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Cours Spectromtrie de Masse Introduction

Sarah SANGLIER Laboratoire de Spectromtrie de Masse BioOrganique UMR 7512 (Dir : Alain Van Dorsselaer) CNRS - Universit Louis Pasteur Strasbourg Tel: 03 90 24 27 78 ssangli@chimie.u-strasbg.fr Cours ESBS Octobre 2005

Plan

Mercredi 12/10 : Les Bases de la Spectromtrie de Masse (Sarah Sanglier) - Introduction la spectromtrie de masse - Lionisation MALDI - Lionisation Electrospray

Vendredi 14/10 : Application lanalyse protomique (Alain Van Dorsselaer)

Spectromtrie de masse : introduction gnrale


Dfinitions 1- Prsentation dun spectre de masse 2- Unit de mesure: le Dalton 3- Masse molculaire monoisotopique 4- Masse molculaire moyenne (ou chimique) Linstrument : structure dun appareil de spectromtrie de masse 1-Structure dun instrument : source et analyseur 2- Rle des champs llectrostatiques 3- Rle et systmes de gnration du vide 4- Prsentation des principales sources EI, FAB, MALDI, ESI 5- Prsentation des principaux analyseurs Magntique, quadruplaire, trappe dion, TOF, FT-ICR 6- La MS-MS

Quest-ce que la spectromtrie de masse ?


Cest une mthode de mesure des rapports masse-sur-charge (m/z) de molcules individuelles et ionises et de leurs produits de fragmentations

Quelles informations peut apporter la spectromtrie de masse ?


1- La masse molculaire dun compos 2- La masse des fragments de ce compos 3- Une mesure de la quantit

Nombre dions Fragments

Pic Molculaire

m/z

Pic molculaire et masse molculaire : dfinition

La masse molculaire est dduite de la valeur m/z du pic molculaire dans le spectre. Celui-ci correspond un ion qui contient TOUS les atomes de la molcule tudie, sans quil y ait eu rupture dune liaison. La molcule a t ionise grce la perte ou au gain dune charge lectrique. La masse molculaire correspond donc la composition lmentaire (formule brute) de lion molculaire. Lexistence disotopes se traduit par la prsence de plusieurs pics molculaires. On observe, non pas UN pic molculaire, mais UN GROUPE de pics molculaires (un massif molculaire ou cluster molculaire ) La prsence disotopes complique donc la dfinition, et la mesure du pic molculaire .

Quelles informations peut apporter la spectromtrie de masse ?


1- La valeur m/z du pic molculaire permet de calculer la masse molculaire 2- Les pics de fragmentation permettent de reconstituer une partie de la structure 3- Lintensit des pics permet de faire de lanalyse quantitative

Cholestane

Pic molculaire
100 217.0

m/z 149
% 55.0 81.0 94.9 0 60 80 00 1 120 108.9

m/z 217
218.0 149.0 148.0 150.0 175.0 203.0 219.0 232.0 140 160 180 200 220 240 262.1 280 302.1 300 357.1 315.1 320 343.1 340 360 372.1 373.2 380 410.1 416.2 Da/e 400 420

260

Fragments
Exemple: spectre en ionisation par impact lectronique du cholestane.

Quelle masse mesure-t-on ?

Masse monoisotopique
cest la masse du premier pic du prol isotopique cest--dire celle qui ne prend en compte que les masses des isotopes les plus stables (C12, H1, O16, S32, N14, ).

Masse chimique ou moyenne


cest le barycentre (centrode) des masses des pics constituant le prol isotopique cest--dire la masse qui prend en compte la masse des lments donne par le tableau priodique (C=12,011).

Quelle masse mesure-t-on ?


Masse moyenne Pic monoisotopique

P P+1 P+2 P+3

m/z

m/z

Masse monoisotopique: dans le massif isotopique, on lappelle le pic P Les autres pics du massif isotopique sont appels les pics P+1, P+2, P+3,. Il contiennent tous au moins 1 des isotopes lourds dun lments.

De quoi dpend la nature de la masse mesure ?


M

R = M/M

Valle 10 % M M + M

La rsolution mesure laptitude dun analyseur sparer lion M de lion M+M

Quelle masse mesure-t-on ?

Masse moyenne Pic monoisotopique

P P+1 P+2 P+3

m/z

m/z

Quelle sont les units de mesure ? La masse m sexprime en Dalton (Da)


1 Da = 1/12 .12 . 10-3 kgmole-1 / N Et donc: 1 Da = 1,66 . 10-27 kg (N = 6, 022045 . 1023)

C12 C13 H1 H2 O16 S32 N14 Cl35 Cl37

= = = = = = = = =

12,000000000 13,003354839 1,0078250 2,0141018 15,9949146 31,9720718 14,0030740 34,968852729 36,965902624

Un spectromtre de masse mesure la masse de molcules isoles

Pour cela, le spectromtre de masse doit assurer les oprations suivantes: 1- Volatiliser Sparer les molcules les unes des autres: on passe de ltat de matire condense un tat gazeux. 2- Ioniser Transformer les molcules en ions, car un spectromtre de masse fonctionne grce des champs lectriques 3- Mesurer les rapports m/z La masse molculaire est calcule partir du rapport charges (z)

masse (m)/nb de

Un spectromtre de masse est constitu de:

