire. I.1.2 le four pasteur C'est un four - étuve à air chaud et sec. Il est utilisé pour la stérilisation de la verrerie vide (tubes à essai, boîtes de Pétri, tubes à culture et bouchons, pipettes Pasteur et récipients divers). La verrerie à stériliser doit être propre et parfaitement sèche, éventuellement bouchée avec du coton et emballée dans du papier solide. Elle est alors disposée à l'intérieur du four et subit un chauffage de :

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 

30 minutes à 1 heure à 170° - 180°C. 2 heures à 160°C ce qui a pour but d'éviter le brunissement du coton.

Le matériel ainsi stérilisé sera laissé dans l'étuve jusqu'à son refroidissement complet, puis stocké à l'abri des poussières. Pour ces opérations, compte tenu des températures relativement élevées, il est conseillé d'utiliser le plus possible de la verrerie de type "pyrex". I.1.3 l’autoclave C'est un appareil très performant qui est indispensable dans une unité de microbiologie. Il est utilisé pour stériliser les milieux de culture neufs ou souillés, mais peut également stériliser tout autre matériel de microbiologie. Le chauffage a lieu sous pression de vapeur d'eau, à une température de 100° à 130°C, pendant une durée qui varie en fonction du milieu, de la température utilisée et du volume des récipients. En milieu saturé d'humidité et sous pression, la stérilisation s'opère à des températures inférieures à celles qui sont nécessaires en milieu sec. Le matériel à stériliser est déposé dans les paniers métalliques de l'autoclave dont on aura vérifié le niveau d'eau avant chaque opération de stérilisation. Les récipients sont préalablement bouchés avec du coton (éviter de le prendre avec les doigts - utiliser de préférence une pince) et recouverts de papier d'aluminium ou de papier d'emballage très résistant. Pour la suite des opérations : mise en chauffe, jet de vapeur, montée de pression, lire attentivement la notice du constructeur. Ces appareils étant relativement chers, on peut utiliser une cocotte minute spécialement achetée et réservée à cet usage. Les températures atteintes ne dépassant pas 115°C, les temps de chauffe seront prolongés de la moitié du temps nécessaire en autoclave. Attention à prendre un modèle suffisamment haut, pouvant accepter les tubes de culture dans leur galerie métallique. I.1.4 Autres méthodes Certains milieux de culture fragiles (comme les milieux au désoxycholate) ne supportant pas les températures élevées, on procède à une ébullition à 100°C. I.2 Pasteurisation La pasteurisation est toujours suivie d'un refroidissement rapide. Elle peut se faire en bouteilles ou en vrac. Dans le premier cas, utilisé essentiellement pour la bière, le cidre ou les jus de fruits, la boisson est mise en bouteilles; celles-ci sont capsulées puis soumises à une

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aspersion d'eau de plus en plus chaude, jusqu'à 65 - 75°C; elles séjournent à cette température pendant 20 à 30 minutes, puis elles sont refroidies par de l'eau de plus en plus froide. La pasteurisation en vrac, généralement utilisée dans le cas du lait, peut se faire de deux façons : dans la pasteurisation basse, le lait est chauffé à 60 - 70°C pendant 30 minutes, ce qui nécessite des récipients de volume important; dans la pasteurisation haute, la plus utilisée en France, le lait est chauffé à 85 - 90°C pendant 20 à 30 secondes. Cette opération se fait dans des appareils à plaques ou à tubes. L'appareil se divise en 3 parties : l'échangeur, dans lequel le lait froid se réchauffe en échangeant de la chaleur avec le lait pasteurisé; le pasteurisateur proprement dit; et le réfrigérant, où le lait pasteurisé, qui a déjà été refroidi par le lait froid, va se refroidir encore en échangeant sa chaleur d'abord avec de l'eau froide, puis avec de l'eau glacée. I.3. Tyndallisation John TYNDALL : physicien irlandais (Leighlin-Bridge 1820 - Hinhead, Surrey, 1893). Il a découvert le phénomène de regel de la glace (1871), grâce auquel il a expliqué la marche des glaciers, ainsi que l'effet qui porte son nom. Il a imaginé une méthode de stérilisation qui consiste en chauffages discontinus à une température relativement basse (60 ou 70°C suivant le cas), suivis de refroidissements. On admet qu'au cours de ces périodes de chauffage discontinu, les bactéries perdent leur aptitude à sporuler. Actuellement, la tyndallisation consiste en une série de 3 pasteurisations de 1h. à 70 - 80°C, séparées par un intervalle de 24 heures à température ambiante, ce qui permet la germination et la destruction des spores, sans l'emploi d'une température excessive. Cette méthode est utilisée pour les milieux fragiles contenant sérum, œuf ou toute substance thermosensible de forte viscosité qui ne peut être stérilisée par filtration. Dans le cas de son utilisation, il faut veiller à la protection des cotons, car l'humidité excessive entraîne des contaminations. I.4. flambage à l’alcool Il est utilisé pour la stérilisation de matériel de manipulation en verre, ou la désinfection des paillasses. Attention, opération dangereuse ! I.4.1 Stérilisation par filtration Cette méthode est utilisée pour les milieux sensibles à la chaleur, mais n'est possible que lorsque la viscosité de ces milieux est faible. On utilise alors, suivant le cas, les bougies de porcelaine (type Chamberland), les filtres de verre poreux (le verre fritté N°5 arrête de nombreuses bactéries) ou les membranes filtrantes à usage unique, de type Millipore ou Sartorius. Ces dernières sont actuellement les plus utilisées dans les laboratoires.

