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ROYAUME DU MAROC OFFICE NATIONAL DE LEAU POTABLE

Rapport de stage sur thme : Contrle de qualit de leau

Encadr par : Mr Kaddour Sissani Raliss par : Boutchich ikram & Nouayti Radoine

Ce stage se droule : Du 1mai au 31 mai 2012

Durant ce mois de stage et loccasion de llaboration de ce rapport je tiens remercier : Monsieur N.DAHMANI le directeur rgional lONEP qui ma permis de passe laboratoire. Monsieur K.SISSANI chef de service contrle qualit DR6 par son accueil, son assistance Son soutien et par ces prcieux conseils qui mont permis dachev ce modeste rapport. Aussi mes remerciements les plus chaleureux tous les membres fonctionnaires et cadres de laboratoire qui mayant encadr et accompagn par leurs efforts et commentaires au cours ce stage. Et plus particulirement : Stage au

Madame DEKHISSI RAHMA Madame MAHMADI OUAFA E Madame CHOUTNA NAZIHA Monsieur BOUTOUIL MUSTAPHA Monsieur EL YOUSSFI MOHAMMED Madame MJAHAD NACIRA Monsieur SOUSSI MOHAMED Monsieur ATTAR

Pour leurs prsences qui a assur le bon droulement de mon stage

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Ce rapport ralis a loffice rgional de leau potable Oujda, dans le service de contrle de qualit des eaux, dans le cadre de mon cursus universitaire pour enrichir ltude professionnelle en science et technologie de leau duniversit Mohamed v facult des sciences de Oujda . au sien

I-

Historique et Definition :
Cre en 1972, lONEP est un tablissement public caractre industriel et commercial dot de

la personnalit civile et de lautonomie financire. Acteur principal dans le secteur de leau potable et de lassainissement, les missions principales de lOffice vont de la planification de lapprovisionnement en eau potable jusqu sa distribution en passant par les phases, tude, conception, ralisation, gestion, exploitation des units de production, de distribution et dassainissement liquide et enfin du contrle de la qualit des eaux jusqu la protection de la ressource. Dimportants investissements ont pu tre raliss durant les trois dernires dcennies pour assurer les infrastructures de base en matire deau potable.

Nouvelles orientations stratgiques :


Les efforts dploys par lONEP durant les trois dernires dcennies ont permis damliorer le niveau de lapprovisionnement en eau potable en milieu urbain. Aujourdhui lOffice sest fix et nouvelle stratgie visant la gnralisation de laccs leau potable lensemble des citoyens et lintervention dans le secteur de lassainissement liquide dans une vision globale et intgre du cycle de leau. Cette nouvelle stratgie qui sinscrit dans les orientations de S.M. LE ROI MOHAMMEDVI Confirme dans son discours douverture de la 9me session du conseil suprieur de lEau et du Climat Agadir le 21 juin 2001, sarticule autour des trois axes suivants : 1-Gnralisation de laccs leau potable. 2-assainissement liquide. 3-Maintien des acquis.

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Coopration internationale :
La coopration internationale participe activement au dveloppement du secteur de leau potable et de lassainissement. Paralllement son intervention efficace en matire dalimentation en eau potable d u milieu urbain, cette coopration accompagne la ralisation de projets dassainissement et dalimentation en eau potable du milieu rural conformment lorientation stratgique de lONEP. Elle a galement contribu dune manire substantielle au renforcement des structures de lONEP, au dveloppement de son potentiel humain et lamlioration de performance. Elle est repartie en deux volets lis respectivement la coopration financire et la coopration technique. Deux accrditations accordes au laboratoire central de lONEP : Selon le rfrentiel international ISO 17025, par le Ministre de lIndustrie, du Commerce et de la Mise Niveau de lEconomie du Maroc, et le Ministre de dveloppement Durable, de lEnvironnement et des parcs des Qubec (Canada). La Direction Contrle Qualit des Eaux (DCE) a obtenu courant 2005, pour une dure de 5 ans, deux nouvelles accrditations selon le rfrentiel international ISO 17025 par le Ministre de lIndustrie, du Commerce et de la mise a niveau de lEconomie du Maroc (MICMNE) et par le Ministre de Dveloppement Durable, de lEnvironnement et des parcs (MDDEP) du Qubec (Canada). Les domaines accrdits par le MICMNE son las analyses bactriologiques, les analyses physico-chimiques inorganiques et les analyses physico-chimiques des micropolluants organiques. Les mmes domaines sont accrdits galement par le MDDEP avec celui sur la toxicologie de leau. Ces deux accrditations sont en fait une actualisation de celles obtenues respectivement en 2002 par le Ministre de Dveloppement Durable, de lenvironnement et des Parcs du Qubec (ex Ministre de lEnvironnement du Qubec) et en 2003 par le Ministre de lIndustrie, du Commerce et de Mise en Niveau de lEconomie du Maroc (ex Ministre du Commerce, de lIndustrie et des Tlcommunications), et, ce, selon le referenda international ISO 17025.

Missions :
-planification de lapprovisionnement en eau potable (AEP) lchelle nationale. -production de leau potable. -Distribution de leau potable pour le compte des collectivits locales. -Gestion de lassainissement liquide pour le compte des C.L -Contrle de la qualit des eaux.

Axes stratgiques :
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-Prennise, scuriser, et renforcer lAEP en milieu urbain. -Gnraliser laccs leau potable en milieu rural -Rattraper le retard en matire dassainissement liquide.

Approche : -Assurer une rveille Technologique.


-Intgrer le composant environnement, -Impliquer le citoyen dans lconomie et la protection des ressources en eau.

Atouts :
-Une entreprise publique haute expertise, -Un personnel comptent, -Des partenariats nationaux et internationaux en expertise et R&D.

Projets relatifs la qualit des eaux dalimentation humaine :


Cette norme fixe les exigences auxquelles doit satisfaire la qualit des eaux d'alimentation humaine. - On comprend par "eau d'alimentation humaine" toute eau destine la boisson quelque soit le mode de sa distribution.

- Pour "les eaux minrales naturelles ": c'est une eau de sources ou de puits, qu'en raison de
leur temprature et de la nature spciale de leur principe salines, gazeux ou radioactifs peuvent tre utilises comme agents thrapeutiques. Cette norme ne concerne que les eaux d'alimentation humaine. Elle ne doit contenir ni substances chimiques, ni microorganismes nocifs pour la sant, en outre elle doit tre aussi agrable boire que les circonstances le permettent et doivent satisfaire aux exigences de qualit spcifie. La vrification de conformits des eaux ces exigences se fera par des normes marocaines suivant les mthodes analytiques suivantes: 1. Analyse de type I: elle est effectue sur les eaux dont les rseaux de distribution l'entre du systme de distribution, elle comprend les paramtres de qualits suivantes : la temprature, le PH, recherche des coliformes totaux et fcaux, germes totaux. 2. Analyse de type II : c'est une analyse de surveillance, elle est effectue sur chaque captages l'entre du systme de distribution elle comprend en plus de l'analyse de type I ; la turbidit, conductivit, Ammonium, Nitrate, Nitrite, Oxydabilit au permanganate de potassium, Dnombrement de streptocoques fcaux pour les eaux brutes.

