DETECCION

GENOTIPICA DE LA
RESISTENCIA A LOS
ANTIMICROBIANOS

Por Ana Cristina Villagra de

Trejo
 Biología Molecular en
Bacteriología

Objetivos:
“Conocer los aportes de la
Biología Molecular en la
detección genotípica de la
Resistencia a los
Antimicrobianos”
 Biología Molecular en
Bacteriología
Temas a abordar:
 Técnicas de Biología Molecular y
Bacteriología
 Breve reseña sobre los métodos usados.
 Reacción de la Polimerasa en Cadena.
 Biología Molecular/Diagnóstico
Bacteriológico.
 Aplicación en la Microbiología clínica de
la PCR
 DETERMINACION RAPIDA DE LA
 Técnicas de Biología Molecular
en Bacteriología
 Métodos de hibridización.
DNA/RNA sondas.
 Métodos de amplificación de ADN.
PCR.
PCR de Tiempo Real.
NABSA – LCR.
 Métodos de separación de ADN.
PFGE – RFLP.
 Métodos de secuenciamiento de ADN.
 Biología Molecular en
Bacteriología
Temas a abordar:
 Técnicas de Biología Molecular y
Bacteriología
 Breve reseña sobre los métodos usados.
 Reacción de la Polimerasa en Cadena.
 Biología Molecular/Diagnóstico
Bacteriológico.
 Aplicación en la Microbiología clínica de
la PCR
 DETERMINACION RAPIDA DE LA
 Métodos de hibridización

Southernbl
ot
Los fragmentos de ADN se encuentran en un gel de agarosa.
Se transfieren a membranas de nylon o nitrocelulosa.
Por la presión creada por una cámara conectada a bomba de vacío.
Los fragmentos de ADN van desde el gel a la membrana.
En dirección de la presión generada por el sistema.
Métodos de amplificación de
ADN.
PCR: Reacción de la Polimerasa en
Cadena

“La PCR es una

herramienta integral en
Biología Molecular, que
debido a su versatilidad y
fácil estandarización se ha
convertido en una pieza
clave tanto en el área de
 Diagnóstico
Microbiológico
ET APAS D E LA
Técnica P CR : (Reacción en
de amplificación genética.
cadena de la polimerasa)

 Extracción y purificación de los ácidos nucleicos

Del microorganismo aislado Directamente de la muestra

 Amplificación de un segmento seleccionado del genoma.

PCR propiamente dicha

 Detección de fragmentos amplificados por PCR (amplicones)

Por electroforesis en gel Por hibridación con sondas
de agarosa y tinción con específicas marcadas con
bromuro de etidio. fluorocromos
 Diagnóstico
Microbiológico
PCR ( Reacción en cadena de la polimerasa):
primera etapa.

 Proteinasa K: 2hs a 65 °C ,
inactivar 10 minutos.
Primer
 Preparación y agregado : DNTPs (2 mM)
Buffer Taq 10 X
Mix Mg (25mM)
H2O
Taq
Controles: negativo 3 µl de agua destilada. Molde
Positivo 1 µl de cepa control+2 µl de agua destilada Volumen final
De inhibición 1 µl de cepa control+2 µl de muestra.
 Diagnóstico
Microbiológico
Técnica
PCR: segunda etapa de amplificación genética.
Procesos
Son controlados
por diferentes Tº
para los tres
fenómenos
básicos:


Desnaturalización

 Annealing.

 Extensión.
 Diagnóstico
Microbiológico
Técnica
PCR(tercera de Observación
etapa): amplificación genética.
con el transiluminad
 PCR de Tiempo Real

“En la PCR a tiempo Real,

los procesos de
amplificación y detección
se producen de forma
simultánea en el mismo
vial cerrado, sin necesidad
de ninguna acción
 Métodos de separación de
ADN
PFGE:
Electroforesis de campo
pulsante.

“Explora todo el
cromosoma
detectando la
variabilidad
existente en los
lugares de
restricción de la
Métodos de separación de
ADN
 Biología Molecular en
Bacteriología
Temas a abordar:
 Técnicas de Biología Molecular y
Bacteriología
 Breve reseña sobre los métodos usados.
 Reacción de la Polimerasa en Cadena.
 Biología Molecular/Diagnóstico
Bacteriológico.
 Aplicación en la Microbiología clínica de
la PCR
 DETERMINACION RAPIDA DE LA
 Reacción de la Polimerasa en
Cadena.
Diagnóstico Molecular y Diagnóstico
Bacteriológico
 Menor desarrollo en comparación con el
diagnóstico virológico.
 Muchas especies bacterianas de importancia
clínica son cultivadas y caracterizadas
fenotípicamente.
 Gran desarrollo de métodos de diagnósticos
fenotípicos automatizados o
semiautomatizados.
 Aplicación en Microbiología
Clínica de la PCR
 Identificación rápida de Ejemplo microorganismos
agentes infecciosos en Causantes de Sepsis o
o
DETERMINACION
pacientes críticos. RAPIDA DE LA
Meningitis.