Source

Interface

Analyseur

obtention d ions en phase gazeuse

focalisation et transmission des ions

sparation des ions en fonction de m/z

Un spectromtre de masse est donc constitu de deux parties :


1- La source dion : pour volatiliser et ioniser Ces oprations peuvent se faire simultanment ou successivement selon le type de source dions. Leur mcanisme intime est souvent mal connu. 2- Lanalyseur: pour mesurer m/z Il mesure les valeurs du rapport: masse / nb de charge (appel m/z) Cest une partie de lappareil o rgne un vide suffisant pour que le libre parcours moyen des ions soit suprieur la distance parcourir dans lappareil pour atteindre le dtecteur.

CECI IMPLIQUE: Des champs lectrostatiques trs prcis pour guider et dplacer les ions dans l'appareil (lentilles lectrostatiques, optique ionique) Un vide suffisant pour que les ions puissent se dplacer sans tre dtruits ou dvis par des molcules rsiduelles (notion de libre parcours moyen)

Les units de mesures des pressions sont nombreuses.


Lunit officielle est le pascal (Pa): 1 pascal = 1 N/m2 On utilise galement: Latmosphre Le bar Le millibar Le Torr Le Psi 1 atm = 101 325 Pa (soit 1 013,25 hecto Pa) et 1 atm = 1,013 bar 1 bar = 105 Pa (=106 dyne/cm2) 1 millibar = 10-3 bar = 102 Pa 1 Torr = 1mm Hg 1 Psi = 1 pound / square inch = 0,07 atm et 14 PSI = 1 atm

Pour la plupart des spectromtres de masse, le vide est indiqu en millibar. Les valeurs du vide dans lanalyseur sont en gnral: 10-5 mbar : pour un analyseur trappe ionique (orbite circulaire) -6 mbar : 10 pour un analyseur quadriplaire (1 mtre de long). -7 mbar : 10 pour un analyseur magntique (2 3 mtres de long). 10-7 mbar : pour un analyseur temps de vol (2 3 mtres de long). 10-9 mbar : pour un analyseur ICR (orbite circulaire).

La source dions : son rle est de volatiliser et dioniser


Il existe de nombreux types de sources dions et chacun de ces types de sources repose sur un principe physique diffrent. Le principe physique qui permet de volatiliser et lioniser un type de compos est choisi par loprateur en fonction des caractristiques de la molcule analyser. Les tapes de volatilisation et dionisation se font successivement ou simultanment selon le type de source. Les critres de choix principaux sont: la volatilit et la stabilit thermique du compos analyser sa labilit chimique les fonctions chimiques prsentes et leur aptitude induire une ionisation la taille des molcules les quantits de produit disponibles le type dintroduction souhaite (directe ou en couplage chromatographique)

Les sources dions se classent en sources dures et en sources douces

De trs nombreuses mthodes dionisation ont t inventes pour ioniser et volatiliser des molcules de plus en plus fragiles, grandes et polaires. Les ionisations dures gnrent souvent des ions molculaires, nombre impair dlectrons, qui se fragmentent beaucoup et parfois mme totalement avant davoir eu le temps de sortir de la source. Lorsque leur dure de vie est assez longue pour quil sortent de la source intacts, mais quils se dcomposent avant davoir compltement travers lanalyseur et darriver au dtecteur, on les appelle ions mtastables. Leurs fragments peuvent tre analyss et donnent des informations de structures. Les ionisations douces gnrent des ions molculaires nombre pair dlectrons, qui sont relativement stables et qui ont des dures de vie suffisantes pour traverser lanalyseur, arriver jusquau dtecteur, et donc tre mesurs.

Quelles informations peut apporter une source ionisation dure ?


1- La masse molculaire dun compos 2- La masse des fragments de ce compos 3- Une mesure de la quantit

Nombre dions Fragments

Pic Molculaire

M/z

Quelles informations peut apporter un soure ionisation douce ?


1- La masse molculaire dun compos 2- Pas de fragmentation 3- Une mesure de la quantit

Nombre dions

Pic Molculaire

M/z

Les sources dions les plus courantes sont :


La source plasma induit coupl (Induced coupled plasmas: ICP-MS) La source impact lectronique (EI) La source ionisation chimique (CI) La source ionisation chimique par dsorption (DCI) Lionisation par thermospray (TSP) La dsorption de champs (FD) Lionisation par bombardement dions ou datomes rapides (LSIMS, FAB) La dsorption par plasma (PD) La dsorption laser (LD) Lionisation chimique pression atmosphrique (API ou APCI) La photoionisation (APPI) Trs dure Dure Assez douce Assez douce Assez douce Assez douce Assez douce Assez douce Assez douce Assez douce Assez douce

Lionisation laser assiste par matrice (MALDI) Llectronbulisation (electrospray: ES ou ESI)

Utilises en PROTEOMIQUE

Douce Douce

Lanalyseur : pour mesurer m/z


Il existe diffrents types danalyseurs. Ils sont tous bass sur des principes physiques diffrents, mais tous les analyseurs mesurent des valeurs m/z. Cest une partie de lappareil o rgne un vide suffisant pour que le libre parcours moyen des ions soit suprieur la distance parcourir dans lappareil pour atteindre le dtecteur.