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3. Analyse de type III : Elle est utilise pour les mmes fins de l'analyse de type II sauf pour la confirmation d'une pollution bactrienne l'intrieure du rseau de distribution d'eau, elle sert galement l'tude des ressources en eau qu'on ce propose d'utiliser pour l'approvisionnement public en eau; elle comprend tous les paramtres pour lesquels une valeur maximale admissible ou une valeur minimale requise et qui sont fixes par les normes applicables l'eau d'alimentation. En plus des analyses de type I & II on trouve la dtermination d'Oxygne dissout, Fer, Manganse. Pour le contrle, lOffice nationale de leau potable dispose dun laboratoire central rabat et de 27 laboratoires dcentraliss rpartis sur tout le territoire national. Parmi ces laboratoires, on trouve le laboratoire rgional de loriental Oujda.

II.

Laboratoire regional dOujda :

Presentation:

Le laboratoire rgional dOujda pour tache la surveillance de la qualit des eaux brutes et leur traitement dans les centres relevant de la direction rgionale de loriental. Dans le but livrer aux consommateurs une eau potable. le laboratoire rgional dispose dun : Laboratoire rgional dOujda. Laboratoire de la station de traitement de Berkane. Laboratoire de la station de traitement de Zao. Laboratoire de la station de traitement de Nador.

Le laboratoire rgional dresse des plannings mensuels de la direction de la qualit des eaux dans lensemble des centres de la Direction Rgionale de lOrientale. En se basant sur le planning annuel de missions tablis par le laboratoire central. En plus des missions de contrle de la qualit de leau. Le personnel du laboratoire est charg de : La prparation de ractifs chimiques et des milieux de culture bactriologique. La mise au point et ltalonnage des appareils de mesure. Ltablissement des tableaux de bord. Linterprtation des rsultats. Gestion de stock Remplir les registres du nouveau matriel livr par le laboratoire central.
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Le laboratoire rgional dOujda et compos des salles :

Salle pour le lavage, le stockage des diffrents matriels (flacons, tubes, etc.) et la strilisation ; soit la strilisation par chaleur : utilise surtout pour les milieux de cultures. Elle se fait dans lautoclave ( 120C, 1bar, pendant 15 20 minutes), soit la strilisation par chaleur sche: utilise surtout pour le matriel de laboratoire, dans le four de 170C pendant 30 minutes. Il faut dabord nettoyer, puis scher et emballer par du papier kraft. Deux salles pour les analyses physico-chimiques, une pour la Spectroscopie dAbsorption Atomique et lautre pour autres analyses physico-chimiques ; mesure de la turbidit , le pH, la conductivit, le fluorure (F-), loxydabilit au permanganate de potassium, le chlorure (Cl-), le titre alcalimtrique (TA), le titre alcalimtrique complet (TAC), le titre hydrotimtrique (TH), loxygne dissous, etc. cette salle est munie dun stock des produits chimiques, des matriels de manipulation :( part les matriels simples comme les pipettes, les bchers, les rlenmeyers, les entonnoirs, les fioles jaugs ( double trait), les pipettes jaugs, il y a aussi des pipettes automatiques, des distributeurs automatiques, des burettes automatiques, des micropipettes, qui facilitent le travail. Les diffrents matriels en verre, en plastiques, sont bien organiss, chaque type a place. Salle danalyses bactriologiques : Dans cette salle seffectuent les analyses bactriologique et la prparation des milieux de cultures, elle est quipe de : -Quatre incubateurs rgls des tempratures diffrentes (371; 440,5; 362; 222) C selon lincubation prconise
- Un bain marie de temprature environ (755) C, -Un e balance, -Une plaque chauffante -Un agitateur -U ne rampe de filtration -Un PH mtre portable -Un conductivimetrie portable -Un compteur de colonie -Un rfrigrateur rgl a une temprature de consigne (42C) -Un ordinateur GDAL (gestion des donnes analytiques).

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Aprs la connaissance de la terre, son noyau trs dense sest chauff et a libre des particules. Par les fissures de la crote terrestre, se sont ainsi chapp leau, le gaz carbonique et lazote. A mesure que les tempratures se sont leves, latmosphre sest emplie de vapeur deau. Les nuages se sont accumuls. Les eaux du ciel sont retombes pour former les ocans. Ctait il y a 3.5 milliards dannes. Ainsi leau est apparue sur terre il y a quelques 3.5 milliards dannes et depuis, la plante gre une masse deau de 1.35 milliards de km3 dont entre 500 000 et 1 000 000 de km3 la quantit deau qui reprsente leau douce (les lacs, les rivires, les mares, les fleuves, les eaux souterrainesetc.), 25 millions de km3 reprsente les calottes glacires et 50 000 de km3 se trouve dans latmosphre sous forme de nuages et de vapeurs. Leau de formule H2O et de masse molculaire 18.016 g/mole est un liquide incolore, inodore, transparent, leau est la substance la plus abondante la surface du globe. Pour la protection et lexploitation de cette source, parmi les directions ralises, lEtat a construit lOffice National de lEau Potable (ONEP).

But de stage Pour lamlioration de notre systme pdagogique, ncessairement on doit par lvaluation de toutes les actions denseignement entreprise. Mon stage au sein de laboratoire de contrle de qualit des eaux dans office rgional de leau potable dOujda est une exprience trs enrichissante qui ma permis dappliquer mes connaissances thoriques et dapprcier dautres dinformations dordre pratique. Il est vident que ce quest demande nom seulement lvaluation de la cour, mais lamlioration de notre situation dans le domaine socioconomique, do la ncessit dun tel stage pour complter mon cursus dtudes universitaire

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Les activits effectues au cours de stage


A. Salle de lavage

Lavage des flacons de prlvement en plastique destines pour analyse physico-chimique: Tremper les flacons dans un mlange de leau et de dtergent Rinages leau de robinet pour enlever le dtergent Egouttage Contrle qualit de lavage : Prendre 3 flacons par un lot de 30 units ; -Remplir les flacons au avec leau distille ; -Laisser une nuit puis effectuer une analyse de conductivit et comparer celle deau distille ; - Accepter seul les lots dont la valeur de conductivit ne dpasse pas 8 us/cm. nettoyage des flacons utiliss pour labsorption atomique:

Trois rinages ou plus leau froide du robinet pour enlever toute trace de dtergent ; Trois rinages avec une solution de HNO3 25% ; Trois rinages leau distille ou de qualit quivalente ;
goutter puis ranger.

