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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET

POPULAIRE
MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR
ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE -EL HADJ LAKHDER -BATNA
FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE


MEMOIRE
Pour lobtention du diplme de
MAGISTER
En Biologie
Option : Biochimie Applique

Prsent par
DJEMAI ZOUGHLACHE SOUMIA

THEME





Devant le jury :
* M
me
HAMBABA L. Matre de confrences, universit de Batna Prsidente
* M
r
YAHIA M. Matre de confrences, universit de Batna Rapporteur
* M
r
LAROUI S. Matre de confrences, universit de Batna Examinateur
* M
me
ZAAMA D. Matre de confrences, universit de Constantine Examinatrice
*M
r
YAHIA A. Matre de confrences, universit dOum Examinateur
El Bouagui

Anne Universitaire : 2008/2009
Etude de lactivit biologique des extraits
du fruit de Zizyphus lotus L.

Remerciement


Avant toute chose, je remercie Dieu, le tout puissant, pour mavoir donne la force
et la patience.
Jexprime dabord mes profonds remerciements et ma vive connaissance M
r

YAHIA M, Matre de confrences la facult des sciences Universit de Batna
pour avoir encadr et dirig ce travail avec une grande rigueur scientifique, sa
disponibilit, ses conseils et la confiance quil maccord mont permet de raliser
ce travail.
Jexprime mes vifs remerciements M
me
HAMBABA L, Matre de confrences
lUniversit de Batna pour sa prcieuse aide et ses conseils, et pour lhonneur
quelle nous a fait en acceptant de prsider le jury de ce mmoire
Je tiens exprimer galement ma profonde reconnaissance au M
r
ABDEDDAIM
M, Matre assistant- charg de cours de lUniversit de Batna tout dabord pour
mavoir fait confiance et pour mavoir inspir le sujet ensuite pour ses orientations
judicieuses.
Je tiens exprimer ma trs grande considration et ma vive reconnaissance M
me

ZAAMA D, Matre de confrences Universit de Constantine pour lhonneur
quelle nous a fait en acceptant de faire partie de jury.
Mes remerciements M
r
YAHIA A, Matre de confrences Universit de Oum
ElBougui davoir bien voulu accepter de juger ce travail.
Mes remerciements vont galement M
r
LAROUI S, Matre de confrences
Universit de Batna davoir accepter de faire partie du jury.
Jexprime mes vifs remerciements aux M
r
ABERKANE M-CH et M
r
AYACHI qui
nous permet de raliser une grande partie de mon travail au sein de leurs
laboratoires.










En guise de reconnaissance, je ddie ce travail
mes chers parents, ma famille
ainsi qu toutes mes amies.

Sommaire
Liste des tableaux
Liste des Figures
Introduction gnrale

Partie I
Etude bibliographique

Chapitre I. Gnralits sur le Zizyphus lotus
I-1-Description botanique du Zizyphus lotus ..1
I-2-Classification botanique 1
I-3-Rpartition gographique. 2
I-4-Composition biochimique du Zizyphus lotus 3
I-5-Activits biologiques et thrapeutiques du Zizyphus lotus 4
I.5.1. Activits anti-inflammatoires et analgsiques 4
I.5.2. Activits anti-fongiques et anti-mollusques .4
I.5.3. Activits anti-ulcrogniques4
I.5.4. Autres activits .5

Chapitre II. Les composs phnoliques
II.1. les flavonodes 7
II.1.1.Localisation et distribution 7
II.1.2.Structure chimique et classification.. 7
II.1.3.Activits biologiques des flavonodes.. 8
II.2. Les tanins 12
II.2.1. Localisation et distribution.. 12
II.2.2.structure chimique et classification.. 12
II.2.3.Activits biologiques et thrapeutiques des tanins. 14
Chapitre III : Les espces ractives oxygnes et stress oxydant
III.1.les espces ractives oxygnes 19
III.2. Sources des espces ractives oxygnes 20
III.2.1.sources exognes. 20
III.2.2. Sources endognes 21
III. 3. Stress oxydant 23
III.4. Les antioxydants. 23
III.4.1. Les antioxydants enzymatiques.. 23
III.4.2. les antioxydants non enzymatiques 24

Partie II
Etude Exprimental
Chapitre I. Matriel et mthodes
I.1. Matriel25
I.1. 1. Matriel vgtal 25
I.2. Mthodes. 25
I.2.1. Dtermination de la teneur en eau 25
I.2.2. Dtermination de la teneur en cendre 26
I.2.3. Prparation des extraits partir des fruits du Zizyphus lotus . 26
I.2.3.1. Extractions avec des solvants polarit croissante. 26
I.2.3.2. Extrait aqueux .. 26
I.2.4. Analyse des extraits du Zizyphus lotus 27
I.2.4.1. Analyse qualitative des extraits du Zizyphus lotus.. 27
I.2.4.1.1.Tests prliminaires 27
I.2.4.1. 2.Chromatographie sur couche mince 28
I.2.4.1. 3.Chromatographie liquide haute performance HPLC RP-C18. 28
I.2.4.2. Analyse quantitative des extraits du Zizyphus lotus 29
I.2.4.2.1. Dosage des polyphnols 29
I.2.4.2.2. Dosage des flavonodes. 29
I.2.4.2.3. Dosage des tanins condenss. 30
I.2.5. Tests des activits biologiques. 30
I.2.5.1. Activit antimicrobienne... 30
I.2.5.2. Tests dactivit antioxydante.31
I.2.5.2.1. Test du blanchissement du carotne31
I.2.5.2.2. Effet scavenger du radical DPPH... 32
I.2.5.2.3. Analyses statistiques.. 32


Chapitre II. Rsultats et discussion
II.1. Dtermination de la teneur en eau dans les fruits du Zizyphus lotus.33
II.2. Dtermination de la teneur en cendre dans les fruits du Zizyphus lotus33
II.3. Prparation des extraits partir des fruits du Zizyphus lotus34
II.4. Analyse des extraits du Zizyphus lotus. 35
II.4.1.Analyse qualitative des extraits du Zizyphus lotus ... 35
II.4.1.1.Test prliminaire. 35
II.4.1.2. Analyses chromatographiques.36
II.4.1.2.1. Chromatographie sur couche mince 36
II.4.1.2.2. Chromatographie liquide haute performance HPLC RP-C18 39
II.4.2. Analyse quantitative des extraits des fruits du Zizyphus lotus...44
II.5. Activits biologiques......................................................................................... 49
II.5.1. Activit antimicrobienne des extraits du Zizyphus lotus ...49
II.5.2. Activit antioxydante 52
II.5.2.1. Test du blanchissement du -carotne52
II.5.2.2. Effet scavenger du radical DPPH56
Conclusion gnrale
Rfrences bibliographiques










Liste des abrviations

AAR : Activit antioxydante relative
ANOVA : Analyse de variance
APR : Pouvoir antiradicalaire
AQ: Extrait aqueux
ATTC : Collection du type Amricain de culture
BHT: Butylated hydroxytoluen
BAW: n-Butanol/Acide actique/eau
CCM: Chromatographie sur couche mince
DMSO: Dimthylsulfoxyde
DPPH:1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
EC
50
: Concentration effective 50%
EDCM: Extrait dichloromthanique
ET: extrait thrique
HPLC: Chromatographie liquide haute performance
IC
50
: Concentration inhibitrice 50%
MET:Extrait mthanolique
Mg EAG/g dextrait: milligramme dquivalent acide gallique par gramme dextrait
Mg ECT/g dextrait : milligramme dquivalent catchine par gramme dextrait
Mg EQ/g dextrait : milligramme dquivalent querctine par gramme dextrait
MO : Matire organique
RF : Rapport frontal
SD : Standard dviation
TR : Temps de rtention
UV : Ultrat violet





Liste des tableaux




N
0
du tableau Titre du Tableau Page
Tableau1. Teneur de la pulpe du jujubier frais en mtabolite primaire.. 3
Tableau 2. Composition en mtabolites secondaires des diffrents organes de
Zizyphus lotus ................................................................................................

3
Tableau 3. Principales espces ractives oxygnes ... 19
Tableau 4. La teneur en eau et de matire sche des fruits du Zizyphus lotus ............... 33
Tableau 5. La teneur en cendre et de matire organique des fruits du Zizyphus lotus 33
Tableau 6. Aspects, couleurs et rendement des divers extraits du fruit du Zizyphus
lotus................................................................................................................

34
Tableau 7. Rsultats des testes prliminaires des flavonoides et des tanins sur les
diffrents extraits du Zizyphus lotus...............................................................

35
Tableau 8. Rapports frontaux et couleurs aprs rvlation des standards... 38
Tableau 9. Temps de rtention des standards tests 41
Tableau 10. Les standards dtects dans les diffrents extraits du Zizyphus lotus............ 41
Tableau 11. Dosage des polyphnols totaux, des flavonoides et des tanins condenss
dans les diffrents extraits du fruit du Zizyphus lotus

45
Tableau 12. Diamtres des zones dinhibition de la croissance microbienne obtenus par
diffrents extraits du Zizyphus lotus ..............................................................

49
Tableau 13. Activit antiradicalaire des extraits du fruit du Zizyphus lotus..

57


Listes des figures







N
0
de
figure
Titres des figures
Page
Figure 1. Les diffrentes parties du Zizyphus lotus... 1
Figure 2. Aire de rpartition du Zizyphus lotus L en Algrie... 2
Figure 3. Quelques structures des composs phnoliques 6
Figure 4. Squelette de base des flavonoides.......................................................... 7
Figure 5. Elments essentiels pour lactivit antioxydante des flavonoides......... 10
Figure 6. Pigeage des espces ractives oxygnes par les flavonoides............. 10
Figure 7. Structure des tanins condenss et leur monomre. 13
Figure 8. Structure des tanins hydrolysables et les acides associs.. 14
Figure 9. Les diffrentes espces ractives oxygnes. 20
Figure10. Origine et rponse cellulaire aux ROS.. 24
Figure 11. Diffrentes parties du fruit du Zizyphus lotus........ 25
Figure 12. Diffrentes tapes dextraction par puisement successive du matriel
vgtal

27
Figure 13. La raction entre la vanilline est les tanins condenss.......................... 30
Figure 14. Chromatographie sur couche mince des extraits polaires des fruits
du Zizyphus lotus aprs rvlation par la vanilline sulfurique...............


36
Figure 15. Chromatographie sur couche mince des extraits des fruits du
Zizyphus lotus (Observation sous la lampe UV (254nm)).....


37
Figure16. Chromatographie sur couche mince des extraits apolaires des fruits
du Zizyphus lotus (Rvlation par la vanilline sulfurique)


37
Figure 17. Chromatographie sur couche mince des extraits des fruits du
Zizyphus lotus (Rvlation par une solution de DPPH).


38
Figure 18. Chromatogrammes des diffrents standards tests dans lHPLC 40
Figure 19. Chromatogrammes obtenus pour lextrait thrique du Zizyphus
lotus.......................................................................................................

42
Figure 20. Chromatogrammes obtenus pour lextrait du dichloromthane du
Zizyphus lotus


43
Figure 21. Chromatogrammes obtenus pour lextrait mthanolique du Zizyphus
lotus

43
Figure 22. Chromatogrammes obtenus pour lextrait aqueux du Zizyphus lotus 44
Figure 23. Droite dtalonnage de lacide gallique............................................. 46
Figure 24. Droite dtalonnage de la querctine.
.
47
Figure 25. Droite dtalonnage de la catchine....................................................... 47
Figure 26. Corrlation linaire entre la quantit en polyphnols totaux et la
quantit des flavonoides des diffrents extraits du fruit Zizyphus
lotus (p0,05).


48






Figure 27. Corrlation linaire entre la quantit en polyphnols totaux et la
quantit des tanins condenss des diffrents extraits du fruit Zizyphus
lotus (p0,05).........................................................................................



48
Figure 28. Structure de la paroi bactrienne... 50
Figure 29. Zones dinhibitions obtenues par diffrents extraits.............................. 51
Figure 30.
Figure 31.

Figure 32.
Structure chimique de -carotne..
Cintique de blanchissement du -carotne 490 nm en absence et
en prsence des extraits du Zizuphus lotus, du BHT............................
Activit antioxydante relative des extraits du fruit du Zizyphus lotus,
du BHT dans le systme carotne /acide linolique...


52

54

54
Figure 33. Corrlation linaire entre la teneur en polyphnols et le pourcentage
de lactivit antioxydante relative.......................

55
Figure 34. Corrlation linaire entre la teneur en tanins et le pourcentage
de lactivit antioxydante relative..


55
Figure 35. Raction dun antioxydant avec le DPPH............................................. 56
Figure 36. Activit antiradicalaire des extraits polaires (MET, AQ) des fruits
du Zizyphus lotus..

59
Figure 37. Activit antiradicalaire des extraits apolaires (DCM, ET) des fruitsdu
Zizyphus lotus.


59
Figure 38. Activit antiradicalaire des standards la querctine , le BHT,la rutine
et la vitamine C..


60
Figure 39. Corrlation linaire entre la teneur en flavonoides et le pouvoir
antiradicalaire (p0,01).


60

Introduction gnrale

Les plantes mdicinales reprsentent une source inpuisable des substances et
composs naturels bioactifs. En effet, les mtabolites secondaires font et restent
lobjet de nombreuses recherches in vivo comme in vitro, notamment la recherche de
nouveaux constituants naturels tels que les composs phnoliques.
Rcemment le dveloppement de la rsistance microbienne aux antibiotiques, et
la toxicit des antioxydants synthtiques, a conduit de chercher des substances
naturelles dotes dactivit antimicrobienne et antioxydante.
Les radicaux libres (RL) en gnral et les espces ractives de loxygne (ROS)
en particulier sont impliqus dans plusieurs pathologies humaines allant de
linflammation au cancer tout en passant par les maladies cardio-vasculaires,
larthrite rhumatode, le diabte et le processus dapoptose ; en plus de leur action
directe en ragissant avec la plupart des macromolcules.
Dans ce contexte sinscrit ce prsent travail de recherche, dont le but principal est
dtudier les activits antimicrobiennes et antioxydantes des diffrents extraits du fruit
du Zizyphus lotus (Sedra), plante largement utilise dans la mdecine traditionnelle
comme adoucissant dans le traitement de la gorge et les irritations broncho-
pulmonaires, un mollient dans le traitement des furoncles. Dailleurs, elle possde
plusieurs activits thrapeutiques : anti-inflammatoire, analgsique, anti-
ulcrognique, antifongique et antidiabtique

Dans ce prsent travail, nous avons fix les objectifs suivants :
Analyse qualitative des diffrents extraits aqueux et organiques du fruit du
Zizyphus lotus en utilisant la CCM et lHPLC
Analyse quantitative du contenu en polyphnols, et en flavonoides et tanins
des diffrents extraits du fruit du Zizyphus lotus.
Etude de lactivit antimicrobienne des diffrents extraits du fruit du
Zizyphus lotus
Etude de lactivit antioxydante des diffrents extraits du fruit du Zizyphus
lotus, en utilisant deux mthodes (Test de blanchissement du -carotne et
test au DPPH).





















