Chem.

Listy 98, 989 992 (2004)

Laboratorn pstroje a postupy

LABORATORN PSTROJE A POSTUPY

POUITIE VYSOKOINNEJ TENKOVRSTVOVEJ CHROMATOGRAFIE A STOLNHO SKENERA NA KVANTITATVNE STANOVENIE VEDAJCH METABOLITOV ANTIBIOTIKA SALINOMYCNU MILO BLAZSEK, OTAKAR ITVNFY a STANISLAV ROMAN
sek vskumu a vvoja, Biotika a.s., 976 13 Slovensk upa, Slovensko blazsek@biotika.sk Dolo 23.7.02, prepracovan 12.6.03, prijat 1.9.03. Kov slov: salinomycn, 17-epi-20-deoxysalinomycn, fermentan pda, premixy veterinrnych produktov, vysokoinn tenkovrstvov chromatografia, HPTLC, stoln skener mono dosiahn zokrabanm separovanch kvn, elciou analytov do rozpadla a analzou elutov almi technikami (spektrofotometria, GC, HPLC). Medzi modernejie techniky vyhodnotenia TLC platn patria optick denzitometrick techniky zaloen na meran reflektancie alebo transmitancie svetelnho la aplikovanho na platu cez trbinu (slit-densitometry). Ich alternatvou s video-denzitometre obsahujce digitlne CCD kamery a sveteln zdroje umoujce iluminciu celej platne svetlom vo vididenej, alebo UV oblasti. Zosnman a zdigitalizovan obraz TLC platne sa analyzuje na potai pomocou pecilnho softvru. Nevhodou spomenutch technk je pomerne vysok cena zariaden, ktor neumouje ich irie rozrenie. Aj preto boli v poslednch rokoch publikovan prce popisujce pouitie cenovo prstupnejch konvennch, alebo upravench kancelrskych skenerov na zoskenovanie (zdigitalizovanie) TLC platn pri analze farebnch ltok35 a fluorescenne aktvnych analytov67. Oproti komernm vyhodnovacm denzitometrom m stoln skener niekoko vhod. Je to predovetkm jeho cenov dostupnos, rchlos a vysok farebn rozlenie vhodn na identifikciu farebnch kvn a dokumentciu TLC platn. Zkladnou nevhodou je limitovan rozsah deteknch vlnovch dok. Tento nedostatok je spsoben pouvanmi CCD poami, ktor nemaj dostaton odozvu v UV oblasti a tie typom bene pouH OH O H H O H H OH O H H H H O H H H O O OH H O H OH

vod
Salinomycn (obr. 1) patr do skupiny monokarboxylovch polyterovch antibiotk, ktor sa vyznauj ionofornmi vlastnosami. Jeho antimikrobilne vlastnosti sa vyuvaj vo veterinrnej praxi pri liebe a prevencii kokcidizy u hydiny a tie pre stimulciu rastu hospodrskych zvierat. Salinomycn je produkovan fermentane kmeom Streptomyces albus. Okrem hlavnej zloky produkuje kme aj prbuzn ltky s vemi podobnou chemickou truktrou a antimikrobilnymi vlastnosami ako salinomycn. Ich vskyt a mnostvo je zvisl od podmienok fermentcie. Medzi najvznamnejie patr 20-deoxy-salinomycn a jeho epimr 17-epi-20-deoxysalinomycn (obr. 2, cit.1). Poda direktvy eurpskej komisie je obsah 17-epi-20-deoxysalinomycnu v produktoch salinomycnu limitovan na 40 g v 1 kg salinomycintu sodnho2. Snahou kadho vrobcu je preto minimalizova produkciu vedajch ltok. Cieom tejto prce bol vvoj rchlej a lacnej metdy vhodnej na screening tchto ltok v produknch fermentanch pdach a produktoch salinomycnu. Pre tento el bola navrhnut metda vysokoinnej tenkovrstvovej chromatografie (HPTLC) na silikaglovch platniach. Nevhodou tenkovrstvovej chromatografie (TLC) je nzka spoahlivos kvantitatvnych vsledkov. Semikvantitatvnu TLC analzu mono uskutoni vizulnym porovnvanm vekosti a intenzity kvrny tandardnej ltky a neznmej vzorky. Sprvnejie a presnejie vsledky
989

Obr. 1. Chemick truktra salinomycnu

a
H OH O H H O H H OH O H H H H O H H O O H O H OH

b
H OH O H H O H H OH O H H H H O H H O O H O H OH

Obr. 2. Chemick truktra vedajch metabolitov salinomycnu; a 20-deoxysalinomycn, b 17-epi-20-deoxysalinomycn

Chem. Listy 98, 989 992 (2004)

Laboratorn pstroje a postupy

vanch iluminanch zdrojov (biele svetlo) vhodnch na vyhodnotenie farebnch kvn. Tento problm bol u ale rieen pravou bench skenerov s pouitm alternatvnych iluminanch zdrojov pri analze fluorescenne aktvnych ltok67. Naskenovan obrzky TLC platn sa kvantitatvne vyhodnocuj pomocou bench grafickch a dta spracujcich softvrovch nstrojov, alebo pomocou pecilnych komerne dostupnch programov (napr. QuantiScan 9). Ich nevhodou je pomerne vysok cena, preto sa v naom prpade pouil vlastn jednoduch program (TLCpix), ktorho funkcia je zaloen na stan intenzity pixelov analyzovanch kvn.