Pour lanalyse de lion ferrique II au moment du lavage LNHO3 doit tre remplace par LHCL 8M.
Lavage de la verrerie et des flacons de prlvement en bactriologies:

La propret de la verrerie et des flacons de prlvent constitue un lment essentiel de la qualit de lanalyse ; il est donc ncessaire de sassurer que le lavage de la verrerie est adquat et conforme de faon minimiser une possible contamination des chantillons lies la verrerie ou des flacons de prlvement lors de lanalyse. Cette procdure a pour objet de dcrire les modalits de lavage des verreries utilises pour les dfrentes dterminations ainsi que des flacons de prlvements elle sapplique tous les secteurs ou des analyses sont effectues.
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NOTE 1 : les flacons de prlvement, verrerie courante et tubes utilises dans les laboratoires de bactriologie doivent tres exemptes de substances bactricides ou bactriostatique et avoir un pH voisin de neutralit. NOTE2 : les flacons de prlvement, verreries courantes et tubes destins lanalyse des eaux potables, naturelles, piscines et les flacons destins lanalyse des eaux uses. NOTE 3 : linstruction de lavage doit tre affiches dans le secteur de la verrerie.
Procdures de lavage des verreries

Cette procdure pour objet de dcrire les modalits de lavage de la verrerie utilise au cours des analyses bactriologiques ainsi que les flacons de prlvement.
a. Trempage : Utiliser un dtergent sans phosphate et de pH neutre pour le lavage de toutes les verreries de la bactriologie ; Tremper les flacons de prlvement, verrerie courante, pipettes et tubes, dans le bac contenant le mlange eau et dtergent ; Laisser immerger pendant 1 heure ; Enlever les restes d critures de marqueur avec lthanol ; brosser couvillon lintrieur des flacons, des tubes et autre verreries ; b. Rinage : Rincer leau du robinet ; Rincer 3 4 fois chaque verrerie avec de leau distille.

c. Egouttage schage Egoutter le tot de matriel sur la paillasse (flacons avec le goulot orient vers le bas Scher le lot de matriel contrle dans le four pasteur environ 50 60 C

d. Strilisation de la verrerie :

La strilisation est lopration qui a pour objet la destruction le micro organismes, contenus dans une prparation, tant sous leur forme vgtative que sous leur forme rsistante. On cite deux types de strilisation : humide et sche. La strilisation par voie humide se fait grce un autoclave dont la temprature est rgle 121 c pendant 15min avec utilisation dun RUBAN comme indicateur (le ruban indicateur est incolore au dpart aprs strilisation sa couleur devient noir, le ruban dans ce cas porte un symbole sous forme de / et seulement cette partie du ruban qui change de couleur), il existe aussi un autoclave consacr pour la dcontamination des dchets des analyses bactriologiques (boites Ptri utilises, pipettes et entonnoirs usage unique, gants) avant dtre jets la nature et les matriaux rutilisables (tubes, lames...) pour viter tout risque de contamination. Chaque mois on contrle la
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qualit de la strilisation des autoclaves on met une ampoule de strikon au fond de chaque autoclave, aprs la strilisation on la met dans le schoir avec une autre ampoule (tmoin) non strile. La temprature de four de pasteur doit tre entre 50 et 60c. Si la strilisation est suffisante les spores de strikon strilis sont dtruites, la couleur du contenu de lampoule reste violette et limpide, si non le contenu devient jaune. Strilisation par chaleur sche: se fait grce une tuve rgle une temprature de 170 c. Cette strilisation concerne les verreries suivantes : flacons de prlvement et les tubes. Avant la strilisation des flacons de prlvement (destins pour le prlvement des eaux traites) on introduit 1 ml de thiosulfate de sodium 3 % dans chaque flacons afin de neutraliser le chlore rsiduel libre prsent dans les eaux traites aprs on suit les tapes suivantes : -Boucher le goulot avec du coton card puis couvrir le bouchon et le goulot avec du papier KRAFT ; -Mettre un ruban indicateur sur le lot striliser (le ruban indicateur dans ce cas porte un symbole sous forme de V et seulement cette partie du ruban qui change de couleur); -Ecrire le numro du lot, date de strilisation et le terme T (traite) ou B (brute) sous Chaque flacon. ; -Mettre les flacons au four 170 C pendant 1h30min. Contrle de qualit du matriel : On dispose quelques gouttes de bleu de bromothymole sur la paroi de chaque type de verrerie et on observe la raction de lindicateur au contact de la verrerie par virage au jaune pH< 6.5.Et bleu vert bleu pH > 7.5 NC et si la couleur est vert 6.5<pH< 7.5 C Scher le lot de matriel dans le four pasteur environ 50 60 C N.B : N .C =non conforme C=conforme Chaque fois quon a strilise soit la verrerie la verrerie soit les milieux de cultures dans lautoclave ou dans ltuve 170C en met le ruban pour vrifier si la temprature est suffisante ou non. Le contrle de la qualit (ou le contrle de surveillance) est le travail qui trs rpondue au laboratoire ce qui mattir lattention on a vu que chaque appareil est munie dun fiche de contrle, la temprature des tuves est contrle par des thermomtres mme celle de la salle et le conglateur est contrl, ainsi ltalonnage des appareils se fait chaque jour (balance, Ph mtre). Les rsultats dune analyse ne sont obtenus que si les chantillons traversent certaines barrires. Premirement les flacons de prlvements en bactriologies sont bien rincs et strilise dans le four 170C (strilisation en chaleur sche) puis stockes dans un placard et denregistrer le numro de lot. Pour confirmer la strilisation de ces flacons, on prend un flacon au hasard, et dans une zone aseptique on introduit une quantit dun bouillon nutritif qui sappelle TSB dans ce flacon et on
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lincube dans un tuve 37C, et si le TSB change daspect et devient trouble, tous les flacons doivent tres rinces et strilise pour chaque fois. Se qui concerne le contrle des milieux de culture, aprs la strilisation en mesure le pH et en le compare avec les normes dclar par le fabricant, puis en prend au hasard des boites contenant le milieu ,une plac a 44C et lautre 37C pendant 24h ( la mme chose pour les liquides (rothe,Litsky,) sauf le glose et TSB coll dans une boite de 50 mm et en le met dans une jarre assure lanarobiose dans 37 C ). Sil nya pas de rsultats positifs en accepte la procdure de strilisation, donc on est dans les normes se qui indiques que notre rsultats danalyses avec ces milieux est faibles. Si en observe des boites prsentes des colonies ou des tubes troubles en rejettent le lot, il faut refaire les milieux nouveaux.

B.

Salle d Analyses bactriologiques :

Les micro-organismes sont rencontrs dans tous les types d'environnement prsents dans la nature, ils colonisent tous les cosystmes. Ils sont isols du sol, des eaux douces et des eaux marines, de l'air, mais aussi d'environnement plus hostiles tel que les ples, les dserts, les geysers, le fond des ocans. De l, lanalyse bactriologique parat importante, afin de se rassurer de linexistence de bactries pathognes dans les eaux. Les deux mthodes utilises pour le dnombrement dans le laboratoire rgional dOujda sont : - La mthode MF (membranes filtrantes) pour les eaux traites. - La mthode NPP (le nombre le plus probable) pour les eaux brutes.
Procdure de la qualit de lenvironnement du secteur de bactriologie

Assurance de qualit:
Avant de pouvoir commencer lanalyse, il faut bien se rassurer de la qualit du matriel et du milieu de travail. Les analyses bactriologiques ne sont pas exemptes, car le matriel et les milieux de cultures sont souponns inadquats jusqu' la confirmation par contrle.

Contrle de strilisation des flacons de prlvements : comme on la vu dans la page prcdant. Contrle de lair ambiant : Cest un contrle mensuel, ralis dans la salle des analyses bactriologiques, et dans tous les incubateurs et le rfrigrateur qui existe dans la salle, il consiste vrifier si lair du milieu o se ralise lanalyse est adquat ou non.