 RESISTENCIA
Identificación de ANTIMICROBIANA Herpes virus .
Virus respiratorios.
agentes no viables o no Enterovirus.
cultivables. Mycobacterium tuberculoso
 Identificación y Bordetella pertussis.
Bartonella henselae.
caracterización de Micosis invasiva por Aspergills
organismos fastidiosos. Ejemplo bacterias causantes
u

 Tipificación de cepas De infecciones alimentarias.

para estudios
DETERMINACION RAPIDA DE LA
RESISTENCIA ANTIMICROBIANA
 DETERMINACION RAPIDA DE LA
RESISTENCIA ANTIMICROBIANA
Ventajas de los Métodos Genéticos:
 Se pueden entregar resultados en
menor tiempo.
 Útil en agentes de crecimiento lento.
 Solo útil si se conoce la genética del
mecanismo de resistencia.
 Los métodos convencionales
detectan la resistencia en forma
global.
 DETERMINACION RAPIDA DE LA
RESISTENCIA ANTIMICROBIANA

Ventajas de los Métodos Genéticos:

 Se pueden realizar directamente
sobre muestras clínicas.
 Útil en agentes no cultivables.
 Si se hicieran con equipos de PCR a
tiempo Real, al usar equipos
cerrados, se disminuye al máximo el
riesgo biológico frente a agentes
peligrosos.
 DETERMINACION RAPIDA DE LA
RESISTENCIA ANTIMICROBIANA

Microorganismo Antimicrobiano Gen blanco Métodos Moleculares

Meticilina y Adquisición del gen PCR

Staphylococcus spp β lactámicos MecA Southern hibridization

Genes
Van D y Van C (1,2,3)
Enterococcus spp. Vancomicina VanB y VanA PCR - RFLP.

Ceftazidima. Genes que codifican

Género Cefotaxima. βLEE (plasmídicas)
Enterobacteriaceae Aztreonam. PCR - RFLP.

Streptococcus PCR - RFLP.

pneumoniae Penicilina pbp 1 A
 ETH implicados en la
diseminación epidémica de
genes de resistencia
Resistencia Otras Microorganismos Comentarios
a
principal resistencias
Fenotipo Genotipo
VanA vanA - Enterococcus spp, - ETH
(Van, Tei) Streptococcus spp, epidémico en
Lactococcus Europa.
Corynebacterium, - Gran
Bacillus circulans, polimorfismo
Staphylococcus aureus genético
específico de
área
geográfica.
VanB(Van) vanB - E. faecium, E. faecalis, ETH
S. bovis, S. gallolyticus epidémico en
Europa.
VanB vanB (Amp)b E. faecium, E. faecalis, ETH
(Van) S. bovis, S. gallolyticus epidémico
universalmente
Extraordinario
polimorfismo
genético
específico de
área
geográfica.
HLRGm aac(6´) - E. faecalis, ETH
epidémico
universalmente
aph(2´´)
Staphylococcus aureus
 ETH implicados en la
diseminación epidémica de
genes de resistencia
Resistencia principal Otras Microorganismos Comentarios
a
resistencias
Fenotipo Genotipo
BLEE clase A βla Tmp, Sm, Enterobacteriaceae ETH epidémico
(cefotaximasa) Spec en España
CTX-M-9
BLEE clase A βla ß-lactamic, Enterobacteriaceae ETH epidémico
(cefotaximasa) en Argentina
AAGG
CTX- M-2
BLEE clase A βla Enterobacteriaceae, No descrito en
Pseudomonas España pero sí
aeruginosa en Europa.
GES-1 Ejemplo de
diseminación de
genes en
distintos ETH
Quinolonas qnr In36 (Tmp,ß- Escherichia coli ETH encontrado
lac, Ag, Su) en China
In37 (Ag,
Cm, Rf, ß-
lac, Su)
 ETH implicados en la
diseminación epidémica de
genes de resistencia
Resistencia
principal
Otras
resistencias
a
Microorganismos Comentarios

Fenotipo Genotipo

BLEE clase B βla In31 (Ag, Cm, Pseudomonas, Alcalígenes,

Su) Acinetobacter, Klebsiella,
No descrito en
España pero sí en
Otros ( Europa y otros
IMP-1 variable) Citrobacter continentes
Ejemplo de
diseminación de gen
de resistencia y
βla variables alélicas en
distintos ETH

IMP-2
macrólidos mef (A) - Streptococcus pneumoniae ETH epidémico en
Italia
macrólidos mef (E) - Streptococcus pneumoniae
 Staphylococcus aureus
Mecanismos de Resistencia
 S/a Oxa R/a Oxa
Gen Mec A
 ------- -------
 ------- -------
PBP 2 a
 2a
-------
R/a Penicilinas
Cefalosporinas  -------- -------
Carbapenems
AMS.
 3’ -------- -------
 4 -------- -------
 Staphylococcus aureus
Mecanismos de Resistencia
Comportamiento frente a Oxacilina