Analza HPTLC platne Vyhodnocovac systm pozostval zo skenera Microtec ScanMaker 4600 (Microtec International, Taiwan) s iluminciou bieleho svetla a personlneho potaa s pouitm softvru ScanWizard 5 (Microtec International, Taiwan). HPTLC platne boli skenovan pri 100% vekosti s rozlen 300 dpi a uchovan v bitmapovom farebnom formte RGB (True Color, 24 bit). Obrzok platne bol vyhodnoten pomocou programu TLCpix. Program umouje kvantifikciu kvn dvoma spsobmi a to samostatnou analzou jednotlivch kvn, alebo analzou celej chromatografickej drhy (obr. 3). V prvom prpade sa kvrna manulne ohrani obdnikom pomocou zameriavacieho kra (a) a to tak, aby vertiklne okrajov psy pokrvali oblas okolo kvrny reprezentujcu pozadie platne. Vo vntornej ohranienej oblasti (b) program sta po riadkoch sumu intenzt pixelov (denzitu), korekcia po-

Experimentlna as
Separan podmienky Separcia salinomycnu a jeho metabolitov bola roben na hlinkovch HPTLC platniach s rozmermi 2020 cm (Merck, Darmstadt, Nemecko) pokrytch 0,25 mm vrstvou silikaglu 60. Analyzovan vzorky boli na platu nanan 10 l mikrostriekakou (Hamilton, USA) v mnostve 15 l. Platne boli vyvjan v sklenenej komore (200/200 mm), mobiln fza pozostvala z etylacettu a dichlrmetnu (Mikrochem, Pezinok, Slovensko) v pomere 1 : 1 (v/v). Po vyvinut HPTLC platne (elun drha 45 mm) sa such plata postriekala deteknm inidlom, ktor bolo pripraven z metanolu (Scharlau Chemie, Barcelona, panielsko), koncentrovanej kyseliny srovej (Mikrochem, Pezinok, Slovensko) a vanilnu (Merck, Darmstadt, Nemecko) v pomere 100 : 3 : 3 (v/v/w). kvrny analyzovanch ltok boli zviditenen po vloen platne na 30 s do teplovzdunho termostatu vyhriatho na 50 C.

Obr. 4. Vyhladen profil (chromatogram) analyzovanej drhy d (obr. 3), pky: SAL salinomycn, S2 17-epi-20-deoxysalinomycn, S1, S3S7 neidentifikovan ltky

zadia je docielen tak, e od intenzity kadho pixelu v riadku sa odta priemern hodnota intenzity pixelov nachdzajcich sa v tom istom riadku na okrajovch vertiklnych psoch (c). Vsledn hodnota je vhodn na kvantifikciu analyzovanej kvrny. Pri ohranien celej chromatografickej drhy (d) program umon zobrazi aj profil drhy (chromatogram) analyzovanej vzorky a stanovi Rf faktor a plochu jednotlivch pkov (obr. 4). Tento spsob umouje identifikova a vyhodnoti aj kvrny, ktor s na platni vizulne horie detekovaten (S6S7). Prprava roztokov Na analzu boli pouit metanolov extrakty fermentanej pdy a produktov pripraven nasledovnm spsobom. Do 25 ml odmernej banky sa navilo vhodn mnostvo vzorky (~ 2 g), pridal sa metanol a banka sa vloila na 15 min do ultrazvukovho kpea. Po premiean sa extrakt prefitroval cez filtran papier (Filtrak 388, Spezialpaper Filtrak, Nemecko) a filtrt sa alej analyzoval. Porovnvacia substancia 17-epi-20-deoxysalinomycnu bola
990

Obr. 3. Zobrazenie HPTLC platne analyzovanej programom TLCpix, a zameriavac kr, b ohranien kvrna 17-epi-20-deoxysalinomycnu, c okrajov psy pozadia, d ohranien analyzovan drha

Chem. Listy 98, 989 992 (2004)

Laboratorn pstroje a postupy

pripraven izolanmi a istiacimi krokmi z fermentanej pdy na pracovisku tvaru pre vskum a vvoj v Biotike a.s. Zkladn roztok substancie (0,2 mg.ml1) sa pripravil rozpustenm presne odvenho mnostva v metanole. Roztoky boli skladovan pri 5 C.

