UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL Facultad de Tecnologa Mdica Escuela de Laboratorio Clnico y Anatoma Patolgica PRACTICA N 08 PRUEBA CONFIRMATORIA

DE SIFILIS ( FTA ABS ) Profesora encargada: TM Mirtha Hernndez Acasiete

La Sfilis es una infeccin crnica con periodos de agudizacin, causada por una espiroqueta Treponema pallidum subsp. pallidum. Debido al fracaso en el cultivo del T. pallidum se han desarrollado distintos mtodos para diagnosticar la infeccin en los distintos estadios de la sfilis. Los mtodos se clasifican en cuatro categoras: a) Examen microscpico directo (campo oscuro) del material de la lesin; b) tests no treponmicos, usados para tamizaje; c) tests treponmicos que detectan anticuerpos especficos, utilizados como confirmatorios; y d) tests para la deteccin directa del antgeno (en desarrollo). Se reconocen tres tests treponmicos standard: FTA-ABS, FTA-ABS DS y MHA-TP. Todos estos utilizan Treponema pallidum como antgeno y se basan en la deteccin de anticuerpos dirigido contra sus componentes. El primer test treponmico fue desarrollado por Nelson y Mayer en 1949, Test de Inmovilizacin de Treponema pallidum (TPI), consiste en enfrentar suero inactivado del paciente con complemento de cobayo y una suspensin de treponemas vivos obtenidos por inoculacin en testculos de conejo con cepa Nichols. . Se incuba a 35C durante 18-24 horas en atmsfera de nitrgeno- CO2. La lectura se realiza en campo oscuro evalundose el porcentaje de inmovilizacin. Se considera positiva cuando se logra un 50-100% de inmovilizacin. Los inconvenientes tcnicos que implican el uso de los treponemas vivos fueron solucionados con el desarrollo en 1957 del test de inmunofluorescencia para anticuerpos anti treponema pallidum (FTA), donde una dilucin 1:5 del suero del paciente se hace reaccionar con una suspensin de treponemas muertos fijados en un portaobjeto, luego se revela la presencia de

anticuerpos con anti-gamma globulina humana conjugada con isotiocianato de fluorescena. Esta tcnica daba falsos positivos en un 25% de sueros normales, esto se debe a antgenos comunes al T. pallidum y treponemas banales. Para solucionar esto se trata previamente el suero con un extracto proteico de treponemas de Reiter (sorbente) para absorber los anticuerpos de grupos presentes con el que se diluye 1:5 el suero de all el nombre de FTA-ABS. Una variante de esta tcnica la constituye la FTA-ABS con doble tincin (FTA-ABS DS) emplea como anticuerpo revelador anti-IgG humana conjugada con isotiocianato de tetrametil rodamina y como contraste anti-T. pallidum conjugado con isotiocianato de fluorescena, con lo que se elimina la necesidad de examinar con campo oscuro la presencia de treponemas en el preparado. En ambos casos se informa Reactivo, Dbil Reactivo y No Reactivo. Las muestras que resultaran Dbil reactivas deben reexaminarse en 1 a 2 semanas y de repetirse el resultado en ausencia de evidencia clnica de infeccin por T. pallidum debe informarse como equivoco. Estas reacciones requieren muchos componentes, por lo tanto las causas de error pueden ser variadas, por lo que deben controlarse especialmente: la titulacin del conjugado, incluirse en los procedimientos controles reactivos, no reactivos, dbil reactivo, control de inespecificidad: sorbente., tambin debe ser controlado las condiciones en las que opera el microscopio. Los laboratorios que no cuentan con microscopio de fluorescencia y/o con personal entrenado para dicha tcnica pueden recurrir para la confirmacin de las pruebas no treponmicas a la microhemaglutinacin (MHA-TP), es una tcnica sencilla en la que inicialmente se trata el suero con un medio de absorcin ( treponemas de Reiter y estabilizadores) luego se enfrenta en placas de microtitulacin a una suspensin de eritrocitos de carnero sensibilizados con antgeno de T. pallidum, se debe agregar eritrocitos no sensibilizados como control de reactividad inespecfica. Los resultados se informan de acuerdo al patrn de aglutinacin, en presencia de anticuerpos especficos los eritrocitos aglutinan (reaccin positiva), en ausencia de anticuerpos los eritrocitos sedimentan( reaccin negativa). Como todas las reacciones de aglutinacin permite la cuantificacin, sin embargo numerosos trabajos han demostrado la falta de correlacin entre el titulo obtenido por la MHA-TP y la evolucin o el estadio de la Sfilis. Objetivo: La FTA-ABS, es una prueba especifica y frecuentemente es empleada para confirmar los casos reactivos a las pruebas de tamizaje. FUNDAMENTO. Esta tcnica de Inmunofluorescencia indirecta (IFI), descrita por Walter y Coons (1954); se basa en la capacidad de los Acs fluorescentes de unirse a ciertos fluorocromos sin alterar sus propiedades inmunolgicas. En un primer paso el suero problema se pone en contacto con el sustrato antignico. Si los Acs estan presentes en el suero, stos se unen al Ag, formando el complejo Ag-Ac. Si el suero no contiene Acs anti Treponema, no se formar el complejo Ag-Ac y todos los componentes del suero sern eliminados en la etapa de lavado. En el siguiente paso se agrega antigammaglobulina humana marcada con fluorescena. Si se formo el complejo Ag-Ac en el primer paso, la antigammaglobulina marcada con fluorescena se adhiere al Ac. La reaccin positiva se evidencia por fluorescencia verde manzana brillante.

