-;k

Principios y tcnicas de microscopa

I-os biloeos celulares menudo necesitan a examinar Ia estructura de'las clulasy de sus componentes.El microscopio es una herramienta indispensablepara ello ya que la mayora de las estructurascelularesson demasiadopequeas para ser observadasa simple vista. De hecho, los comienzos de la biologa celular se pueden seguir hastaIa invencin del microscopio ptico, que posibilit por primera vez a Ios cientficosla observacinde imgenesaumentadas de las clulas.El primer microscopio ptico fue desarrollado en 1590por Z. |ansseny su sobrino H. jansenn.Durante el siguiente siglo se describieron muchas observaciones microscpicasimportantes, entre las que destacanlas realizadaspor Robert Hooke, que observlas primeras clulas y por Antonie van Leeuwenhoek,cuyos microscopios mejorados nos hicieron vislumbrar por primera vez la estructura interna de las clulas.Desde entonces,el microscopio ptico ha experimentado numerosasmejoras y modificaciones hastala actualidad. De igual forma que la invencin del microscopio ptico permiti una oleada de logros cientficos al posibilitar por primera vez la observacinlas clulas,el desarrollo del microscopio electrnico en la dcadade 1930revolucion nuestracapacidadde explorar la estructuray Ia funcin celular. En microscopio electrniconos hizo pasara una nueva era en biologa celular debido a que es al menos 100 veces ms eficaz que el microscopio ptico para visualizar objetos,abriendo nuestros ojos a la exquisita arquitectura subcelular,nunca observadaanteriormente, y cambiando para siempre nuestra forma de pensar sobre las clulas. Sin embargo,a pesarde su poder de resolucin inferior, el microscopio ptico no ha cado en desuso.Por el contrario la microscopa ptica ha experimentado un renacimiento en los ltimos aos por el desarrollo de nuevastc-

que nicas especializadas han permitido a los investigadores explorar aspectos la estructuray del comportamiento cede lular que no pueden ser estudiadosmediante la microscopa electrnica.Estosavances han sido posiblespor la combinacin de tecnologasprocedentesde Ia fsica,ingeniera, qumica y biologa molecular,y han ampliado en gran medida nuestra capacidadpara estudiar clulasempleando la microscopa ptica. En este apndice,exploraremos los principios fundamentalestanto de microscopaptica como de microscopa electrnica,haciendo nfasisen las diversastcnicasespecializadasque se emplean para adaptar estos dos tipos de microscopapara una gran diversidadde objetivos especializados.

Principios pticos de la microscopa

Aunque los microscopiospticos y electrnicosdifieren en muchos aspectos, ambos hacenuso de principios pticos semejantes parala formacin de imgenes.Por lo tanto, comenzamos nuestra discusin sobre microscopa examiprincipios comunes,y haciendoespecial nando estos nfasis en los factoresque determinan el tamao mnimo de los objetos que pueden observarse. .: Le loNcrruD DE oNDA DE LA rLUMrNAcrN ESTABLECE LMITE EN EL TAMAO OB LOS OBIETOS UN QUE PUEDENSEROBSERVADOS Independientementedel tipo de microscopio que se emplee, se necesitansiempre tres elementospara formar una imagen: wa fuente de iluminacin, una muestra para ser examinada y un sistemadelentesqlueenfocan la iluminacin sobrela muestra y que forma la imagen.La Figura A.1 ilusPrincipios pticos la mlcroscopa 873 de

Fuente luz de Luzvisible

+ kvl 5o-1oo
Y

Haz de electrones Anodo

Lentes condensadoras

Muestras
Lentesobjetivo

Lentes vidrio de

electromagnticas Lentes

Lentes intermedias

Lenteocular Lentede proyeccin

FiguraA.1 Sistemaspticos de los ptico y electrnico. El microscopios microscopio ptico utiliza luz visible y lentes de vidrio paraformar a partir de la muestra una imagen que puede ser observadaa simple vista, enfocadaen una pelcula fotogrfica o recibida por un detector electrnico como una cmara de vdeo. (b) El microscopio electrnico utiliza un haz de electronesemitido por un filamento de tungsteno y enfocado por lentes para formar una electromagnticas imagen de la muestra en una pantalla fluorescente,un detector digital o una pelcula fotogrfica. (Estosdiagramas han dibujado se para enfatrzarlas semejanzas el en diseogeneralentre los dos tipos de el microscopio. realidad, En microscopioptico estdiseado con la fuentede luz en la parte inferior y el ocular en la parte superio como semuestraen la Figura 5b.)

pelcula Ojo humano,

l+ar4fia ^ dt^t^r

Pantalla fluorescente
n nolinr rl taar Afio

(cmara vdeo) de electrnico (a) Microscopio ptico (b) Microscopio electrnico

Si dos personassujetan los dos extremos opuestos de en tra estascaractersticas un microscopio ptico y en un mila fuente _ una cuerda y la hacen ondular mediante un movimiento rtcroscopio electrnico. En un microscopio ptico, mico hacia arriba y hacia abajo,generarnun largo patrn de iluminacin es luz visible,y el sistema de lentes consiste regular de movimiento en la cuerda denominado movipuede ser vista o en una serie de lentes de vidrio. La imagen miento ondulatorio (Figura A.2a).La distancia desde la puede enbien directamentea travsde un ocular o bien se crestade una onda a la crestade la siguientese denomina focar sobreun detectorcomo una pelculafotogrficao una longitud de onda. Si alguien localizado en un lado de Ia cmaraelectrnica. En un microscopio electrnico, la fuencuerda arroja hacia la cuerda un objeto grande como una emitido por un fite de iluminacin es un haz de electrones pelota de playa,stapuede interferir con el movimiento de y lamento de tungsteno calentado, el sistemade lentesconla cuerda y perturbarlo (Figura A.2b). Sin embargo, si se sisteen seriesde electroimanes.El haz de electronesseenfoca arroja hacia la cuerda un pequeo objeto como una pelota en una pantalla fluorescente,en una pelcula fotogrfica o es de bisbol, el movimiento de la cuerda probablemente no visualizada digitalmente empleando un detector. se ver afectado (Figura A.2c). Si las personasque sujetan A pesar de estasdiferenciasen la fuente de iluminacin la cuerda la mueven ms rpidamente, su movimiento toy en el diseo de los instrumentos)los dos tipos de microsdava serondulatorio, pero la longitud de onda serprocopios dependen de los mismos principios pticos, y forsi bablementems corta (FiguraA.2d). En bstecaso, searroman imgenes de una manera similar. Cuando se coloca ja contra Ia cuerda una pelota de bisbol, es bastante una muestra en el recorrido de un baz de luz o de electroprobable que el movimiento de la cuerda se perturbe (Fines, las caractersticasfsicasdel haz cambian de forma que gura A.2e). se crea una imagen que puede ser interpretada por el ojo Esta analoga sencilla ilustra un principio importante: la humano o puede ser registradapor un detector fotogrficapacidad de un objeto de perturbar un movimiento onco. Paracomprender estainteraccin entre la fuente de iludulatorio depende crticamente del tamao del objeto con minacin yla muestra, necesitamosentender el concepto de relacin a la longitud de onda del movimiento. Esteprincilongitud de onda que se ilustra en la Figura A.2 empleanpio es de gran importancia en microscopa, ya que significa do la siguiente analoga sencilla.

874

y tcnicas microscopa de ApndicePrincipios

(a)

(b)

(c)

que la longitud de onda de la fuente de iluminacin estableceel lmite del tamaomnimo de un objetoparapoder Paracomprenderestarelacin,necesitamos serobservado. que el movimiento de la cuerdade la FiguraA.2 reconocer que se es anlogoal rayo de luz (fotones)o de electrones empleacomo fuentede iluminacin en el microscopiop-en tanrespectivamente otraspalabras, tico o electrnico comoondas-. se to la luz comolos electrones comportan incide sobreuna Cuandoun haz de luz o de electrones fsicasdelhaz muestra,la muestraalteralas caractersticas de iluminacin de igual forma que la pelota de playao de Debido a que un bisbolalterael movimiento de la cuerda. por sobre onda,la la objetoslosepuededetectar su efecto al de onda debetenerun tamaocomparable del longitud que debeserdetectado. objeto esta Unavezque entendemos relacinentrela longitud podemos comprender ahode onday el tamaodel objeto, pequeos sepuedenobra por qu los objetosmuy slo la electrnico: longitud de onda con el microscopio servar es de los electrones muchomscortaquela de los fotones. son comovirus y ribosomas demasiaobjetos As,algunos peropueparaperturbaruna ondadefotones do pequeos Al den interaccionarcon una onda de electrones. tiempo y los quedescribimos distintostiposdemicroscopios detcpuedesertil que seprede nicasde preparacin muestras la gunte cmo interaccionan fuentede iluminacin y la de muestra,y cmo semodifican las caractersticas ambas paraproduciruna imagen. Le nrsoluclN INDtcA LA cAPActDAD ADYACENTES OBJETOS PARADISTINGUIR SEPARADOS COMO OBJETOS pasaa travsde una Cuandoun haz de luz o de electrones lente y se enfocaen un punto, la imagenque se forma es de de consecuencia una propiedad lasondasdenominada interferencia-proceso por el cual dos o ms ondasse produciendouna o combinan para reforzarse cancelarse, onda igual a la suma de las dos ondasiniciales-. As, la una muestraa travs imagenque ustedve cuandoobserva un de una seriede lentesesrealmente patrn de interacde cionesaditivasy destructivas las ondasque atravesaron laslentes,un fenmenoconocidocomo difraccin. lentesde vidrio ptico seemplean En un microscopio para dirigir la direccin de los fotones,mientras que un comolentes emplea electroimanes microscopioelectrnico Aun de paradirigir la direccin los electrones. as,los dos fundatipos de lentestienen en comr'dos propiedades La focaly aperturaangular. distanciafodistancia mentales: entreel punto medio de la lentey el puncal esla distancia la queconvergen rayosqueatraviesan lente los to focalen el (FiguraA.3). La apertura angular esla mitad del nguloa del cono de luz que entra en el objetivo del microscopioa partir dela muestra(FiguraA.4).La aperturaangularespor lo tanto una medidade la cantidadde iluminacin que sale de la muestray pasatravsde la lente.Esto determinala
de Principios pticos la microscopa 875

(d)

(e)
FiguraA,2 Movimientoondulatolio,longitudde onday pertuaciones. El movimiento ondulatorio de una cuerda sujeta por dos personasesanilogoal movimiento ondulatorio de los y fotonesy electrones, sepuede utilizar para ilustrar el efectodel tamao de un objeto en su capacidadde perturbar el movimiento ondulatorio. (a) EI movimiento rtmico del extremo de una cuerda hacia arriba y hacia abajo generarun movimiento ondulatorio con (b) una longitud de onda caracterstica. Cuando searroja contra la cuerdauna pelota de playau otro objeto con un dimetro comparablea la longitud de onda de la cuerda,seperturba el movimiento de la cuerda.(c) Una bola de bisbol u otro objeto con menor que la longitud de onda de la un dimetro significativamente cuerda producir perturbacionesmuy pequeaso no Perturbar el movimiento de la cuerda.(d) Si la cuerdasemuevems rpidamente, (e) Ia longitud de onda sereducesustancialmente. Ahora, una pelota de bisbol puede perturbar el movimiento de la cuerdaporque su metro escomparablea la longitud de onda de la cuerda.

Lneamedia de la lente

medio que rodea a la muestra. (El ndice de refraccin es una medida de la variacin de la velocidad de la luz al atravesar de un medio a otro.) El efecto de estastres variables sobre la resolucin se describe cuantitativamente mediande te la siguienteecuacinconocida como la ecuacin Abb:

Rayos parareros

r:

- 0,6u" nsena

(A.l)

Distancia focal, focalesla Figula A.3 Distancia focalde unalente. La distancia distancia desde lneamediade unalenteal punto en el que la paralelos pasan travs Ia que a de convergen un focolosrayos en 1ente.

agtdeza del patrn de interferenciay,por 1o tanto, la capacidad de la lente para trasladarinformacin de la muestra. En los mejores microscopios pticos la apertura angular es alrededor de 70o. La apertura angular de una lente es uno de los factores que determina la resolucin de un microscopio, que sedefine como la distancia mnima que existe entre dos puntos que todava se pueden identificar como puntos separados cuando se observancon un microscopio. La resolucin estdeterminada por tres factores:la longitud de onda de la luz que se emplea para iluminar la muestra, la apertura angular y el ndice de refraccin del

en la que res la resolucin ,t esla longitud de onda de la luz empleada como iluminacin, n esel ndice de refraccin del medio entre la muestra y la lente objetivo del microscopio, y d esaapertura angular ya descrita.La constante0,61 relos presentael grado en el que pueden solaparse puntos de la imagen y todava ser reconocidos como puntos separados por un observador. En la ecuacin anterior, la cantidad r seno de a se denomina apertura numrica de la lente objetivo y se abrevia como NA. Por lo tanto, una expresin alternativa para la resolucin sera:

(4.2)

EN le pRcrICA, EL LMrrE DERESoLUcTN EL PTICO ESDE2OONM PARA MICROSCOPIO ELECTRNICO Y 2 NM PARAEL MICROSCOPIO es Maximizarla resolucin una tareaimportantetanto en microscopa pticacomo electrnica. que r esuna meYa puedenestar puntosy sertodados dida de cmode cerca va distinguidos, resolucin la mejora al tiempo que r se hacemspequeo. parauna mejor resolucin, nuAs, el poA.2 ser meradordela Ecuacin debera lo mspequeo posible. lo sibley el denominador msgrande preguntndonos cmo maximizarla Comenzaremos Lenteobletvo resolucinde una lente de vidrio usandoluz como fuente En hacerel nude iluminacin. primer lugar,necesitamos pequeo posible. longitudde ondapara La meradorlo ms nm, por lo que la luz visibleoscilaen el rangode 400-700 por vendr determinado la longitud el valormnimo para,2, de onda ms corta, dentro de esterango,que seaprctica como fuentede iluminacin lo que resultaserluz azulde alrededor 450nm. Paramaximizarel denominadordela de lmagen rmagen Ecuacin que numrica el proA.2,recuerde la apertura es y ducto del ndicede refraccin el senode la aperturaangular.Estos valores debenpor lo tanto sermaximizados dos para alcanzar una resolucinptima. Ya que la apertura objetivos alrededor 60o, vaes de angularparalos mejores el (b) Lentede aperturaalta (a) Lentede aperturabaja parasenode a esalrededor 0,94.El ndice lor mximo de parael aireesde aproximadamente por de refraccin 1,0, Figun 4.4 Apertutaangulatde una lente. La aperturaangulares la mitad del ngulo a del cono de luz que entra en la lente objetivo parausarse seco, aperen la lo queparauna lentediseada del microscopio a partir de la muestra. (a) Lente de poca apertura de tura numricamximaesde alrededor 0.94. (a espequeo).(b) Lentede aperturagrande (a esgrande).A As,parauna lentecon apertura angular 70",la resode mayor apertura numrica ms informacin puede transmitir la lucin parauna muestrailuminada en secocon luz azulde lente. Las mejores lentes de vidrio pueden tener una apertura de 450nm sepuedecalcular la manerasiguiente: angular de alrededor de 70'.
876 y tcnicas microscopa ApndicePrincipios de

0.61
I -

NA - (o'61)J450) :292nm 0.94

(A.3)

Por tanto, como regla bsica,el lmite de resolucin para una lente de vidrio en seco es aproximadamente 300 nm. Con objeto de incrementar la apertura numrica, algunas lentes de microscopio estn diseadasparaufrlizar aceite de inmersin entrela lente en la muestra.El aceitede inmersin tiene un ndice de refraccin mayor que eI aire por tanto, permite que la lente reciba mayor cantidad de luz transmitida a travs de la muestra. Debido a que el ndice de refraccin del aceitede inmersin es alrededor de 1,5,la apertura numrica mxima para una lente de aceitede inmersin esalrededorde 1,5 X 0,94 : 1,4.Por lo tanto, Ia resolucin de una lente para aceitede inmersin es de alrededor de 200 nm.