Chapitre I
Gnralits sur le Zizyphus lotus

Chapitre I Gnralits sur le Zizyphus lotus


1
I.1. Description botanique du Zizyphus lotus
Le Zizyphus lotus (jujubier) est un arbuste fruitier, pineux appartenant la famille
des Rhamnaces (Rsaissi et Bouchache, 2002). Communment appel en Afrique du Nord
Sedra (Borgi et al ., 2007(a)). Il forme des touffes de quelques mtres de diamtres pouvant
atteindre 2m de haut.
Ses feuilles sont courtement ptioles, glabres, caduques alternes et ovales marges
entires. Chaque feuille porte sa base deux stipules transformes en pine ingale et
vulnrable. Les fleurs sont jaunes, pentamtres et groupes en inflorescence cymeuses. Les
fruits sont des drupes noyaux souds, lendocarpe mucilagineux appel Nbeg (Figure 1)
(Rsaissi et Bouchache, 2002).











Figure 1. Les diffrentes parties du Zizyphus lotus (Rsaissi et Bouchache, 2002)


I.2. Classification botanique
Embranchement : Spermatophytes.
Sous embranchement : Angiospermes.
Sous classe : Dicotyldone.
Ordre : Celastrales
Famille : Rhamnaces.
Genre : Zizyphus.
Espce : Zizyphus lotus L. (Quezel et Santa, 1962).

Chapitre I Gnralits sur le Zizyphus lotus


2
I.3. Rpartition gographique
Dans le monde
Le genre Zizyphus renferme environ 50 espces des rgions tropicales et subtropicales
des deux hmisphres. Lune entre elles, Zizyphus lotus, est spontane dans le sud dEspagne
et du Portugal, en Sicile, en Grce (Bross ,2000). On le rencontre aussi dans les steppes
dsertiques dAfrique du Nord et Asie Mineure (Paris et Dillemann, 1960).
En Algrie
Le Zizyphus lotus est rpandu dans toute lAlgrie sauf le Tell Algro-constantinois
(Quezel et Santa, 1962).


Aire de Zizyphus lotus L.

Figure 2. Aire de rpartition du Zizyphus lotus L en Algrie (Quezel et Santa, 1962).








Chapitre I Gnralits sur le Zizyphus lotus


3
I.4. Composition biochimique du Zizyphus lotus
Les tudes phytochimiques mene sur le Zizyphus lotus montrent la prsence de mtabolites
primaires et secondaires.
a) mtabolite primaire
Tableau 1. Teneur de la pulpe du jujubier frais en mtabolite primaire (Catoire et al ., 1999).

La fraction de la pulpe du fruit Le pourcentage
sucres 20% 32%
lipides 0,1% 0,3%
protides 0,8% 2,1%

b) mtabolites secondaires
Le Zizyphus lotus est connu par son contenu en molcules biologiquement actives tels que
les polyphnols (flavonoides, tanins), les triterpnes, les antrachinones, les alcalodes
(cyclopeptides et isoquinolides), les saponosides (Borgi et Chouchane, 2006 ; Catoire et al.,
1994).

Tableau 2. Composition en mtabolites secondaires des diffrents organes du Zizyphus lotus :

Organe vgtal Composition chimique Rfrences
Fruits -flavonoides, tanins saponines, alcalodes
(Borgi et al .,2007 (b))



Feuilles

-flavonoides, tanins, alcalodes.
-saponines de type dammarane :
-jujuboside B
-jujubogenin glycoside
-driv sulfat de jujubasaponine IV

(Borgi et al .,2007 (b))

(Macuek et al .,2004)


Ecorce des racines

-flavonoides, saponines de type damarane.
-tanins.
-alcalode cyclopeptidiques lotusines A-G

(Borgi et al .,2007(a))

(Borgi et al .,2007(b))
(Le crouour, 2002)

Chapitre I Gnralits sur le Zizyphus lotus


4
I.5. Activits biologiques et thrapeutiques du Zizyphus lotus
Les diffrentes espces du Zizyphus sont largement utilises dans le traitement de
certaines maladies comme : les troubles digestives, la faiblesse, les affections du foie,
lobsit, les troubles urinaires, le diabte, les infections cutanes, la fivre, la diarrhe et
linsomnie (Abu-Zarga et al .,1995,Abdel-Zaher et al ., 2005 ; Suksamrarn et al ., 2005). Les
recherches actuelles sur les diffrentes activits pharmacologiques de Zizyphus lotus ont
ressorti plusieurs effets de grande importance pour la mdecine moderne. Parmi ces effets on
souligne les plus importants :

I.5.1. Activits anti-inflammatoires et analgsiques
Les flavonodes et les saponines de lcorce des racines du Zizyphus lotus ont montr une
activit anti-inflammatoire significative (Borgi et Chouchane, 2006).
Le Zizyphus lotus inhibe la production de monoxyde dazote (NO), cette activit apparat
potentiellement avec lextrait mthanolique de lcorce des racines qui est la source possible
de lagent anti-inflammatoire dans la raction de lhypersensibilit retarde induite par
oxazolone (Borgi et al ., 2008).
Les feuilles du Zizyphus lotus possdent des effets analgsiques attribus leur contenu en
principes actifs ; les flavonoides et les saponines (Borgi et al ., 2007 (a). Borgi et al ., 2008).
Toutes ces activits confirment lusage traditionnel de cette plante dans certaines
maladies inflammatoires et douloureuses (Borgi et al ., 2007(a)).

I.5.2. Activits anti-fongiques et anti-mollusques
Les diffrents extraits (thr, chloroformique, extrait dactate dthyle et mthanolique)
de Zizyphus lotus se sont avrs trs actifs in vitro vis--vis de neufs souches des
champignons pathognes et des mollusques Balinus truncatus (htes intermdiaires et
vecteurs de la transmission de la bilharziose) (Lahlou et al ., 2002).

I.5.3. Activits anti-ulcrogniques
Le Zizyphus lotus (les feuilles, lcorce des racines) possde une importante activit anti-
ulcrognique attribue la prsence des tanins et des flavonodes connus par leur effets
gastroprotecteur (Borgi et al ., 2007(b)).



Chapitre I Gnralits sur le Zizyphus lotus


5
I.5.4. Autres activits
Les fruits de Zizyphus lotus sont dcrits comme adoucissant, et entrent dans le traitement de
la gorge et les irritations broncho-pulmonaires. De mme, la poudre des feuilles sches et des
fruits est applique dans le traitement des furoncles (Borgi et al ., 2007(a)). Dailleurs lcorce
des racines du Zizyphus lotus est utilise dans la mdecine traditionnelle dans le traitement du
diabte (Ghedira et al .,1995).

















Chapitre II
Les composs phnoliques

Chapitre II Les composs phnoliques

6
Les composants phnoliques sont des mtabolites secondaires caractriss par la
prsence dun cycle aromatique portant des groupements hydroxyles libres ou engags
avec des glucides.
Ils sont prsents dans toutes les parties des vgtaux suprieures (racines, tiges,
feuilles, fleurs, pollens, fruits, graines et bois) ; et sont impliqus dans de nombreux
processus physiologiques comme la croissance cellulaire, la rhizognse, la germination
des graines et la maturation des fruits (Boizot et Charpentier, 2006).
Les principaux classes des composants phnoliques sont les acides phnoliques
(acide cafique, acide hydroxycinnamique, acide ferulique, acide chlorogenique), les
flavonoides, les tanins, et les coumarines (King et Young, 1999 ; Tapiero et al ., 2002).
Les composants phnoliques sont des molcules biologiquement actives (King et
Young, 1999), ils sont largement utiliss en thrapeutique comme vasoconstricteurs, anti-
inflammatoires, inhibiteurs enzymatiques, antioxydants et antiradicalaires, antimicrobiens,
(Bahorun, 1997 ; Cetkovic et al ., 2008) (Figure 3).

Figure 3. Quelques structures des composants phnoliques (Gervaise ,2004).


Chapitre II Les composs phnoliques

7
II.1. Les flavonodes
Les flavonoides dsignent une trs large gamme de composs naturels appartenant
la famille des polyphnols (Marfak, 2003).
Ces molcules sont considres comme des pigments quasiment universels des vgtaux ;
ils sont responsables de la coloration des fleurs, des fruits et parfois des feuilles (Bruneton,
1999). Ils existent le plus souvent ltat naturel sous forme dhtrosides (Ghestem et al .,
2001)

II.1.2. Localisation et distribution
Les flavonodes sont amplement rpandus dans le rgne vgtal (graines, fleurs,
fruits, feuilles) (Dacosta, 2003). On les trouve aussi chez les Psylotales, les Fougres,
Angiospermes, Asteraceae etc.
Les formes htrosidiques des flavonodes hydrosolubles saccumulent dans les
vacuoles, et selon les espces se concentrent dans lpiderme des feuilles, ou se
rpartissent entre lpiderme et le msophile. Dans le cas des fleures, ils sont concentrs
dans les cellules pidermiques (Bruneton, 1999).

II.1.3. Structure chimique et classification

Les flavonodes sont des drivs benzo--pyran (Skerget et al ., 2004). Leur structure
de base est celle dun diphnylpropane 15 atomes de carbone (C
6
-C
3
-C
6
), constitu de
deux noyaux aromatiques (ou anneaux) que dsignent les lettres A et B, relis par un
htrocycles oxygns, qui dsigne la lettre C (figure 4) (Dacosta, 2003).

Figure 4 : Squelette de base des flavonoides (Girotti-Chanu, 2006).

La classe des flavonodes comporte elle seule plus de 4000 substances qui ont t
isoles et identifies partir des milliers des plante (Forkmann et Martens, 2001), quen
divise en plusieurs catgories : Les flavones, les flavonols et les dihydroflavonols, les
Chapitre II Les composs phnoliques

8
isoflavonoides, les biflavonoides, les flavanones, les flavanols, les flavanediols
(leucocyanidines), les anthocyanidines, les chalcones et les dihydrochalcones, les aurones
(Dacosta, 2003).

II.1.4. Activits biologiques des flavonodes
Les flavonodes sont des composants naturels hautement actifs. Plusieurs tudes ont
dmontr une large gamme des effets biochimiques et pharmacologiques de ces molcules.

a) Activit anti-inflammatoire des flavonoides
De nombreux travaux semblent indiquer que les flavonoides possdent des proprits
anti-inflammatoires (Milane, 2004). Sous laction de la cyclooxygnase (CO) et la
lipooxygnase (LO), lacide arachidonique se mtabolise respectivement en
prostaglandines, et leucotrines induisant ainsi des phnomnes inflammatoires (Marfak,
2003 ; Formica et Regelson, 1995). Les flavonodes inhibent la synthse des eicosanodes
par inhibition de lactivit de LO et CO, aussi ils provoquent linhibition de la
perooxydation non enzymatique des acides gras poly insaturs ncessaires pour lactivation
de ces oxygnases ce qui provoque un effet anti-inflammatoire (Formica et Regelson
,1995).
Par ailleurs, les flavonodes ont un effet polliatif sur linflammation d ses effets
inhibiteurs sur la synthse des leucotrines et la libration de lhistamine, et ses activits
comme pigeurs de superoxyde (Formica et Regelson ,1995)

b) Flavonodes comme inhibiteurs enzymatiques
Les favonodes sont des inhibiteurs enzymatiques, ils inhibent plusieurs enzymes
intervenant dans divers mcanismes biologiques.
Il inhibent lhistidine dcarboxylase, llastase , la hyaluronidase ce qui permettrait
de conserver lintgrit de la substance fondamentale de la gaine vasculaire ; ils inhibent
aussi d une manire non spcifique la catchol-O-mthyltransferase ,ce qui augmenterait
la quantit de la catcholamine disponible et donc provoquerait une lvation de la
rsistance vasculaire.
En plus, les flavonoides inhibent la phosphodiestrase de lAMP
C
ce qui pourrait
expliquer leur activit anti-agrgante plaquettaire ; aussi, ils inhibent laldose rductase
quest implique dans la pathognie de la cataracte (Bruneton, 1999).
Chapitre II Les composs phnoliques

9
Par ailleurs, les flavonodes peuvent inhiber la promotion de tumeur travers un
effet inhibiteur sur la phosphoxylase C et la protine kinase (Formica et Regelson, 1995).

c) Flavonodes et les maladies cardiovasculaires
Les flavonodes sont des composs veinoactifs, ils sont capables de diminuer la
permabilit des capillaires sanguins et de renfoncer leur rsistance .Cette action est
appele vitaminique P (Bruneton, 1999).
Dailleurs, ils ont un effet protecteur des maladies cordiovasculaires.Ils induisent la
vasodilatation et provoquent la relaxation des muscles lisses cardiovasculaires ce qui
engendre une activit anti-hypertensive et des effets antiarrhythmiques.En plus les
flavonodes protgent LDL de loxydation et par consquent empchent la formation des
plaques athrosclerotiques, aussi, ils ont des effets antithrombotiques travers
lempchement de lagrgation plaquettaire (Formica et Regelson, 1995).

d) Activit antioxydante des flavonoides
Les flavonoides possdent une forte activit antioxydante quest le principe de
plusieurs activits biologiques doues par ces molcules (Saija et al ., 1995).
Lactivit du pigeage des radicaux libres est lun des mcanismes importants de
lactivit antioxydante, pour les flavonoides, ce mcanisme est li leur structure et de
larrangement des groupements hydroxyles (Sokol-Letowska A et al ., 2007).
Des tudes faites sur la capacit des flavonoides piger les radicaux libres ont
montr que les composs les plus actifs sont ceux qui combinent les trois critres suivants :
La structure ortho dihydroxy sur le cycle B (groupement catchol) qui confre la
stabilit au radical flavonoxy et participe la dlocalisation des lectrons.
La double liaison C
2
-C
3
en conjugaison avec la fonction 4-oxo
La prsence du groupe 3OH en combinaison avec la double liaison C
2
-C
3.