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

MATERIAL. 1) Sustrato: Portaobjetos con reas reactivas. Cada rea reactiva contiene Treponema pallidum formulados, cepa Nichols 2) Cubreobjetos 3) Matraz de 1 litro 4) Vasos Coplin 5) Cmara hmeda 6) Micropipetas EQUIPOS. 1.- Microscpio de Fluorescncia Con filtro de excitacin a 495 nm y de emisin para visualizacin de FITC a 2.- Bao Maria a 56C 3.- Cmara Hmeda. 4.- Centrfuga. REACTIVOS. 525 nm

1. Anti-Ig (G, A, M) humana conjugada con Isotiocianato de Fluorescena (FITC)

2. Buffer Fosfato Salino (PBS)

3. 4. 5. 6.

Suero Humano Control Reactivo Suero Humano Control No Reactivo Medio de Montaje: Glicerina tamponada con PBS pH 8.0 +/- 0.5 Absorbente: preparado de Treponema cepa Reiter para remover los Acs treponemicos no sifiliticos

MUESTRA. Emplear suero o plasma sin inactivar. No emplear muestras hemolizadas, contaminadas o lipmicas. Si el anlisis no se va a realizar en el momento, se pueden conservar las muestras a 20 C durante un mximo de 4-6 semanas. PROCEDIMIENTO 1. Preparar el PBS Buffer 2. Preparar una dilucin 1/5 de los sueros controles y las muestras con el absorbente (v.g.: 10 ul de muestra + 40 ul del absorbente 3. Sacar los portaobjetos (sustrato), emplear las improntas necesarios 4. Cubrir las reas reactivas con las diluciones del control reactivo, no reactivo y muestras problemas 5. Incubar en cmara hmeda 30 minutos a temperatura ambiente 6. Lavar rpidamente con PBS, usando pizeta. Luego realizar dos lavados de 5 minutos cada uno, colocando los portaobjetos en el coplin, conteniendo PBS, agitarlo suavemente 7. Diluir la antigamma (G,A,M) humana FITC en PBS, aprox. 1/100. Tener en cuenta la dilucin sugerida por el fabricante 8. Sacar las improntas del PBS, sacudir el exceso sobre papel toalla, pero manteniendo hmeda las reas reactivas 9. Cubrir cada rea reactiva con la dilucin de antigammaglobulina humana, e incubar en cmara hmeda 30 minutos a temperatura ambiente 10. Lavar como en paso 6. Secar como en paso 8 11. Colocar medio de montaje sobre un cubreobjetos y cubrir las reas reactivas sin presionar evitando la formacin de burbujas 12. Se recomienda leer inmediatamente en el Microscopio de Fluorescencia o dentro de las 24 horas conservados entre 2 8C en oscuridad INTERPRETACIN DE RESULTADOS. SUEROS REACTIVOS: los treponemas se observan teidos en forma homognea con una tpica fluorescencia verde manzana SUEROS NO REACTIVOS: Ausencia total de fluorescencia o coloracin verde amarilla muy dbil opaca y no fluorescente REACCION INDETERMINADA: Cuando una muestra no puede interpretarse como reactivo ni como no reactivo. Si se diera ste caso, el exmen deber repetirse con una segunda muestra.