0,614 NA

(0 ,6 r)(4 so )
:

1,4

Iyb nm

(A.4)

posible) As,el lmite deresolucin(la mejor resolucin que paraun microscopio emplea visibleesaproximadaluz paraaceite de y mente300nm en seco de 200nm conlentes valopuedeseroptimizada hasta La inmersin. resolucin como fuentede luz resde 100nm empleando ultravioleta debidoa la longitudde ondamscorta(200iluminacin, imagen debeser 300nm) deese tipo deluz.Sinembargo,la o registrada una pelculafotogrftca mediante en entonces ya algnotro medio de deteccin que la luz ultravioletano es parael ojo humano. Adems, vidrio corriente el esvisible por emplear lenopaco la luz ultravioleta, lo quesedeben a Ios En tesde cuarzomuy caras. cualquiercaso, valoresque En de hemoscalculado los lmitestericos resolucin. son estoslmites debido a las abelaprctca,esraro alcanzar (defectos tcnicos) laslentes. de rraciones determinalacapaDebidoa queel lmite de resolucin que deuna lenteparadistinguirentredosobjetos escidad prximos,tambin establece lmite superiorde el tn muy En con lente. la prclosaumentos tilesposibles cualquier tilesquesepuedenconseguir tica,Iosmayores aumentos de veces conun microscopio pticosonde alrededor 1.000 Ya la apertura numricade la lenteempleada. quela aperque los tura numricavaraentre 1,0y 1,4,estosignifica limitados tilesde un microscopio pticoestn aumentos y aproximadamente 1.000Xen seco a 1.400x con aceite a por lmitesse Los de inmersin. aumentos encimade estos <aumentos vacos> queno proporcionan ya indenominan del formacin adicional acerca objeto que seestudia. La forma ms efectivade alcanzarms aumentoses cambiarla fuentede iluminacin deluz visiblea electrones.

es Debidoa quela longitudde ondade un electrn alredeque veces pequea la deun fotn deluz ms dor de 100.000 visible,el lmite terico de resolucinde un microscopio (0,002nm) es algunosrdenes magnitud de electrnico ptico (200 nm). Sin emmenor que el del microscopio problemas prcticos el diseode laslenen algunos bargo, para empleadas enfocarlos electrones teselectromagnticas alcance estevalor evitan que el microscopioelectrnico es proEI terico. principalproblema queloselectroimanes considerables cuandola aperturanuducendistorsiones dcimas grado.Estengulo de mricaesmayor de algunas que de diminuto esvariosrdenes magnitudmspequeo el de una lente de vidrio de buenacalidad(alrededor de que confiere microscopio al electrnico aperuna 70'), lo ms que tura numricaconsiderablemente pequea la del para el mejor microscopio ptico.El lmite de resolucin electrnico por lo tanto nicamente ales de microscopio rededorde 0,2 nm, lejos del lmite terico de 0,002nm. muestras biolgicas, existen Adems, cuandose observan y de problemas la preparacin la muestra con el concon que el lmite prcticode resolucin a que hacen sea traste, la de menudoentorno a2 nm.Enla prctica, resolucin un 100 electrnico generalmente veces es mejor microscopio que la de un microscopio ptico.Como resultado, aulos electrnico alrededor son mentostilesde un microscopio ios ptico,esdecir,alredede 100veces de un microscopio dor de 100.000x.

El microscopioptico
El microscopio ptico abri inicialmente nuestrosojos a la existenciade las clulas.Un nombre pionero en la historia de Ia microscopa ptica esel de Antonie van Leeuwenhoek, el comercianteholandsreconocido generalmentecomo el padre de la microscopaptica. Laslentesde Leeuwenhoek, que l mismo fabric durante los ltimos aos del siglo xvtt, tenan una calidad sorprendentementealta para lo de aquellapocay eran capaces aumentar 300 veces, que supone una mejora de 10 vecescon respectoa los instrumentos previos. Este incremento en la capacidadde aumentar hizo visible por primera vez el interior de las clulasy las observaciones Leeuwenhoekdurante ms de 25 aos conde dujeron al descubrimiento de las clulasen varios tipos de para la forel muestrasbiolgicasy establecieron escenario mulacin de la teora celular.

EMpLEAN Los utcRoscoproscoMpuEsTos

COMBINACIONES DE VARIAS LENTES Se han hecho avances considerables en la construccin y la

pticosen los 300aospostede aplicacin microscopios En rioresal trabajopionerode Leeuwenhoek. la actualidad, en ptica utiliza el instrumentode eleccin microscopa y por lentes sedenomina Io tande combinaciones diversas (FiguraA.5). la FiguraA.5 En compuesto se to microscopio compuesto ilustrael recorridode la luz en un microscopio
Elmicroscopio ptico 877

Ocular (pieza ocular) Aumenta imagen la

formada por el objetivo Lenteocular

Tubodel cuerpo Transmite imagen la al delobjetivo ocular Brazo Principales Lentes objetvo que lentes aumentan la muestra
Platina Mantiene la posicinde la

Lneade visin de la luz

4s4

AfTM Tubo del cuerpo

hiotirrne
v v l v L ' Y

v v

preparacron mrcroscoprca Entoca Condensador la luza travs la de muestra

Diafragma ControlaIa cantidad de luz oue entraen el condensador

lvluestra Lentes conoensaooras

Tornillode enfoquerpido Iluminador Fuente luz de Base fino Tornillo enfoque de .. r".*,r$rti Basecon la fuente de iluminacin
(b) Recorrido la luz (de abajo a arriba) de

ts,
prlncipales (a) Partes funciones y

FiguraA.5 Microscopioptico compuesto. (a) Un microscopio ptico compuesto. (b) Recorrido de la luz a ttavs del microscopio comPuesto.

que comienzacon la fuentede iluminacin, normalmente en una fuentedeluz localizada la basedel instrumento.Los de rayosde luz procedentes estafuente pasana travsde que dirigen la luz haciala muestra lentescondensadoras en montadaen un portaobjetosde vidrio dispuesto la platina del microscopio.La lente objetivo, localizadainmees de sobre muestra, responsable la formacin la diatamente primaria.La mayorade microscopios comdela imagen puestostienen diversos objetivosde distintosaumentos montadossobreun revlverrotatorio. por aumentada La imagenprimaria esposteriormente la lente ocular, o pieza ocular. En algunosmicroscopios entre el objetivo y el ocular se posicionauna lente interLos toan mediaparaconseguir msaumentos. aumentos talesde la imagense puedencalcularmultiplicandolos aumentos objetivo,del oculary dela lenteintermedia(si del presente). un microscopio un objetivo l0 x, con de As, est de2,5X,y un ocularde 10X,aumenuna lenteintermedia la ta250 veces muestra. hastaahora Los elementos microscopiodescritos del constituyenla forma bsicade microscopaptica denominada microscopade campo claro. En microscopiode es con campoclaro,comparado otrosmicroscopios, baraIas Sin to y fcilde usary alinear. embargo, nicasmuestras
878 y tcnicas microscopa ApndicePrincipios de

directamente mediante microscoque sepuedenobservar que pa de campoclaroson aquellas tienencolor o tienen a algunaotra propiedadque afecta la luz que la atraviesa. caractersticas carecen esas de muestras biolgicas Muchas con colorantes examinao y por lo tanto deben teidas ser Estos microscode microscopios. dascon tipos especiales quelosadecuan para piosespecficos ventajas tienenvarias Entre ellosseincluvisualizardistintostipos de muestras. de yen Ia microscopa contrastede fase,la microscopa de la diferencial, microscopa de contrastede interferencia y En confocal. las siguientes fluorescencia la microscopa y stas otrastcnicas importantes. estudiaremos secciones DETEcTA Le urcRoscopA DE coNTRAsrE DEFASES
EN DIFERENCIAS EL NOIC DE REFRACCIN Y EN EL GROSOR Como describiremos ms adelante con mayor detalle, antes de poder examinar las clulas mediante microscopa de campo claro, stas habitualmente se matan, se cortan en seccionesfinas y setien. Aunque estosprocedimientos son tiles para visualizar los detalles de la arquitectura celular interna, el estudio de clulas que se han fijado, seccionado y teido proporciona poca informacin acercade los aspectos dinmicos del comportamiento celular. Por lo tan-

para de una to, sehan desarrollado ampliavariedad tcnicas de el uso de microscopaptica en la observacin clulas todavavivas.Una de que estnintactasy en muchoscasos increla estas tcnicas, microscopade contrastede fases, de sin menta contraste necesidad cortar ni teir, haciendo de uso de lasdiferencias grosory de ndicede refraccintle que seexaminan.Paraentende variasregiones las clulas de debemos de de der lasbases la microscopa contraste fase por mulprimero saberque un haz de luz estcompuesto titud de rayosindividualesde luz. A medida que los rayos la pasandesde fuente delaz a travsde la muestra,suveloftsicas la de por cidadpuedeverseafectada laspropiedades la Habitualmente, velocidadde los rayosseve dismuestra. minuida de maneravariable por distintas regionesde la muestra,lo que produceun cambio de fasecon relacina el lasondasdeluz queno han atravesado objeto(sediceque en lasondasde luz viajan enfaseunndo coincidenlascresde tasy los valles lasondas). Aunque el ojo humano no puededetectardirectamende de Ia de te estos cambios fase, microscopa contraste fase de solucionaesteproblematransformandolas diferencias se del faseen alteraciones brillo. Estaconversin consigue usandovna placadefase(FiguraA.6) que es un compo- Planode la imagen

en nenteptico dispuesto el recorrido de la luzpor encima del objetivoparaponer en faselos rayosdirectosno difracpor que tadoscon aquellos han sido difractados la muestra. de longitudesde onda intensificala El patrn resultante entre imagen,produciendouna imagencon alto contraste fondo iluminado homogy sobreun zonasclaras oscuras (Figura las inA.7).Comoresultado, estructuras neamente se ternasen lasclulas visualizana menudomejor medianque de de te microscopa contraste fase con pticadecampo claro. ptica es particularEstamodalidaden microscopa vivasy sin teir ya que mentetil para examinarmuestras biolgicosproducendifraccin de la luz de los materiales La de de maneracasiinevitable. microscopa contraste fase en seempleageneralmente microbiologay en Ia investigapara detectar bacterias, orgnucin con cultivoscelulares presentes las partculas y en los celulares otras pequeas vivas. muestras DE Le urcnoscopA DE coNTRASTE TNTERFERENcIA (OTC) DELIj.AZ UTU-ZA UN DISOCIADOR DIFERENCIAL DE DIFERENCIAS FASE DELUZ PARADETECTAR La microscopla de contrastede interferencia diferencial (DIC) en principioseasemeja Ia microscopa contrasde a ya un peroesmssensible queemplea prismaeste defase, (Fiseparados paraseparar hazdeluz en dosrayos el pecial cualquier se guraA.8). Cuandolos doshaces recombinan, a en cambiode fase algunode ellosproducidoal pasar tragenerauna interferencia con el segundo vsde la muestra normalcambios fase de haz.Debidoa quelos principales (el ndicede en de menteseproducen losbordes lasclulas la dentrode la clula), perifees refraccin msconstante intensa. produce generalmente seal una La ria de la clula tridimensionalcomo resultadode imagentiene apariencia que ya una ilusindefusinde sombras seproduce quelas

Placa de fase

Luz difractada (fasealterada por la muestra) Lenteobjetivo Luz directa (fase inalterada por la muestra)

Lentecondensadora

G?lxl'#'"
Fuente luz de

FiguraA.6 0ptica del mictoscopiode conttaste de fase. Configuracin de los elementospticos y de los recorridos de los rayos de luz a travs del microscopio de contrastede fase.Las lneas rosasrepresentanla luz difractada por la muestra y las lneasnegras representanla luz directa.

so;m-

de de de Figura A.7 Mictoscopia conttaste fase. Micrografa Las fueronobservadas epiteliales. clulas de de contraste fase clulas principalde la y sin procesar sin teir,lo queesunaventaja de de microscopa contraste fase.

Elmicroscopio ptico

879

-------Plano

de laimaoen

Analizador (rotado90" con respectoal polarizadr) Prismade Wollaston

\i
Lenteobjetivo

2 hacesde luz polarizada separadospor el prisma inferior Lentescondensadoras

Torrm' Figura Microscopa Micrografa deun grupo 4.9 DlC. DIC de

neuronas hipocampalesde rata creciendo en cultivo. Obsrvese el efecto de grabado de sombra que haceque estasclulasaparezcan oscurasen la parte superior y clarasen la parte inferior.

Prismade Wollaston Polarizador

-E-

Q-ruente

oetuz

Figura Optica microscopiocontlaste inteilerencia A.8 del de de (DlG). Configuracinloselementos diferencial de pticos delos y recorridos losrayos luzatravs microscopio de de del DIC. diferencias fasesonpositivas un lado dela cebray nede en (Figura gativas el ladoopuesto en A.9). Los componentes pticosnecesarios parala microscopa DIC incluyenan polarizador,unanalizadorywpar de prismas Wollaston (FiguraA.8).El polarizador el primer de y prisma de Wollanstonseparan rayo de luz, creandodos el hacesseparados una pequeadistanciaen una direcpor cin. Despus atravesar muestra,los haces recomde la se binan por el segundoprisma de Wollanston.Si no existe muestra, haces recombinan los se paraformar un rayoidntico al que entr inicialmenteen el polarizadory en el primer prismadeWollanston. presencia una muestra,los En de doshaces serecombinandela mismaforma (interfieren no entreellos),ylapolarizacin de los haces rota ligeramente en compracin con el original. El efectoneto esun marcadoincrementode la resolucin, que haceque estatcnica seaespecialmente para estudiarmuestras til vivasy sin teir. Como veremosen breve,la combinacinesatcnica con la videomicroscopa una aproximacinespeciales menteefectiva para estudiarlos procesos dinmicosde las clulas tiempo real. en
880 y tcnicas microscopa ApndicePrincipios de

Losbilogos celulares emplean otrosmtodos mejode ra de contraste.Lamodulacin contraste Hoffman,dede de sarrollada por Robert Hoffman, incrementael contraste detectandogradientes pticos a travsde una muestra transparente, utilizando filtros especiales un polarizador y que rota. La modulacin de contrastede Hoffrnan produceun efecto fusinde sombras de parecido de la microsal copaDIC. pERMrrE Le urcRoscopA DEFLUoREScENcIA DETECTAR PRESENCIA MOLCULAS IONES LA DE O
ESPECFICOS DENTRO DE LAS CLULAS

Aunque las tcnicas microscpicas descritas hastaahora sonbastante efectivas paravisualizarlasestructuras celulares,proveen relativamente pocainformacinacerca la lode calizacin molculas de especficas. forma de obtener Una estainformacin esmedianteel uso de la microscopade fluorescencia,que permite la Tocalizacin molculas de fluorescentes dentrodelasclulas. Paraentender cmo funcionala microscopa fluorescencia necesario primero de es comprenderel fenmenode la fluorescencia. Naturaleza la fluorescencia. trmino fluorescencia de El hacereferencia proceso comienza la absorcin al que con de luz por una molculay termina con su emisin.La aproximacin a esteproceso optimizaconsiderando comse el portamiento de un cuanto de luz en contraposicina su comportamiento ondulatorio. FiguraA.l0 esun diagraLa ma de los diversos nivelesde energa un tomo simple. de Cuandoun tomo absorbeun fotn (o cuanto)de luz de una determinada energa, uno de suselectrones saltade su

c .o

b c) c) -o
! ,g

de una molcula fluorescentetpica. Cada molcula fluorescente tiene su propio espectrode absorciny de emisin caracterstico. El microscopio fluorescencia. La microscopa de fluoresde cencia es un tipo especializado microscopa ptica que de emplea luz para excitar fluorescencia en la muestra. Un microscopio de fluorescencia tiene un filtro de excitacin entre la fuente deluzy el condensador, que transmite nicamente luz de una longitud de onda particular (FiguraA.l l). El condensadorenfoca la luz sobre la muestra, produciendo que los compuestosfluorescentes la muestra emitan de luz de una longitud de onda ms larga. Thnto la luz de excitacin del iluminador como Ia luz emitida, generadapor los compuestosfluorescentes la muestra, pasan a travs de del objetivo. A medida que la luz pasaa travsdel tubo del
Planode la imagen

9)
c) c

LIl

Estadobasal (a) Diagrama energa de

N f,

-c)

'11

p E (
O

Luz 400 500 600 700

VlSlDle
i

I i

Longitud onda (nm) de y (b) Espectros absorcin de emisin de Figura A.10 Principios la fluorescencia. (a) Diagramade de energa la fluorescencia un tomo simple.La luz de una de de determinadaenerga absorbida(lneaazul).El electrnsaltade es Vuelveal estadobasal su estado basala un estadoexcitado. emitiendo un fotn de menor energa por lo tanto de mayor y longitud de onda (por ejemplo,Iuz roja). (b) Espectros de absorcin y de emisin de una molcula fluorescentetpica. La curva azul representaIa cantidad de energaabsorbida en funcin de la longitud de onda, y la curva arroja muestra la cantidad de luz emitida como funcin de la loneitud de onda.