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Les boites de ptri de 90mm, contenant le milieu de culture MTC (Microbial Cotent agar) sans couvercles sont exposes lair ambiant pendant 17 minutes, puis fermes et incubes une temprature de 37C pendant trois jours. Si le rsultat ne dpasse pas 15unit formant colonie (UFC), le contrle est conforme. Contrle de surface du travail : lentretien des surfaces du travail seffectu par nettoyage humide. Les surfaces du travail sont aseptises laide de solution dsinfectante avant et aprs chaque manipulation, pulvriser les surfaces avec le dsinfectant puis essayer avec un papier usage unique. NB : alterner le dsinfectant (acide/alcalin).vrifier mensuellement lasepsie des surfaces du travail lord des activits analytiques. Lchantillonnage est fait lendroit dsigns par la liste de prlvement figurant sur les formulaires de contrle de qualit bactriologique des surfaces du travail. La mthode dcouvillonnage : consister frotter les surfaces sur une dimension donne avec un chantillon humide et dinoculer celui-ci sur un milieu propice au dveloppement des microorganismes Cette mthode est utilise pour valuer la contamination des incubateurs et des rfrigrateurs qui sont des endroits rugueux, irrguliers, convexes et difficilement accessibles. Dissoudre ces composes dans un bcher 1 litre sur une plaque chauffante, refroidir et complter le volume 1 litre avec leau distille Striliser cette solution lautoclave 121C pendant 15 min. De faon aseptique, rpartir la solution en volume de 10 ml dans des tubes bouchon visss pralablement striliss. Ecouvillonnage Identifier un tube pour chaque point de prlvement. Plonger un couvillon strile dans la solution de rinage et enlever lexcs de liquide en pressant lcouvillon sur le bord de tube. couvillonner une surface de 25 cm2 dlimite par un cadre de 5cm 5cm, en vitant de toucher un cadre. rincer lcouvillon dans la solution de rinage. Rpter cette opration pour quatre autres surfaces de 25 cm2 du mme endroit de prlvement, en ayant soin de rincer lcouvillon dans le tube de rinage entre chaque prlvement. Apres le cinquime prlvement, remettre lcouvillon dans le solution de rinage et lui couper la tige avec des ciseaux strile. Refermer le tube et le conserver 4O C jusqu' le moment de lanalyse
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Pour lanalyse agiter rigoureusement

le tube contenant lcouvillon

et prlever

aseptiquement 1.0 ml et 0.1ml de la solution de rinage afin de faire le dnombrement par incorporation la glose MCT ; Incuber les boites de ptri 37C pendant 48 h. Dnombrer les colonies et calculer le nombre de colonies par ml (UFC/ml) Sachant que 1.0ml correspond 10 cm2 de surface values, exprime les rsultats cihaut mentionn en UFC/25 cm2 en le multipliant par facteur de 2.5. inscrire les rsultats dans le formulaire. Un rsultat < UFC/25 cm2 est juge satisfaisant .si un rsultat > UFC/25 cm2 est obtenu, dsinfecter la surface faire une reprise du test et avertir le chef de service de microbiologie. Mthode par boite de rodac : Identifier les endroits de prlvement sur les boites de rodac Appliquer le glose sur la surface prlever Refermer la boite Incuber 37C pendant 48 h

Rsultats Dnombrer les colonies sur chaque boite de ptri et rapporter les rsultats en UFC/25 cm2. Si la limite est dpasse, une dsinfection de la paillasse doit tre effectue et puis reprendre lanalyse. Nettoyage et entretien du sol : lentretien du sol seffectue par un nettoyage humide .le sol doit tre nettoy au moins une fois par semaine laide dune solution dsinfectante. Tremper une vadrouille dans un seau contenant de leau et le dsinfectant Retirer la vadrouille et la passer humide sur le sol avec un mouvement de va et vient. Reprer lopration deux trois fois en change leau de seau

NB : cette opration de nettoyage doit seffectuer dans le sol de la marche en avant. Condition ambiante : noter la temprature ambiante de toutes les salles de travail quotidiennement, en dbut et daprs midi si possible. la temprature doit se situer entre le 16 et 27C. Si les limites suprieures et inferieures sont dpasses revoir le systme de climatisation de salle. Contrles des boites de ptris des nouveaux lots rceptionns :

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La glose PCA (Plat counet agar) est introduite dans 10 boites du lot contrler. 5 de ces boites sont incubes 37C, tandis que les 5 restantes sont incubes 22C, pendant 3 jours. La strilit des boites est indique par labsence de colonie. Contrles des pipettes jetables des nouveaux lots rceptionns: Le contenu dun tube en TSB (Tryptone soy broth), est pipet puis rintroduit dans le tube, cette opration est refaite 3 4 fois pour chaque pipette (5 pipettes sont analyses de chaque lot). Les tubes sont incubs 37C pendant 3 jours. Si : La solution dans le tube reste limpide = lot de pipettes adquat ; La solution dans le tube devient trouble = une reprise est effectue en vrifions chacune des tapes si encore une fois les critres dacceptabilits sont dpasser prvenir immdiatement le chef de service contrle qualit et en retire le lot concern du stock. Contrle des entonnoirs jetables : des nouveaux lots rceptionns Contrle de strilit : Pour le contrle de la strilit, 5 entonnoirs de chaque lot sont pris, puis 100 ml deau de rinage est filtre sur des membranes de 0.45 m de porosit. Les membranes sont insres dans des tubes contenant du TSB puis incubes 37C pendant 48 heures. Labsence de turbidit indique que les entonnoirs sont vraiment striles Calibration : Les entonnoirs gradus jetables utiliss lors de la filtration des chantillons deau doivent tre vrifis laide dune fiole jauge de 100ml. On vrifie la calibration de 5 entonnoirs par lot. Le niveau de leau doit tre gal au trait prdtermin de lentonnoir. Si ce nest pas le cas ; on rejette tout lot dont les entonnoirs ne sont pas conformes. Contrle de la qualit des milieux de culture : Chaque milieu de culture est muni dune fiche de contrle qui comporte : - La date de prparation. La date dexpiration. Le volume prpar. Le rsultat du contrle du milieu aprs la prparation. Numro de lot Numro de code PH recommand PH aprs strilisation Rsultat du control de la strilit Matricule du prparateur
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Contrle de la qualit des appareils: Chaque appareil est muni dune fiche de contrle. *Les tuves, les bains maries et le rfrigrateur sont munis des fiches de contrle de la temprature qui se lit 2 fois par jours ( partir dun thermomtre talonn qui se trouve au sein de chaque appareil) et des fiches de suivi de maintenance. *La balance est aussi munie de deux fiches, une de vrification de niveau et lautre de la masse *Le pH-mtre est aussi vrifi avant chaque mesure et talonn en cas de non conformit. Au niveau du laboratoire le matriel subit aussi un contrle externe auprs des entreprises de mtrologie afin de mesurer leur capacit de donner des rsultats qui rpondent aux normes internationales. N.B : Chaque appareil possde un dossier qui comporte : une fiche de vie, des certificats dtalonnage des entreprises de mtrologie, et un manuel