INNO-LIA SIFILIS

Como la deteccin del Treponema pallidum sub sp. pallidum por campo oscuro o microscopia de inmunofluorescencia directa es slo posible en las primeras etapas de la enfermedad, la serologa se ha convertido en el mtodo de eleccin para el diagnstico de la sfilis. En muchos pases, se utilizan las pruebas no treponmicas tales como la del Laboratorio de Investigacin de Enfermedades venreas (VDRL) o la prueba de reagina plasmtica RPR. Sin embargo, el gran nmero de resultados falsos positivos y la baja sensibilidad de estas pruebas han dado lugar a la introduccin de pruebas especficas, tales como la prueba de hemaglutinacin (TPHA) o inmunoensayos enzimticos (EIA) para la deteccin de sfilis. Independientemente de la proyeccin del mtodo empleado, hay un acuerdo general que la confirmacin de una prueba de deteccin reactiva es esencial, sobre todo en los resultados falsos positivos que se encuentran asociados con condiciones tales como embarazo, enfermedades autoinmunes, borreliosis, inmunodeficiencia humana a infeccin por el virus VIH, tumores malignos y enfermedades crnicas del hgado. La clsica prueba de inmovilizacin del T. pallidum (Nelson-Mayer) ya no se utiliza habitualmente debido a su complejidad y el consiguiente alto costo, y ha sido reemplazado por el fluorescente T. pallidum absorcin (FTA-ABS).Sin embargo, esta prueba de confirmacin puede dar lugar a falsos positivos o falsos negativos si la intensidad de la fluorescencia es desconocido o si la prueba del equipo no es el ptima. Los resultados falso-positivos se han presentado en los pacientes con otras infecciones por espiroquetas, trastornos inmunolgicos (por ejemplo, el lupus eritematoso sistmico, los factores reumatoides, anticuerpos antinucleares y anti-ADN o anticuerpos de reaccin cruzada, como los de Borrelia burgdorferi ).