Filtrn herrare

/hlnn,roa

la transmisin toda de la luz ultravioleta,

normitiondn al nrcn

nicamente luz visible) de Lenteob.letivo

lvluestra

Luz
ultravioleta Lentecondensadora (fillra Filtro excitacin de la luz y transmite nicamente rayosultravioleta)

estado basal un estado excitado o de mayor energa. Este electrn a menudo pierde parte de su energa y desciende a su estado basal original, emitiendo un fotn al hacerlo. El fotn emitido tiene siempre menor energa (mayor longi-

tud de onda) que el fotn original que fue absorbido.As, por ejemplo, la iluminacin con luz azrtlde un tomo puede producir Ia emisin de luz roja (la energade un fotn esinversamenteproporcional a su longitud de onda; por lo tanto, la luz roja, al tener una longitud de onda mayor que lahlz az,il' tiene menor energa). Las molculas fluorescentes en realidad tienen diagramas de energams complicados que los que se muestran en la Figura A.10a. El nmero de nivelesposiblesde energa en las molculas reales es mucho mayor y por lo tanto, los diferentes tipos de energa que se puedan absorber y emitir son consecuentemente ms numerosos.En Ia Figura A.10b se muestran los espectros absorcin y emisin de

\ -ruenre oe ruz
EI +

Figura A,11 pticadel microscopio fluorescencia. de Configuracinde los elementos pticosy de Ios recorridosde la luz a travs del microscopio de fluorescencia.Laluz procedentede la fuente de iluminacin pasaa travs de un filtro de excitacin que transmite nicamente luz de excitacin (lneasnegrascontinuas). La iluminacin de Ia muestra con estaluz produce que sus molculasfluorescentes emitan luz de una longitud de onda mayor (lneasazules).Posteriormente,el filtro barrera elimina la luz de excitacin y permite el paso de Ia luz emitida. Por lo tanto, Ia imagen se forma exclusivamentea partir de luz emitida por las molculasfluorescentes Ia muestra. de

Elmicroscopio ptico

881

un microscopio por encima del objetivo, atraviesa filtro barrera que elimina especficamentela longitud de onda de la luz de excitacin. Esto deja nicamente las longitudes de onda de la luz emitida por la muestra parala formacin de la imagen fluorescentefinal que, por lo tanto, parecebrillante frente a un fondo oscuro. fluotescentes, Para emplear la microscopa de Anticuetpos fluorescencia la localizacinde molculaso iones especen ficos dentro de las clulas,los investigadoresdeben emplear de indicadores especiales las molculas denominados sondas Una sonda fluorescente esuna molcula capaz lluorescentes. para indiy de emitir luz fluorescente que puede emplearse presenciade una molcula o un ion especfico. car la Una de las aplicacionesms frecuentes de las sondas es fluorescentes la inmunotincin, una tcnicabasadaen la capacidadde los anticuerposde reconocery unirse a mol(las molculas a las que se unen los anticulas especficas Los cuerpossedenominan antgenos). anticuerposson protenasproducidas de manera natural por e1sistemainmune invasores, de a en respuesta la presencia microorganismos pero se pueden generartambin en el laboratorio inyectando una protena extraau otra macromolculaa un animal como un conejo o un ratn. De estaforma, es posible a producir anticuerposque se unirn selectivamente virtualmente cualquier protena que un cientfico quisieseesusanno tudiar. Los anticuerpos son visiblesdirectamente do microscopa ptica, sin embargo, se suelen unir a colorantes fluorescentescomo Ia fluorescena,que emite verde,o \a rodamina,que emite fluorescencia fluorescencia roja. Ms recientemente los anticuerpos se han unido a <quantum dots>> son cristalesdiminutos que emiten luz que y que son ms establesqumicamente que los colorantes n tradicio nales.Para identifi car la lo calzaci subcelularde las una protena especfica clulassetien simplementecon un anticuerpo fluorescentedirigido contra Ia protena y la localizacin de la fluorescenciase detectamediante el examen de Ia clula con luz de la longitud de onda apropiada. Se pueden aplicar tcnicasmicroscpicasde inmunofluorescenciausando anticuerpos marcados directamente (FiguraA.l2a). Sin embargo, con marcadoresfluorescentes la microscopa de inmunofluorescenciase emplea ms comnmente utilizando tcnicasde inmunofluorescencia indirecta (Figura A.12b). En la inmunofluorescenciaindirecta se trata un tejido o una clula con un anticuerpo sin marcar. Este anticuerpo, llamado anticuerpoprimario, se dentro del tejido o de une a los sitios antignicosespecficos Entoncesse aadeun segundotipo de anticuerpo la clula. El llamado anticuerpo secundario. anticuerpo secundario partcula fluorescente se une al any estmarcado con una que se pueden unir ms de ticuerpo primario. Debido a una molcula de anticuerpo primario al antgeno,y ms de una molcula de anticuerpo secundario al anticuerpo primario, seconcentrauna mayor cantidad de molculasfluocercade la molcula que queremos detectar.Como rescentes

marcados Anticuerpos con un colorante fluorescente

A n t i c u . e r p o s , , ,Y V .,
otflgtooscl / especrlrcos

;;;;;;;;,r1s"r;-4 1 \A v

que los Se permite anticuerpos unan se

r1'

(a) Inmunofluorescencia icos Anticuerpos especf frenteal antgeno primario) (anticuerpo

a Sepermite losanticuerpos unirse antgeno al

\/\
-

I
-t

v -

f'(

Se aadenanticuerpos que se unen marcados primarios a los anticuerpos ("anticuerpo secundario') (b) Inmunofluorescencia indirecta fluotescentes. empleando anticuerpos FigwaA.t2 Inmunotincin se La microscopa inmunofluorescencia basaen el uso de de paradetectarcomponentes marcadoscon fluorescencta anticuerpos (antgenos) dentro de una muestrade especficos moleculares directaun anticuerpoque se tejido. (a) En la inmunofluorescencia une a un componentemolecularen la muestrade tejido semarca El se con un colorantefluorescente. anticuerpomarcadoentonces localizaciones aadea la muestrade tejido unindosea algunas que El especficas. patrn de fluorescencia seorigina sevisualiza o de empleandomicroscopa fluorescencia confocal.(b) En ia indirecta,seaadeun anticuerpoprimario al inmunofluorescencia que lleva tejido.A continuacinseaadeun anticuerposecundario se El el marcajefluorescente. anticuerposecundario une al anticuerpoprimario. Debido a que sepuedeunir ms de un fluorescente cadamolculade anticuerpo a anticuerposecundario indirectaamplificade manera primario, la inmunofluorescencia que la haciendoque seams sensible 1a fluorescente, efectiva sea1 directa. inmunofl uorescencia

resultado, la inmunofluorescencia

indirecta produce una

amplificacin de la sealy esmucho ms sensibleque la utilizacn de un nico anticuerpo primario. El mtodo es <indirecto>ya que no detectadirectamentednde se unen los anticuerpos a los antgenos;tcnicamente,la fluorescencia refleja el sitio al que se ha unido el anticuerpo secundario. Por supuesto,esto refleja el lugar donde se localizala molcula originaria de inters.

882

y tcnicas microscopa de Apndice Principios

de fluotescentes,En microscopa fluorescenOttassondas que son unidas naturales tambinprotenas cia seemplean especficos. Por celulares a selectivamente componentes de unaimagen fluorescenejemplo, FiguraA.l3muestra la teidas confaloidina, una toxina cia de clulasepiteliales que procedente una seta, marcada con fluorescena, se de de Otra a los une especficamente microfilamentos actina. utiliza la protenaverde tcnicapotentede fluorescencia (GFP),una protenafluorescente origen de fluorescente Aequoria victoria.Usannaturalproducidapor la medusa pueden los do tcnicas DNA recombinante, cientficos de unir el DNA que codificapara GFP a un gen que codifica

--

1orm-----]

de Clulas epiteliales A.13 Micloscopa fluotescencia. de Figura phalloidina, fluorescente con rin de perroteidas el colorante queseunea losmicrofilamentos actina. de

Et una protenacelularen particular. DNA recombinante en resultantesepuedeintroducir dentro de las clulas, las fluorescente queseexpresarparaproducir versin una de la la protenacelularnormal.En muchoscasos, fusin de GFP al final de una protenano interfierecon su funcin, de lo que permite el uso de la microscopa fluorescencia protenas fusionadas GFPmientrasstas a paravisualizar sus desempean funcionesen una clulaviva (Figuhan Losbilogosmoleculares producidoformas ra A.14). que absorbeny emiten luz de diversas mutantesde GFP se otrasprolongitudes onda.Adems, han identificado de roja tenasde origennatural,la protenafluorescente del han herramientas expandidoel repertoriode coral.Estas que a de molculas fluorescentes estn disposicin losbiIogoscelulares. de se La microscopa fluorescencia puedeutilizar para subcelular variosionesadede monitorizarla distribucin comoprotenas. macromolculas Para msde paradetectar cuyas los conseguirlo, qumicoshan sintetizadomolculas son a propiedades fluorescencia sensibleslasconcentrade H+, Na*, Zn'* y Mg2+,as de ionescomo Ca2+, ciones a elctricos travsdela membranaplascomoa potenciales sondas fluorescentes inyectan cse en mtica. Cuandoestas al lulasde forma que sequedanrestringidas citosolo a un producen informacin intracelular especfico, componente inicasdentro de la de importanteacerca las condiciones llamadafura-2 clula.Por ejemplo,una sondafluorescente paraestudiar concentraciones las habitualmente seemplea vivas,ya que fura-2 emite fluode Ca2* dentro de clulas de bajas rescencia amarillaen presencia concentraciones verdeo azul en presencia conde de Ca2+y fluorescencia progresivamente altasde esteion. Por lo ms centraciones del en tanto,la monitorizacin colordela fluorescencia ccon estasondapermite a los cientficos lulas vivasteidas intracelulares de observarcambiosen las concentraciones se Ca2*amedidaque stas producen.

(a)00:00

(b) 03:a0

(c) 05:08

-iotm-

ptoteinas. Serie imgenes unaclulade un embrinde patavisualizal de de fluorescente vetde de Figura A.14 Utilizacin la protena El fluorescente verde(GFP). tiemporespecto queest unidaa la protena mitosis. embrinexpresa El experimentando nematodo B-tubulina en a Ia primerasemuestra minutos:segundos.

Elmicroscopio ptico

883

Le utcnoscope coNrocAl MINMTzAEL ASpEcro BoRRoSoMEDIANTE EXcLUSIN LALUz zuERA LA oT DE FOCO LA IMAGEN DE Cuando se visualizanclulasintactas,la resolucinde la microscopa fluorescencia limitada por el hechode de est que aunqueseemite fluorescencia travsde toda la proa fundidad de la muestra,el observadornicamentepuede enfocarel objetivoen un determinadomomento a un nico plano.Como resultado, luz emitida desde la regiones de la muestra encimay por debajodel planofocalhaceque por la imagensea borrosa(Figura A.15a). Parasolucionar este problema,los bilogoscelulares menudo empleanel mia croscopioconfocal-un tipo especializado microscopio de ptico que empleaun haz dehtz lserpara producir una imagende un nico plano de la muestraen un momento determinado(FiguraA. I 5b)-. Estaaproximacinmejora la resolucina lo largo del ejeptico del microscopio-as se pueden distinguir las estructuraslocalizadas el que en centro de la clulade las que estnen la superficieo de la parteinferior-. De igualforma,sepuededistinguiruna clula en el centro de una piezade tejido de las clulasque estnpor encimao por debajode ella. Paraentender este tipo de microscopa necesario es primero considerar recorridosde la luz que atraviesa los una lente simple.La FiguraA.16 ilustra cmo una lente forma una imagende una fuentepuntual de luz. Paraentender lo que verasu ojo imagineque colocaun trozo de una pelcula fotogrficaen el plano de foco (plano de la imagen).

Ahora pregntese cmo contribuyena la imagenoriginal lasimgenes procedentes otrospuntosdeluz localizados de mscerca mslejosde la lente(FiguraA.16b).Como se o puedededucir,existe una relacinprecisa entrela distancia entre el objeto y la lente (o), la distanciaentrela lente y la imagenenfocada objeto (i) yladistanciafocalde la lendel te (fl.La siguiente ecuacin expresa relacin: esta 111

j:;-

(A.s)

Como muestra FiguraA.l6b, la luz que seoriginaa la partir de los puntos que no estnen foco cubreuna superficie mayor de la pelculaya que los rayosconvergen dio vergen.As, la imagen en la pelcula estformada por la fuentepuntual original, que esten foco,y un halo de luz procedente los objetosfuera de foco. superpuesto de Si nicamenteestuvisemos interesados ver la fuenen te puntual original, podramos eliminar la ltz ajenaa estepunto disponiendo una apertura u orificio puntual (pinhole), el mismo plano de la pelcula.El microscopio en confocalempleaesteprincipio para discriminar los rayos fueradefoco.Porsupuesto, una muestrarealno tenemos en nicamente una fuentepuntual de luz extraaa cadalado del objeto que deseamos observar,sino un continuo de puntos.Paraentendercmo afectaestoa nuestraimagen, imagineque en lugar de tres puntos de luz nuestramuesa estuviese formadapor un tubo deluz fino ylargo, como muestrala FiguraA.16c.Considere se ahoracmo seob-

(a) Microscopa fluorescencia de tradicional

(b) Microscopa fluorescencia de confocal

FigutaA.15 Comparacin la microscopa fluorescencia de de confucalcon la microscopiade fluorescencia tladicional. Estasmicrograflas de fluorescenciamuestran clulasde gla marcadascon fluorescencia(rojo) y clulasnerviosas(verde) marcadascon dos marcadorei fluorescentes diferentes.(a) En la microscopa de fluorescenciatradicional se ilumina la muestra completa de forma que el material fluorescentepor encima y por debajo del plano de foco tiende a hacer borrosa la imagen. (b) En la microscopa confoial de fluorescencia,la luz incidente se enfocaen un nico plano, y se excluyela fluorescenciafuera de foco de la muestra. La imagen resultanteespor lo tanto mucho ms ntida. (Imagen cortesade Karl Garsha,especialista microscopla ptica digital, grupo de tecnologa de imagin, Instituto en Beckman de Ciencia y Tecnologa,Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Urbana,IL wwi.tig.uiux.edu.l

884

y tcnicas microscopa ApndicePrincipios de

Visin plano del de Ia imagen Lente Planode la imagen

(a) Formacin una imagenpor una lentea partirde un nico de puntode luz

FiguraA.16 Reconidosde la luz a travs de una lente. (a) Imagen de un punto nico de luz formada por una lente. (b) Recorridos de laluz a partir de tres puntos de luz situados a diferentesdistancias de Ia lente. En el plano de la imagen, la imagen enfocadadel punto central sesuperpone con los rayos desenfocados procedentesde los otros puntos. Sepuede usar una apertura alrededor del punto central para discriminar los rayos desenfocados maximizar la y contribucin del punto central. (c) Recorridos de la luz originada a partir de un continuo de puntos, representadocomo un tubo de luz. Esto es semejantea una muestra iluminada uniformemente. En el plano de la imagen, las contribuciones procedentesde una pequea seccinenfocadaarbitraria, dx, estncompletamente enmascaradas los otros rayos fuera de foco; en estecasoun por pinhole o pequeo orificio no ayuda. (d) Mediante la iluminacin intensa de una nica seccindel tubo y la iluminacin dbil del resto,podemos recuperar Ia informacin en el plano de imagen de la seccin dx. Ahora un orificio localizado alrededor del punto rcchazalos rayos fuera de foco. Debido a que los rayos del centro proceden casitodos de dx, tenemos una forma de discriminar frente a los puntos ms dbilesfuera de foco.