Analyse bactriologique : Introduction : Lobjectif de lanalyse bactriologique dune eau nest pas deffectuer un inventaire de toutes les espces prsentes, mais de rechercher soit celle qui est susceptibles dtre pathognes, soit celles qui sont indicatrices de contamination fcales. Lanalyse dbute par lacte de prlvement qui doit mettre en uvre des mthodes assurant labsence de contamination et la survie bactrienne. Sont indiques ensuite les mthodes gnrales dexamen bactriologique des eaux suivies des recherches de bactries indicatrices de pollution et defficacits de traitement puis des bactries spcifiques pathognes. Les analyses bactriologiques de leau se fait selon le type de leau analys (leau brute et leau traite). Prlvement : Un examen bactriologique ne peut tre valablement interprt que sil est effectu sur un chantillon correctement prlev, dans un flacon strilis, selon un mode opratoire prcis vitant toute contamination accidentelle, ou variation prlvement. Mthode analyse La mthode ou bien la technique danalyse pour lestimation de la qualit bactrienne dans un chantillon dpend en premier lieu de la nature de lchantillon (eau traite ou eau brute) et de la nature des bactries recherches.
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de la quantit des bactries prsentes lors du

mthode danalyse bactriologique de leau traite :


Qualit de leau : Recherche et dnombrement des Escherichia Coli : Dfinition : les Escherichia Colis sont des bactries coliformes, capables de produire de lindole partir du tryptophane dans les 24 4hreures 44 0.5c.

Mthode par filtration membrane

Test prsomptif

Dnombrement des colonies typiques (jaune avec halo jaune) et les colonies atypiques (diffrentes couleurs et morphologies)
Test confirmatif

Isoler Isolement par isolement sous forme de stries sur le TSA


Incubation 362C/ 21H3H

Ensemencement sur le tube deau peptonne exempte dindole


Incubation 44C0.5C / 21H3H

Par suite on ajoute 0,2 0,3 ml du ractif de Kovac dans les tubes deau peptonne

21H+/-3H

Apparition de coloration rouge la surface de leau peptonne confirme la production de lindole prsence dE. Coli

Nombre de colonies Confirmes en UFC/100ml


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Qualit de leau : recherch et dnombrement des entrocoques intestinaux dans les eaux trait

Dfinition : le terme entrocoque intestinaux dsigne lensemble des bactries de forme de cocci gram positif Formant gnralement des chanes, capable de rduire le chlorure de 2,3,5-triphnyl-ttrazoliumen formazan et dhydrolyser lesculine sur les milieux de slanetez et bartley, et faisant partie de la flore intestinaux normale de lhomme ou dautre animaux sang chaud
Mthode par filtration membrane

Test prsomptif

Dnombrer les colonies rouges, marron ou roses

Test confirmatif

Transfert de la membrane sur boite contenant le milieu BEA


Incubation 44 C0.5C/24H

Dnombrement des colonies brune ou noire

Nombre de colonies typique confirmes en UFC /100ml


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Qualit de leau : recherche et dnombrement des bactries coliformes Dfinition : Le terme bactries coliformes regroupe plusieurs espces bactriennes de la famille des Entrobactries. Se sont des micro-organismes arobies et anarobies facultatifs, en forme de btonnets, gram ngatif. De plus les bactries coliformes produisent une raction ngative lpreuve du cytochrome oxydase (oxydase ngative). Milieu de culture pour le dmembrement : mme milieu de culture pour la recherche et le dnombrement dE. coli sauf lincubation se fait 36c2c/21h3h jusqu 44h4h
Test confirmative : talement de la colonie sur le TSA, et incubation 36c pendant 24h. Ractif loxydase: tetramethyl-1.4-phenylenediamine dihydrochloride. KIT gram color(voir annexe ) Qualit de leau : Recherche et dnombrement des spores de bactries des anarobies de clostridium sulfitorducteurs dans leau traite

Dfinition. clostridia : Micro-organismes anarobies formant des spores et sulfitorducteurs, appartenant la famille des Bacillaces at. au genre Clostridium. Principe et ractions: La recherche des spores dorganismes anarobies sulfitorducteurs (clostridia) dans un chantillon deau de volume dtermin, passe par les tapes suivantes. Slection des spores: Avant quil soit procd lessai, lchantillon deau doit tre chauff dans un bain deau 755C pendant 15 min partir du moment o cette temprature a t atteinte. Un flacon similaire contenant le mme volume deau que celui de I chantillon pour essai doit tre utilis paralllement comme tmoin afin de vrifier le temps de chauffage ncessaire. La temprature de leau dans le flacon tmoin peut tre enregistre de manire permanente laide dun thermomtre. Filtration sur membrane &culture: Filtration de lchantillon deau au travers dune membrane filtrante dont les pores prsentent une dimension telle que les spores des bactries (0,2um) sont retenues lintrieur de la membrane filtrante ou sur celle-ci. Aprs filtration, enlever la membrane avec des pinces striles et la placer la face suprieure tourne vers le bas dans le fond dune bote de Ptri en sassurant quil ne reste pas de bulles dair prises sous le filtre. Verser ensuite soigneusement 18 ml du milieu TSC liqufi entier (avec supplment D-cyclosrine) et pralablement refroidie 50C sur la membrane en limmobilisant avec des pinces striles. Aprs que cette couche de milieu se soit dpose, incuber anarobiquement, ou bien dans dautres conditions assurant I anarobiose, une temprature de 37C 1C dans lincubateur pendant 20 4 h et 44 4 h. Interprtation: Compter toutes les colonies noires (nombre de colonie exprim en UFC/100ml)
Principe : Ensemencement, par mlange dans un milieu de culture spcifi coul dans des botes de Ptri, de volumes mesurs d'un chantillon ou de ses dilutions. Incubation d'un jeu de botes 36C pendant 44 h et d'un autre jeu 22C pendant 68 h .Calcul du nombre

d'units formant colonie (UFC) par millilitre (ml) d'chantillon partir du nombre de colonies formes dans le milieu. Botes de Ptri en verre ou en matire de plastique : de diamtre 90 mm ou 100 mm Milieux de culture et diluants :Composants de base Pour la prparation du milieu, utiliser des composants de qualit uniforme et des produits chimiques de qualit analytique, ou bien utiliser un milieu de culture quivalent complet dshydrat et suivre les instructions du fabricant.
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Pour prparer le milieu, utiliser de l'eau distille dans un appareil en verre ou de l'eau dionise conforme la qualit 3 de l'EN ISO 3696 et exempte de substances pouvant inhiber la croissance dans les conditions de l'essai. NOTE: L'utilisation de produits chimiques d'autres qualits est permise, sous rserve de dmontrer qu'ils ont une Performance gale pour l'essai. - Diluant Pour les dilutions, utilis le diluant base de peptone indiqu dans l'ISO 8199.
Glose l'extrait de levure
6,0 g 3,0 g 10 g 20 g (en fonction du pouvoir glifiant) 1 000 ml Tryptone (Peptone de casine, pancr.) Extrait de levure dshydrat Glose, en poudre ou en paillettes Eau

Ajouter les composants ou le milieu complet dshydrat, l'eau et dissoudre par chauffage. Ajuster le pH si ncessaire de faon qu'aprs strilisation il soit de 7,2 0,2 25C. Rpartir le milieu par volumes de 15 ml 20 ml dans des tubes, flacons ou autres rcipients. Pour conserver des volumes plus importants, utiliser des rcipients de capacit allant jusqu' 500 ml. Striliser l'autoclave (en chaleur humide) (121 3) C pendant (15 1) min. Pour l'emploi, faire fondre le milieu, le laisser refroidir et le maintenir (45 1) C au moyen du bain marie deau. Il est recommand de ne pas garder le milieu plus de 4 h 45 C, aprs quoi le milieu doit tre rejet.