B: Q: IT: TOF: FT-ICR:

Dflexion par un champ magntique (c'est l'analyseur le plus ancien) Dflexion par un champ quadrupolaire Confinement dans un pige ion (Ion Trap) Mesure dun temps de vol (Time Of Flight) Rsonnance Cyclotronique dIons Transforme de Fourrier

Les ions forms dans la source sont dirigs (extraction et focalisation) vers lanalyseur par des champs lectrostatiques qui peuvent tre de quelques volts (Q, IT, FT-ICR) ou de plusieurs dizaines de kilovolts (TOF, B). La vitesse de dplacement des ions dans lanalyseur dpend de lintensit du champ dextraction On peut coupler plusieurs analyseurs (MS-MS et MSn) pour faire de la spectromtrie de masse plusieurs dimensions en utilisant successivement le pouvoir sparateur de chaque analyseurs. Ceux-ci peuvent tre identiques ou diffrents.

Les caractristiques principales d'un analyseur sont :

La rsolution R La gamme m/z qu'il peut analyser La rapidit de balayage en m/z La sensibilit La vitesse avec laquelle les ions le traversent

Souvent, avec un mme analyseur, on peut augmenter l'une de ces caractristiques aux dpends des autres, mais seulement dans certaines limites. Chaque type d'analyseur a son "point fort".

Caractristiques des analyseurs

Analyseurs Quadriple (Q) Magntique (EB) Temps de vol (TOF) Trappe ionique

Rsolution 2 000 20 000 20 000 5 000

Gamme m/z 8 000 20 000 500 000 6 000 4 000

Cyclotron rsonance des ions (FT-ICR) 1 000 000

Spectromtres de masse commerciaux:


De nombreux couples source /analyseur sont possibles

Q EI/CI BE FAB TOF MALDI/LD IT ES/APCI FT-ICR

La spectromtrie de masse plusieurs dimensions: Il y a plusieurs analyseurs qui se suivent


Les analyseurs peuvent tre coupls et agir de faon squentielle. On parle alors de spectromtrie de masse plusieurs dimensions Un premier analyseur slectionne les ions avec un certain m/z On purifie donc un ion prsent dans un mlange dion qui peut tre trs complexe Lion purifi est alors fragment dans une chambre de collision. Un deuxime analyseur mesure alors les m/z des fragments. Cest de la MS-MS (spectromtrie de masse en tandem) Si on rpte lopration, on fait de la MS-MS-MS ou MS3 Certain appareils permettent de faire de la MS10 La MS-MS est un puissant outil de dtermination de structure

Principe de la MS/MS: tude dions ls

Source

MS1

Cellule de collision

MS2

Dtecteur

Ions

Ion parent

Fragmentation (CID)

Ions ls

Spectre MS/MS

Le premier analyseur ne balaye pas

Principe de fragmentation dans la chambre de collision (Collision Induced Dissociation : CID) Mi, z Cellule de collision

m1 m2 m3

mg V

Ec = Elab = ze V

Ecm = Elab mg / Mi + mg

Les analyseurs MSn

La MS-MS peut tre ralise par : Deux quadruples Un quadruple et un analyseur temps de vol Deux analyseurs temps de vol Un pige ions (Ion Trapp) Une rsonnance cyclotronique dion transforme de Fourrier Q-Q Q-TOF TOF-TOF IT FT-ICR

La MSn peut tre ralise par : Un pige ions (Ion Trapp) Une rsonnance cyclotronique dions transforme de Fourrier IT FT ICR

Les nergies de la collision en MS/MS dpendent du type danalyseur utilis.


On peut obtenir des schmas de fragmentation diffrents selon les nergies utilises

Collision haute nergie en keV EB/EB ou BEB EB/Q EB/TOF TOF/TOF TOF (PSD)

Collision basse nergie en eV QQ Q-TOF IT FT-ICR

Nomenclature des fragments peptidiques


Bieman, Roepstorff, Fohlmann

an

bn

cn

NH

CH Rn

CO
xn

NH
yn

CH Rn+1
zn

COOH

dn , v n , w n

dn+1, vn+1, wn+1

Fragments observs en haute et basse nergie Fragments observs seulement en haute nergie

Spectre ESI-MS dun digeste trypsique (m/z=681)


Intens. x104 462.14

864.96 1.25

MS/MS
809.97 371.1 391.26 622.86 887.36 778.42 1076.29

1.00

0.75 618.22 543.37 0.50 529.35 577.29

681,33

720.30 756.82 1010.39 1090.87

0.25 1223.54

300

600

900

1200

ESI-IT-MS-MS de lion [M+2H]2+ m/z=681


A G E K D I/L