Visin plano del

da la imnan

Lente

Planode la imagen magen

(b) Formacin la magende un puntode |uz en presencia en

aia ^trc 2 nr rninc

Visin plano del

lo l imnon
I

Lente

Planode la imagen

(c) Formacin una imagende una seccinde un tubo de de luz uniforme

t. 1 .l

I I

Visin plano del de la imagen

Lente

Planode la imagen

(d) Formacin una imagende una secciniluminada en d e u n t u b od e | u z

tieneuna imagena partir de una pequea seccin arbitraria, dx. Si el tubo envala misma cantidadde luz por unidad de longitud,entonces inclusocon un pinhole,la imagendeinters estar por enmascarada loshalos procedentes de otras partesdel tubo. Estosucede porquela pequea contribucinde cadauna de lassecciones fuerade foco,y todaslaspequeas producenconjuntamente secciones un fondo intensosobrela seccin inters. de Estasituacin muy semejante la que encontramos es a en muestras biolgicas reales que se han teido con una sondafluorescente. general, distribucinde la sonda En la y estridimensional cuandodeseamos mirar en detalle un nico objeto(comoun microtbulo)usando microscopa defluorescencia convencional, imagen la est menudoesa por tropeada el halo de luz de fondo queseoriginaprincipalmente por los microtbuloslocalizados encimay por por debajodel plano de inters. Paraevitaresto, podemos iluminar preferentemente plano de intersdesequiliel brando as las distintascontribuciones el plano de Ia en imagen, formaqueprocedan de principalmente un nide co plano (FiguraA.16d).As,la esencia Ia microscopa de confocal consiste enfocar un nico planoel hazdeiluen en minacin queexcitala fluorescencia, usarun orificio para y asegurar la luz que llegaal plano de la imagenseorigique na principalmente partir del planoenfocado. a La FiguraA.17ilustracmofuncionanestos principios enun microscopio lserconfocal, iluminalasmuestras que empleando whazde luz lserenfocdo travs una lena de te objetivohaciaun punto limitado de difraccin.La posicin del punto se controlamedianteespejos barrido, de que permiten que el haz deluz recorrala superficiede la muestra formaprecisa. medidaqueel hazhaceun bade A rrido sobrela muestraseforma una imagena partir de la mismade la siguiente forma.En primer lugar,la luz fluorescente emitidapor la muestra captada la lenteobpor es jetivo y conducidapor el mismo recorrido de la luz inciElmicroscopio ptico

88s

Lser Espejos de barrido

Haciael oroenaoor Espejo dicroico Detector | t ^hiii\/^ (tubofotomultiplicador)

L v , , r v v v J v ! , v v

Muestra
(b) de FiguraA.1? Microscopio banidolserconfocal. (a) Fotografiay (b) esquemade un microscopio de barrido lserconfocal.Seemplea un lserpara iluminar un punto de la muestra en un determinado de momento (lneasazules).Los espejos barrido mueven el punto en un determinado plano de foco siguiendoun patrn preciso.La luz fluorescenteemitida por la muestra (lneasrojas) esreflejadapor los de mismos espejos barrido y retorna por el mismo recorrido original del haz incidente.La luz emitida no urelve al lser por el contrario, estransmitida a travsde un espejodicrico (que en esteejemplo refleja la luz azul y transmite lafuzroja). Un orificio o pinhole en el plano de la imagen bloquea los rayosextraosque estnfuera de foco. La luz esdetectadapor un tubo fotomultiplicador, cuya seales digitalizaday almacenadaen un ordenador.

dente. El recorrido de la luz fluorescente se separa entonces

de la luz lserutilizando un espejodicroico,que reflejaluz de un color y transmitela de otro. Debido a quela luz fluorescente tieneuna longitud de onda mslargaquela luz de hacia es el excitacin, color dela luz fluorescente desplazado en atraviesa orificio localizado el el roio. La luz fluorescente
886 y tcnicas microscopa de ApndicePrincipios

un plano de la imagen,frentea un tubo fotomultiplicador, La que actacomo detector. sealdel tubo fotomultiplicay digitalizada mostradaen un ordenador. dor esentonces Paraver el incrementode resolucinque seobtienecon la microscopaconfocal,vuelva a mirar la Figura A.15, que mediande muestraimgenes la misma clulavisualizada y convencional mediante te microscopade fluorescencia de microscopa lserconfocal. lserconfocal, miel a Como alternativa la microscopa que giran giratorioempleadiscos de confocal disco croscopio leny rpidamente que contieneun conjunto de pequeas Aunque no de tes y una seriecorrespondiente pinholes. pticastan finas como los mipuedeproducir secciones puedegenerar imgenes confolserconfocal, croscopios usandocmaras que sepuedenadquirir rpidamente cales rEstavelocidadestil paravisualizarprocesos digitales. en pidosqueseproducen lasclulas. un confocal, emplea pinholeparaelise En microscopa es luz fuerade foco.El resultado una imagenntiminar la por molculas encimay por debajodel plada, aunquelas por siendoexcitadas Ia luz no focaldela lenteobjetivoestn rpidode Estopuedeproducir el blanqueamiento incidente. especialen de las molculas fluorescencia; algunoscasos, vivasque contienenmoclulas mentecuandoseobservan libera radicales este lculasfl uorescentes, blanqueamiento txicosque puedencausarla muerte de la clula.Parareque nicamente serladeseable ducir esta<fototoxicidad> muy prximas fluorescentes las fuesenexcitadas molculas Estoesposibleutilial plano focalque seestexaminando. zandolamicroscoplade excitacinmultifotn. En la mimultifotn, seempleaun lserque de croscopa excitacin y emitepulsosde luz de muy altaenerga muy rpidamente fluorescencia, Paraqueseproduzca parairradiar Ia muestra. una rpidasucesin debeabsorber la molculafluorescente (FiguraA.l8). casos o ms)fotones tres dedos(o enalgunos es de Laprobabilidad queestoseproduzca muy baja,excepto nicerca plano focaldel objetivo.Como consecuencia, del que camentelas molculasfluorescentes estnenfocadas El es emitenfluorescencia. resultado muy similar en nitidez el perono esnecesario pinholeya confocal, a la microscopa se queno hayqueeliminarluz fueradefoco.Thmbin reduce Como ejemplo,seemla considerablemente fototoxicidad. ple microscopa excitacinmultifotn para generarla de imagende la FiguraA.14 de un embrin vivo. la una tercera tcnica, microscopladiSepuedeemplear muy ntigital de deconvolucin,para producir imgenes digital sebasae un principio comdas.La deconvolucin pletamentediferente.En estecaso,seempleamicroscopa para adquirir series imde convencional de fluorescencia de a genes fluorescentes lo largo del espesor la muestra. digitalEntonces empleaun ordenadorpafa procesar se cada o deconvolucionar, plano focal para eliminar mente, la matemticamente contribucin debida alalaz fuera de digital puedeprocasos, deconvolucin la foco.En muchos mediantemicomparables las obtenidas a ducir imgenes

Figura A.18 Microscopa de excitacin multifotn. (a) En un microscopio confocal estndarse produce fluorescenciaen un recorrido con forma de reloj de arena a travs de la muestra. Debido a que una zona amplia emite fluorescenciaesmucho ms probableque seproduzca fototoxicidad que en la microscopa de excitacin multifotn. (b) En un microscopio de excitacin multifotn la fluorescenciaest limitada al punto de foco de los pulsosdel lserinfrarrojo, lo que producemucho menosdao.La iluminacin infrarroja tambin penetrams profundamenteen la muestraaue la luz visible.

(a) Microscopa confocal

(a) Microscopa multifotn

croscopaconfocal (Figura A.l9). Una ventaja de la deconvolucin es que microscopano estrestringida a las longitudes de onda especficas que se emplean comnmente en los lseres los microscopios confocales. de LR vtool,ncRoscopA DIcITAL pUEDE REGIsTRAR IMGENESCONSECUTIVAS OPTIMIZADAS El advenimiento de detectoresde luz de estadoslido ha hecho posible en muchos casosreemplazar la pelcula foto-

grflcacon un equivalenteelectrnico-por ejemplo, con una cmarade vdeo o una cmarade imagen digital-. Estas mejoras han dado lugar a la tcnica de videomicroscopa digital, en la que se registrany se almacenanelectrnicamenteimgenesmicroscpicasponiendo una cmarade vdeo en el plano de la imagen producido por la lente ocular. Esta aproximacin se aprovechadel hecho de que las cmaras de vdeo pueden detectar pequeas diferencias de contraste con mayor sensibilidad que el ojo humano.

(a)

(b)

4"n---:,

Figura A'19 Microscopia deconvolucin de digital. Fisin de una clulade levaduras teida con un coloranteespecfico para el DNA (rojo) y un colorante especficode membrana (verde). La imagen de la izquierda esuna seccinptica sin procesara travs del centro de la clula. La imagen de la derechaesuna proyeccin de todas las secciones despusdel procesamientotridimensional de la imagen. El anillo del tabique central en desarrollo (rojo) se estformando entre los dos ncleos (rojo) que surgieron por divisin nuclear durante Ia mitosis previa.

Elmicroscopio ptico

887

1.1

imgenes un foren de las Adems, cmaras vdeogeneran medianteel promato digital que pueden seroptimizadas digital. En el procesode optimizacin,primecesamiento como un conjunto de la ro sealmacena sealdela cmara a cuyos valorescorresponden nmerosen dosdimensiones particular en la la claridadu oscuridadde una localizacin paraincrementar el entonces Los imagen. datosseprocesan del y contraste paraeliminar las caractersticas fondo que A.20). la enmascaran imagende inters(Figura de permitenla visualizacin esLasmejorasproducidas de tructurasque son un orden de magnitud mspequeas las que se pueden observarmediantemicroscopaptica ptica Como hemosvisto, Ia microscopa convencional. incapazde resolverobjetos es convencional generalmente de mspequeos 200 nm de dimetro.Por el contrario,la permite la visualizacin computerizada videomicroscopla de microtrlbulos individuales que miden nicamente25 digitalesde vdeo sepueden nm de dimetro.Lastcnicas de convencional campo claro,as aplicar a la microscopa creandoasun conDIC y confocal, como a la microscopa junto poderoso aproximaciones paraincrementarla efide ptica. caciade la microscopa digital es Una ventajaadicionalde la videomicroscopla fijada,comoesel casoen estar el quela muestrano necesita de electrnica, forma que sepuedenmonila microscopa se a dinmicos medidaquestos producen. torizarprocesos cmaras vdeo especialde Adems, han desarrollado se que imgenes extremadamentesensibles puedendetectar de mentedbilesfacilitandoaslla capacidad registraruna celude consecutivas los procesos serierpidade imgenes laresa medidasque stosseproducen.Por ejemplo,utilipodra llevar zandouna pelculafotogrficaconvencional, ms de minuto registraruna imagendel marcajefluoresconseculo cente, quesignificaqueuna seriede fotografias tivaspodrla slomostraruna foto de una clulapor minusi to. Sin embargo, una cmarade vdeooptimizadapuede

registraruna imagen de la misma clula30 vecespor segundo,estopermite monitorizar cambiosrpidosen el assubcelulares. pectoy el comportamientode componentes Estoha permitido a los cientficosobtenerinformacin de y los cambiosen la concentfacin en la distribucin subcemensajecomo segundos citoslicos lular de componentes y celular, estudiarel papelde las ros durantela sealizacin en de estructuras citoesqueleto los movimientosintraceludigital ha ampliado enorlares.As, la videomicroscopa para monitorizar procesos al mementenuestracapacidad vivas. tiempo que seproducenen las clulas til digital no essolamente paraexamiLa microscopa en nar procesos un plano focal.En una variantede estatcnica seempleaun ordenadorpara controlar el foco motoimgenes De forma,secaptan rizadodeun microscopio. esta de series de a lo largo del espesor la muestra.Cuandoestas este se imgenes captana intervalosde tiempo especlficos, en se tipo de microscopa denominamicroscopa cuatrodi(expresin a acuada partir de la ftsica;las cuamensiones msla del son tro dimensiones lastresdimensiones espacio de en deltiempo).El anlisis los datos adicional dimensin informticasesrequiereaplicaciones cuatro dimensiones a entrelos planosfocales que pecializadas puedennavegar especficas. lo largo del tiempo para mostrar imgenes MToDosprtcos S pusoN EMPLEAR Y LOSMOVIMIENTOS LASPROPIEDADES PARAMEDIR Y MACROMOLCUTS DELASPROTENAS OTRAS a La microscopapticapuedeayudarnos visualizardnde y dentro de lasclulas para estulocalizanlas molculas se de delos momientosy laspropiedades las diar la dinmica brevemente estas Consideraremos biolgicas. molculas en estaseccin. modernas tcnicas y fotoactlvacln,Cuandolasmolculas Fotoblanqueamiento son fluorescentes irradiadascon luz de la longitud de onda

(a)

(b)

(c)

(d)

ffi

digital computeilzada. Esta serie de micrografas muestra cmo sepueden emplear los ordenadorespara FiguraA.20 Videomicroscopa mejorar las imgenesobtenidas mediante microscopa ptica. En esteejemplo, la imagen de numerosos microtbulos, que son demasiado pequeospara ser observadosmediante microscopa ptica convencional,seprocesanpara hacerlosvisibles en detalle. (a) Imagen resultante del incremento electrnico del contrastede la imagen original (que pareceestarvaca). (b) Fondo de Ia imagen procesadaen (a) que es sustrado (c) de la imagen (a) dejando como resultado nicamente los microtbulos. (d) Imagen final detalladaque resulta del promedio que semuestran en a-c. electrnico de las imgenesindiduales procesadas

y tcnicas microscopa de ApndicePrincipios

de excitacin apropiada durante largos periodos de tiempo, sufren un fotoblanqueamiento (la irradiacin induce que las molculas dejen de emitir fluorescencia).Si solamente una pequea regin de Ia clula es expuesta a la luz intensa, el blanqueamiento produce una disminucin caractersticade la fluorescencia estazona (FiguraA.2la).A meen dida que las molculas no blanqueadas se mueven hacia la zona blanqueada, se recobra gradualmente los niveles de fluorescencia.La recuperacinde la fluorescenciadespus del (FRAP) es una medida til de la velofotoblanqueamiento