Analyse bactriologique de leau brute (eau naturelle) :


Le dnombrement des bactries sur milieux liquides est bas sur la technique du nombre le plus probable (NPP). Il sagit dune technique de dnombrement indirecte par calcul statistique aprs rpartition de linoculum dans un milieu de culture liquide. Dans ce type de mthode les bactries se multiplient librement dans le milieu liquide

**NPP /100ml: nombre le plus probable de la table Mac CRADY. milieux de culture liquide et bactries recherches
Coliformes totaux : sont utilise depuis trs longtemps comme indicateur de la qualit microbienne de leau parce quils peuvent tre indirectement associe une pollution dorigine fcale. Les coliformes totaux sont dfinis comme tant des bactries en forme en btonnets arobies ou anarobies facultatifs permettant lhydrolyse du lactose 36c.
Milieu de culture: -

Bouillon lauryl sulfate-tryptose (37c/48h).


Milieu de confirmation :

Bouillon lactose bili au vert brillant (37c/48h)

Coliformes fcaux : sont des sous groupe des coliformes totaux capables de fermenter le lactose une temprature de 44c, lespce la plus frquemment associe ce groupe bactrien est E. Coli.
Milieux de cultures : Bouillon lauryl sulfate-tryptose (37c/48h). milieu de confirmation :

Bouillon EC medium (44c/24h).

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Streptocoques fcaux Sont des bactries Gram positif, de forme sphrique ou ovode formant des chanettes et capable de se dvelopper en prsence de lacide de sodium 37 (agent slectif) pendant 48 heure et dans un bouillon glos en prsence de lacide de sodium et de lthyle violet 37C pendant 48 heure.
Milieu de culture : Bouillon glucose lazide de sodium (37c/48h). Milieu de confirmation : Bouillon litsky ((37c/48h).

Remarque : Les tubes positifs (trouble+gaz, trouble et /ou dpt) repiquer sur les milieux confirmatifs

C. Analyses physico-chimiques Introduction : Les analyses physico-chimiques de leau consistent analyser plusieurs paramtres Pour caractriser leau en tenant compte des normes, chaque paramtre une valeur maximale admissible (VMA). les paramtres physico-chimiques :
1. temprature : La temprature est un facteur cologique important du milieu .elle agit sur la conductivit lectrique et le pH. La temprature de lchantillon est mesure au moment de prlvement. La temprature gnralement mesur laide dun thermomtre mercure talonn et avec une graduation dau moins 0.5c. 2. conductivit lectrique ou bien la minralisation : Cest la quantit de sels minraux contenus dans leau : Anions: HCO3-, SO4--, Cl- Cations: Ca2+, Mg2+, Na+, K+ La conductivit est mesure par la mthode lectromtrie qui se base sur la mesure de la rsistivit de lchantillon. 3. pH: Le pH est mesur sur place par une lectrode de verre ou bien par un indicateur color ou par papier pH. Il caractrise lacidit de leau .leau destin lalimentation humaine doit avoir un pH entre 6.5 et 8.5. 4. turbidit : La turbidit varie suivant les matires en suspension de leau, son principe consiste mesurer la lumire Disperse par les particules en suspension prsentes dans leau .la turbidit est mesure par un turbidimtre. 5. loxygne dissous : Loxygne dissous dans leau est mesur par la mthode iodomtrique. la fixation de loxygne doit tre Effectu au moment de prlvement en introduisant successivement 1ml de solution de chlorure de manganse (Mncl2) et 1ml diodure de potassium (KI), lchantillon doit tre prlev dans des flacons spcialement rservs Pour le dosage de loxygne dissous.

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Dosage iodomtrique : Laide dune pro pipette on met 1ml dacide sulfurique (H2SO4) concentr on agite le flacon pour que liode soit bien rpartit. Transvasons le contenu dans erlenmeyer de 100ml et on effectue le titrage avec le thiosulfate de Na. La valeur maximale admissible de lo2 est comprise entre 5mg et 8mg. (Dosage pour 125ml dchantillon). 6. chlorure : Les chlorures donnent une saveur dsagrable leau surtout en prsence de sodium, calcium et magnsium. Les chlorures sont doss en milieu acide par le nitrate mercurique Hg (NO3)2e en prsence de diphnylcarbason. 7. fluorures : Le dosage est bas sur la mesure potentiomtrique de la quantit dion fluorures laide dune lectrode spcifique cristal de fluorure de lanthane. Les chantillons doivent tre prlevs dans des flacons en polythylne ou en verre. 8. la duret totale et calcique : La duret totale est la concentration en ions calcique et magnsium et dautres cations bivalents et trivalents. La duret se dtermine par un dosage complexomtrique par Lthylnediamine tetraactate disodique (EDTA), En prsence de noir driochrome qui donne une couleur rouge fonce ou violette avec le calcium et le magnsium. Lacide calcon carboxylique est un indicateur de calcium, prcipite sous forme dhydroxyde pendant lors du dosage. La duret calcique est la concentration des ions calcium dans leau. 9. oxydabilit : Lindice de permanganate de potassium dune eau est la quantit doxygne en mg/l cde par lion de permanganate MnO4- et consomme par les matires oxydables contenues dans un litre deau dans les conditions dfinies par la prsente norme. Son principe consiste De chauffer 100ml dchantillon dans un bain marie en prsence de 10ml KMNO4 (excs) et 2ml dacide sulfurique (fixation de loxygne) pendant une priode de 13min.une partie de KMNO4 est rduite par les matires oxydable de lchantillon et lexcs de KMNO4 sera dterminer par laddition de lacide oxalique en excs, suivi par un titrage de lexcs de loxalate par le permanganate de potassium. Permanganate de potassium : un oxydant fort. Acide oxalique : acide et un rducteur fort (H2C2O4). 10. titre alcalimtrique (TA) et titre alcalimtrique complet (TAC): Titre alcalimtrique :

Le titre alcalimtrique (TA) correspond la neutralisation des ions hydroxydes (OH) et la transformation des ions carbonates (CO3 2) en hydrognocarbonates (HCO3) par un acide fort (acide chlorhydrique de 0.1N). Dans Erlenmyer contenant 100ml dchantillon, on lui ajoute 3gouttes de phnolphtaline si le pH de lchantillon est : <8.3, lchantillon ne se colore pas en rose ------ le TA=0 >8.3, lchantillon est rose, le TA est dterminer par addition de lacide chlorhydrique de 0.1N.