A titre dexemple, la querctine satisfait tous ces critres et par consquent, elle est
le compos le plus actif de la famille des flavonoides (figure 5) (Marfak, 2003).
Chapitre II Les composs phnoliques

10

Figure 5. Elments essentiels pour lactivit antioxydante des flavonoides
(Marfak, 2003)
La proprit antiradicalaire des flavonoides est dirige principalement vers HO

et
O
2
-
aussi les radicaux peroxyl et alkoxyl.
En plus, comme ces composants prsentent une forte affinit pour les ions du fer
(catalysent plusieurs processus conduisant lapparition des radicaux libres), leur activit
antiperoxydative peut tre aussi attribue une capacit concomitante de chlation du fer
(Saija et al .,1995).
Par ailleurs, linhibition des enzymes prsente un autre mcanisme de lactivit
antioxydante, les flavonoides peuvent agir sur lactivit de la xanthine oxydase et par
consquent, peuvent faire rgresser la maladie de la goutte en rduisant la fois les
concentrations dacide urique et celle du radical superoxyde dans les tissus humains.
Une tude faite a montr que les flavonoides sont aussi des bons inhibiteurs dautres
enzymes responsables de la production des radicaux libres comme la cyclooxygnase et la
lipooxygnase (figure 6) (Marfak, 2003).

Figure 6. Pigeage des espces ractives oxygnes par les flavonoides (Marfak, 2003)

e) Effet anticancreux des flavonodes
Certains flavonoides possdent une activit antitumeurale et anticancrogenique
significative .Par blocage de la production de la tumeur de la peau, la querctine peut tre
considre effectif dans la prvention du cancer de la peau.
Chapitre II Les composs phnoliques

11
Linhibition de la glyoxylase I par la querctine peut tre explique son activit
anticancerogne, comme le systme glyoxylase joue un rle dans la production de D
lactate et la rgnration du glutathion ,des facteurs importants dans linduction du tumeur
et la croissance (Formica et Regelson,1995).
Dailleurs, la querctine inhibe la croissance cellulaire en empchant certaines
phases du cycle cellulaire et en bloquant les sites rcepteurs des hormones (Marfak, 2003).

f) Activit antimicrobienne des flavonodes
Les flavonoides possdent des proprits antimicrobiennes (Petit et al ., 2007). Ils
sont capables dagir au niveau de la synthse des protines virales. Mucsi et Pragai en
1985 ont galement montr une corrlation entre leffet inhibiteur de certains flavonoides
sur divers virus dherps et leur capacit augmenter les taux intracellulaires en AMP
C

dans les cellules infectes .Des travaux ont mis en vidence un impact des flavonoides sur
le rtrovirus HIV responsable du syndrome dimmunodficience acquise (SIDA), aussi les
flavonoides se sont avrs de bons inhibiteurs de transcriptase reverse.
Autre tude a montr que, les flavonoides pouvaient avoir une action plus slective
en interagissant avec une glycoprotine de surface du virus HIV, empchant ainsi la liaison
du virus la cellule hte .Enfin, les flavonoides seraient susceptibles dinhiber lintgrase
rtrovirale du virus HIV-1.Cette enzyme permet lintgration du gnome viral celui de la
cellule hte.
Thoriquement, les flavonoides pourraient exercer des effets antibactriens puisquils
sont de puissants inhibiteurs in vitro de lADN gyrase. Dautre part, une tude a montr
leffet bactricide de diffrentes flavanones sur un Staphylococcus aureus.
Une tude rcente a montr leffet antibactrien de certains flavonoides isols de
Dorstenia barteri (Mbaveng et al ., 2008).
Lactivit antifongique des flavonoides est aussi tablie, une tude faite sur Dianthus
caryophyllus a mont lefficacit de ses flavonoides sur des souches fongiques (Galeotti et
al ., 2008).
Le mcanisme des effets antimicrobiens des polyphnols est sans doute trs
complexe .parmi les hypothses avances, il faut citer :
Linhibition des enzymes extracellulaires microbiennes.
Squestration de substrat ncessaire la croissance microbienne ou la chlation
de mtaux tels que le fer.
Linhibition du mtabolisme microbien (Milane, 2004).
Chapitre II Les composs phnoliques

12
g) Autres activits des flavonodes
A ct des activits cites prcdemment, les flavonoides possdent dautres
activits :
Activit anti-allergique, antihpatotoxique, anti-ostoporotique (Ielpo et al ., 2000),
activit hypocholestrolmiante (Formica et Regelson,1995), activit antidiabtique
(Marfak,2003), activit antimitotique,antiprotozoaires et activit anxiolytique (Cabrera et
al.,2007).

II.2. Les tanins
Les tanins sont des mtabolites secondaires polyphnoliques (Khanbabaee et Ree,
2001), hydrosolubles de masse molaire entre 500-2000D. Leur structure chimique leur
confre une capacit trs dveloppe de se fixer sur des molcules telles que les alcalodes,
la glatine, les polysaccharides, et essentiellement les protines (Zimmer et Cordesse,
1996 ; Bruneton, 1999). Parmi les caractristiques des tanins le got astringence qui est
une sensation tactile due la prcipitation des protines salivaires et qui cre une sensation
dasschement dans la bouche (Peronny, 2005).
Le rle biologique des tanins dans la plante est li sa propre protection contre les
infections ,les insectes et les animaux herbivores (Khanbabaee et Ree,2001),en plus de la
protection contre les attaques fongiques et bactriennes (Peronny,2005).

II.2.1. Localisation et distribution
Les tanins sont trs rpandus dans le rgne vgtal, ils sont particulirement
abondants chez les Conifres, les Fagace, les Rosace (Ghestem et al ., 2001).
Tous les organes vgtaux peuvent en renfermer (lcorce, le bois, les feuilles, les
fruits, les racines, les graines) (Khanbabaee et Ree ,2001).Les tanins sont prsents dans une
varit de plantes utilises dans lalimentation notamment les crales et les lgumineuses
(sorgho,millet,orge,haricots secs, petits pois, caroube et les fruits comme (pomme,mre
,canneberge, datte,raisin,aubpine, pche poire,kaki,prune,framboise et fraise
(Peronny,2005).
II.2.2. structure chimique et classification
A la base de leur caractristique structurale, il est possible de diviser les tanins en 2
groupes :
Tanins condenss (proanthocyanidines).
Chapitre II Les composs phnoliques

13
Tanins hydrolysables.

a)Tanins condenss (proanthocyanidines)
Ce sont des polymres ou oligomres flavanique, constitus dunits flavan-3-ols, le
plus souvent picatchine et catchine, avec un degr de polymrisation entre deux et plus
de 50 units (Khanbabaee et Ree ,2001) .Ces units lies entre elles par une seule liaison
carbone-carbone C
4
-C
8
ou C
4
-C
6
dans le type B des proanthocyanidines ;ou par une liaison
interflavanique double (C
4-
C
8
ou C
4-
C
6
) et (C
2
-O-C
7
) dans le type A (figure7)
(Bruneton,1999 ; Xie et Dixon,2005 ;Vivas et al ., 2006).












Figure 7. Structure des tanins condenss et leur monomre (Peronny, 2005).

b) Tanins hydrolysables
Ce sont des oligo ou des polyesters dun sucre (ou dun polyol apparent) et dun
nombre variable dacide phnolique. Le sucre est trs gnralement le glucose .Lacide
phnolique est soit lacide gallique dans le cas des tanins galliques, soit lacide
hexahydroxydiphnique (HHDP) et ses drivs dans le cas des tanins llagiques (Figure 8)
(Bruneton, 1999)
Chapitre II Les composs phnoliques

14


Figure 8. Structure des tanins hydrolysables et les acides associs (Peronny, 2005).

II.2.3. Activits biologiques et thrapeutiques des tanins
Les tanins sont des molcules biologiquement actives, doues dactivits
pharmacologiques remarquables et des effets significatifs sur la sant humaine (Chavan et
al ., 2001 ; Okuda, 2005).

a) Activits antimicrobiennes des tanins
Lactivit antimicrobienne des tanins est importante. La croissance de plusieurs
bactries, virus, champignons et levures est inhibe par les tanins (Chung et Wei, 2001).
-Activit antibactrienne
De nombreuses tudes ont montr lactivit antibactrienne des tanins .Ces
molcules ont t rapportes comme bactriostatique ou bactricide sur plusieurs souches
bactriennes :Aeromonas sobria, Bacillus anthracis, bolulinum, Desuomaculum
nigrificans , Klebsiella pneumonia, Plesiomonas shigelloides , Pseudomonas aeruginosa,
Pseud maltophila , solanacearum , Staphilococcus aureus , Staph epidermis ,
Streptococcus lactis , Strept mutans , Strept pneumonia , Strept sobrinus etc.
Chapitre II Les composs phnoliques

15
Chung et ses collaborateurs ont trouv que lacide tannique a inhib la croissance
des bactries des aliments comme :Alealigenes faecalis, Enterobacter aerogenes ,
Escherichia coli, K pneumonia , Proteus vulgaris , Pseud fluorescens ,Salmonella
enteritidis, S paratyphi,Staph aureus, Strept faecalis, Strept pyogenes et Yersinia
enterocolitica.
Les bactries intestinales humaines comme :Bacteroides fragilis , Clostridium
clostridiiforme, C perfringens , C paraputrficum, Enterobacter cloacae , Escherichia coli
et Salmonella typhimurium sont inhibes par lacide tannique (Chung et Wei, 2001).

-Activit antivirale
Lactivit antivirale des tanins est due la fixation des molcules des tanins
lenveloppe protique du virus ou la membrane de la cellule hte et par consquent
linhibition de ladsorption et la pntration virale ; cependant, dans certains cas la fixation
cause seulement des changements mineurs la surface virale, la pntration reste mais
lenlvement de lenveloppe virale est inhib. Plusieurs types de virus sont inactivs par les
tanins, le virus Herpes simplex (HSV-1 ,HSV-2) est inhib par les tanins hydrolysables et
les tanins condenss galloyls de plusieurs extraits des plantes (De Bruyne et al.,1999).
Les tanins ont aussi rapports dinactiver le virus tobacco mosaique, et poliovirus.
Lacide tannique est capable dinhiber la rplication du virus dinfluenza, Coxsackievirus,
echovirus, reovirus, virus dherpes (Chung et Wei, 2001).
Les oligomres proanthocyanidins prsentent une activit antivirale contre le virus
respiratoire syncytial (RSV), virus dinfluenza A (FLU-A) et le virus para influenza (PIV),
en outre lhpatite A et B.
Les tanins ont un autre effet inhibiteur de la rplication virale ,cest linhibition de la
transcriptase inverse des rtrovirus comme virus (HIV) ; cette inhibition est influence par
la galloylation, ltendue de loligomrisation ,la diffrence de la liaison inter-flavan, la
strochimie de la fonction 3 hydroxyle (De Bruyne et al.,1999).

Activit antifongique et anti-levure
Plusieurs types de champignons sont inhibs par les tanins .Les champignons
filamenteux comme Aspergillus niger ,Botrytis cinerea ,Chaetomium cupreum ,
Collectotrichum graminicola, Coniphora olivacea ,Coriolus versicolor, Crinepellis
perniciosa , Fomes annosus , Gloeophyllum trabeum, Merulius lacrymans, Penicillium,
Chapitre II Les composs phnoliques

16
Poria monticola ,Trametes hirsuta et Trichaderma viride sont inhibs par les tanins de
diffrentes prparations .
De mme, diffrentes levures incluant Saccharomyces crevisiae sont aussi sensitives
aux tanins (Chung et Wei, 2001).

b) Activit thrapeutique due lastringence
Par voie externe, les tanins impermabilisent les couches les plus externes de la peau
et des muqueuses, protgeant ainsi les couches sous-jacentes ; elles ont galement un effet
vasoconstricteur sur les petits vaisseaux superficiels.
En limitant les pertes en fluides et en empchant les agressions extrieurs, les tanins
favorisent la rgnration des tissus en cas de blessures superficielles ou de brlure
(Bruneton, 1999). Sur les blessures, les tanins induisent la cicatrisation par diffrents
mcanismes cellulaires, en favorisant la contraction de blessure, laugmentation de la
formation des vaisseaux capillaires et des fibroblastes ; et induisant la prolifration des
kratinocytes (Lopes et al ,2005).
Par voie interne, ils exercent un effet antidiarrhque (Bruneton, 1999), qui est du
linhibition de la motilit intestinale (De Bruyne et al. 1999).

c) Inhibition enzymatique
La fixation des tanins avec les protines peut tre engendre linhibition de plusieurs
enzymes (De Bruyne et al ., 1999). Le blocage de la 5-lipoxygnase par graniine,
corilagine , inhibition de lenzyme de conversion de langiotensine , de lactivation de la
hyaluronidase ,des glucosyltransferases des microorganismes impliqus dans la
cariogense ;inhibition des topoisomrases par la sanguiine H6 ou lacide chbulagique ;
inhibition de la protines kinase C par les tanins llagiques et les tanins complexes
(Bruneton,1999 ) ; inhibition de amylase salivaire humaine qui joue un rle dans la
formation des caries dentaires (Kandra et al ., 2004).
Dailleurs, les dimres procyanidoliques ont une activit inhibitrice sur lhistidine
dcarboxylase et llastase (Bruneton, 1999).





Chapitre II Les composs phnoliques

17
d) Activit antioxydante des tanins
Les tanins ont de grandes capacits antioxydantes dues leurs noyaux phnols
(Peronny, 2005) .Elles ont la particularit dinhiber la peroxydation des lipides, en agissant
comme donneur de proton et accepteur de radicaux libres, stoppant ainsi le mcanisme
dauto oxydation (Perret, 2001).
Les tanins hydrolysables et condenss sont 15 30 fois plus efficace que les phnols
simples (Peronny, 2005).De mme, il a t dmontr in vitro que les tanins sont plus
actives que les vitamines .Des tudes faites montrent que les procyanidines B
1
et B
3
sont
des antioxydants pour lacide linolique, et ils ont une activit antioxydante suprieure
celle de lacide ascorbique et l tocophrol.
Dans une autre tude faite sur la proprit du pigeage radicalaire, il a t remarqu
que les procyanidines dimriques peuvent emprisonner 8 radicaux pyroxyles alors que
lacide ascorbique emprisonne un seul radical, et l tocophrol emprisonne deux radicaux.
Uchida et ses collaborateurs suggrent que les tanins condenss galloyls ont une
action de pigeage radicalaire sur le radical 1-1 diphnyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) aussi
sur lanion superoxyde et OH

, OOH.
Plusieurs proprits structurales des tanins augmentent leur activit antioxydante :
La galloylation, prfrablement en position 3 augmente la capacit du pigeage pour les
deux O
2

et OH

, aussi le pigeage de O
2

est plus important pour les dimres procyanidines


coupls par une liaison (48) que les dimres lis par (46) (De Bruyne et al ., 1999).

e) Activit anti cancrognique des tanins
Le potentiel anticarcinognique des tanins peut tre li leur proprit antioxydante
qui apparat importante dans la protection cellulaire des dommages oxydatifs.
Plusieurs tudes montrent lactivit anticancrogniques des tanins, Migamato et
ses collaborateurs montrent lactivit anti tumorale de plusieurs oligomres des tanins
hydrolysables incluant : agrimoniin, oenothein B et coiiariin A contre la sarcoma (Chung et
Wei, 2001).Une tude faite sur la plante Eugenia jambos a t suggre que les tanins
hydrolysables de cette plante induisent lapoptose sur les cellules humaines leucmiques ce
qui prsente un autre mcanisme dactivit antioxydante des tanins (Yang et al .,2000).
Autre tude faite sur les tanins de sorghum suggre lactivit anticancrognique des
tanins de sorghum sur les cellules humaines de mlanome (Awika et Rooney, 2004).