:F*QF--QF
(a) Fotoblanqueamiento (b) Fotoactivacin Monmero de G actina

cidad a la que las molculas difunden o son transportadas (vasela directamente Figura7.ll paraun ejemploclsico de la utilizacin de FRAP). En otroscasos, molculas las fluorescentes modificason das qumicamente para no emitir fluorescencia hastaque son irradiadascon luz de una longitud de onda especfica, normalmente ultravioleta. luz ultravioleta luz La inducela liberacindel modificadorqumico,permitiendoque la molculade intersemitafluorescencia. han producidotanSe to colorantes modificadosqumicamente como formas de GFPque secomportande estaforma. Estoscompuestos se denominan frecuencia con compuestos enjaulados,ya son que <liberados> la escisin nicamente por inducidapor la luz. La liberacin, fotoactivacin, o producela situacin contraria al fotoblanqueamiento: liberacinlocal de una molla produceun punto luminosodefluorescenculafluorescente quesepuedeseguira medidaquelasmolculas cia siguen su caminoa Io largode la clula(Figura A.2lb). La liberacin por fotoactivacin puedeemplear se tambinparatransformar otro tipo de molculas inertesa su estadoactivo.Por ejemplo, ncalcio el enjaulado> consiste un quelante calen de cio que estunido a los ionescalcio.Cuandoel compuesto enjaulado irradiado,liberael calcioque llevaunido, proes duciendouna elevacin local de calciodentro de la clula. Microscopa fluorescenciareflexin intema. La mide de total croscopa florescencia reflexin de de total interna(TRIF) suponeun mtodoinclusoms precisopara observar las molculas fluorescentes. sebasa unapropiedad TRIF en til dela luz: cuandola luz semuevedesde mediocon un alto un (comoel vidrio) a un medioconun nndicederefraccin dicede refraccin menor (comoel aguao una clula), el si ngulodeincidencia la luz supera ciertovalor (denode un minadongulo crtico),Laluz reflejada. es puede Usted estar familiarizadocon los cables fibra ptica,que sebasanen de el mismo principiofsico. curvatura Ia fibra produce La de que casitoda la luz que entra en el cableseareflejada internamente, permitiendoa estas fibrasservircomo<tuberas de luz>.Losmicroscopistas pueden tambinusarlentes especialespara haceruso de la reflexintotal interna.Cuando una clulaemiteluz brillantefluorescente forma quetoda de la luz supera ngulocrtico,seproducirla reflexintotal el interna.Por qu estil la TRIF si sereflejatoda la luz?Una capade luz muy pequea, llamadael <campo evanescente) (FiguraA.21c). capa seextiende hacia agua la clula el o Esta esmuyfina,dealrededor 100nm, haciendo TRIFsea de que 10veces mejor que un microscopio confocal pararesolver objetospequeos muy prximos a la superficiedel cubreobjetos. Estohaceque TRIF seaespecialmente para estil tudiar la liberacinde vesculas secrecin para la obde o servacin la polimerizacinde actina. de pol Tlansferencia energa resonancia fluorescencia, de de La microscopa fluorescencia til no solamente de es para la observacin movimientode lasprotenas, de sino tamElmicroscopio ptico 889

Agua (bajo ndice de refraccin)

aa o ol

evanescente a T .lo 1 0 0n m la
a a

a aaa

a oa

a a o O a a o Vidrio

Aceitede inmersin
l^^+^

(altondice de refraccin)

objetivo

(c) Figura A,21 Tcnicas estudiode los movimientos de dinmicos de las molculas dentrode las clulas. (a) Fotoblanqueamiento de molculas fluorescentes. reabien definida de una clula es Un irradiada, lo que produce el blanqueamiento de las molculas fluorescentes. Gradualmente,nuevasmolculassin blancuear invaden la zona blanqueada.(b) Fotoactivacin de protenas fluorescentes. fotoactivacin de una regin seleccionada, La como el ncleo (indicadoen rojo), produceun incrementode 1a fluorescencia.El movimiento posterior de molculasfluorescentes sepuede monitorizar. (c) Microscopa de fluorescenciade reflen total interna (TIRF). El ejemplomostradoimplica monmeros fluorescentes G actina (vaseCapitulo de l5). Cuando un haz paralelo de luz en un medio con un alto ndice de refraccin (como el vidrio) incide sobre su interfasecon un medio de menor ndice de refraccin (como una clula o el agua) con un ngulo que supera el ngulo crtico, sufre una reflexin total interna. La reflexin total interna produce un (campo evanescente) el en medio de menor ndice de refraccin, que decaerpidamente con la distancia.Esto permite la observacinnicamente de un nmero pequeo de molculasfluorescentes.

ffsicasentre ellas.Cuanbin para medir las interacciones propiedades fluode cuyas fluorescentes do dosmolculas y estnemparejadas muy prximasentre s, es rescencia posibleque sufrantransferenciade energapor resonrncia de fluorescencia(FRET).En FRET la iluminacin de una clulaa la longitud de onda de excitacindel primer al energa seproduce transferencia la fluorforo(donante) no energa Esa gundo fluorforo (aceptor). transferencia implica un fotn de luz, pero una vezque ocurre,induceIa emisinde luz por el aceptoren su longitud de onda caen Frecuentemente FRETseempleaun par de racterstica. de derivadas GFP:una brilla con molculasfluorescentes proazul fluorescencia (cian) (sedenominafrecuentemente la cian tenafluorescente o CFP); otra seexcitaconluz azul y brilla con un color amarillento (y sedenominaprotena puedemedir FRETentredos amarilla oYFP).Se fluorescente (FRETintermolecular;FiguraA.22b). protenasseparadas y en La FRETsloacta un rangomuy pequeo comoconla secuencia, FRETintermolecularproporcionauna lectufluoen ra dellugardentrodela clula el quedosprotenas tocando. se esencialmente estn rescentes tipos de FRET intramolecularse empleaen diversos Vimos un ejemplode un bio<biosensores moleculares>. los en sensor el Captulo14,cuandoconsideramos <camaprotenas cambiande forma paraponer en Estas leones>. y azules amarillasnicacontactoprotenasfluorescentes los nivelesde calcio.La FRET mente cuando se elevan

se resultante puedeusarcomo una medidade los niveles similares biosensores de Iocales calcio.Seestnempleando protenas G, local de pequeas para medir la activacin del un reguladorclaveen la sealizacin recepcomo Ras, Captulo 14). Estossensores tor tirosina quinasa(vase de forma que permite la FRET nicasufren un cambio de menteen regiones la clulaen las que seactivaRas(Figura A.22c). uPinzas pticas'. La ltima aplicacinde la microscopa comopropuedeserconsiderada pticaque discutiremos pero sebasaen formasbien estableficcin, pia de ciencia cidasde interaccinde la luz con los objetospequeos. propequeos, Cuandolos fotonesimpactancon objetos Cuandoun objetopesobreellos. lumnica> ducen<presin en comoesel caso una pequeotieneuna grancurvatura producidas Ias diferenciales queaesfera plstico, fuerzas de a por un haz de luz lsercompactoy canalzado travsdel tiendena mantenerla gota en el centrodel microscopio, <pinzas n haz,atrapndolamediantepresi lumnica.Estas o se pticas> puedenusarpara moverobjetos, sepueden pequeas sobreessumamente usarparaproducirfuerzas Por o unidasa protenas a otrasmolculas. ferasque estn sobreesferas acoejercidas midiendolas fuerzas ejemplo, de han pladas la miosinalos cientficos sidocapaces mea dir las fuerzasproducidaspor el golpe de fuerzade una 4.23) de nicamolcula miosina(Figura

CFP

vv

ao

y,vvvvv

nrnA,,a

de Interaccin protenas YFP

la FRET: luz incidente es absorbida por CFP;YFP emiteluz amarilla

'+
Proceso de celular sealizacin

Se produce FRET

Activdad Ras: alta I

baja (c) (FRET). (a) FRET intermolecular. Cuando dos protenas unidas a dos de de FigutaA.22 Transferencia ener$a pol resonancia fluorescencia lateralesfluorescentes(como la protena fluorescentecian, o CFP,y la protena fluorescenteamarilla o YFP), estnmuy prximas, al cadenas y excitar CFP,stapuede transferir energadirectamente a YFP.EntoncesYFP emite fluorescencia, stasepuede medir. (b) FRET intramolecular. En estecaso,CFP yYFP estnunidas a la misma molcula, pero nicamente pueden interaccionar cuando la protena sufre un cambio conformacional. Estasprotenas sepueden usar como <biosensores,celulares.(c) Deteccin de la activacin de Rasen una clula viva. Una clula COS-I que expresauna protena que sufre una FRET intramolecular en las regionesen las que Rases activa,muestra un incremento de FRET despus" .*potr.i lu clula al factor de crecimiento epidrmico (EGF), el cual activa a Ras.(Reproducido con permiso de Nature Publishing Group.)

890

y tcnicas microscopa de ApndicePrincipios

animal antes de extraer los rganos.Esta tcnica, llamada perfusin,puede ayudar a reducir los artefactos,que son representaciones falsaso inexactasde la muestra,que seproEsfera plstico de ducen por el tratamiento qumico o por la manipulacin de y Iasclulas los tejidos. En la mayora de los casos, paso siguienteconsisteen el cortar la muestra en secciones que seanlo suficientemente finas para transmitir la luz. De otra forma, la muestra sera opacabajo el microscopio y no seranvisibleslas estructuras discernibles. Parapreparar estas secciones finas,lamuestra se incluye en un medio (como plstico o parafina) que puede mantener su posicin mientras se obtienen las secciones.Debido a que la parafina esinsoluble en agua,cualquier resto de aguasedebeextraerpreviamentede la muesFigura4.23 "Pinzaspticas., lJna pequeaesferade plstico se puede mantener en un determinado lugar por un haz de luz lser tra (habitualmente mediante deshidratacinen alcoholes) enfocado a travs de la lente obietivo de un microscopio. Cuando la y debe ser reemplazadopor un solventeorgnico, como el esferaestunida a una molcula como la miosina, la fuerza xileno, en el que es soluble la parafina. El tejido procesado producida cuando la miosina tira de un filamento de actina unido a se coloca entoncesen un medio calientede parafina lquiportaobjetosde un microscopiosepuedemedir con precisin. un da que posteriormente se deja endurecer.La deshidratacin es menos crtica si la muestra se incluye en un medio soluble en agua en lugar de en parafina. Las muestras se Tcnicas de preparacinde muestras pueden incluir tambin en resinasplsticasepoxi o el tejipara microscopaptica do sepuede simplemente congelarde manera rpida como Una de lascaractersticas atractivas la microscopa medio alternativo de soporte. ms de pticaesla facilidadcon la que sepuedenpreparar mala Despus la inclusin o la congelacin de rpida,la muesyorade lasmuestras parasu examen. algunos En casos, la tra se corta en seccionesfinas de pocos micrmetros de preparacin lasmuestras implicamsqueel montar de no grosor empleando un microtomo, un instrumento que fununa pequea pieza un espcimen un lquido adecua- ciona de forma parecida a un seccionadorde embutidos (Fide en do sobreun portaobjetos vidrio y cubrirla con un de gura A.24). La muestra se monta simplemente en el brazo cubreobjetos vidrio. La preparacin coloca de se entonces de un micrtomo, que la hace avanzaen incrementos peen la platinadel microscopio seexamina travs ocuy a del queos hacia una cuchilla metlica o de vidrio que cort; el lar o con una cmara. tejido en secciones finas.A medida que se cortan secciones paraaprovechar mximo el poderde reSinembargo, al sucesivas, habitualmente se pegan unas a otras formando solucin la microscopa de ptica, muestras preparan una tira de secciones las se finas. Las secciones montan entonse habitualmente una forma queincrementa contraste, de eI es cesen un portaobjetos y se procede a su tincin con cualdecir,diferencias la opacidad en el color delasestruc- quiera de los colorantesque sehan adaptadopara esteproen o turasque seexaminan. lJna forma habitualparaincremen- psito. Algunas veces el tejido se trata con un nico tar el contraste la aplicacin colorantes es de especficos que colorante, pero ms frecuentementese emplean seriesde dan color o que alterarlaspropiedades transmisin de de colorantes cada uno de los cuales tiene afinidad por un la luz delos constituyentes celulares. preparacin cLa de componente celular diferente.Una vez teida,la muestra se lulas para su tincin generalmente implica los procedi- cubre con un cubreobjetosde vidrio para su proteccin. mientosespeciales describiremos continuacin. que a La autorradiografa microscpicaes una aproximacin con importancia histrica paralalocalizacin de compoLe pnrpeRecrN DELASMUESTRAS nentes especficosdentro de las clulas; es una tcnica que FRECUENTEMENTE IMPLICA SU FIJACIN, emplea una emulsin fotogrfica para determinar en qu SECCIONAMIENTO Y TINCIN lugar selocaliza un compuesto radioactivo especficodentro En lospreparativos la tincin declulas, tejidosdepara los de Ia clula en el momento en el que stasefija y secorta para ben sertratadospreviamente con fijadores que matan las microscopa.En eseprocedimiento, los compuestosreactivos clulas, tiempo que preservan apariencia al su estructural. seincuban con seccionesde tejidos o seadministran a las cLosfijadores msampliamente empleados los cidos son y lulas o a organismos intactos. Despus de que haya pasado aldehdos como el cidoactico, cidopcrico,el formalel un periodo de tiempo suficiente para que el compuesto radehdo el glutaraldehdo. forma de fijacindelostey Una diactivo seaincorporado en las molculas y estructuras injidos essencillamente sumergirlos la solucinfijadora. tracelularesde nueva formacin, selava la radiactividad resen Una aproximacin paratejidosanimales alternativa consiste tante no incorporada, se seccionala muestra de manera en la inyeccindel fijador en el torrente circulatorio del convencional y se monta en una preparacin microscpica.
Rayolser("pinzaspticas")

para Tcnicas preparacinmuestras microscopa de de ptica

891

Le urcnoscopA ELEcTRNIcADE TRANSMISIN

incluida Muestra
vr I vdrdilr ro

o resinaplstica Brazodel micrtomo de Cuchilla metal o devidrio Tirade secciones finas

FORMALA IMAGEN A PARTIRDE LOS ELECTRONES QUE ATRAVIESANLA MUESTRA El tipo de microscopio electrnico que se emplea ms comnmente se llama microscopio electrnico de transmisin (TEM) ya que forma una imagen a partir de los electrones que se trqnsmiten a travs de la muestra que est siendo examinada.Como se muestra en la Figura A.25,la mayoria de los componentes del TEM tienen nombres y a funciones semejantes sus equivalentesen el microscopio ptico, aunque su orientacin fisica estinvertida. Examiprincinaremosbrevementecadauna de las caractersticas pales. Sistemade vaco y cande electrones. Debido a que los electronesno pueden viajar muy lejos a travs del aire, se debe mantener un intenso vaco a lo largo de todo el recoPara crear estevaco dos tipos rrido del haz de electrones. de bombas de vaco funcionan de manera conjunta. En algunos TEMs seincorpora un dispositivo llamado trampa de vaco como parte del sistemade vaco para ardar a establecer un nivel de vaco elevado.La trampa fra es un metal introducido en la columna del microscopio que seenfra y con nitrgeno lquido. La trampa de fro atrapagases molculascontaminantesque sesolidifican en la superficiedel metal fro. Los electronesen un TEM son generadospor un can de electrones, un conjunto compuesto por diversoscomponentes.El ctodo,un filamento de tungsteno semejante al filamento de una bombilla, libera electronesde su superficie cuando es calentado.La punta del ctodo estcerca de una apertura circular en un cilindro de metal. Un voltaje negativo en este cilindro alrada a controlar la emisin de electronesy a dar forma alhaz. En el otro extremo del cilindro se encuentra eI nodo.El nodo se mantiene a 0 V mientras que el ctodo se mantiene a 50-100 kV. Esta difese al rencia de voltaje haceque los electrones aceleren pasar y por lo tanto se denomina potencial a travs del cilindro de aceleracin. y de Lenteselectromagnticas formacin la imagen. La formacin de una imagen en un microscopio electrnico depende tanto de la longitud de onda como de las propiedades particuladas de los electrones. Debido a que los electronesson partculas cargadasnegativamente,su movimiento puede ser alterado por fuerzasmagnticas.Esto significa que la trayectoria de un haz de electronesse puede de controlar usando electroimanes, la misma forma que las lentesde vidrio pueden desviarlos rayos de luz que pasan a travs de ellas. A1 tiempo que l haz abandona el can de electrones, entra en una serie de lentes electromagnticas(Figura A.25b). Cada lente es simplemente un espaciobajo la inLa fluencia de un campo electromagntico. distanciafocal de cadalente sepuede incrementar o disminuir variando la

Tirade secciones montadas un en portaobjetos vidrio, de teidasy cubiertas con un cubreobjetos con un micrtomo. La FigwaA.24 0btencinde secciones muestra fijada se incluye en parafina o resina plsticay semonta en el brazo de un micrtomo. A medida que el brazo semuevehacia arriba y hacia abajo siguiendo un arco circular, la cuchilla corta formando Las se sucesivas. secciones adhierenentre e1las, secciones finas que sepuedemontar en un portaobjetos una tira de secciones con un cubreobjetos. de vidrio, teir y protegerse

La preparacin se cubre entonces con una capa delgada de emulsin fotogrfica y se coloca en una caja sellada du-

que frecuentementees rante el periodo de tiempo deseado, Cuando la emulsin serede varios daso incluso semanas. vela posteriormente y la muestra se examina con un microscopio aparecen granos de plata directamente sobre la muestra, en los puntos en los que la radiacin ha estimulado la emulsin.Lalocalizacin de estosgranos de plata, que son visiblestanto con el microscopio ptico como electrnico, puede servirnos para apuntar la regin de la clula que contiene Ia radiactividad.