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Titre alcalimtrique complet TAC : Le titre alcalimtrique complet correspond la neutralisation des ions hydroxyde, carbonates et hydrognocarbonates (HCO3) par lacide chlorhydrique. La mesure de TAC elle succde Celle de TA sur la mme chantillon, si le TA est non nul, ne pas rajustons la burette de la solution dacide chlorhydrique zro. Dans lchantillon prcdent on ajoutant 3 gouttes dhlianthine. Si Le pH <4.3, la solution est immdiatement rouge : TAC=TA LE PH >4.3, la solution est jaune, le TAC est dterminer de la mme manire que le TA. Remarque : Le TA et TAC se mesurent aprs dtermination du pH de lchantillon. 11. Ammonium : En milieu fortement basique (10,8pH11,4), lammoniac ragit quantitativement avec lhypochlorite et donne une monochloramine selon la raction : NH3 + HOCl NH2Cl + H2O Le monochloramine forme avec du phnol, en prsence de nitroprussiate et un excs dhypochlorite, du bleu dindophnol, susceptible dun dosage colorimtrique la longueur Donde 630nm (par spectrophotomtrie) selon les ractions : NH2Cl + C6H5 + 2HOCl ClNC6H4O + 2H2O + 2HCl C6H5OH + ClNC6H4O OC6H5NC6H4O + H+ +Cl Les concentrations en ammonium doivent tre comprises entre 2g/l et 15000g/l en NH4+.Avant les analyses, les chantillons concentrs contenant plus de 1,5g/l en NH4+ doivent tre dilus. La valeur maximale admissible (VMA) pour lammonium dans leau dalimentation est 0,5mg/l. Remarque : - la verrerie utilise pour effectuer le dosage ne doit servir qu cet usage. - il est prfrable aprs chaque srie danalyse de laisser les verreries sans lavage, jusqu la prochaine analyse. - la verrerie est conserve lobscurit aprs chaque analyse. 12. nitrates : La concentration des nitrates dans les eaux est gnralement faible. Origine : Minralisation de la matire organique. Engrais azots. Rsidus animaux, fumier. Eaux uses domestiques et station dpuration.

Les nitrates sont trs recherchs dans les eaux dalimentation. Aprs lajustement du pH qui doit tre entre 7et9, lchantillon est dilu dans un tampon puis pass sur une colonne du grain de cadmium recouvert de noir de cuivre, pour rduire les nitrates NO3 en nitrites NO2. Les nitrites rsultants (ceux prsents dans lchantillon +ceux issu de la rduction) donnent une raction de diazotation avec la sulfanilamide (NED), puis un couplage avec le chlorhydrate d -naphtylthylnediamine, pour former un complexe rose, dont lintensit de la coloration est mesur par une spectrophotomtrie 540nm. Lintensit mesure est proportionnelle la concentration initiale en nitrates rduits+nitrites prsent dj dans lchantillon. La valeur maximale admissible (VMA) pour les nitrates (NO3) est de lordre de 50mg/l
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Remarque Lchantillon traverse la colonne avec un dbit de 7 10 ml/min. il ne faut jamais laisser la colonne sec avant et aprs les analyses. aprs lajout de NED, nous devons attendre 30min et nous ne dpassons pas 120min pour mesurer labsorbance de lchantillon. 13. silicates : Lacide molybdique, en prsence dions silicates un pH 1.2, produit une coloration jaune due au complexe silico-molybdique dont lintensit est proportionnelle la quantit dions silicates. Cette mthode est applicable pour la dtermination des concentrations en silicates comprise entre 0.05mg/l et 2.5mg/l, pour les chantillons dont la concentration en silicate est suprieure peuvent tre analys aprs dilution. leau distille doit avoir une teneur en silicate infrieure 0.025mg/l. Le prlvement des chantillons se fait dans des bouteilles en polythylne. Le dlai de conservation ne doit pas dpasser 7jours. 14. bore : En milieu tamponn, le bore donne avec lazomthine H un complexe jaune steristique dont lintensit est mesure au spectrophotomtre la longueur donde de 420nm avec une cuve de trajet optique de 10 mm. Cette mthode sapplique la dtermination de la teneur en bore dans les eaux destin la consommation humaine. Le dlai de conservation de lchantillon ne doit pas dpasser 28jours. 15. sulfates : Les ions sulfates sont prcipits en prsence de chlorure de baryum, en milieu acide dune manire telle quil se forme des cristaux de sulfate de baryum de taille uniforme. La quantit de la suspension du sulfate de baryum est mesure soit au spectrophotomtre UV visible 420nm soit au turbidimtre. La valeur maximale admissible (VMA)=400mg/l.

Remarque :

Remarque :

Remarque : 1) on porte lchantillon en agitation pendant une minute. 2) la lecture se fait dans les premires secondes. 3) pour les chantillons chargs il est ncessaire de faire une dilution.
spectromtrie dabsorption atomique (SAA) : Le principe de cette technique utilise les proprits des atomes dtre excits condition quon lui fournisse de lnergie gal la diffrence dnergie entre le niveau excit et le niveau fondamental, lnergie fournie peut tre dorigine thermique, cintique ou lumineuse .Lorsque les atomes dun lment ont t excits, le retour ltat fondamental saccompagne de lmission des radiations propre llment. Lutilisation de ce phnomne constitue la base de la spectromtrie dmission. Le mme lment dispers ltat atomique dans un four ou une flamme possde galement la proprit dabsorber tout rayonnement de mme radiation, il rsulte une absorption du rayon incident lie la concentration de llment considr par la relation :
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Log (Io/I) =K.l.C Io, I : intensits de la radiation incidente et transmise, K: coefficient dabsorption ou section efficace de capteur dun photon. L : longueur de chemin optique, dans latomiseur. C : concentration de llment doser.

Deux systmes sont utiliss par cette technique pour gnrer des atomes : flamme et four. 1. spectromtrie dabsorption atomique par flamme (SAAF) : La solution est aspire par un fin capillaire. Le capillaire amne la solution dans le nbuliseur dans le rle est de produire un arosol solution gaz dans le quel les gouttes sont les plus fines possibles, ce mlange (solution+gaz) qui va arriver la base de brleur et pntrer ensuite dans la flamme. Le temps ncessaire pour passer dune goutte de solution un atome libre en phase vapeur dpend de la taille de la goutte et de la temprature de la flamme. Les lments doser par cette technique: Zn, Mn, Fe, Cu, K+, Na. Le dosage se fait par des lampes spcifiques pour chaque lment. 2. spectromtrie dabsorption atomique par four (SAAE) : Lintroduction de la solution dans le tube en graphite se fait automatiquement. Aprs lintroduction de lchantillon lintrieur du tube, celui-ci est chauff par effet Joule par passage du courant lev dans lectrodes suivant un programme thermique qui se droule en trois tapes principales : schage, dcomposition et atomisation. Les lments doss par cette technique : Al, Pb, As, Se, Cr, Cd, Ba, Ni. Le dosage se fait par des lampes spcifiques pour chaque lment.

Remarque :
Une erreur qui sest produite pendant la dure du stage au niveau de lapplication de lappareil ce qui a rendu les analyses impossibles. Contrle de la qualit des analyses physico-chimiques 1. Contrle de la qualit analytique : Chaque srie danalyse comporte diffrents contrles savoir : blanc de la mthode : Lanalyse de blanc (eau distille) chaque srie danalyse permet dmontrer sil y a eu de contamination pendant la prparation de lchantillon ou bien lors de lanalyse. Le rsultat du blanc doit tre infrieur trois fois la limite de dtection de la mthode. matriau de rfrence (MR) : Le matriau de rfrence est un chantillon de contrle utilis pour mesurer la performance de la mthode. il informe sur lexactitude de la mthode sans considration leffet de la matrice des chantillons analyser et permet de prendre une dcision sur lacceptabilit des rsultats analytiques. Le matriau de rfrence est
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prpar partir dune solution mre diffrente de celle servant la prparation des solutions talons. Le % dcart relatif acceptable est infrieur ou gale 20%.