Falsa R: * Hiperproducción de β Lactamasa

Mec A (-) (AORSA)
Resistencia * PBP modificada ( < afinidad:
MODSA)

R.verdadera: * Homogénea (fácil

detección)
Mec A (+) * Heterogénea (Clases 1-2
y 3.)
 Staphylococcus aureus
Mecanismos de Resistencia
PBP 2 a vs. CIM y Grado de
Expresión
CIMs Grado de
Clase 1 1,5 – 3 µg/ml 1/ 10 (7-8) cel R
R. expresión
Heterogénea
Clase 2 6 – 12 µg/ml 1/10 (4-6) cel R
Clase 2-3 25 – 50 µg/ml
Clase 3 100 - 200 µg/ml 1/10 (2-3) cel R

Clase 4 > ó = 400 µg/ml todas

R. Homogénea.
 Staphylococcus aureus
R/a Macrólidos y
Lincosamidas
 R/aMacrólidos: Eflujo……gen msrA.
 R/a Clindamicina: Metilación del
rRNA 23S……….gen erm. (Tb se
llama MLS)Interpretación:
Sin achatamiento: S/a
Clinda.
Con achatamiento: R/a
ción de R inducible
Clinda a Clinda, en este aislamiento apar
R/a Clinda, aunque en algunos pacientes podría ser e
 Staphylococcus aureus
Resistencia a Vancomicina

Recomendaciones:
Halo = o > a 15 mm: S/a
Vanco.
Halo = o < a 14 mm hacer
CIM.
 DETERMINACION RAPIDA DE LA
RESISTENCIA ANTIMICROBIANA
Métodos
Microorganismo Antimicrobianos Gen blanco Moleculares
Genes
KatG
inhA
Isoniacida ahpC PCR - RFLP.

Complejo Rifampicina Gen rpoB PCR.

Mycobacterium Etambutol Gen embB PCR

tuberculosis. Estreptomicina Gen rrs PCR - RFLP.

Pyrazinamida Gen pncA PCR

Complejo MAI
Mycobacterium
avium-intracelulare Macrólidos Gen 23S rRNA PCR
 Mycobacterium tuberculoso
Detección de genes de Resistencia

Isoniacida Se producen mutaciones en los

Genes:kanG, inhA y aphC

Rifampicina Mutación en el gen rpo

Etambutol Mutación en el gen embB.

Estreptomicina Mutación en los genes rpsL y rrs.

Fluorquinolonas Mutación en los genes gyrA y B

 DETERMINACION RAPIDA DE LA
RESISTENCIA ANTIMICROBIANA

Métodos
Microorganismo Antimicrobiano Gen blanco Moleculares

Virus de la
Inmunodeficiencia
humana Inhibidores de la
transcriptasa
(VIH) reversa Gen pol RT-PCR-DNA

Inhibidores de la Gen de la
proteasa proteasa RT-PCR-RFLP

Genes UL97 y
Citomegalovirus Ganciclovir UL54 PCR-DNA

Virus de la hepatitis C Variante genética

(VHC) Interferón de VHC RT-PCR-RFLP
 Enterobacteriaceae: tipos de
βLEE
 βLEE

SHV OXA GES TLA

TEM CTX-M PER
 Métodos Moleculares para
Detección de βLEE
 Sondas de Hibridización:
Técnica
Para Genes TEM, SHV laboriosa
No distingue entre βLEE y no β
LEE
No puede determinar las
variantes de TEM o SHV

 PCR Ídem a sonda de

hibridización
 Métodos Moleculares para
Detección de βLEE
 PCR – RFLP.
Fácil de realizar, detecta cambios
nucleotídicos, detecta variantes de
βLEE.
 LCR.
Determina variantes de βLEE, utiliza
gran
variedad de primers
 Secuenciación ADN.
Es el gold standard, puede detectar
 Desventajas de los Métodos
Genéticos en la Detección de la
Resistencia
 Falta de Sensibilidad si la concentración
del microorganismo es baja en la muestra

 Para cada antimicrobiano se requieren

diferentes pruebas.

 La Resistencia a un determinado
antimicrobiano puede ocurrir por varios
mecanismos asociados
a diferentes genes de resistencia.
 Desventajas de los Métodos
Genéticos en la Detección de la
Resistencia
 Para algunos agentes, los mecanismos
genéticos de resistencia son aun
desconocidos.
 Pueden detectar resistencia expresada a
un nivel que no sea clínicamente
relevante.
 Falsos positivos por contaminación de la
muestra.
 Estandarización y control de calidad
multicéntrico aún en etapas iniciales.
 Muchas Gracias por
su atención.