Chapitre II Les composs phnoliques

18
f) Autres activits biologiques des tanins
Les tanins ont une activit anti inflammatoire .Tits et ses collaborateurs montrent
une importante activit anti inflammatoire des prodelphinidines isols de Ribes nigrum.
Les effets cardiaques et vasculaires des tanins sont aussi dmontrs, Calixto et ses
collaborateurs dnotrent que lacide tannique affecte la disponibilit du calcium pour la
contraction des muscles lisses et cardiaques .En effet par fixation de lacide tannique avec
le Ca
++
, lacide tannique prsente un effet hypotensif.
Dailleurs des tudes faites montrent leffet dinhibition dagrgation plaquettaire
dans le plasma humain et le plasma du rat par deux procyanidines trimriques et un dimre
thioether.
Outre ces activits, les tanins prsentent une activit antiulcreuse et antiparasitaire,
en effet, la consommation des plantes tanins peut affecter la biologie de certaines espces
de parasites intestinaux (Peronny, 2005).







Chapitre III
Les espces ractives oxygnes et
stress oxydant

Chapitre III Les espces ractives oxygnes et le stress oxydant
19
III.1. Les espces ractives oxygnes
La vie en arobie se traduit au niveau cellulaire par lexistence dune chane respiratoire
mitochondriale (Curtay et Robin ,2000) ; au niveau de laquelle loxygne est normalement
transform en eau .Cette raction de rduction implique quatre lectrons, et est rendue grce un
systme complexe de protines et denzymes (cytochromes). Elle permet dapporter la cellule toute
lnergie ncessaire sous forme dadnosine triphosphate (ATP) pour assurer ses fonctions vitales.
Ce processus mitochondrial nest toutefois pas parfait, car 2 5% de loxygne est transform en
espces ractives oxygnes (ERO) ou reactive oxygen species (ROS) (Gueye, 2007) ; qui sont des
formes varies de loxygne active, elles incluent les radicaux libres comme lanion superoxyde
(O
2
. -
) et le radical hydroxyle (
.
OH), et les espces non radicalaires qui sont des oxydants et/ou
facilement transformes en radicaux comme le peroxyde dhydrogne (H
2
O
2
) (Halliwell et
Whiteman, 2004) (tableau 3).

Tableau 3. Principales espces ractives oxygnes (Antwerpen, 2006).

Espces ractives oxygnes (ROS)
Radicalaires Non radicalaires
.
OH Radical hydroxyle
RO
.
Radical alkoxyl


ROO
.
Radical peroxyl
O
2
.
Anion superoxyde
NO
.
Radical oxynitrique
H
2
O
2
Peroxyde dhydrogne
ROOH Peroxyde organique
HOCl Acide hypichloreux

1
O
2
Oxygne singulet
ONOO

Peroxynitrite

Les radicaux libres oxygns sont des espces chimiques (atomes ou molcules) qui possdent
un ou plusieurs lectrons clibataires (lectron non appari) sur leur couche externe (Gueye, 2007).
Cela leur confre une grande ractivit chimique (Dacosta, 2003).
Leur hyperractivit les engage dans des ractions de dnaturation des constituants cellulaires
de type peroxydation avec les glucides, les lipides, les protines et lADN, formants des produits trs
instables .Ceux ci donnent lieu des ractions en chane gnrant de nouveaux radicaux libres
(Curtay et Robin, 2000).
Lespce ractive primaire de loxygne est lanion superoxyde (O
2

) qui rsulte de la
rduction univalente de loxygne molculaire.Une grande partie de lanion superoxyde est
Chapitre III Les espces ractives oxygnes et le stress oxydant
20
transforme en peroxyde dhydrogne (H
2
O
2
) sous leffet dune enzyme, le superoxyde dismutase
(Milane, 2004).
A son tour, le peroxyde dhydrogne selon la raction de Fenton peut se dcomposer en
prsence de cuivre cuivreux ou fer ferreux pour donner une espce hautement ractive et a dure de
vie trs courte, le radical hydroxyle (

OH) (figure 9) (Nzengue,2008).






Figure 9. Les diffrentes espces ractives oxygnes (Nzengue, 2008).


III.2. Sources des espces ractives oxygnes
Les ROS sont produits dans lorganisme par de nombreux mcanismes tant exognes ou
endognes (Figure 10).
III.2.1. Sources exognes
Lorganisme humain est soumis lagression de diffrents agents capables de donner naissance
des espces ractives oxygnes.
Les rayonnements UV induisent la synthse de radicaux libres (O
2

OH ,
1
O
2
) et des
molcules gnratrices de radicaux libres (H
2
O
2
) par lintermdiaire dagents photosensibilisants.
Chapitre III Les espces ractives oxygnes et le stress oxydant
21
Les radiations ionisantes provoquent galement la gnration de radicaux libres drivs de
loxygne.
Lingestion dalcool est suivie de la formation des radicaux libres selon divers mcanismes .La
xanthine oxydase et laldhyde oxydase peuvent oxyder le principal mtabolite de lthanol,
lactaldhyde, avec production dO
2

.
Lthanol stimule galement la production danion superoxyde par induction de la synthse
des NADPH oxydase, NADPH cytochrome rductase, et du cytochrome P450.Dautre part, Schisler
et Singh (1989) ont montr que lalcool pouvait diminuer lactivit des enzymes de protection (SOD-
GSH-Px).De mme, les concentrations sriques en slnium et vitamine E sont abaisses chez les
alcooliques et corrles avec une atteinte hpatique plus ou moins svre.
Des toxiques tels que monoxyde dazote (NO) et le dioxyde dazote (NO
2
), prsents dans notre
environnement (suies, goudron, tabac, polluants industriels) participent la gense de radicaux
libres, ils sont responsables dune auto-oxydation des acides gras polyinsaturs des alvoles
pulmonaires. NO, NO
2
peuvent aussi ragir avec le peroxyde dhydrogne produit par les
macrophages au niveau des alvoles pulmonaires et donner naissance des radicaux

OH .
La fume de cigarette joue un rle majeur dans la formation de ces espces radicalaires, elle
contient NO, NO
2
et des fortes concentrations en composs insaturs, et stimule par son action
irritante les macrophages des alvoles pulmonaires (Milane, 2004).
Dautres facteurs peuvent conduire la formation des ROS : les xnobiotiques (toxines,
pesticides, herbicides) et mdicaments, en plus des aliments qui peuvent contenir des oxydants
(Curtay et Robin, 2000 ; Diallo, 2005).

III.2.2. Sources endognes
Lune des sources majeurs des ROS est la chane respiratoire mitochondriale .Cette production
rsulte de laddition dun lectron loxygne molculaire.Une telle raction est catalyse par le
cytochrome oxydase mitochondrial.
O
2
+ O
2

(Marfak, 2003).
Autres chanes du transport dlectrons (ex : peroxymes et microsomes) contribuent galement
la production du O
2

dans la cellule arobiose .Les cytochromes P
450
et b
5
de la chane du
transport dlectron des microsomes peuvent produire des ROS quand ils interrompent le cycle
redox normal et dtournent le flux dlectrons vers lO
2
(Sevanian et al .,1990).
Chapitre III Les espces ractives oxygnes et le stress oxydant
22
Dautre part les ROS peuvent se produire au cours des processus pathologiques ou la
production du radical rpond une stimulation et intervient dans le processus
inflammatoire (NADPH oxydase et xanthine oxydase) (Antwerpen, 2006).
Les cellules phagocytaires actives sont le sige dun phnomne appel explosion
oxydative, consistant en lactivation du complexe NADPH oxydase, enzyme capable dutiliser
loxygne molculaire pour produire de grandes quantits danions superoxydes au niveau de la
membrane cellulaire. Ce mcanisme lorsquil est contrl est capital dans la lutte infectieuse car il
permet la phagocytose des bactries et des corps trangres (Favier, 2003). Dailleurs le systme
xanthine/xanthine oxydase permet aussi la production de lanion superoxyde :

Xanthine + 2O
2
+H
2
O xanthine oxydase acide urique +2O
2

+2H
+
(Marfak, 2003).

Une autre espce ractive oxygne produite au cours de linflammation est le peroxyde
dhydrogne (H
2
O
2
) ; en vue de ragir directement ou de produire lacide hypochloreux par
lintervention de myloperoxydase.Cette espce (HClO) est caractrise par un pouvoir oxydant
nettement plus lev que le H
2
O
2
.

H
3
+
O +H
2
O
2
+Cl

myloperoxydase HClO +2H
2
O ( Antwepen, 2006).

Le monoxyde dazote est produit aussi par un systme enzymatique NO synthtase (NOS),
des fins de mdiation par les neurones, les cellules endothliales ou les macrophages (Favier, 2003).
Dautres systmes sont capables de produire les ROS, citon par exemple : les ractions
catalyses par les lipooxygnases et cyclooxygnases dans la voie de synthse des leucotrines,
thromboxanes et prostaglandines (Babior et al ., 2002) ; les aldhydes oxydases ou les protines
hmiques qui peuvent oxyder leur fer (I) en fer (III) avec production du radical O
2


(Antwerpen,2006).
Cest ainsi lautooxydation des monoamines (dopamine, pinphrine, et norpinphrine) ; et
lhmoglobine en prsence de traces de mtaux peut galement tre lorigine de la production des
ROS (Gueye, 2007).





Chapitre III Les espces ractives oxygnes et le stress oxydant
23
III.3. Stress oxydant
Dans les circonstances normales, les ROS sont produites en faible quantit comme mdiateurs
tissulaires ou des rsidus des ractions nergtiques ou de dfense. Cette production physiologique
est parfaitement matrise par des systmes de dfense, dailleurs adaptifs par rapport au niveau de
radicaux prsents.
Dans ce cas, la balance antioxydant/prooxydant est en quilibre. Si tel nest pas le cas que ce
soit par dficit en antioxydants ou par la suite dune surproduction normes de radicaux, lexcs de
ces radicaux conduit au stress oxydant (Favier,2003 ; Haliwell et Whiteman ,2004).La production
excessive de radicaux libres provoque des lsions directes de molcules biologiques (oxydation de
lADN, des protines , des lipides, des glucides), mais aussi des lsions secondaires dues au
caractre cytotoxique et mutagne des mtabolites libres notamment lors de loxydation des
lipides.
En faisant apparatre des molcules biologiques anormales et en surexprimant certains gnes,
le stress oxydant sera la principale cause initiale de plusieurs maladies : cancer, cataracte, sclrose
latrale amyotrophique, syndrome de dtresse respiratoire aigu, odeme pulmonaire, vieillissement
acclr, maladies cardiovasculaires...etc. (Favier, 2003).

III. 4. Les antioxydants
Les antioxydants sont lensemble de molcules susceptibles dinhiber directement la
production, de limiter la propagation ou de dtruire les espces ractives de loxygne. Ils peuvent
agir en rduisant ou en dismutant ces espces, en les pigeant pour former des composs stables, en
squestrant le fer libre, ou en gnrant du glutathion (Favier, 2003 ; Dan, 2008).
De nombreux antioxydants interviennent, il sagit principalement des systmes enzymatiques
et non enzymatiques (Figure10) (Souley Amadou, 2004 ; Yoo et al ., 2008)

III.4.1. Les antioxydants enzymatiques
Cette ligne de dfense est constitue principalement de trois enzymes.Il sagit de la superoxyde
dismutase (SOD), de la catalase et de glutathion peroxydase (GP
X
).
Ces enzymes ont une action complmentaire sur la cascade radicalaire au niveau du
superoxyde et du peroxyde dhydrogne, conduisant finalement la formation deau et doxygne
molculaire.
2O
2

+2H
+
superoxyde dismutase H
2
O
2
+O
2


Chapitre III Les espces ractives oxygnes et le stress oxydant
24

2H
2
O
2
Catalase

2H
2
O +O
2

H
2
O
2
+2GSH Glutathion perooxydase 2H2O +GSSG
(Lehucher-Michel et al ., 2001)


III.4.2. Les antioxydants non enzymatiques
Ce groupe des antioxydants renferme les protines de squestration des mtaux, qui agissent
en diminuant la disponibilit dagents pro oxydants, comme Fe
2+
/Fe
3+
ou Cu
2+
/Cu
+
(ex : la
transferrine, la ferritine, lalbumine, caeruloplasmineetc.).
Dautre part, il y a des molcules faible poids molculaire qui agissent soit comme
cofacteurs des enzymes cites soit comme antioxydant propre (Antwerpen, 2006).
Les antioxydants action directe sont capables de donner des lectrons loxygne radicalaire
afin quils puissent le piger, lempcher ainsi dattaquer les structures biologiques. Ils peuvent agir
comme agents rducteurs capables de passer leurs lectrons aux ROS et les liminer (Kohen et
Nyska, 2002). Ces molcules proviennent soit de sources endognes (glutathion, mlatonine, acide
urique, la mlanine), soit de sources exognes apports par lalimentation (ex : les carotnodes, la
vitamine E, la vitamine C (Curtay et Robin, 2000), les composs phnoliques (Yoo et al ., 2008) et
surtout les acides phnoliques, les flavonoides, les tanins, les coumarine (Siddhuraju,2007).


Figure 10. Origine et rponse cellulaire aux ROS (Petropoulos, 2003)
































Chapitre I
Matriel et mthodes


Chapitre 1 Matriel et mthodes


25
Matriel et mthodes
I.1. Matriel
I.1. 1. Matriel vgtal
Il est constitu des fruits du Zizyphus lotus (Figure11), rcolts des rgions de Batna en
Septembre Octobre 2007, 2008.
Les fruits ont t dabord dnoyauts, ensuite la partie comestible a t sche lombre
labri de la lumire, temprature ambiante.
Aprs schage, la partie comestible a t broye pour obtenir une poudre fine, qui a servi
pour la prparation des diffrents extraits.