El microscopioelectrnico
El impacto de la microscopa electrnicaen nuestro conocimiento de las clulas sepuede describir nicamente como revolucionario.Aun as,igual que la microscopaptica, la microscopa electrnica tiene tanto ventajas como debilidades.En microscopa electrnicala resolucin es mucho mejor, pero la preparacin de la muestra y el manejo del instrumento son a menudo ms difciles. Los microscopios elecelectrnicostienen dos diseosbsicos:el microscopio electrnico barride trnico de transmisiny el microscopio do. Ambos son similares, ya que cada uno utiliza un haz de electronespara producir la imagen. Sin embargo, Ios dos instrumentos emplean mecanismosdiferentespara formar la imasen final como veremos a continuacin. y tcnicas microscopa de ApndicePrincipios

892

- Cande Ctodo (filamento I electrones de tungsteno) [ (en el interior > \'.-:-+

Anooo Hnmera
lant6

I de un cilindro
I OUenOSe

J muestra) I
| I

Muestra Soportede la muestra

condensadora Sistema I I de lentes segunoa I condensadoras renre I conoensaooraJ Lenteobjetivo

Lenteintermeda

Lentede proyeccin

Detector

(b) FigutaA.25 Mictoscopioelectfnicode transmisin. (a) Fotograffay (b) diagrama esquemticode un TEM.

cantidad de corriente elctrica aplicada a la espiral. As, pueden concuando se disponen variasventasjuntas, stas trolar la iluminacin, el foco y los aumentos. La lente condensadora esla primera en afectar alhaz de electrones. Funciona de la misma forma que su equivalente en el microscopio ptico para enfocar el haz sobre la muestra.Lamayoria de microscopioselectrnicosusan un con dos lentespara enfosistemade lentescondensadoras car mejor el haz de electrones. siguientecomponente, la El lente objetivo, esla parte ms importante del sistemade lentes del microscopio electrnico. La lente objetivo, junto con Ia lente intermedia, y la lente de proyeccin, producen una imagen final en una pantalla que emite fluorescencia cuando recibe impactos de los electroneso en un detector que genera directamente la imagen. Cmo se forma la imagen a partir de la accin de estas lentes electromagnticas sobre un haz de electrones? Recuerde que el haz de electronesgenerado por el ctodo pasa a travs de un sistema de lentes condensadorasy afecta a la muestra. Cuando impactan sobre la muestra, algunos elecpor la muestra, mientras que otros trones son dispersados continan su recorrido relativamente sin desviacin. Esta desviacin de electrones es el resultado de las propiedades creadasen la muestra mediante los protocolos de preparacin que describiremos a continuacin. La preparacin de la muestra, en otras palabras,confiere a la muestra densidad

selectiva los electrones,' decir, algunaszonasse hacen a es que otras.Las zonaselectroms opacasa los electrones ya oscuras, que son atradensas la muestraaparecern de por mientrasqueotrasreas vesadas pocoselectrones, apaya recernms claras, que permiten el pasode una mayor cantidad electrones. de El contraste entrelaszonasclaras, oscuras intermedias e de la muestraforman la imagenfinal. El hecho de que la gradosde transmisin imagenestformadapor diferentes a de electrones travsde la muestraquedareflejadoen el de hombre de microscopio electrnico transmisin. de Sistema captuta imagen. Debido a que los electrones de no son visiblespara el ojo humano,la imagenfinal esdeen electrnico transmisinal perde tectada el microscopio mitir a los electrones transmitidosimpactarsobreuna pano La talla fluorescente una pelculafotogrfica. utilizacin fotogrficas que se de pelculapermite crear impresiones micrograffas electrnicas, que setransfory denominan man en un registrofotogrficopermanente la muestra de (Figura A.26a).En muchos microscopiosmodernos una cmara digital registrala pantallao un detectordigital delos incidentes. tectadirectamente electrones Voltaje. Elhaz de electrones demasiado es dbil para penetrar en las muestras biolgicas, forma que las muesde
Elmicroscopio electrnico 893

(a) lMicrografa electrnica transmisin de

'

0,5rm

(b) Micrografa electrnica barrido de

tilm'

FigutaA.26 Gomparacin micloglafiaselectlnicasde tlansmisiny de barido, (a) La micrografia electrnica de transmisin muestra las de membranas del retculo endoplsmico rugoso en el citoplasma de una clula pancreticade rata. La apariencia (rugosa) de las membranas de estamuestra estcausadapor la presenciade numerosos ribosomas unidos a Ia membrana. (b) Una muestra similar visualizadacon un microscopio electrnico de barrido revelaIa aparienciatridimensional del retculo endoplsmico rugoso, aunque no sepueden distinguir los ribosomas individuales.

trasqueseexaminan mediante microscopa electrnica de transmisin convencional ser finas deben extremadamente (normalmente msde 100nm de grosor). lo contrano De no rio, loselectrones seran capaces atravesar muestra de la y la imagen sera completamente opaca. observacin La de ms requiere microscopioelectrnisecciones gruesas un co especialde alto voltaje (HVEM), que es similar a un microscopio electrnico transmisinperoutiliza un volde muchomsalto-alrededor de200-1.000 taiedeaceleracin kV en comparacin los 50-100 de un TEM-. Decon kV bido a queel poderdepenetracin hazde electrones del resultanteesaproximadamente veces 10 mayor que el de los microscopios electrnicos convencionales, puedenexase relativamente gruesas una buenareminar secciones con solucin.Como resultado, estructura la celularse puede estudiar secciones hasta1 prmde grosor) quesupoen de lo ne 10veces grosorposiblecon un TEM ordinario. el Le urcRoscopA ELEcTRNrcA BARRIDo DE REvELA
LA ARQUITECTURA DE LA SUPERFICIEDE CLULAS Y ORGNULOS La microscopa electrnica de barrido es un tipo funda-

mentalmente que diferente microscopa de electrnica proa por duceimgenes partir delos electrones reflejados la superficie externade la muestra (en lugar de los electrones transmitidos travs la misma). una tcnica a de Es especialmente espectacular debido a la sensacin profundidad de queconfierea lasestructuras permitiendopor lo biolgicas, tanto estudiarla topograffade superficie(FiguraA.26b). Como su nombre implica,un microscopioelectrnicode barrido (SEM) genera una imagenmedianteel barrido de la superficie la muestracon un hazde electrones. de
894 y tcnicas microscopa ApndicePrincipios de

En Ia FiguraA.27semuestra SEMy susistema un ptico.El sistema vacoy la fuentede electrones similade son resa los del TEM, aunqueel voltajede aceleracin ms es (alrededor 5-30kV). La principaldiferencia bajo de entre losdostiposdeinstrumentos consiste la formaen Ia que en segenera imagen. un SEM el sistema lenteselecIa En de tromagnticas enfoca intensamente elhazde electrones en un punto que semuevesobrela superficie la muestra de medianteplacascargadas denominadas deflectores haz, del y localizados entrela lentecondensadorala muestra. deLos flectores atraeno repelen hazde acuerdo lasseales el con enviadas desde circuito deflector(FiguraA.27b). un Mientrasel hazdeelectrones barrerpidamente muesla tra, lasmolculas la muestraseexcitana niveles de altosde y secundarios. electrones Estos energa emitenelectrones emipor un detectorlocalizadoinmediatatidos son captados mentepor encimay en un lado de la muestra,generando una imagende susuperficie. componente El esencial dedel que emite fotonesde luz tector es un detector centelleo, de por que cuandoesexcitado electrones incidensobre1. Los fotonesseemplean paragenerar seal una electrnica sobre punto una pantallade vdeo.La imagensegenera entonces por punto,lneapor lneaen la pantallaal tiempo queel haz primario de electrones barriendola rhuestra. va

Tcnicas de preparacinde muestras para microscopaelectrnica

Las muestras para ser examinadas mediante microscopa electrnica se pueden preparar de diversas formas dependiendo del tipo de microscopio y del tipo de informacin que pretenda obtener el microscopista.En cada caso,sin

(a)

Cande electrones Lente conoensaoora Haz de electrones Deflector de deflector electrones Circuito (generador barrldo) de Pantalla de vdeo

Electrones
secundaflos

Muestra
(b)

Detector de centelleo

Deflector de pantalla

y de A,27 Mictoscopio electrnico barido. (a) Fotografa Figura (b) diagrama esquemticode un SEM. La imagen es generadapor Ios electronessecundarios(lneasnaranjascortas) emitidos por la muestra al enfocar y desplazarrpidamente el haz de electrones primarios (lneasnaranjaslargas) sobre ella. La sealhacia la oantalla de vdeo estsincronizadacon el movimiento del haz de ilectrones primarios sobre la muestra por el circuito deflector del generador barrido. de

requieremucho tiemel embargo, mtodo escomplicado, que con po y esmscostoso comparacin los mtodos en no ptica. Adems, sepueden en seemplean microscopia examinarclulasvivas debido al vaco al que hay que soelectrnico. en metera lasmuestras el microscopio Le osrNcIN DE sEccIoNESULTRAFINAS
Y LA TINCIN SON TCNICAS PREPARATIVAS COMUNES EN MICROSCOPA ELECTRNICA DE TRANSMISIN La forma ms comn de preparar muestras para microscopa electrnica de transmisin implica el seccionamiento de

ultrafinas, no msde 50-100 de en tejidosy clulas secciones nm de grosor(menosde la dcimapartedel grosorde las que normalmente microscopa en psecciones seemplean fijadasqumicamuestras debenserpreviamente tica). Las El mentey estabilizadas. procesode fijacin mataa las ccelulares gran en pero mantienelos componentes lulas vivas. fijadores Los que y comoeranenlasclulas medidatal de aldehdosy se empleanson habitualmentesoluciones Despus la fijacin,la de glutaraldehdo. muy comnmente con muestrasetie habitualmente una solucinall-2o/ode que tetraxidode osmiotamponado(OsOn), seune a vahacindolos msdensos a de rios componentes las clulas, los electrones. en Los fijadoresqumicosson muy eficaces la estabiliperotiedentrodelasclulas, muchas estructuras zacinde la En nen dosefectos. primer lugar,sonlentos; difusindel requiere parafijarsusestructuras una fijadorenla muestra lugar,losfijadode mnima cantidad tiempo.En segundo (a componentes celulares resqumicosa menudoextraen estructuras menudo sepierdendurantela fijacin algunas La pequeas dentro de lasclulas). criofijacin, que generalmente consisteen una congelacinrpda (20 ms) de de bajo condiciones alta presin,evitaestos una muestra ya a problemas. Estacongelacin alta presines necesaria, de que sin ellaseforman cristales hielo dentro de la muesEn daosen susestructuras. la mayora tra lo queproduce la a de los protocolos, congelacin altapresinesseguida el Duranteestasustitucin, aguade por una criosustitucin. por muy es la muestra reemplazada lentamente un solvenduranteun periodode das. comola acetona, te orgnico, parasu inclusin se resultante puedeprocesar La muestra las y cortadode la mismaforma en queseprocesan muestras fijadasqumicamente. a de de se El tejidoposteriormente pasa travs una serie y de soluciones alcoholque1odeshidratan, posteriormencomoaceen te sesumerge una solucinde un disolvente parasuinclusin u xido depropilenoparapreparcrlo tona Despus que de de lquidaplstica tipo epoxi. en una resina stasecolocaen plsticoseha infiltrado en la muestra, el paraendurecer plsel un moldey secalientaen una estufa la muestraincluida es cortadapara tico. Posteriormente ultrafinasutilizandoun instrumentollaobtenersecciones La se mado ultramicotomo (FiguraA.28a). muestra coloca firmementeen el brazo del ultramicotomo,el cual la pequeos haciauna cuchillade viayanza incrementos en (Figura A.28).Cuandoel bloquealcandrio o de diamante de se zala cuchilla, cortansecciones'ltrafinasla superficie del flotan enla superficie aguadesdelbloque.Lassecciones de de donde sepuedanmontar sobrerejillascirculares cobre. Lasrejillasestnformadaspor un entramadode hilos de cobremuy finos, que sujetanla muestraal tiempo que a de entreloshilos adyacentestravs los seforman aberturas la se cuales puedeobservar muestra. IJnavez que sedisponenen la rejilla, normalmentelas que se secciones tien de nuevo,estavez con soluciones
para electrnica 895 de Tcnicas preparacinmuestras microscopa de

(a) Ultramicrtomo

pica para localizar molculas radiactivas dentro de las clulas. La autorradiografia sepuede tambin aplicar a la microscopaelectrnicade transmisin con algunaspequeas diferencias.Para el TEM, la muestra que contiene componentes marcados radiactivamente se examina simplemente en secciones ultrafinas sobre rejillas de cobre en lugar de en secciones finas montadas en portaobjetos de vidrio. Tambin describimos cmo se pueden emplear anticuerpos marcados con fluorescencia en microscopa ptica paralocalizar componentes celularesespecficos. la misDe ma manera,sepueden usar anticuerposen la tcnicade microscopaelectrnicallamada inmunomicroscopa electrnica (inmuno EM). La fluorescencia sepuede visualizar no en el microscopio electrnico y para visualizar los anticuerpos stosdeben estar unidos a sustancias densasa los electrones por lo tanto visiblescomo puntos opacos.lJna y de las aproximacionesms comuneses acoplarlas molculas anticuerpo con partculas de oro coloidal. Cuando las secciones ultrafinasde tejidos setien con anticuerposmarcados con oro dirigidos contra diversasprotenas, la microscopaelectrnicapuede desvel la localizacin subcear lular de estasprotenas con gran precisin (Figura A.29). Ss puo EMpLEARLA MlcRoscopA coRRELATIVA PARA CUBRIR EL ESPACIO ENTRELAS MICROSCOPAS prrce Y ELEcTRNrcA La inmunotincin de muestrasfijadasylas tcnicasde imagen de clulasvivas que expresanprotenas marcadascon GFP son herramientas poderosasen el arsenalde los bilogos celulares,ya que proporcionan informacin importante sobre lalocalizacin de los componentes celulares.Sin embargo,debido a que la longitud de onda de la luz visible esgrande,la microscopaptica tiene lmites inherentes. En contraposicin la microscopa electrnica de transmisin proporciona visiones increblemente detalladasde las c-

(b) Brazo ultramicrtomo del (a) Figuta A.28 Ultramicrtomo. Fotografa un de (b) ultramicrtomo. Visincercana brazo un del de ultramicrtomo muestra pieza que una histolgica un bloque en de plstico montadoen el extremo brazo. medidaqueel brazo del A delultramicrtomo mueve se haciaarribay haciaabajo, bloque el avanza incrementos en pequeossecortan y secciones ultrafinas de Ia superficie bloque unacuchilla diamante. del con de contienen plomo y uranio. Este paso incrementa el contraste de la muestra ya que el plomo y el uranio confieren an una densidad electrnicamayor a regionesespecficas de la clula.Despusde estatincin, la muestra estpreparcdapara ser observadao fotografiada en un TEM. SB puoBx LocALrzAR MoLcuLAS EN MrcRocRAFAS ELECTRNICAS CON RADIOISTOPOS ANTICUERPOS O En nuestra exposicin sobre microscopa ptica describimos cmo se puede emplear la autorradiografamicrosc-