%dcart

(rsultat exprimental rsultat thorique) *100. Rsultat thorique

duplicata de lchantillon : Le duplicata de lchantillon donne une indication de la prcision de la mthode danalyse en tenant compte de leffet de la matrice de lchantillon, un chantillon en duplicata est analys chaque srie danalyse. Le % dcart entre les deux rsultats doit tre infrieur ou gale) 20%.ce % dcart ne sapplique pas pour les chantillons dont la concentration est dix fois plus leve que la limite de dtection de la mthode.

%dcart= (Rsultat de lchantillon- rsultat du duplicata) (Rsultat de lchantillon + rsultat du duplicata)/2

chantillon fortifi (AJD) : Lajout dos un mlange entre un chantillon choisi au hasard et une prise dessai bien dterminer pris de la solution mre quest rserve au contrle (en gnral la concentration de lAJD est de la concentration de lMR). Le % rcupration informe sur lexactitude de la mthode en considrant leffet de la matrice des chantillons analyser, le % doit tre entre 80 et 120%.

% rcupration = (Cf C)*100/Ca


Cf. : concentration de lchantillon fortifi C : concentration de lchantillon non fortifi. Ca : concentration de lajout dos. contrle de la courbe dtalonnage : Cest une solution talon dont la concentration correspond la mi- courbe, il est au moins une fois tous les17 chantillons pour vrifier le maintien de ltalonnage. le % dcart doit tre infrieur 10%. vrification de ltalonnage : La qualit de ltalonnage est vrifie par le calcul du coefficient de corrlation linaire (r) de la courbe de ltalonnage. La valeur de (r) doit tre suprieure ou gale 0,995

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Eau constitue un lment vital pour cela il faut prserver et assurer sa persistance continuelle, non seulement pour fournir lhomme une quantit suffisante pour ces besoins mais pour lui assurer une irrprochable qualit. Pour cela fessait lobjet de notre tude. Aujourdhui, la qualit de leau et de lenvironnement nous concerne tous. La qualit de leau est prioritairement une exigence de la sant. Cest la raison pour la quelle, il est ncessaire de la traiter et de lconomiser.

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Certains genres de bactries ont en commun une membrane qui retient certains colorants. Ils forment le groupe des bactries Gram Positives (Gram +) Toutes les autres bactries soit qu'elles n'ont pas de membrane soit que la nature de leur membrane est totalement diffrentes se laissent dcolorer par la mthode de Gram. Elles sont dites Gram ngatives. (Gram -)

Matriel

Microscope biologique avec immersion. Culture (ou prlvement) bactrienne. Lames dgraisses. Pince lames Bec Bunsen (ou bien lampe alcool) Pissette d'alcool absolu ou alcool-actone. Pissette d'eau. COLORANTS
o

o o

Violet phniqu (Nicole) Violet de gentiane (cristal violet) 1 gramme Alcool absolu...................... 10 ml Eau phnique 1%............... 90 ml Liquide de Lugol (IKI) Iode ................... 1 g Iodure de potassium... 2 g Eau distille......... 300 ml (200 g d'aprs Nicole) Solution de Fuchsine Solution de fuchsine sature dans l'alcool 10 ml Eau distille ................................90 ml Alcool Absolu. ou bien Alcool-Actone (Nicole) Alcool Absolu 5 Volumes Actone ......1 Volume

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Composition du Kit de GRAM HUCKER (RAL) 1. 2. 3. 4. Cristal Violet Oxalate Liquide de Lugol stabilis Diffrenciateur lent Safranine

AVERTISSEMENT :

La manipulation de matriel infectant doit tre effectu par du personnel qualifi en respectant les rgles d'asepsie.

Protocole

1. TALEMENT. L'talement doit se faire en couche mince, sur une lame dgraisse. 2. DESSICCATION. Laisser scher l'air. 3. FIXATION. Passer trois fois rapidement dans la flamme du bec Bunsen la face de la lame oppose l'talement. Ne pas trop insister sous peine de carboniser le prlvement. On peut galement fixer en laissant vaporer quelques gouttes d'alcool mthylique verses
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directement sur le prlvement. A ce stade les germes ne sont plus considrs comme contaminants. 4. COLORATION de GRAM. 1. Dposer quelques gouttes de Violet 2. Laisser agir 4 6 secondes 3. goutter sans rincer. 4. 5. 6. 7. Dposer quelques gouttes de Lugol Laisser agir 4 6 secondes. goutter et recommencer avec le Lugol. goutter.

8. Faire couler sur la lame (pas sur l'talement) l'Alcool ou l'Alcool-Actone. Jusqu' disparition du Violet. 9. Laisser agir quelques gouttes de Fuchsine 25 secondes. 10. Laver. 11. Scher. 5. EXAMEN. Examiner l'objectif immersion. Commentaires

La coloration de Gram se fait en trois phases suivies d'une phase facultative de coloration du fond.

A-(1, 2,3) Coloration au Violet. Tous les lments sont colors en Violet. B- (4, 5, 6,7) Le Lugol fixe le Violet sur les structures membranaire des bactries Gram+.Tous les lments sont colors en noir.

C-(8) Dcoloration. Les bactries Gram + sont colors en violet fonc, les autres lments ne sont pas colors. D-(9, 10,11) Recoloration du fond la Fuchsine. Les lments tissulaires et les bactries Gram- sont colors en rose. Les Bactries Gram+ sont colors en violet.

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Une oxydase est une enzyme catalysant une raction d'oxydorduction impliquant une molcule de dioxygne (O2) comme accepteur d'lectron. Dans ces ractions, l'oxygne est rduit en eau (H2O) ou en peroxyde d'hydrogne (H2O2). La recherche d'oxydase est un test fondamental pour orienter l'identification des bacilles Gram-. On utilise comme ractif le chlorhydrate ou le PDA, on l'utilise gnralement avec des disques imprgns de ce ractif (disques oxydases). Sur une lame, on place un disque imprgn du ractif et on dpose aprs une colonie avec une pipette pasteur. S'il y a apparition d'une tache violette au bout de 30 secs, on conclut que la bactrie est oxydase+ et qu'elle possde le cytochrome oxydase. Et s'il n'y a rien qui apparat a veut dire que la bactrie est oxydase- et qu'elle ne possde pas l'enzyme respiratoire (cytochrome oxydase

Test oxydase Ce test est la base de lidentification des bactries Gram -. Ce test permet de mettre en vidence une enzyme : la phnylne diamine oxydase des bactries partir de leur culture en milieu glos. Cette enzyme est capable doxyder un ractif : le N dimthyle paraphnylne diamine. - Si la colonie prend une teinte rose, violette. Le germe possde une oxydase : le test est positif. - Si la colonie reste incolore, le germe ne possde pas doxydase, le test est ngatif. Le ractif peut se trouver sous deux formes :

soit en solution : sur une lame de verre, dposer un carr de papier filtre et limbiber dune
solution frachement prpare de ractif, soit sous la forme dun disque pr-imprgn par le ractif. Dans les deux cas, craser avec une effilure de pipette Pasteur une colonie de germes tudier sur ce papier (instrument noxydant pas le ractif).

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