Figure11. Diffrentes parties du fruit du Zizyphus lotus

I.2. Mthodes
I.2.1. Dtermination de la teneur en eau
Pour dterminer la teneur en eau, on fait une dessiccation de la matire frache la
temprature de 1032C
0
dans une tuve isotherme ventile la pression atmosphrique
jusqu une mesure pratiquement constante (Audigie et al .,1987).
La teneur en eau est la diffrence entre le poids de lchantillon avant et aprs la dessiccation
lorsque leur poids soit constant.
H% = M
1
- M
2 x100
P
H% : taux dhumidit ou teneur en eau.
M
1
: masse en g de la capsule avec lchantillon avant la dshydratation.
Chapitre 1 Matriel et mthodes


26
M
2
: masse en g de la capsule avec lchantillon aprs la dshydratation.
P : masse en g de la prise dessai.

I.2.2. Dtermination de la teneur en cendre :
La teneur en matire minrale est conventionnellement le rsidu de la substance aprs
minralisation de la matire sche des chantillons .Elle est obtenue par incinration 500-
600C
0
(Pinta, 1980 ; AOAC, 1984).
MO% = M
1
- M
2 x 100

P
MO% : matire organique.
M
1
: masse en g de la capsule et la matire sche avant lincinration.
M
2
: masse en g de la capsule avec les cendres.
P : masse en g de la prise dessai.
La teneur en cendre est dtermine comme suit : cendre%=100-MO%

I.2.3. Prparation des extraits partir des fruits du Zizyphus lotus :
Selon la mthode de Diallo et al (2004), diffrents types dextraits ont t prpars partir
des fruits pulvriss (Figure 12).
I.2.3.1. Extractions avec des solvants polarit croissante :
250 g de poudre ont t extraits avec 2000ml dther de ptrole et placs sous agitation
pendant 24h. Aprs filtration sur papier Whatmann, le marc est ensuite mis en agitation avec
2000 ml de dichloromthane pendant 24 h, puis 2000 ml de mthanol pendant aussi 24h.
Les 3 types extraits ont t concentrs sous vide au Rotavapor.
I.2.3.2. Extrait aqueux :
Une macration aqueuse a galement t effectue sur 50 g de poudre avec 500 ml deau
distille et placs sous agitation pendant 24 h. Aprs filtration, lextrait a t lyophilis.

Chapitre 1 Matriel et mthodes


27
Matriel vgtale sec broy
Extraction froid par
lther de ptrole (24h)
Dcantation
.Filtration
Extrait Etheroptrolique
Rsidu vgtal sec
Extraction par le dichloromthane
Dcantation
Filtration
Rsidu vgtal sec
Extrait Dichloromthanique
Extraction par le mthanol
Dcantation
Filtration
Rsidu vgtal sec
Extrait Mthanolique
Filtrat
Filtrat
Concentration T=40C
Filtrat
Concentration T=35C
Concentration T=50C


Figure 12. Diffrentes tapes dextraction par puisement successive du matriel vgtal.

I.2.4. Analyse des extraits du Zizyphus lotus
I.2.4.1. Analyse qualitative des extraits du Zizyphus lotus
I.2.4.1.1.Tests prliminaires
Mise en vidence des flavonodes
A 3 ml de chaque extrait, on ajoute 5 ml d HCl (acide chlorhydrique), puis quelques
morceaux du magnsium.En prsence des flavonoides (flavone aglycone), une couleur rouge
est apparue (Ciulcl, 1982).
Mise en vidence des tanins :
Lajout de trichlorure du fer (FeCl
3
) 1%, permet de dtecter la prsence ou non des tanins.
La couleur vire au bleu noir en prsence des tanins galliques, et au bleu verdtre en prsence
des tanins catchiques (tanins condenss) (Dohou et al ., 2003).
Chapitre 1 Matriel et mthodes


28
I.2.4.1. 2.Chromatographie sur couche mince
Pour une caractrisation partielle des extraits du Zizyphus lotus, on utilise la
chromatographie sur couche mince, cette technique de sparation base sur lutilisation dune
phase mobile (solvant) le long dune phase stationnaire (gel de silice), dont la sparation
dpend des phnomnes dadsorption et de partage.
Lanalyse des extraits du Zizyphus lotus a t ralise sur des plaques de gel de silice avec
indicateur de fluorescent (20x20cm, 60 F254), selon la mthode de Diallo et al (2004) avec
quelques modifications,les quatre extraits ont t dissous dans leur solvant dorigine.
Lanalyse des extraits polaires (AQ, MET) est effectue par un systme de sparation BAW
(butanol/acide actique/eau) avec des proportions (60/15/35). Alors pour les extraits apolaires
(DCM, ET) on utilise le systme (ther de ptrole/actate dthyle) avec les proportions (8/2).
5 l de chaque extrait (10mg/ml) et de standard (2mg/ml), sont dposs et les plaques sont
ensuite introduites dans la chambre de migration pralablement sature par la vapeur de la
phase mobile. Aprs migration, les plaques sont sches, puis visualises par 3 systmes de
rvlation :
Rvlation physique sous UV 254nm.
Rvlation physique sous UV 366nm.
Rvlation chimique par une solution de vanilline sulfurique.
Rvlation chimique par une solution thanolique du DPPH 2,4% pour la
dtection des extraits ayant une activit antioxydante (Juma et Majinda, 2004).
Les rapports frontaux (RF) des spots issus de la sparation sont calculs (le rapport frontal est
le rapport entre la distance parcourue par la tache et celle du solvant) et compars ceux des
tmoins permettant ainsi lidentification de diffrents extraits.

I.2.4.1. 3.Chromatographie liquide haute performance HPLC RP-C18
Pour analyser les diffrents extraits du Zizyphus lotus lHPLC -RP-C18 a t utilis.
La chromatographie liquide haute performance phase inverse est une technique de
sparation, dans laquelle la phase mobile est un liquide polaire (solvant), et la phase
stationnaire est une colonne (125 x 4,6mm) troitement emballe par des particules C18
(apolaire), ces particules ayant un diamtre moins de 10m, ce qui ncessite de pomper la
phase mobile travers la colonne haute pression. La pompe garde un dbit prcis de sorte
que le temps de rtention de chaque pic peut tre employ pour identifier des pics de
lchantillon tester.
Chapitre 1 Matriel et mthodes


29
Ceci est fait par comparaison des chromatogrammes des standards avec celui de
lchantillon.
Dans notre analyse, nous avons utilis une lution isocratique dans laquelle une seule source
du solvant utilise pour luer les composons travers la colonne .La phase mobile utilise est
un mlange mthanol /eau (60/40), le dbit de la phase mobile est 0,5 ml/min. La temprature
est rgle 40 C
0
. Le dtecteur utilis est un dtecteur UV une longueur donde 254nm
(Kuntie et al ., 2007).

I.2.4.2. Analyse quantitative des extraits du Zizyphus lotus :
I.2.4.2.1. Dosage des polyphnols
Les polyphnols sont estims par la mthode de Folin Ciocalteu (Wong et al ., 2006).Ce
dosage repose sur le ractif de Folin Ciocalteu qui est constitu dun mlange dacide
phosphotungstique et dacide phosphomolybdique. Loxydation des phnols rduit, ce ractif
en un mlange doxyde bleus de tungstne et de molybdne .lintensit de la couleur est
proportionnelle au taux de composs phnoliques oxyds ( Boizot et Charpentier,2006).
200 l de chaque extrait (dissous dans le mthanol pour les extraits organiques, et leau
distille pour lextrait aqueux) sont ajouts 1 ml du ractif de Folin Ciocalteu dilu 10 fois,
aprs 4 min, 800 l dune solution de carbonate du sodium (75g/l) sont ajouts. Labsorbance
est mesure 765 nm aprs 2h dincubation. Les concentrations des polyphnols sont
dduites partir des gammes dtalonnage tablies avec lacide gallique (0-200g/ml) et sont
exprimes en microgramme dquivalent dacide gallique par milligramme dextrait (g
EAG/mg).

I.2.4.2.2. Dosage des flavonodes
La mthode du trichlorure daluminium (Bahorun et al .,1996) est utilise pour quantifier
les flavonodes dans les diffrents extraits du Zizyphus lotus .1 ml de chaque chantillon et du
standard ( prpars dans le mthanol pour les extraits organiques et leau distille pour
lextrait aqueux )avec dilutions convenables sont ajouts 1 ml dAlCl
3
(2 % dans le
mthanol). Aprs 10 min dincubation, labsorbance est lue 430 nm. Les concentrations des
flavonodes sont dduites partir des gammes dtalonnage tablies avec la querctine (0-
35g/ml), et sont exprimes en microgramme dquivalent de querctine par milligramme
dextrait (g EQ/mg).


Chapitre 1 Matriel et mthodes


30
I.2.4.2.3. Dosage des tanins condenss
Le dosage des tanins condenss dans les extraits du Zizyphus lotus est effectu selon la
mthode de Broadhurst et Jones (1978), modifie par Heimler et al. (2006). Le principe de ce
dosage est bas sur la fixation du groupement aldhydique de vanilline sur le carbone 6 du
cycle A de la catchine pour former un complexe chromophore rouge qui absorbe 500nm
(Schofield et al .,2001) (Figure 13).



Vanilline Couleur rouge
Figure13. La raction entre la vanilline est les tanins condenss (Schofield et al ., 2001).-

Pour 400l de chaque chantillon ou standard, on ajoute 3ml dune solution de vanilline
(4% dans le mthanol), et 1,5 ml dacide hydrochlorique concentr. Le mlange est incub
durant 15 min et labsorbance est lue 500nm.
Les concentrations des tanins condenss sont dduites partir des gammes dtalonnage
tablies avec la catchine (0-300g/ml), et sont exprimes en microgramme dquivalent
catchine par milligramme dextrait (g E CT/mg).

I.2.5. Tests des activits biologiques
I.2.5.1. Activit antimicrobienne
Souches microbiennes testes
Les souches microbiennes utilises sont :Staphylococcus aureus (ATCC 25923)
,Escherichia coli (ATCC 25922) ,Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) Salmonella
thyphimurium ,Klebsiella pneumonia ATB (1476), Candida albicans.


Chapitre 1 Matriel et mthodes


31
Test antimicrobien
Afin dvaluer lactivit antimicrobienne des extraits des fruits obtenus, nous avons utilis
la mthode de diffusion en milieu glos.
Le principe de cette mthode est dutiliser des disques de papier Whatmann de 6mm de
diamtre. Les disques ont t imprgns dans diffrentes solutions (1g/ml) des extraits dissous
dans le DMSO (dimethylsulfoxide) pour les extraits organiques, et dans leau distille strile
pour lextrait aqueux (Un disque imbib par le DMSO a t employ en tant que contrle
ngative).Puis dposs la surface dun milieu couvillonn par une suspension microbienne
dune densit optique de 0,5McFarlend. Nous avons utilis pour les souches bactriennes le
milieu Muller Hinton, et le milieu Saboroud pour la levure. A la fin de la dure dincubation
(18-24h pour les souches bactriennes et 48h pour la levure 37
o
c), les diamtres des zones
dinhibition ont t mesurs (Choi et al ., 2006).

I.2.5.2. Tests dactivit antioxydante :
I.2.5.2.1. Test du blanchissement du carotne
Lactivit antioxydante des extraits du Zizyphus lotus est mesure selon la mthode de
Khartal et al (2007).Dans ce test la capacit antioxydante est dtermine en mesurant
linhibition de la dgradation oxydative de carotne (dcoloration) par les produits
doxydation de lacide linolique.
Lmulsion de - carotne /acide linolique est prpare par solubilisation de 3 mg de
carotne dans 1 ml du chloroforme ,25l de lacide linolique et 200mg de tween 40 sont
additionns, le chloroforme est compltement vapor au rotavapeur, par la suite 100ml deau
oxygne est ajout, lmulsion rsultante est agite vigoureusement.
350l de solution dextrait ou antioxydant de rfrence (BHT) (solubilis dans le mthanol
sauf lextrait aqueux dans leau distille (2mg/ml)) sont additionns 25 ml de lmulsion
prcdente.
La cintique de dcoloration de lmulsion en prsence et en absence dantioxydant
(contrle ngatif dans lequel lchantillon est remplace par 350l de mthanol) est suivie
490nm des intervalles de temps rgulires pendant 48heures .Lactivit antioxydante
relative des extraits (AAR) est calcule selon lquation suivante :
AAR=Abs
t=48h
(chantillon)/Abs
t=48h
(BHT) x100



Chapitre 1 Matriel et mthodes


32
I.2.5.2.2. Effet scavenger du radical DPPH :
Afin dtudier lactivit antiradicalaire des diffrents extraits, nous avons utilis la mthode
base sur le DPPH (diphnyl picryl hydrayl) comme un radical relativement stable ,selon le
protocole dcrit par Mansouri et al (2005).Dans ce test les antioxydants rduisent le diphnyl
picryl hydrayl ayant une couleur violette en un compos jaune , le diphnyl picryl hydrazine ,
dont lintensit de la couleur est inversement proportionnelle la capacit des antioxydants
prsents dans le milieu a donn des protons (Sanchez-Moreno,2002).
La solution de DPPH est prpare par solubilisation de 2,4 mg de DPPH dans 100ml de
mthanol .50l des solutions dextraits ou standard (querctine) sont ajouts 1,95ml de
DPPH, le mlange est laiss lobscurit pendant 30min, et la dcoloration par rapport au
contrle ngatif contenant uniquement la solution de DPPH est mesure 517nm.
Lactivit antiradicalaire est estime selon lquation suivante :
% dactivit antiradicalaire= [(Abs
517
contrle-Abs
517
chantillon)/Abs
517
controle] x100
Les concentrations des extraits dans le milieu ractionnel sont comprises entre 0-
12,5mg/ml, 0-4mg/ml,0-2,5mg/ml,0-1mg/ml pour les extraits :ET , DCM, MET, AQ
respectivement. Alors que pour les antioxydants standard (Rutine, Querctine, BHT) sont
comprises entre 050g/ml et entre 025g/ml pour la vitamine C.

I.2.5.2.3. Analyses statistiques
Les rsultats des tests effectus sont exprims en moyenne SD. Les sigmodes de lactivit
antiradicalaire des diffrents standards et extraits sont effectus par le logiciel (Graph Pad
Prism V 5,00).
La diffrence entre les extraits et les contrles et la dtermination des taux de signification
sont effectus par test ANOVA suivi du test Tukey.





