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I.4.2 Stérilisation par les radiations La stérilisation par les U.V. est utilisée au laboratoire pour la décontamination de l'air et des paillasses situées sous la hotte de protection : le rayonnement n'agit que de façon directe et sa pénétration est faible. Des instruments ou des récipients tels que les boîtes de Pétri peuvent être stérilisées de la sorte. D'autres radiations (rayons X, , ) , peu utilisées, peuvent cependant servir pour la stérilisation industrielle des boîtes de Pétri en matière plastique : stérilisation par ionisation. II. Stérilisation par des agents chimiques Ils sont utilisés en général pour la désinfection des salles et plans de travail et pour la destruction des germes portés par des instruments souillés. Ce mode de stérilisation doit être systématiquement pratiqué, dans nos laboratoires, pour les lames et pour la verrerie qui ne passe pas en autoclave. II.1 Les antiseptiques liquides L'alcool éthylique à 60% pour la désinfection des paillasses et des instruments. Mais certains germes étant résistants, la désinfection n'est pas toujours évidente. L'hypochlorite de sodium (eau de Javel) est utilisée dilué au 1/4 dans les bacs destinés à recevoir les lames usagées, ou en pissette pour la désinfection des mains, des paillasses et des sols. Rappelons que l'eau de Javel est toujours largement employée en milieu hospitalier, dans certaines industries et à domicile. Les savons et détergents agissent surtout par leur pouvoir mouillant, ce qui facilite l'élimination des germes. Dans le commerce, des produits antiseptiques (Désogerm sp. par exemple) sont très efficaces sur les bactéries et sans danger pour l'homme. On les emploie pour désinfecter le petit matériel, les appareils de fabrication en industrie, mais aussi les paillasses et les mains après manipulations, dans les cabinets médicaux et dentaires, les laboratoires ... II.2. Les antiseptiques gazeux Les vapeurs d'une solution chauffée de formol sont utilisées pour désinfecter les pièces et les étuves. Dans les années 70, les salles de classe étaient désinfectées par ce procédé. Au Centre hospitalier de Haguenau, nous avons observé une enceinte à vapeur de formol et d'ammoniac, servant à la désinfection des couveuses et des respirateurs, le rôle de l'ammoniac étant de diminuer la toxicité des vapeurs.

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L'oxyde d'éthylène est utilisé dans l'industrie pour la désinfection de certains matériels en plastique à usage unique. Dans les centres hospitaliers, une enceinte est réservée à ce type de désinfection pour le matériel d'intubation par exemple, qui ne supporte pas l'échauffement. Ce matériel, acheté stérile passe une seule fois dans l'enceinte à oxyde d'éthylène, pour une deuxième utilisation, puis il est détruit. On peut noter que les types de stérilisation sont nombreux et que, quelque soit le matériel à traiter, il existe actuellement une méthode adaptée. A notre niveau, dans un laboratoire ou une salle de classe dans laquelle les élèves manipulent des souches bactériennes, il est indispensable de respecter les règles fondamentales de l’asepsie :  Port d'une blouse en coton, fermée.  Travail dans la zone de stérilité du bec Bunsen.  Flambage rapide des orifices des tubes à cultures et du matériel de prélèvement et d'ensemencement.  Immersion de toutes les lames et petit matériel dans l'eau de Javel.  Nettoyage rigoureux des mains avant et après la séance.  Nettoyage des paillasses et du matériel éventuellement contaminé.  Lavage à ébullition des blouses contaminées.

 Au niveau du laboratoire, les boîtes de Pétri et tubes de culture usagés seront
entièrement immergés dans de l'eau de Javel pendant 24 h. Les boîtes en plastique seront ensuite incinérées.

 La verrerie et tout le matériel supportant la chaleur seront soigneusement lavés puis
stérilisés dans une étuve à chaleur sèche (180°C pendant 30 à 45 minutes) ou un autoclave (120°C pendant 20 à 30 minutes).

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Conclusion
Bien qu’inconnus du public, les services de Stérilisation ont un rôle clé face au risque infectieux. Tout geste médical ou chirurgical dès qu’il est invasif comporte un risque infectieux, c’est à dire que tout dispositif médical introduit dans l’organisme est source potentielle d’infection. Il est donc nécessaire de nettoyer et de stériliser les dispositifs médicaux, à l’échelle des laboratoires et même dans notre vie quotidienne, c’est à dire détruire les micro-organismes présents sur le matériel après tout geste invasif. Compte tenu de la résistance des Agents Transmissibles Non Conventionnels (A.T.N.C.) ou prions, particules protéiques responsables de la maladie de Creutzfeldt-Jakob, les procédures de stérilisation ont été normalisées. Il s’agit de la mise en œuvre d’un ensemble de méthode et de moyens visant à éliminer par destruction tous les micro-organismes vivants de quelque nature et sous quelque forme que ce soit, portés par un objet parfaitement nettoyé. Stériliser, c’est l’opération permettant d’éliminer ou de tuer les micro-organismes portés par des milieux inertes contaminés, le résultat de l’opération, non limité à la durée de l’application, étant l’état de stérilité. Les procédures de stérilisation visent à limiter les contaminations microbiennes à l’origine d’infections nosocomiales, sources de complications pour les patients et coûteuses pour la collectivité.

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