{^. Figura 4.29 Utilizacin anticuerpos de marcados oroen con mictoscopa electrnica, Clulas la bacteria collquefueron de E. teidas anticuerpos con marcados oro,dirigidos con cntra una protena la membrana de plasmtica. pequeos Los granos oscuros, distribuidos alrededor la periferiadela clula, lasmolculas de son de anticuerpo marcadas oro. con

896

y tcnicas microscopa ApndicePrincipios de

o lulas,pero estas clulas debenestarfijadasqumicamente procesamiento para rpidamenteantesde su congeladas TEM. Uug aproximacinpbderosaque unifica estasdos es formas de examinarlas estructuras celulares la microscopa correlativa. En la microscopacorrelativasecaptan microscopa imgenes dinmicas una clulaempleando de y/o La ptica,a menudousandoanticuerpos GFP. misma posteriormente sevisualizaempleando y clulaseprocesa EM. Generalmente empleainmunoEM paradeterminar se la localizacinde la protenacon una alta resolucin(Figura A.30). La microscopacorrelativaestablece un as

puenteentrelasimgenes dinmicasde microscopa ptique solamentese pueden ca y las imgenesdetalladas EM. adquirirmediante Le TrNcTNNEGATIVA PUEDE RESALTAR PEQUEoS EN EN oBJETOS RELTEVE CONTRASTE UN FONDO CON TEIDO Aunque el cortado de tejidos en secciones ultrafinas en la paramicroscopa forma mscomnde preparar muestras electrnica transmisin,se disponede otras tcnicas de parafinesparticulares. ejemplo, forma y la aparienPor la de cia de la superficie objetosmuy pequeos, comovirus u orgnulos aislados, puedenexaminar seccionar se sin la muestra.En la tcnicade tincin negativa,que esuna de las tcnicasms simplesen microscopa electrnicade transmisin,las muestrasintactasse visualizansimplemente en relieveen contrastecon un medio teido intensamente. la Pararealizar tincin negativa rejilla de cobredebe una serinicialmentecubiertacon una pelculade plsticomuy fina.Entonces suspende muestra una pequea se la en gota de lquido que seaplicasobrela superficiede plsticoy se dejasecar aire.Unavez quela muestraseha secado la al en rejilla se aplicaa la superficie la pelculauna gotade code de lorante como acetato uranilo o cidofosfotngsico. Los bordesde la rejilla se hacencontactaren diversospuntos de con papel de filtro para absorberel exceso colorante. por y Estodejaal colorante debajo alrededor la muestra de y de suscaractersticas ultraestructurales. Cuandosevisuala liza en un TEM seobserva muestraen contraste negativo ya que el fondo es oscuroy muy teido, mientras que la muestra est menosteida(FiguraA.3l).

TF'
FiguraA.30 Mictoscopa conelacin, (Izquierda)Seccinfina de de la faringe (estructuramuscular para la alimentacin) de un C. elegans adulto (un nematodo) visualizadomediante microscopla confocal.La sealverde esuna protena unida a la protena fluorescente verde (GFP) que sexpresa las uniones entre las en clulasepiteliales la faringe.El rojo semuestra una imagen de coloreadade la luz reflejadade la seccin (Derecha) misma sesin . La para inmunoEM, usando un anticuerpo que despus procesarse de reconoceGFP.Las partculasde oro selocalizan en las mismas regionesque emiten la sealfluorescente. Vista a mayoresaumentos (recuadro) que muestra dnde selocalizanlas partlculas de oro en relacin con las uniones entre las clulas(TEM).

2;; FiguraA.31 Tincinnegativa. Micrografla electrnica de un bacteriofagovisto en una preparacin con tincin negativa.Esta muestra simplemente sesumergi en un colorante electrodensolo que permite su visualizacin en relieve en contrastecon el medio intensamentemarcado (TEM).

Tcnicas oreoaracinmuestras microscooa de de oara electrnica 897

Les rcNrcAS DE SoMBREADoEMpLEAN vApoR DE METAL VAPORIZADO SOBRELA SUPERFICIE DE LA MUESTRA La tcnica de sombreado consisteen vaporizar una capafina de un metal electrodenso, como oro o platino, con un cietto ngulo sobrela superficiede la muestra biolgica,y permite visualizar partculas aisladas como macromolculas (Figura A.32).La Figura A.33a ilustra la tcnica de sombreado. La muestra se extiende primero sobre una superficie limpia de mica y sedeja secarlpaso e). Entoncessecoloca en un evaporador devaco, un recipiente en forma de campana en el que secrea un vaco mediante un sistemaparecido al del microscopio electrnico (Figura A.33b). Dentro del evaporador hay tambin dos electrodos,uno de ellos consiste en un bastn de carbono localizado directamente sobre la muestra y el otro en un cable metlico localizado con respecto a la con un ngulo de alrededor de 10o-45o muestra, Despus de crearse el vaco en el evaporador, se aplica corriente al electrodo metlico, produciendo la evaporacin del metal pesadoel cual se depositasobrela superficie de la muestra (Figura A.33,@). Debido a que el electrodo que emite metal est posicionado con un ngulo con respecto a la muestra, el metal se deposita solamente sobre un Muestra \

b ,r '
FigutaA.32 Sombreado. Micrograffa electrnica de partculas del virus mosaico del tabacovisualizadascon la tcnica del sombreado. En esatcnica, sevaporiza metal pesadocon un ngulo sobre la muestra, lo que produce una acumulacin de metal en un lado de cadapartlcula viral, y una regin de sombra que carecede metal en el otro lado (TEM). Electrodode metal

de ,Superficie mrca

o
tomosde metal vaporlzados desde el electrodo lateral Rplica metal de

Electrodo oe carDono

lvluestra

+tt+
ad'rrcaoemelal

Atomosde metalvaoorizados desdeel electrodo superior Haciael sistema vaco de (b) Evaporador vaco al

,zRplica de metal

____
-H

Re.jilla cobre de (a) Tcnicade sombreado

-"

FigutaA.33 Tcnicadel sombleado, (a) Procedimiento del sombreado paso a paso.@ La muestra seextiende en una superficie de mica y se deja secar. La @ muestra se sombrearecubrindola con tomos de un metal pesado(platino u oro, mostrado en azul) que sevaporiza a partir de un filamento calentado, localizado en un lado de la muestra en un evaporador al vaco. Esto generauna rplica de metal (naranja) cuyo grosor refleja el contorno de la superficie de la muestra. @ A continuacin, Ia muestra esrecubierta con tomos de carbono evaporadopor el electrodo superior para estirar y estabihzarla rplica de metal. @ Esta rplica entoncessehaceflotar en la superficie de un bao cido que disuelvela muestra dejando limpia la rplica de metal. @ La rplica selava y se recogeen una rejilla de cobre para su posterior visualizacin en un TEM. (b) Evaporador de vaco en el que serealiza el sombreado.El electrodo de carbono estlocalizado directamente sobre la muestra, mientras que el electrodo de metal pesadoestdesplazadolateralmente.

898

y tcnicas microscopa ApndicePrincipios de

_I

lado de la muestragenerando una rplicade la superficie. La caraopuesta la muestrapermanece teir; estarede sin <sombreado>. gin sifteRir creael efecto-de que liberacarbnpararcEntonces usaun electrodo se cubrir la muestracon carbonovaporizado,loque proporcionaestabilidad soportea lasrplicas metal @. A cony de tinuacin, el soportede mica que contienela muestrase extrae evaporador vacoy sesumerge del de suavemente bajo la superficie aguahaciendoque la rplicaflote y sedesdel prendade la superficie mica.La rplicasetransfiere un de a y bao cido,quedisuelve restos la muestra, dejauna los de rplicalimpia de metaldela muestra@. La rplicasetransfiere entonces una rejilla de cobreestirdar para su via @ sualizacin el microscopioelectrnico transmisin. con de purificadas Paravisualizar molculas comodeDNA o de RNA comnmente empleaun procedimiento se relacionado. En estatcnica,se extiendeuna solucinde DNA yio RNA en una interfase aire-agua, creandouna monocapamolecularque serecoge como una fina pelculaque esvisualizadad, depositaruniformementemetal pesadosobreella. Le cRrorn,cruRA y EL cRABADopoR coNGELActN SONTILES PARAEL ESTUDIO DELINTERIOR DE LASMEMBRANAS La criofractura esun procedimientode preparacinde la muestracompletamente diferentedelos mtodosdescritos

hastaahora.En lugar de cortar secciones uniformesa travsde la muestrade teiido (o de teir materialsin seccionar),lasmuestras congelan se rpidamente ia temperatua ra del nitrgeno lquido o de helio lquido, se sometenal vaco,y segolpeancon el borde de una cuchillaafilada.Las muestrascongeladas temperaturas bajasson demaa tan siadoduraspara ser seccionadas. el contrario, sefracPor turan a travsde laslneasde debilidadnatural-en la mayor parte de los casosel interior hidrofbico de las membranas-. Entonces empleael sombreado se con platino/carbono pafa$ear una rplicade la superficiefracturada. En la FiguraA.34 seilustrala criofractura. Tienelugar en un evaporador vaclomodificadocon una cuchillainde ternade micrtomoqueseempleaparafracturar muesla tra congelada. temperatura soportede la muestra, La del del brazo del micrtomo y de Ia cuchillase controlade maneraprecisa. muestras Las estngeneralmente fijadas la criofractura, aunque algunostejidos vivos se antesde puedencongelar suficientemente lo rpido para manteprcticamente nerlosen condiciones iguales cuandoesa tabanvivos.Debido a que las clulas tienen gran cantidad de agua,las muestrassetratan habitualmentecon un anticongelante, como el glicerol,que confierecrioproteccin, estoes,reducela formacin de cristales hielo durantela de congelacin.

Muestra
rinnrntanir'le

-,E

-;iZ

/--

Soporte de la muestra

ru

^"v/

Cuchilla

Muestra

Cuchilla fra del micrtomo

Soporte la muestra de

(-100.c)

o
Rplica metal de

tu

o
FiguraA.34 Tcnicade cliofiactula. @ Una muestra crioprotegida semonta en un soporte metlico. @ La muestra montada se sumergeen fren lquido enfriado con nitrgeno llquido. @ La muestra congeladasetransfiere a un evaporador al vaco y se ajusta a una temperatura de - 100 oC.@ La muestra se fractura con un golpe de la cuchilla de microtomo. El plano de fractura pasaa travs del interior de Ias bicapas lipdicas cuando esto esposible, ya que staesla llnea de menor resistenciaa travs de la muestra congelada. La muestra fracturada se @ sombreacon platino y cartrono,como en Ia Figura A.33, para hacer una rplica de metal de la muestra.@ Larplica de metal se examina en un TEM.

para r Tcnicas preparacin muestras microscopa de de electrnica 899

La muestracrioprotegida monta en una mordaza(Fise rpidamente frenenen gura A.34,paso y sesumerge O) friado con nitrogenolquido @. Esteprocedimientoredude cetambinla formacin de cristales hielo en lasclulas. Cuandosedisponela muestrasobrela mordazaen el evaporador de vaco@ seestablece alto vacioy seajustala un temperaturade la mordaza akededorde - 100 oC,y la se muestracongelada fracturacon un golpedela cuchillade micrtomo@. Entonces haceuna rplicade la muestra se mediante sombreado platinoy carbonocomo de fracturada anterior @ y la rplicaestlisseha descritoen la seccin en taparaobservarse el TEM @. Lasmembranas criofracturadas aparecen como supercon partculas intremembranosas ficies lisas salpicadas (IMPs) que sedistribuyenen la membranao bien alazaro partculas Estas son seorganizanen complejosordenados. que en protenas integrales membrana han permanecido de al una u otra monocapa pasarel planode fracturapor el interior de la membrana. de La micrograffa electrnica la FiguraA.35 muestran por plasmtica observadas las dos carasde la membrana inLa criofractura. caraP esla carainterior dela monocapa terna;sedenominacaraP porqueesten el lado protoplsLa micodelamembrana. caraE esla carainterior de la monocapaexterna;se llama cara E porque esten el lado exteriorde la membrana.Observecmo la cara P tienen que muchas mspartculas intramembranosas la caraE.En general, mayor parte de las partculasde Ia membrana la permanecen Ia monocapa interna cuandoel plano de en pasapor el centrode una membrana. fractura P caa en Paraquelascaras y E aparezcan a cara, Ia Figude ra A.35,el planode fracturadebepasara travs dosclupierdasucitoplasma la y de lasvecinas, forma queuna clula plasmtica paraexponer monocapa internadesumembrana la caraE, mientrasquela otra cluladebeperderla monocay pa externa su membranaplasmtica el espacio intercede para las la con lular asociado exponer caraP.De acuerdo esto, caras estnsiempreseparadas lascaras de las clulas E de P (indicadocon flechas la Fipor en adyacentes un <escaln> guraA.35) que representa grosordel espacio el intercelular. llamada grabado Existeuna tcnicamuy relacionada que por congelacin, aade pasoadicionalrespecto la un a criofracturay permite aportar ms informacin.A continuacin de la fractura de la muestra,pero antesdel somsobreado, disponeelbrazodel micrtomo directamente se duranteun periodocorto de tiempo (desde bre la muestra a minutos).Estamaniobra unos pocossegundos algunos (sublimacin) una pequea producela evaporacin cande tidad de aguade la superficiede la muestrasobrela superficie de la cuchilla,y estasublimacinproduceun efectode grabado que consiste la acentuacin los detalles la de en de EI brevemejorala visualizacin la sude superficie. grabado que de otra forma estara perficiede la membranaexterna, cubiertacon hielo y esdifcil de visualizaren una muestra tpica de criofractura. 900
y tcnicas microscopa ApndicePrincipios de

6ffi
plasmtica. Esta A.35 Criofiactura la membtana Figura de de micrografia electrnica muestra las carasexpuestas las membranas plasmticasde dos clulasendocrinas adyacentes del pncreasde una rata tal y como se observanmediante criofractura. La caraP esla superficie interna de la monocapa lipldica en el lado protoplsmico de la membrana plasmtica.La cara E esla superficie interna de la monocapa lipdica en el Iado externo de la membrana plasmtica.La caraP esmucho ms rica en partculas intramembranosasque la cara E. Las flechasindican el <escaln> por el que pas el plano de fractura del interior de la membrana plasmticade una clula al interior de la membrana plasmticade ia clula vecina. Por lo tanto, esteescalnrepresenta1grosor del intracelular(TEM). espacio

Mediantela utilizacin de tcnicasde congelacin ulminimizar la formacinde cristales hielo trarrpidapara de y durantela congelacin, mediantela inclusinde un crioprotector voltil como el metano lquido, que se sublima muy rpidamentehacia una superficiefria, el periodo de grabado puedeprolongary sepuedeeliminaruna capa se de hielo ms profunda, exponiendode estaforma las esa tructuraslocalizadas mayorprofundidaddentro del interior celular.Estamodificacinllamadagrabadoprofundo proporcionauna visin fascinante la estructuracelular. de til El grabadoprofundo ha sido especialmente en la exploracindel citoesqueletoen el examn susconexioy de de nescon otras estructuras la clula. pERMrrE Le rsrBnroMrcRoscopA ELECTRNrcA DE EN LA VISUALIZACIN MUESTRAS TRES
DIMENSIONES

quierenvielectrnicos frecuentemente Losmicroscopistas las en El sualizar muestras tres dimensiones. sombreado. la electrnica barrido son de criofracturay la microscopa

tcnicastiles para estefin, as como otra tcnica especiaIizada Ilamada estereomicroscopa electrnica. En la estereomicroscopa electrnica se obtiene informacin tridimensional fotografiando la misma muestra desde dos ngulos ligeramente diferentes. Esto se consigue usando una mordaza especialque puede ser inclinada con respecto a las de electrones. muestra seinclina inicialmente en La una direccin y se fotografa,y despus inclina la misma se magnitud en la direccin opuesta y se fotografa de nuevo. Las dos micrografas se montan caa a caracomo un estreopar. Cuando se observa un estreopar a travs de un visor estereoscpico, cerebroemplea dos imgenesindeel pendientes para construir una visin tridimensional que ofrece una sensacinintensa de profundidad de la estructura que se estinvestigando.La Figura A..36es un estreo par del cromosoma politnico de Drosophila,obtenido mediante microscopa electrnica de alto voltaje. Usando un visor estereoscpico permitiendo que susojos fundan las o dos imgenesvisualmente se crea una visin tridimensional del cromosoma.

pARAMrcRoscopA Le pRpeRecrN DEMUESTRAS

ELECTRNICADE BARRIDO REQUIERE FUACIN LA PERONO EL SECCIONAMIENTO Cuando se prepara una muestra para microscopa electrnica de barrido el objetivo es preservar las caractersticas estructurales de la superficie celular y tratar al tejido de forma que se minimice el dao causadopor el haz de electrones. El procedimiento es similar a la preparacin de seccionesultrafinas en la microscopaelectrnicade transmisin, pero sin el paso de cortado. El tejido est fijado en aldehdos,postfijado en tetraxido de osmio y deshidratado mediante el procesamientoa travsde seriesde soluciones de alcoholes.El tejido entoncesse sumergeen un fluido como dixido de carbono lquido en un recipiente de metal pesadollamado secador de punto crtico, que seemplea para secarla muestra en condicionesde presin y temperatura controladas.Esto aluda a mantener la estructura de las superficiesdel tejido en casi las mismas condiciones que tenan antesde la deshidratacin. La muestra secase pega entonces sobre una mordaza metlicacon una pastametlica.La muestramontada esrecubierta con una capa de oro o una mezclade oro y paladio utilizando una forma de evaporacin al vaco -oaincada llamada recubrimiento por bombardeo (sputter coating). Una vez que la muestra se ha montado y recubierto estpreparadapara ser examinadaen un SEM.