Chapitre II
Rsultats et discussion


Chapitre II Rsultats et discussion
33
II.1. Dtermination de la teneur en eau dans les fruits du Zizyphus lotus
Afin de dterminer la teneur en eau dans les fruits du Zizyphus lotus, nous avons
utilis la mthode dAudigie et al (1987), dont le but est dexprimer les rsultats des
constituants biochimiques par rapport la matire sche.
Tableau 4. La teneur en eau et de matire sche des fruits du Zizyphus lotus




Les valeurs reprsentent la moyenne de 30 essais SD
Comparativement aux valeurs trouves chez dautres varits du mme genre
doccurrence, le Zizyphus mauritiana (Grosskinsky, 1999), Zizyphus spina christi
(Anthony, 2005) et Zizyphus jujuba (Catoire et al ., 1994), dont la teneur en eau est
comprise entre 46 85%,la valeur que nous avons obtenue pour Zizyphus lotus est
nettement faible (8,960,73%).
Ce ci sexplique probablement par sa conservation pendant de longues dures,
et mme la diffrence des conditions climatiques et la rpartition gographique.
II.2. Dtermination de la teneur en cendre dans les fruits du Zizyphus lotus
La teneur en cendre du Zizyphus lotus a t dtermine aprs incinration, la
cendre gristre obtenue reprsente les diverses substances minrales.
Tableau 5. La teneur en cendre et de matire organique des fruits du Zizyphus lotus




Les valeurs reprsentent la moyenne de 30 essais SD
Selon Murdock (2002), la teneur en lments minraux de ce fruit est (0,82% de
matire sche), qui est une valeur infrieure celle de notre chantillon (3,5%).
Teneur en eau (g/100g) Teneur en matire sche (g/100g)

8,960,73

91,030,73
Teneur en cendre (g/100g) Teneur en matire organique
(g/100g)

3,50,31

96,50,31
Chapitre II Rsultats et discussion
34
II.3. Prparation des extraits partir des fruits du Zizyphus lotus
La prparation des extraits partir des fruits du Zizyphus lotus a t effectue
selon la mthode de Diallo et al. (2004) modifie. Cette mthode est base sur
lutilisation des solvants polarit croissante (Ether de ptrole
DichloromthaneMthanol), avec la prparation dune macration aqueuse
10%. De ce fait, quatre diffrents extraits ont t obtenus.
Lextrait thrique (ET), qui reprsente lextrait le plus apolaire, et le plus
riche en matire grasse.
Lextrait dichloromthanique (DCM), reprsente lextrait moyennement
apolaire
Lextrait mthanolique (MET) reprsente lextrait polaire
Lextrait (AQ), reprsente lextrait le plus polaire.
La couleur, laspect ainsi que le rendement de chaque extrait par rapport au
poids du fruit sec sont reprsents dans le tableau 6 ci-dessous.
Tableau 6. Aspects, couleurs et rendement des divers extraits du fruit Zizyphus lotus
Extrait Aspect Couleur Rendement
ET
DCM
MET
AQ
Huileux
Huileux
Pteux
poudre
Vert
Vert noir
Marron fonc
Marron clair
0,36%
0,28%
6,4%
40,4%

Les rsultats obtenus montrent que parmi les quatre extraits, lextrait (AQ)
reprsente le rendement le plus lev (40,4%), suivi par lextrait mthanolique 6,4%,
alors les extraits apolaires possdent les rendements bas, dont lextrait thrique
(0,36%) suivi par lextrait dichloromthanique(0,28%).
Chapitre II Rsultats et discussion
35
Lutilisation de diffrents solvants polarit diffrente permet de sparer des
composs selon leur degr de solubilit dans le solvant dextraction. Cette mthode
dextraction mene temprature ambiante et sous agitation contenue, permet
dextraire le maximum des composants bioactifs et de prvenir leur dnaturation ou
modification probable, dont la temprature leve provoque linactivation des
composs phnoliques, la diminution de leur extractibilit dans le solvant, aussi
affecte leur quantification (Hagermann et al ., 2000).
II.4. Analyse des extraits du Zizyphus lotus :
II.4.1.Analyse qualitative des extraits du Zizyphus lotus
II.4.1.1.Tests prliminaires
Tableau 7. Rsultats des testes prliminaires des flavonoides et des tanins
sur les diffrents extraits du Zizyphus lotus

A lgard des rsultats obtenus, la prsence des flavonodes et des tanins dans
les fruits du Zizyphus lotus est vidente, ce qui est en accord avec les rsultats obtenus
par Borgi et al. (2007(b)).
Extraits Mtabolite test Couleur rsulte Rsultats
ET
DCM
MET
AQ

Flavonode
-
-
Couleur rouge
Couleur rouge
-
-
+
+
ET
DCM
MET
AQ

Tanins
-
-
Bleu verdtre
Bleu verdtre
-
-
+
+
Chapitre II Rsultats et discussion
36
Les extraits polaires montrent une prsence des flavonoides plus importante que
les extraits apolaires, ce ci peut tre attribu la diffrence du degr de polarit des
flavonodes, dont les flavonoides polaires reprsentent la fraction la plus leve.
Lapparition de la couleur bleu verdtre reflte la prsence des tanins
catchiques (condenss) dans les extraits polaires, alors son absence total dans les
extraits apolaires. Les mmes rsultats sont trouvs par Borgi et al. (2007(b)), qui ont
effectu le test prliminaire des tanins sur diffrents extraits obtenus partir des
diffrents organes du Zizyphus lotus, dont ses rsultats ont rvl la prsence des
tanins dans les extraits polaires (aqueux et mthanolique), et leur absence dans
lextrait chloroformique (solvant quivalent du point de vue polarit au
dichloromthane utilis dans le prsent travail).
II.4.1.2. Analyses chromatographiques
II.4.1.2.1. Chromatographie sur couche mince
Pour une caractrisation partielle des diffrents extraits du Zizyphus lotus, une
chromatographie sur couche mince (CCM) a t ralise. Les standards utiliss sont
des composs phnoliques. La rutine (Rut), querctine (Que), catchine (Cat) sont des
flavonoides, lacide tannique (At) et lacide gallique (Ag) sont des acides
phnoliques. Le systme de migration utilis (BAW) butanol-acide actique- eau
(60/15/35) permet seulement de sparer lextrait MET. Alors pour les extraits DCM et
ET, le systme de migration (Ether de ptrole/actate dthyle) (8/2) a t employ

MET AQ Ag At Que Rut Cat
Figure 14. Chromatographie sur couche mince des extraits polaires des fruits du
Zizyphus lotus aprs rvlation par la vanilline sulfurique
Chapitre II Rsultats et discussion
37

MET AQ Ag At Que Rut Cat
Figure 15. Chromatographie sur couche mince des extraits des fruits du Zizyphus
lotus (Observation sous la lampe UV (254nm))










ET DCM ET DCM
Figure 16. Chromatographie sur couche mince des extraits apolaires des fruits du
Zizyphus lotus (Rvlation par la vanilline sulfurique)


Chapitre II Rsultats et discussion
38

AQ MET Rut Que ET DCM
Figure 17. Chromatographie sur couche mince des extraits des fruits du
Zizyphus lotus (Rvlation par une solution de DPPH)

Tableau 8. Rapports frontaux et couleurs aprs rvlation des standards








Aprs rvlation, deux taches apparaissent pour lextrait MET, elles sont visibles
sous les rvlateurs (vanilline sulfurique, UV 254nm et UV366nm) (Figure 14,15).
La mesure des rapports frontaux de chacune des taches rvle que lune des
tache correspond la querctine (RF=0,93) et lautre la rutine (RF=0,52), ceci est en
Standards Couleur aprs rvlation
(vanilline sulfurique)
RF
Catechine Rouge 0,87
Querctine Jaune orange 0,93
Rutine orange 0,52
Acide gallique Mauve 0,86
Acide tannique Mauve 0,83
Chapitre II Rsultats et discussion
39
accord avec les rsultas obtenus par Kriventsov et Krakhanova (1970) qui ont montr
la prsence des polyphnols et de la rutine dans les fruits du Zizyphus lotus.
Alors pour le systme (Ether de ptrole/actate dthyle) (8/2), plusieurs taches
apparaissent pour les extraits apolaires (ET, DCM) avec des couleurs mauves, et
roses, tmoignant probablement la prsence des strols et terpnes (Figure 16).
La rvlation de la plaque par la solution thanolique de DPPH est une CCM de
criblage qui permet lobtention dune vue prliminaire sur lactivit antioxydante des
diffrents extraits tests. Les substances actives sont visualises comme des taches
jaunes sur un fond violet (Figure 17).
Globalement, lintensit des taches jaunes est plus dense dans les extraits polaires
(AQ, MET) par rapport aux extraits apolaires (ET, DCM) qui ne prsentent aucune
tache jaune. Notant toutefois quun rsultat ngatif obtenu pour un extrait test ne doit
pas exclure la prsence de substances actives dans cet extrait.
Lune des taches apparaissent pour lextrait MET, une tache jaune correspondante
la rutine (RF=0,52), ce qui confirme le rsultat obtenu sous la rvlation par la
vanilline sulfurique, alors nous avons remarqu labsence de la tache qui est
normalement correspondante la querctine, ceci peut tre attribu la faible
concentration de la querctine prsent dans lchantillon test. Alors pour lextrait AQ
une tache jaune apparue, ayant un (RF=0,93) correspondant la querctine qui
napparat pas sous les autres rvlateurs.
II.4.2.2. Chromatographie liquide haute performance HPLC RP-C18
LHPLC-RP C18 permet didentifier la prsence de quelques substances dans
chacun des quatre extraits tudis, par comparaison entre le temps de rtention des
standards (Figure18) et les chromatogrammes des extraits.





Chapitre II Rsultats et discussion
40





Acide gallique Acide tannique






Acide cafique Catchine






Rutine Querctine

Figure 18. Chromatogrammes des diffrents standards tests par lHPLC

Minutes
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
V
o
l
t
s
0
1
2
V
o
l
t
s
0
1
2
0
,
7
0
0

1
,
3
2
5
1
,
6
7
5
3
,
1
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5
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soumia
1062
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V
o
l
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0,5
1,0
1,5
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,
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1064
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0
ChannelA
soumia
1139
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1
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2
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1
,
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,
1
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1047
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,
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,
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,
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,
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5
1
,
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,
3
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3
1
2
,
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8
3
1
3
,
7
9
2
ChannelA
soumia
1036
RetentionTime
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14
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,
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,
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1
,
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1
,
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2
,
9
5
0
3
,
3
0
0
ChannelA
soumia
1137
RetentionTime
Chapitre II Rsultats et discussion
41
Tableau 9. Temps de rtention des standards tests
Standards (TR) min
Querctine
Rutine
Catechine
Acide caffique
Acide tannique
Acide gallique
6,5
3,3
1,7
1,9
1,64
1,67

Les rsultats obtenus sont montrs dans le tableau suivant :
Tableau 10. Les standards dtects dans les diffrents extraits du Zizyphus lotus
Querctine Rutine Catechine A.caffique A.gallique Atannique
ET - - + + - -
DCM - - + + - -
MET - - - + - -
AQ + - + - - -

Lanalyse des diffrents extraits par lHPLC permet didentifier la prsence de la
catchine et lacide cafique dans les extraits apolaires (ET, DCM) (Figure 19,20)
Alors pour lextrait MET (figure 21), lacide cafique est le seul composant
dtect, ceci est correspondant au rsultat obtenu par Capanoglu et al. (2006) qui a
ralis lHPLC sur le Zizyphus vulgaris
Pour lextrait aqueux (Figure 22), deux composants sont dtects, la catchine et la
querctine qui est apparu prcdemment aprs rvlation par la solution du DPPH.
Chapitre II Rsultats et discussion
42
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14
V
o
l
t
s
0,000
0,002
0,004
V
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s
0,000
0,002
0,004
0
,
6
8
3

1
,
5
7
5
1
,
8
3
3
2
,
0
8
3
2
,
3
5
8
2
,
6
7
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,
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,
2
9
2
3
,
6
6
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,
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1
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,
5
7
5
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,
2
5
8
6
,
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0
8
6
,
5
0
8
7
,
2
2
5
8
,
3
7
5
9
,
0
3
3
1
0
,
3
6
7
1
1
,
3
3
3
1
2
,
2
3
3
1
4
,
7
4
2
Channel A
soumia
1003
Retention Time

S
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
V
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0,000
0,002
0,004
V
o
l
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0,000
0,002
0,004

1
,
6
7
5
1
,
9
6
7
2
,
2
4
2 2
,
5
3
3
2
,
8
7
5
3
,
2
3
3
3
,
5
4
2
3
,
9
5
0
4
,
4
4
2
4
,
9
3
3
5
,
6
6
7
5
,
9
5
8
7
,
0
3
3
7
,
6
2
5
9
,
5
4
2
1
0
,
8
5
0
1
2
,
9
1
7
1
5
,
4
5
0
1
6
,
3
9
2
Channel A
soumia
1004
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Minutes
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0,002
0,004
V
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s
0,000
0,002
0,004

1
,
6
5
8
1
,
9
4
2
2
,
2
4
2
2
,
5
0
0
3
,
1
8
3
3
,
4
8
3
3
,
8
8
3
4
,
3
7
5
4
,
8
7
5
5
,
5
7
5
6
,
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2
6
,
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8
7
,
6
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,
4
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9
,
8
7
5
9
,
9
9
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1
0
,
7
9
2
1
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,
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4
2
1
2
,
7
3
3
1
5
,
3
0
8
1
6
,
2
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8
1
6
,
8
3
3
1
7
,
1
0
8
Channel A
soumia
1005
Retention Time
Figure 19.Chromatogrammes obtenus pour lextrait thrique du Zizyphus lotus
Chapitre II Rsultats et discussion
43
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
V
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s
0,0000
0,0025
0,0050
V
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l
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0,0000
0,0025
0,0050

1
,
4
9
2
1
,
9
8
3
2
,
2
0
0
2
,
8
6
7
3
,
5
0
8
3
,
9
3
3
4
,
3
8
3
5
,
0
5
0
5
,
4
5
8
5
,
5
7
5
6
,
2
5
8
6
,
8
8
3
1
1
,
6
0
8
1
3
,
8
7
5
Channel A
soumia
1006
Retention Time

Minutes
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V
o
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s
-0,00025
0,00000
0,00025
0,00050
V
o
l
t
s
-0,00025
0,00000
0,00025
0,00050

1
,
3
8
3
1
,
7
6
7
1
,
9
6
7
2
,
1
5
8
3
,
6
6
7
3
,
8
5
8
4
,
0
3
3
8
,
4
0
0
Channel A
soumia
1010
Retention Time
Figure 20.Chromatogrammes obtenus pour lextrait du dichloromthane du Zizyphus
lotus
Minutes
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
V
o
l
t
s
0,00
0,05
0,10
0,15
V
o
l
t
s
0,00
0,05
0,10
0,15

1
,
6
9
2
2
,
0
0
8
2
,
1
4
2
2
,
4
5
8
3
,
9
3
3
Channel A
soumia
cafeine011
Retention Time




Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
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t
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0,0
0,1
0,2
0,3
V
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l
t
s
0,0
0,1
0,2
0,3

1
,
5
4
2
1
,
6
5
0
2
,
0
9
2
2
,
7
2
5
7
,
5
7
5
9
,
9
0
0
Channel A
soumia
1211
Retention Time

Figure 21. Chromatogrammes obtenus pour lextrait mthanolique du Zizyphus lotus
Chapitre II Rsultats et discussion
44

Minutes
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
V
o
l
t
s
0,0
0,1
0,2
0,3
V
o
l
t
s
0,0
0,1
0,2
0,3
0
,
5
0
8

1
,
4
7
5
1
,
7
0
8
3
,
6
2
5
Channel A
soumia
1191
Retention Time

Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14
V
o
l
t
s
0,0
0,1
0,2
V
o
l
t
s
0,0
0,1
0,2

1
,
0
8
3
1
,
5
4
2
1
,
7
7
5
2
,
8
0
8
4
,
2
9
2
6
,
5
5
8
Channel A
soumia
1066
Retention Time

Figure 22. Chromatogrammes obtenus pour lextrait aqueux du Zizyphus lotus
II.4.2. Analyse quantitative des extraits des fruits du Zizyphus lotus
Afin de caractriser les diffrents extraits prpars partir des fruits du Zizyphus
lotus ,un dosage des polyphnols totaux , des flavonoides et des tanins a t effectu.
Le choix du dosage de ces substances rside dans le fait que la majorit des proprits
antioxydantes des plantes leur sont attribus.
La mthode du dosage des polyphnols totaux est celle de Folin Ciocalteu (Li et al .,
2007). Lacide gallique a t utilis comme standard .Tandis que celui des flavonoides
a t ralis selon la mthode de trichlorure daluminium (Bahorun et al ., 1996) ,en
utilisant comme standard la querctine, enfin celui des tanins condenss a t
effectu selon la mthode de vanilline (Broadhurst et Jones 1978), modifie par
Heimler et al. (2006), en utilisant la catechine comme standard. Les rsultats sont
reprsents dans le tableau11 et les gammes dtalonnage dans les figures 23, 24,25

Chapitre II Rsultats et discussion
45
Tableau 11.Dosage des polyphnols totaux, des flavonoides et des tanins condenss
dans les diffrents extraits du fruit du Zizyphus lotus

(a)
g dquivalent dacide gallique par milligramme dextrait.

(b)
g dquivalent de querctine par milligramme dextrait.
(c)
g dquivalent de catchine par milligramme dextrait.
Les valeurs reprsentent la moyenne de 3 4 mesures SD.
Les rsultats du dosage des polyphnols totaux montrent que les extraits
polaires (mthanolique et aqueux) sont les extraits les plus riches en polyphnols,
dont les valeurs sont trs proches (50,00 versus 5,81,24). Dautre part les extraits
apolaires (thrique et du dichloromthanique) ont montr des valeurs voisines
(2,340,54 versus 1,990,12).
Dans une tude faite sur cinq varits du jujube chinois (Zizyphus jujuba), Li et
al. (2007) ont dos les polyphnols totaux par la mthode de Folin-Ciocalteu dans des
extraits polaires obtenus par extraction base mthanol/eau (4 :1 v/v) ; le rsultat
obtenu pour lun des cinq varits (Zizyphus jujuba Sanbianhong) (5,180,29 g
EAG/mg dextrait) est presque similaire celui obtenu avec lextrait aqueux du
Zizyphus lotus (5,181,24 g/mg dextrait).
La dtermination quantitative des flavonoides totaux par la mthode du
trichlorure daluminium rvle que lextrait aqueux est lextrait le plus riche en
flavonoides avec une teneur de (1,820,26g EQ/mg dextrait), suivi par lextrait
mthanolique (0,830,17 g EQ/mg dextrait). Par la suite vient les extraits apolaires
(ET, DCM), dont lextrait dichloromthanique avec une teneur de (0,710,5g
EQ/mg dextrait), suivi par lextrait thrique (0,640,4 g EQ/mg dextrait).
Extrait Polyphnols
(a)
Flavonodes
(b)
Tanins

ET 2,340,54 0,640,4 -
DCM 1,990,12 0,710,5 -
MET 50,00 0,830,17 4,570,94
AQ 5,81,24 1,820,26 6,771,95

Chapitre II Rsultats et discussion
46
Capanoglu et al. (2006) ont dos les flavonoides dans lextrait mthanolique du
Zizyphus vulgaris, o ils ont trouv une valeur suprieure (5,93g/ml) celle trouve
dans lextrait mthanolique du Zizyphus lotus (0,83 g/ml).
En tenant compte de la polarit des extraits, il apparat que la teneur en
flavonoides dans le Zizyphus lotus augmente avec la polarit de lextrait
(AQ>MET>DCM>ET). Pawliska et al. (2009) a fait une tude sur deux espces
Zizyphus jujuba et Zizyphus spina-christi, dont ils ont attribu la diffrence de teneur
en flavonoides entre les fruits, non seulement lespce, mais aussi aux conditions de
croissance, comme le sol, les conditions enviromentales et gographiques durant le
dveloppement du fruit, le dgre de maturation et la diffrence gntique.
Le dosage des tanins condenss montrent la haute teneur de ces molcules dans
les extraits polaires (mthanolique et aqueux), dont lextrait aqueux reprsente
lextrait le plus riche (6,771,95 g ECT/mg dextrait), suivi par lextrait
mthanolique (4,570,94 g ECT/mg dextrait)
Lexamen de ces rsultats permet de mettre en vidence une corrlation linaire
significative (R
2
=0,79 p0,05) entre la teneur des extraits en flavonodes et en
composs phnoliques (Figure 26). De mme, une corrlation linaire significative
(R
2
=0,98, p0,05) entre la teneur des extraits en tanins condenss et en composs
phnoliques (Figure 27).
Ceci apparat logique, o les flavonoides et les tanins reprsentent les composs
prpondrants des polyphnols.

y = 0,0116x + 0,0375
R
2
= 0,9985
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 50 100 150 200 250
C oncentrations en (ug/ml)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e


7
6
5
n
m
Figure 23. Droite dtalonnage de lacide gallique (moyenne SD de deux essais)
Chapitre II Rsultats et discussion
47
y = 0,0661x + 0,0112
R
2
= 0,9984
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 10 20 30 40 50
concentrations (ug/ml)
a
b
s
o
r
b
a
n
c
e


4
3
0
n
m
Figure 24. Droite dtalonnage de la querctine (moyenne SD de deux essais)
y = 0,0021x + 0,004
R
2
= 0,9975
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 100 200 300 400
c onc entrations (ug/ml)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e


5
0
0
n
m

Figure 25. Droite dtalonnage de la catchine (moyenne SD de deux essais)







Chapitre II Rsultats et discussion
48
R
2
=0,7948


0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
0
2
4
6
8
quantit en flavonoides (ug EQ/mg)
Q
u
a
n
t
i
t


e
n

p
o
l
y
p
h

n
o
l
s

t
o
t
a
u
x

(
u
g

E
A
G
/
m
g
)

Figure 26. Corrlation linaire entre la quantit en polyphnols totaux et la quantit
des flavonoides des diffrents extraits du fruit Zizyphus lotus (p0,05)



R
2
=0,9855

0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
Quantit en tanins (g E CT/mg)
O
u
a
n
t
i
t


e
n

p
o
l
y
p
h

n
o
l
s

(

g

E
A
G
/
m
g
)

Figure 27.Corrlation linaire entre la quantit en polyphnols totaux et la quantit
des tanins condenss des diffrents extraits du fruit Zizyphus lotus (p0,05)
Chapitre II Rsultats et discussion
49
II.5. Activits biologiques
II.5.1. Activit antimicrobienne des extraits du Zizyphus lotus
Lactivit antimicrobienne des diffrents extraits des fruits du Zizyphus lotus a
t value par la mthode de diffusion en milieu glos, en mesurant les diamtres
des zones dinhibition de la croissance microbienne (Figure 29).
Tableau 12. Diamtres des zones dinhibition de la croissance microbienne obtenus
par diffrents extraits du Zizyphus lotus
Les valeurs sont une moyenne de 3 4 essaisSD (les zones sont mesures en mm)
Tous les extraits du Zizyphus lotus se sont rvls actifs avec un degr
diffrent, li au contenu des extraits aux substances activit antimicrobienne.
Ghdira (1995) a montr quun alcalode de cette espce prsente une activit
antibactrienne significative, sans ngliger leffet synergique des autres molcules
effet antimicrobien.
Daprs les rsultats obtenus, il apparat que toutes les souches microbiennes
testes sont inhibes au moins par lun des extraits, ce qui confirme le spectre large de
lactivit antimicrobienne de ce fruit.
Lextrait thrique du Zizyphus lotus semble avoir leffet inhibiteur le plus
puissant, parmi les quatre extraits, en prsentant des zones dinhibition de croissance
avec toutes les souches microbiennes sauf Salmonella thyphimurium, de mme cet
extrait montre la plus grande zone dinhibition, qui est apparue avec Escherichia coli
(une zone dinhibition > 45mm), suprieure toutes les zones obtenues aprs test des
antibiotiques sur la mme souche (Amoxilline 22mm, Cefoxitine 26mm).
Extraits Staphylococcus
aureus
Escherichia
coli
Pseudomona
aeruginosa
Klebsiella
pneumonia
Salmonella
thyphimurium
Candida
albicans
ET 22,070,81 45,720 10,321,65 17,160 - 90
DCM 14,130,58 - - - - -
MT 16,450,49 6,290,05 9,761,81 - - -
AQ 17,411,71 - - - 70 120
Chapitre II Rsultats et discussion
50
Cette activit de lextrait thrique peut sexpliquer par leffet antimicrobien
puissant des composs apolaires de lextrait thrique .Une tude faite par Nasif
(2002) sur les graines du Zizyphus spina christi a montr que les acides gras de la
fraction lipidique prsentent une forte activit contre E coli. Lextrait (DCM) a
montr seulement une activit avec Staphylococcus aureus.
Les extraits polaires du Zizyphus lotus ont montr une activit antimicrobienne
avec toutes les souches microbiennes sauf Klebsiella pneumonia, lextrait
mthanolique a montr des zones dinhibition avec trois souches bactriennes
(Staphylococcus aureus, Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa), alors lextrait
(AQ) a une activit avec Staphylococcus aureus, Salmonella thyphimurium et
Candida albicans.
Il est apparat que le Staphylococcus aureus (gram positive) est la bactrie la
plus susceptible par comparaison avec les autres souches (gram ngative) ; ceci peut
tre attribu la diffrence de la structure entre les bactries gram positives et les
bactries gram ngatives. La paroi cellulaire des bactries gram positives est
constitue par une seule couche alors que la paroi cellulaire des gram ngatives a une
structure multicouche lie par une membrane cellulaire externe (Ali-Shtayeh et al .,
1998) (Figure 28)

Gram+ Gram-
Figure28 .Structure de la paroi bactrienne (Ali-Shtayeh et al ., 1998)
Chapitre II Rsultats et discussion
51

Zones dinhibitions de lextrait MET sur Staph a Zones dinhibition de lextrait ET sur Staph a

Zones dinhibitions de lextrait ET sur Pseudo a Zones dinhibition de lextrait AQ sur Staph a

Zones dinhibitions de lextrait ET sur E coli Zones dinhibitions de lextrait AQ sur Candida a

Zones dinibitions de lexrait ET sur Klebsiella p
Figure 29. Zones dinhibitions obtenues par diffrents extraits du Zizyphus lotus
Chapitre II Rsultats et discussion
52
II.5.2. Activit antioxydant
II.5.2.1.Test du blanchissement du -carotne
Dans ce test, loxydation de lacide linolique gnre des radicaux peroxydes, et
des hydroperoxydes dine conjugus (Kaur et Kapoor, 2002). Ces radicaux libres vont
par la suite oxyder le -carotne hautement insatur (Figure 30) qui perd ses doubles
liaisons entranant ainsi la disparition de sa couleur rouge, qui est suivi
spctrophotomtriquement 490 nm. Cependant la prsence dun antioxydant
pourrait neutraliser les radicaux libres drivs de lacide linolique, et donc prvenir
loxydation et le blanchissement du -carotne (Yanishilieva et Marinova ,1995 ;
Yang et al ., 2008)

Figure 30. Structure chimique de -carotne (Diallo, 2005)
La cintique du blanchissement du -carotne en absence et prsence des
extraits du Zizyphus lotus, du BHT et les activits antioxydantes relatives (AAR) sont
reprsents dans (Figure 31,32).
Daprs ces rsultats, il est vident que le BHT et les extraits tests inhibent
dune manire significative (p0,01) loxydation couple de lacide linolique et du -
carotne par rapport au contrle ngatif qui reprsente (100%) de la peroxydation.
Lextrait aqueux (AQ) montre la plus grande activit inhibitrice, dont son
activit antioxydante relative est 85,05%, mais cette activit reste significativement
infrieure (p0,001) celle du BHT (100%) utilis comme contrle positif.
Une activit antioxydante intermdiaire a t obtenue quavec lextrait
mthanolique (MET) (69,24%) qui a une activit significativement suprieure (p
0,001) celle de lextrait thrique (36,48%).
Chapitre II Rsultats et discussion
53
Lactivit de ce dernier est statistiquement similaire celle de lextrait du
dichloromthane (33,9%) qui reprsente lextrait le moins actif.
En comparaison avec BHT, lextrait aqueux (AQ) est 1,7fois moins actif que le
BHT, lextrait du dichloromthane (DCM) est 2 fois moins actif que lextrait
mthanolique, et 2,5 fois moins actif que lextrait aqueux , et presque 3 fois moins
actif que le BHT.
Le test de blanchissement de -carotne a t ralis par Kamiloglu et al. (2009)
sur les extraits mthanoliques de 50 gnotypes du Zizyphus jujube , o la moyenne de
lactivit antioxydante obtenue est 73% qui est une valeur modrment suprieure
celle obtenue de lextrait mthanolique du Zizyphus lotus (69,24%).
En effet, une corrlation linaire remarquable et significative (R
2
=0, 99, p0,05)
a t mise en vidence entre lARR (activit antioxydante relative) des extraits du
Zizyphus lotus et leur teneurs en composs phnoliques (Figure 33). Ce ci est en
accord avec les rsultats obtenus par Yang et al. (2002) qui ont rapport qui il y a une
corrlation entre le contenu en composants phnoliques et la capacit antioxydante.
Dailleurs, il y a une autre corrlation significative (R
2
=0, 99, p0,05), entre
lAAR et la teneur en tanins condenss des diffrents extraits du Zizyphus lotus
(Figure 34), alors cette corrlation est non significative entre lAAR et la teneur en
flavonoides des diffrents extraits.
Ces rsultats nous permettent de dduire le rle important des polyphnols des
extraits du Zizyphus lotus, et prcisment les tanins condenss dans lactivit
antioxydante relative, o leur noyau phnolique leur confre une activit
antioxydante puissante (Peronny, 2005).
Dune manire gnrale, ces rsultats sont en accord avec la littrature qui
suggre que lactivit antioxydante des extraits vgtaux dpend du type du solvant
dextraction et de sa polarit, dont la distribution des substances activit
antioxydante entre les diffrents extraits dpend de polarit des extraits (Kang et al .,
2003).