La prueba de inmunoblot occidental para T. pallidum tambin se utiliza como una prueba confirmatoria con la alternativa de mejorar la sensibilidad y especificidad, pero han sido reportados falsos positivos y patrones de reactividad indeterminada. Una nueva lnea de inmunoensayo (LIA) ha sido validada sobre la base de antgenos recombinantes y pptidos sintticos derivados de las protenas del T. pallidum, la sfilis-LIA ensayo INNO (Innogenetics NV, Gante, Blgica), se ha demostrado que proporcionan alta fiabilidad de confirmacin de diagnstico. INNO-LIA sfilis. La prueba se usa para la deteccin simultnea de anticuerpos antitreponema, hace uso de antgenos recombinantes y pptidos sintticos derivados de proteinas de membrana del T. pallidum (cepa Nichols). Los antgenos constan de tres protenas inmunodominantes (TpN47, TpN17 y TpN15), expresada en tamao completo de las protenas en Escherichia coli (antigenos recombinantes) y un pptido sinttico (TmpA) derivado de una protena de la transmembrana. Adems de los antgenos de la sfilis en la tira reactiva hay lneas de control que se utilizan para la evaluacin semicuantitativa de los resultados y para la verificacin de la adicin de la muestra. El procedimiento de ensayo puede describirse brevemente como sigue: Las muestras de suero o plasma se diluyen 1:100 y se incuban a temperatura ambiente (20 C) durante la noche, seguido de tres pasos de lavado con solucin bfer antes de la adicin de un anti-IgG humana de cabra (cadenas pesadas y ligeras) conjugadas con fosfatasa alcalina. Despus de la incubacin, se realizan tres etapas de lavado de nuevo, seguido de la adicin de un cromgeno. El desarrollo del color se detiene con una adecuada solucin de parada. En un protocolo de lectura visual, despus del desarrollo de color, cada lnea se compara con las lneas de control, y las intensidades son anotados como sigue: 0, no hay lnea o una lnea menos intensa que la lnea de corte, 1, una lnea con una intensidad de entre los que de la lnea de corte y el del control de la lnea 1 +, 2, una lnea con una intensidad de entre el de la lnea de control + 1 y el de la + control de la lnea 3, 3, una lnea igual a la de los 3 + el control de la lnea ; 4, una lnea con una intensidad mayor que la de los 3 + lnea de control. El algoritmo de interpretacin de la sfilis-LIA kit de INNO fue optimizado inicialmente por el fabricante para la lectura visual con un conjunto independiente de las muestras negativas y positivas. Una muestra se considera T. pallidum anticuerpos negativos si no hay banda o una sola banda con una intensidad mxima de 0,5 est presente. Si hay varias bandas con una intensidad mnima de 0,5 son visibles, la muestra se considera T. pallidum anticuerpos positivos. Por ltimo, una muestra se considera indeterminada si una sola banda es visible con una intensidad mnima de 1. Ejemplos de INNO-LIA patrones de sfilis se muestran en la figura. 1 . Fig. 1. Como regla general, los resultados de las pruebas de laboratorio deben ser revisados por el mdico a la luz de los sntomas clnicos y la historia de la infeccin y el tratamiento. Sin embargo, para los pacientes con sospecha de sfilis o anteriores con frecuencia no hay datos vlidos disponibles, por lo que es muy importante que el diagnstico de laboratorio sea lo ms fiable posible. La INNO-LIA sifilis como una nueva prueba de confirmacin para las infecciones treponmicas parece cumplir con esta necesidad. No obstante, se puede argumentar que la comparacin de la LIA

con los resultados de consenso derivado de la TPHA y la IgG-FTA-ABS est abierto a posibles crticas, ya que el investigador de la interpretacin no es independiente de los resultados de las pruebas individuales. Sin embargo, la INNO-LIA sfilis se correlaciona significativamente mejor con los resultados de referencia que cualquiera de las otras pruebas individuales slas. Por otra parte, cuando los resultados de un consenso basado en la informacin derivada de las pruebas serolgicas convencionales se comparan a los resultados de la INNO LIA- sfilis, se obtiene (100% de sensibilidad y especificidad 99,3%). Estos datos son confirmados con los estudios de Ebel et al. ( 3 ), quien determin la sensibilidad y la especificidad de las INNOLIA sfilis que 99.6 y 99.5%, respectivamente. La sfilis de INNO-LIA por lo tanto puede ser considerado como vlido, no si es superior, alternativa a la prueba FTA-ABS para la confirmacin de la sfilis resultados de la prueba de cribado (TPHA, VDRL, o EIA), y su uso puede mejorar la fiabilidad de serologa de sfilis.

Bibliografa

1. 1.Annimo. 1979. Richtlininen 1979 fr die der Serodiagnose

sfilis. Bundesgesundheitsblatt 22: 398-400.

2. Byrne, RE, S. Laska, M. Bell, D. Larson, J. Phillips, y J.

Todel. 1992. Evaluacin de un Treponema pallidum prueba de Western blot como prueba de confirmacin para la sfilis. J. Clin. Microbiol. 30: 115-122.

3. Ebel, A., L. Vanneste, M. Cardinaels, E. Sablon, L. Sansn, K. De

Bosschere, F. Hulstaert y Zrein M.. 2000. Validacin de la sfilis-LIA kit de INNO como un ensayo de confirmacin de Treponema pallidum anticuerpos. J. Clin. Microbiol. 38: 215-219.