Otros mtodos de imagen

Las microscopasptica y electrnicason tcnicasde imagen directa,en las que los fotoneso los electrones producen imgenesde una muestra. Sin embargo, otras tcnicasde imagen son indirectas.Para comprender lo que queremos decir por imagen indirecta suponga que le dan un objeto para manipular con los ojos cerrados.Usted puede sentir seissuperficiesplanas,12 bordes y ocho esquinasy si usted puede dibujar lo que ha percibido, el objeto resuldespus tante seruna caja.Esto esun ejemplo de un procedimiento indirecto de imagen. Los dos mtodos indirectos de imagen que describimos sonla microscopa barrido de sonday la difraccin de rayos de X. Ambas aproximaciones tienen el potencial de mostrar las estructuras molecularescon una resolucin casi atmica, l0 vecesmejor que el mejor microscopio electrnico.Tienen algunos defectosque limitan su utilidad para muestras biolgicas,pero cuando estas tcnicasseaplican con xito,las imgenes resultantes proporcionan na informacin nica acercade la estructura molecular que no se puede obtener empleando tcnicasconvencionalesde microscopa. Le urcnoscopA DE BARRIDo DE soNDA REVELA LAS CARACTERSTICAS LA SUPERFICIE DE DE MOLCULASINDIVIDUALES Aunque el <barrido> se produce tanto en la microscopa electrnica de barrido como en la microscopa de barrido

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:1 .i:, ,'*1{ ,

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- qstmFigura A.36 Estereomicroscopia electrnica. El cromosoma politnico que se observaen estamicrografa electrnicade alto voltajesemuestracomo un estreo de fotos que sepueden par fundir pticamente para generar una imagen tridimensional. Las dos fotografassetomaron inclinando el soporte de Ia muestra primero 5oa la derechay despus5" a la izquierda respectoal haz de electrones. Para una vista tridimensional sepuede examinar el estreo con un visor estereoscpico, par fusionndolas dos micrografias en una imagen simple (HVEM).

Otros mtodos imagen de

901

El los de sonda, dos mtodosson muy diferentes. primer de ejemplode microscopa barrido de sondadenominado al de tnel (STM) fue desarrollado prinmicroscopio efecto cipio de los aos80 con el fin de explorarla estructurasuperficial de muestrasa nivel atmico.El STM utiliza una que no emite un haz de electrones, sondamuy pequea de una sinoquepor el contrarioposee puntahecha un maLa comoel platino-iridio. puntadela sonterialconductor idealafiladaestandocompuesta da estextremadamente mentepor un nico tomo.Medianteel control precisode esta un circuitoelectrnico punta sepuedemoverentresdix Las mensiones sobreuna superficie. dimensiones e ybamientrasque la dimensinz controlala la superficie, rren (Figura A.37). de distancia la puntasobrela superficie que la punta del STM semuevea lo largo de A medida se de la superficie una muestra, aplicanvoltajesque oscilan entre unos pocosmilivoltios y algunosvoltios. Si Ia punta y cerca la superficie, la superficie de estlo suficientemente empezarn fluir o a desa es conductoraelctricamente, plazarse o electrones travsdel espacio la brechaexistena

lmagen construida poroarnqos sucesrvos-

enla ,f Movimiento direccin

ffi

El en te entrela sondaenla muestra. flujo depende granmeirrede dida dela distancia, forma queinclusolaspequeas gularidades el rango del tamao de tomossencillos en A afectarn la velocidaddel flujo de electrones. medida a quela sonda la se barrela muestra, puntadela sonda muepara manve hacia arribay haciaabajoautomticamente de a tenerun flujo constante electrones travsde la brecha. Un ordenadormide estemovimiento y usala informacin para generarun mapa de la superficiede la muestraque puedeverse un monitor de vdeo. en Pese enormepoder del STM,tienedoslimitaciones: al y ser elctrico, la tcnica nila muestra debe un conductor proporcionainformacinde los electrones asocamente de Los investigadores ciadoscon la superficie la muestra. por otrostipos de mihan comenzado lo tanto a desarrollar de croscopios barrido de sondaquehacenun barrido como tiposde interacciones en el STM pero quemiden distintos de Por en la puntay la superficie la muestra. ejemplo, entre (AFM),la punta del escdefuerzaatmica el microscopio de A ner seempujacontrala superficie la muestra. medida y haciaabaquesebarrela muestra, mueve haciaarriba se jo comosi sedesplazase y sobrecolinas valles microscpipor los tomospresentes la superficie en de cosformados microscopios badiversos de la muestra. han diseado Se propiedades paradetectar comola friccin, rrido de sonda el calory el sonido. potencialmente importanms Una de lasaplicaciones de tesde la microscopa barrido de sondaesla medidade de en los cambios dinmicos la conformacin lasbiomolpor Io Consider ejemplo impreculas funcionamiento. en el sionanteque podraser<visualizar> cambiode forma de una nica molculade una enzimaa medidaque hidroliza transportar necesariapara ioAIP paraproducirla energla Esta<visualizacin molecular> nesa travsde membranas. en real.Esinesahorauna posibilidadenteramente la esfera de clusoposible usaruna forma modificada la microscopa biomolculas de fierza atmicapara estirar directamente paramedir suspropiedades mecnicas. grandes Le ornccrN or RAYosX pnrr,rtrr DE LA DETERMINACIN LA ESTRUCTURA DE TRIDIMENSIONAL LASMACROMOLCULAS Aunquela difraccin de rayosX no incluyeningunaforma parainvestide microscopa, un mtodotan importante es indivigar la estructura tridimensionalde las molculas que mtodoreconstruye imduales la incluimosaqu.Este genes partir de los patrones difraccinde rayos que de X a pasana travsde una muestracristalinao fibrosa,revelando la estructuramolecularcon una resolucinde nivel atmico. Una buenaforma de entenderla difraccinde rayosX con una esestablecer analoga la luz visible.Como discutipropiedades se que la luz tiene algunas mos anteriormente forma ptima comouna onda.Cuandoocudescriben de se rren fenmenosondulatoriosen la naturaleza pueden

Superficie estudiada electrnica efectotnel, El de Figura A.37 Microscopa microscopio de efecto tnel (STM) emplea mtodos electrnicos para mover una punta metlica a lo largo de la superficie de una Ia muestra. En esailustracin la punta no estdibujada a escala; punta estcompuestade manera ideal nicamente por uno o unos pocos tomos, mostrados aqu como esferas. establece voltaje Se un elctrico entre la punta y la superficie de la muestra.A medida que la punta hace un barrido de la muestra en las direccionesx e ft ocurre un efectotnel de los electronesa un ritmo dependientede la distancia entre la punta y la primera capa de tomos de la superficie.El instrumento estdiseadopara mover la punta en la direccin z con objeto de mantener un flujo constantede corriente. El movimiento espor lo tanto una funcin de Ia corriente de electronesy se representaen una pantalla de vdeo. Los barridos construyen de estaforma una imagen de la superficie a sucesivos resolucin atmica.

902

y tcnicas microscopa Apndice Principios de

a
producirinteracciones entrelasondas. lasondasproceSi dentesde dos orgenes entran en fase, amplitud total es su aditiva (interferencia constructiva); estnfuerade fase, si su amplitud sereduce(interferencia destructiva). efectose Este puedever cuandola luz pasa travs dosorificiosen una a de piezadematerialopacoy entonces incidesobreuna superficieblanca. produce patrndeinterferencias, reSe un con gionesoscuras lasregiones lasquelas en en ""*:_0"^tli.:^ tn fuera de fasey regionesclarasdonde estnen fase (Figura A.38).Si la longitudde ondade la luz (,1)esconocida,uno puedemedir el ngulo d entre el rayo original y el primer pico de difracciny entonces calcularla distancia d entrelos dos orificios mediantela frmula:
u-

| tv ;)

)_

A
sen

(A.6)
patrones

Figura A.38 Comprensin los de de difiaccin, Cualquier Sepuedeusarestamismaaproximacin paracalcularla energacon forma ondulatoia producir patrones de interferencia distancia entretomosen cristales fibrasde protenas o o si las ondas producidas a partir de dos o ms fuentesse superponen cidos nucleicos. lugarde unahoja depapelcon dosaguEn en el espacio.Uno de los patrones ms simples que sepuede jeros,imaginequetenemos observar cuando la luz monocromtica pasaa travs de dos mltiplescapas tomosorde orificios vecinos e incide sobre una pantalla. Cuando la luz ganizados un cristalo una fibra. En lugar de luz visible, en atraviesalos dos orificios, stosactan como fuentesde luz, que tiene una longitud de onda demasiado grandepara irradiando ondas que inciden sobre una superficieblanca. En los interaccionar los tomos, con emplearemos hazestrecho puntos en los que las ondas estnen la misma fase,apareceuna un de rayosX, con longitud de onda en el rango de lasdistansuperficie brillante (interferencia constructiva), pero cuando las ciasinteratmicas. medidaquelos rayos pasan travs ondas estnfuera de fasese neutralizan entre ellasintroducen zonas A X a de la muestra, reflejan planosde tomos, los haces y refle- oscuras(interferencia destructiva). jadossufren interferencias y constructivasdestructivas. Los rayosreflejados inciden sobreplacas para deducirla estructura fotogrficas detrsde tridimensional la molcula de la muestragenerando patronesdistintivosde difraccin. original.La FiguraA.39 ilustrala utilizacinde estatcnipatrones entonces Estos son analizados matemticamente caparareducirla estructura doblehlice DNA. de del FigutaA.39 Difiaccinde tayos X. Sepuede utilizar la difraccin de rayos Xpara analizarla estructura molecular con una resolucin casiatmica. O Los rayosX son difractados por los tomosde cristales fibrasde la misma forma que las ondasde luz son difractadas los o por orificios.En Ia mayorade los casos, muestras interspara los bilogosson protenaso las de cidos nucleicos.El ejemplo especficoilustrado en estafigura es una fibra de DNA. @ Los patrones de difraccin resultantesson registradosfotogrficamentey se pueden analizar matemticamentePara deducir la estructura molecular. Estafotografla muestra el patrn de difraccin de rayosX empleado por famesWatson y Francis Crick para deducir la estructura molecular de la doble hlice del DNA. @ Modelo srfico de ordenador de la estructura en doble hlice del DNA.

Fibrade DNA

Haz de rayosX

Patrnde difraccin sobre una placa fotogrfica

por lo. rayos difractados la fibra X

de DNA producenun patrn de difraccin una placafotogrfica en

ft patrOn difraccln de
resultante analiza se matemtcamente.

t" deduce estructura la

tridimensional de la molcula,

0trosmtodos imagen de

903

a-La tcnicade difraccinde rayosX fue desarrollada en l9l2 por Sir William Bragg,que la emple paraestablecer la estructura cristales de minerales relativamente simples.40 y aosdespus, Perutz |ohn Kendrew Max encontraron formasde aplicarla difraccinde rayosX a cristales hemode globinay mioglobina,proporcionando nuestraprimeravisindela estructura lasprotenas. de Desde entonces, han se y cristalizado analizado difraccinde rayosX numeropor protenas otrasmolculas y sas biolgicas. Aunquelasprotenasde membranason mucho msdiffcilesde cristalizar quelasprotenas generalmente difraccinde por analizadas rayosX, Hatmut Michel y Iohann Deisenhofer solucionaron esteobstculoen 1985al cristalizarlas protenasdel centroreaccin fotosinttico lasbacterias. de Enronces continuaron paradescribirla organizacin moleculardel centro reaccin una resolucin 0,3 nm, un logro que les a de hizo merecedores PremioNobel. del Le cmoEM ESTABLEcE PUENTE uN ENTRE CRISTALOGRAFA RAYOS LA DE X Y LA MICROSCOPA ELECTRNTCA La cristalografia rayosX ha proporcionado de unasvisionessin precedentes lasmolculas de biolgicas nivelata mico. Sin embargo, cristalografa la requieregrandes canpurificadas. tidades molculas de Adems, cristalografta la de rayosX no esthastael momentobien adaptada para analizaragregados macromoleculares grandescomo por (vaseFigura que ejemplo ribosomas los 20.1). Unatcnica a:gtdaa rellenarestevaco esla crioEM. En la crioEM, se congelanrpidamentemediantecriofijacin molculaso agregados macromoleculares purificados. congelacin La rpidaevitala formacinde cristales hielo.Por el conde quedan trario,lasmolculas embebidas enhielovtreo,agua congelada cristalina no quepreserva mejor lasestructuras de lasmolculas embebidas. muestraesentonces La visualizadaen un microscopioelectrnicoa muy baja temperatura ( - 170"C). A menudo,lasmuestras rotadas vison y sualizadas desdenumerosasorientacionesdiferentes,las visionesrotadasresultantes reconstruyen se para proporcionarinformacintridimensionalacerca la muestra, de un procesoconocido como tomografaelectrnica. Para ver cmo funciona la crioEM junto a la cristalografa rayos de X considere FiguraA.40,en la que seha combinadouna la imagende crioEM de las subunidades ribosomales y 30S 50Sy de un factorconocidocomoRF2conla estructura detalladade RF2obtenidaa partir de datosde rayosX. Utilizando estasdos tcnicasde manera conjunta, es posible ver cmo la estructurade la protenaposibilita que encaje en la estructura general ribosomaparadesempear del su funcin.

(a)

(b)

FiguraA.40 Utilizacinde la ciloEM y la cristalogtafria rayosX de para establecerun puenteentre los nivelesatmico y molecular, (Izquierda) Reconstruccintridimensional de las subunidades30S (amarillo) y 50S (azul) del ribosoma unidas al factor de liberacin (RF2, en rosa) obtenida mediante crioEM. La cristalografade rayos X proporciona una visin ms detallada deRF2 (derecha). (Reproducido con el permiso de Nature Publishing Group.)

Bibliografa recomendada
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