Chapitre II Rsultats et discussion
54
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 10 20 30 40 50 60
temps (h)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e


4
9
0

n
m
BHT
ET
DMC
Met
AQ
CON-
Figure 31. Cintique de blanchissement du -carotne 490 nm en absence et en
prsence des extraits du Zizuphus lotus, du BHT, (chaque valeur reprsente la
moyenne de trois essais)


Figure 32. Activit antioxydante relative des extraits du fruit du Zizyphus lotus, du
BHT dans le systme carotne /acide linolique (les valeurs sont la moyenne de trois
mesures SD), les barres avec des lettres diffrentes indiquent des activits
significativement diffrentes (p 0,05).
B
H
T
E
T
D
C
M
M
E
T
A
Q
c
o
n
t
r
o
l
e

(
-
)
0
50
100
150
a
b
b
c
d
e
%

a
c
t
i
v
i
t


a
n
t
i
o
x
y
d
a
n
t
e

r
e
l
a
t
i
v
e
Chapitre II Rsultats et discussion
55
R
2
=0,9913

0 2 4 6 8
0
20
40
60
80
100
teneur en polyphnols (g EAG/mg)
%

a
c
t
i
v
i
t


a
n
t
i
o
x
y
d
a
n
t
e

r
e
l
a
t
i
v
e

Figure 33. Corrlation linaire entre la teneur en polyphnols et le
pourcentage de lactivit antioxydante relative (p0,05).

R
2
=0,99


0 2 4 6 8
0
20
40
60
80
100
teneur en tanins(g ECT/mg)
%
a
c
t
i
v
i
t


a
n
t
i
o
x
y
d
a
n
t
e

r
e
l
a
t
i
v
e

Figure 34. Corrlation linaire entre la teneur en tanins et le pourcentage
de lactivit antioxydante relative (p0,05).



Chapitre II Rsultats et discussion
56
II.5.2.2. Effet scavenger du radical DPPH
Lactivit antioxydante des diffrents extraits du Zizyphus lotus vis--vis le
radical DPPH a t value spectrophotomtriquement en suivant la rduction de ce
radical qui saccompagne par son passage de la couleur violette la couleur jaune
517 nm (Figure 35).

Diphenylpicrylhydrazyl +Antioxydant-OH Diphenylpicrylhydrazine+Antioxydant-O
.

(Couleur violet) (Couleur jaune)

Figure 35. Raction dun antioxydant avec le DPPH (Molineux ,2004).

Le DPPH (diphenylpicrylhydrazyl) est un radical libre organique, toujours utilis
comme un ractif pour valuer lactivit antiradicalaire des antioxydants (Oyaizu,
1996).
Le DPPH est caractris par son adaptation plusieurs chantillons dans une
courte dure, aussi il est assez sensible pour dtecter les ingrdients actifs des basses
concentrations, cet effet, il a t employ pour le criblage des activits
antiradicalaires des extraits vgtaux (Yi et al ., 2008).
Les profiles dactivit antiradicalaire obtenu (Figure 36,37) rvlent que les
extraits du Zizyphus lotus possdent une activit antiradicalaire dose dpendante, les
IC
50
sont dtermins pour les extraits polaires (MET et AQ) seulement car les extraits
apolaires natteignant pas 50% dactivit (Tableau13) Pour mieux caractriser le
pouvoir antiradicalaire, deux autres paramtres sont introduits :
-Calcul de l EC
50
qui prend en considration la concentration de DPPH dans le
milieu ractionnel [concentration effective 50%, EC
50
= (IC
50
/mg de DPPH/ml)]
-Calcul du pouvoir antiradicalaire (APR) qui est inversement proportionnel
lEC
50
) (Prakash et al ., 2007).

Chapitre II Rsultats et discussion
57
Tableau 13. Activit antiradicalaire des extraits du fruit du Zizyphus lotus
IC
50
(g /ml)

EC
50
(g /g DPPH)

APR

BHT
Rutine
4,47 1,00
1,250,01
0,21 0,04
0,060,00
4,77 1,09
160,18
Querctine
Vitamine C
0,440,00
1,440,07
0,02 0,00
0,070,00
50 0 00
13,860,74
MET 195 35,35 9,75 1,76 0,1 0,01
AQ 5535,35 2,751,76 0,450,28
DCM - - -
ET - - -

Les valeurs reprsentent la moyenne de deux essais SD
A des fins comparative, quatre antioxydants standards sont utiliss, le BHT, la
rutine, la querctine et la vitamine C (Figure 38), ils ont montr une activit
antiradicalaire puissante avec des IC
50
de lordre de 4,47g/ml et 1,25 g/ml, 0,44
g/ml, 1,44g/ml et des APR de lordre de 4,77, 16, 50 et 13,86 respectivement. La
valeur de EC
50
de la vitamine C est similaire celle rapporte auparavant
(EC
50
=0,07g/g DPPH) par Siddhurajuet et Manian (2007).
Baydar et al. (2007) ont rapport que la rutine a montr une grande efficacit
antiradicalaire vis--vis le radical DPPH par rapport le BHT, ce qui est en accord avec
les rsultats du prsent travail, dont la rutine possde un pouvoir antiradicalaire 4 fois
suprieure celui du BHT.
Parmi les quatre extraits du Zizyphus lotus, lextrait aqueux reprsente lextrait
le plus actif, avec une IC
50
de lordre 55g /ml et un APR de 0,45 suivi par lextrait
MET avec une IC
50
195g/ml et un APR de 0,1.
Par contre les extraits apolaires (ET, DCM) montrent une trs faible activit
antiradicalaire, dont le pourcentage de lactivit antiradicalaire natteint mme pas
50%, ce qui montre que les antioxydants apolaires sont inactifs vis--vis du DPPH.
Chapitre II Rsultats et discussion
58
Globalement ces rsultats confirment les rsultats de la CCM de criblage ou les
extraits polaires apparaissent les plus actifs.
En comparaison avec les antioxydants standards, tous les extraits tests savrent
moins actifs .Le BHT ayant lAPR le plus faible entre les standards est 10,6 fois plus
actif que lextrait aqueux et 47,7 plus actif que lextrait mthanolique.
Li et al. (2005) ont valu lactivit antiradicalaire vis--vis le radical DPPH des
extraits mthanoliques de cinq varits du Zizyphus jujuba , o leffet antiradicalaire
obtenu est entre 17,8 69,1% pour une concentration de 0,5 mg/ml .Cependant pour
la mme concentration lextrait AQ et MET du Zizyphus lotus ont montr un effet
antiradicalaire suprieure 83,56 et 83,14 % respectivement.
Lexamen de ces rsultats permet de mettre en vidence une corrlation linaire
significative (R
2
=0,98, p0,01) entre la teneur des extraits en flavonoides et le
pouvoir antiradicalaire (APR) (Figure 39). En effet, les flavonoides sont reconnus
comme des substances potentiellement antioxydantes ayant la capacit de piger les
espces radicalaires et les formes ractives de loxygne.
Il est vident que la forte activit des extraits AQ et MET est attribue leur
richesse aux composs phnoliques, flavonoides et tanins, dont lextrait AQ possde
la plus forte teneur en molcules doss (polyphnols, flavonoides et tanins), suivi par
lextrait MET. Une tude faite par Kang et al. (2003) a suggr que les molcules
polaires prsentes dans les extraits vgtaux contribuent laugmentation de lactivit
antiradicalaire.







Chapitre II Rsultats et discussion
59


0 1 2 3
0
20
40
60
80
100
MET
Concentration (mg/ml)
%
A
c
t
i
v
i
t


a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e

Figure 36. Activit antiradicalaire des extraits polaires (MET, AQ) des fruits
du Zizyphus lotus (Chaque valeur reprsente la moyenne de deux essais)


DCM
0 1 2 3
0
10
20
30
Concentrat ion (mg/ml)
%
A
c
t
i
v
i
t


a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e

Figure 37. Activit antiradicalaire des extraits apolaires (DCM, ET) des fruits du
Zizyphus lotus (Chaque valeur reprsente la moyenne de deux essais)

AQ
0.0 0.5 1.0 1.5
0
20
40
60
80
100
Concentration (mg/ml)
%
A
c
t
i
v
i
t


a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e
ET
0 5 10 15
0
5
10
15
20
25
Concentrat ion (mg/ml)
%
A
c
t
i
v
i
t


a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e
Chapitre II Rsultats et discussion
60

Querctine
0 20 40 60
0
20
40
60
80
100
concentration(g/ml)
%
A
c
t
i
v
i
t


a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e
BHT
0 20 40 60
0
20
40
60
80
100
Concentration (g/ml)
%
A
c
t
i
v
i
t


a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e


Rutine
0 20 40 60
0
20
40
60
80
100
Concentration en (g/ml)
%
A
c
t
i
v
i
t


a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e

Vitamine C
0 10 20 30
0
20
40
60
80
100
Concentration en ug/ml
%
A
c
t
i
v
i
t


a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e

Figure 38. Activit antiradicalaire des standards la querctine , le BHT,la rutine
et la vitamine C (Chaque valeur reprsente la moyenne de deux essais)
R
2
=0,98

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
teneur en flavonoideg EQ/mg)
P
o
u
v
o
i
r

a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e

Figure 39. Corrlation linaire entre la teneur en flavonoides et le pouvoir
antiradicalaire (p0,01).

Chapitre II Rsultats et discussion
61









Conclusion

Lutilisation des plantes mdicinales en phytothrapie a reu un grand intrt
dans la recherche biomdicale ; une telle thrapie prvient lapparition des effets
secondaires observs lors de lutilisation des mdicaments de synthse chimique.
Ltude des proprits microbiologiques et antioxydantes des extraits du fruit du
Zizyphus lotus nous a permis dobtenir des rsultats intressants.
Dans un premier temps, lanalyse qualitative de chaquun des quatre extraits
obtenus du fruit du Zizyphus lotus, a mis en vidence la prsence des flavonoides, des
tanins dans les extraits polaires, et leur absence dans les extraits apolaires, alors que
lanalyse effectue par chromatographie sur couche mince a montr la prsence de la
rutine et la querctine dans lextrait mthanolique.
Lanalyse des diffrents extraits du Zizyphus lotus par HPLC a rvl la prsence
de quelques composs phnoliques dans les extraits, telles que dans les extraits
apolaires, la catchine et lacide cafique. Dans lextrait aqueux cette analyse montre
la prsence de querctine et catchine, alors dans lextrait mthanolique lacide
cafique est prsent.
Lanalyse quantitative des extraits du Zizyphus lotus est reprsents par le dosage
spectrale des trois substances biactives : les polyphnols, les flavonoides et les tanins.
Les extraits polaires (mthanolique et aqueux) sont les extraits aux teneurs
considrables en mtabolites doss, dont lextrait aqueux est lextrait le plus riche,
alors les extraits apolaires (ethrique et dichloromthanique) sont les extraits en
teneurs faibles.
Le test de lactivit antimicrobienne des diffrents extraits a montr que tous les
extraits tests sont actifs .Dailleurs toutes les souches microbiennes testes (bactries
et levures) sont inhibes au moins par lun des extraits dont lextrait ethrique qui a
plus dactivit (une zone dinhibition suprieure 45mm), suprieure lantibiotique
test.
Lune des technique utilise pour tudier lactivit antioxydante des diffrents
extraits est la mthode du blanchissement du -carotne qui a rvl que les extraits
polaires les plus riches en composs phnoliques sont les extraits les plus actifs, dont
lextrait aqueux montr la plus grande activit, alors les extraits apolaires sont moins
actifs.


Le criblage prliminaire des extraits en CCM a permis de localiser le pouvoir
pigeur du DPPH dans les extraits polaires (AQ, MET) qui sont les extraits les plus
riches en composs phnoliques. Effectivement, le test au DPPH rvle que ces deux
extraits sont les plus actifs comme pigeur du radical DPPH dont lextrait aqueux qui
a leffet antiradicalaire le plus puissant, suivi par lextrait mthanolique, alors que les
extraits apolaires ont montr une activit antiradicalaires faible.
En fin, lensemble de ces rsultats obtenus in-vitro ne constitue quune premire
tape dans la recherche de substances et source naturelle biologiquement active.Des
essais complmentaires seront ncessaires et devront pouvoir confirmer les
performances mises en vidences.

















Rfrences bibliographiques

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Rsum

Les extraits naturels issus des vgtaux contiennent une varit de
molcules biologiquement actives. Dans ce contexte, nous avons tent dvaluer
lactivit antimicrobienne et antioxydante des diffrents extraits prpars partir du
fruit du Zizyphus lotus, Lanalyse qualitative de ces extraits par CCM et HPLC a
rvl la prsence des flavonoides et des tanins dans diffrents extraits , ce ci est
confirm par une analyse quantitative base sur le dosage, des composs
phnoliques,des flavonoides et des tanins dont les extraits polaires qui sont les plus
riches en ces molcules , o la teneur en composs phnoliques est (5,8g EAG/mg
dextrait) pour lextrait aqueux , et (5g EAG/mg dextrait) pour lextrait
mthanolique. Lvaluation de lactivit antimicrobienne des diffrents extraits a
rvl une puissante activit des diffrents extraits, surtout lextrait ethrique qui est
responsable dune grande zone dinhibition de la souche bactrienne E. coli (>45mm).
Ltude de lactivit antioxydante par la mthode du blanchissement du -
carotne et le test du DPPH a rvl le pouvoir antioxydant des extraits polaires (AQ,
MET) suite a une comparaison avec les extraits apolaires (ET, DCM), dont lextrait
aqueux reprsente lextrait le plus actif, avec une activit antioxydante relative de
85,05% et une IC
50
de lordre de 55g/ml. A partir de ces rsultats, on peut dire que
les extraits les plus riches en composs phnoliques sont les extraits pouvoir
antioxydant puissant.
Mots cls : Zizyphus lotus, activit antimicrobienne, activit antioxydante, composs
phnoliques, flavonoides, tanins.
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(Zizyphus lotus)
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