Vsledky a diskusia
Obr. 5 predstavuje typick zoskenovan HPTLC platu konvertovan do iernobieleho formtu. Na platu boli nanesen vzorky metanolovho extraktu fermentanej pdy salinomycnu (a) a porovnvacieho roztoku 17-epi-20-deoxysalinomycnu (b). Vo vzorkch vidno vrazn kvrnu salinomycnu (SAL, Rf = 0,26) a dvoch vedajch ltok 17-epi-20-deoxysalinomycnu (S2, Rf = 0,58) a pravdepodobne 20-deoxysalinomycnu (S1, Rf = 0,34). Okrem nich je vo vzorke aj mnostvo menej vraznch kvn neidentifikovanch ltok (S3S7). V analyzovanch vzorkch sa kvantitatvne vyhodnocovala kvrna 17-epi-20-deoxysalinomycnu porovnanm so kvrnou tandardnej ltky o znmej koncentrcii (metda externho tandardu). Linearita stanovenia bola roben nanesenm rznych objemov (17 l) roztoku 17-epi-20-deoxysalinomycnu (0,2 mg.ml1) na jednu platu. Pre zvenie objektvnosti vsledkov bola denzita kadej kvrny nameran trikrt. Kalibran krivka bola zskan nanesenm priemernej hodnoty denzt kvn na os y a nanesenho mnostva analytu (g) na os x, linearita bola vyhodnoten metdou najmench tvorcov. V sledovanom rozsahu 0,21,4 g bol njden linerny vzah medzi denzitou kvn a nanesenm

mnostvom analytu s hodnotou korelanho koeficientu r = 0,994. Presnos stanovenia bola overen na troch platniach, a to esnsobnm nanesenm rovnakho objemu (5 l) tandarnho roztoku 17-epi-20-deoxysalinomycnu (0,2 mg.ml1) na kad platu. Pre zvenie objektvnosti vsledkov bola denzita kadej kvrny nameran trikrt a na alie vpoty sa pouval aritmetick priemer hodnt. Vsledn hodnoty presnosti na jednotlivch platniach vyjadren relatvnou smerodajnou odchlkou (RSD) boli 5,4 %, 7,4 % a 10,0 %. Tieto vsledky s porovnaten s vsledkami publikovanmi Mustoem a McCrossenom5,6. Stanoven presnos predstavuje sumu prspevkov variability rznych experimentlnych faktorov (aplikcia vzorky, vvoj platne, homogenita nanesenia deteknho inidla) ako aj variabilitu denzitometrickho vyhodnotenia. Jednotliv prspevky neboli zvl vyhodnoten.

Zver
Navrhovan podmienky metdy HPTLC umouj dostaton separciu vedajch metabolitov salinomycnu. Pouitie vlastnho vyhodnovacieho programu pri spracovan zoskenovanho obrzku HPTLC platne umouje kvantitatvne stanovenie obsahu 17-epi-20-deoxysalinomycnu. Metda preukazuje v sledovanej oblasti dobr linearitu (r = 0,994) a dostaton presnos (priemern hodnota RSD 7,6 %). Stanovenie sa u niekoko rokov spene vyuva na naom pracovisku a nahradilo drahiu HPLC metdu. Pre vetkch zujemcov je demo verzia programu TLCpix dostupn na internetovej adrese www.biotika.sk v poloke Na stiahnutie pod nzvom TLC demo. LITERATRA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Berdy J., Aszalos A., Bostian M., McNitt K.L.: CRC Handbook of Antibiotic Compounds, dl V. CRC Press, Boca Raton 1980. Commission Directive 96/66/EC of 14 October 1996 amending Council Directive 70/524/EEC concerning additives in feeding stuffs. Valente A. L. P., Augusto F., Lemes A. C., Lukjanenko K.: Anal. Commun. 34, 193 (1997). Mustoe S. P., McCrossen S. D.: Chromatographia 53, 474 (2001). Johnson M. E.: J. Chem. Educ. 77, 368 (2000). Mustoe S. P., McCrossen S. D.: J. Planar Chromatogr. 14, 252 (2001). Stroka J., Peschel T., Tittelbach G., Otterdijk R., Anklam E.: J. Planar Chromatogr. 14, 109 (2001). http://www.biosoft.com/w/quantiscan.htm, stiahnut 16.6.2001.

Obr. 5. Obrzok preskenovanej HPTLC platne s analyzovanm extraktom fermentanej pdy (a) a porovnvacieho roztoku 17-epi-20-deoxysalinomycnu (b), kvrny : SAL salinomycn, S2 17-epi-20-deoxysalinomycn, S1, S3S5 neidentifikovan ltky

8.

991

Chem. Listy 98, 989 992 (2004)

Laboratorn pstroje a postupy

M. Blazsek, O. Itvnfy, and S. Roman (Research and Development Section, Biotika Co., Slovensk upa, Slovak Republic): Application of High-Performance Thin-Layer Chromatography and a Flatbed Scanner for the Quantitation of Cometabolites of Antibiotic Salinomycin

A computer-driven office scanner has been used as a densitometer for the quantitation of analytes after separation by HPTLC. This densitometry is based on measuring the intensity of pixels covering the spots using a homemade program. This methodology has been successfully applied in the HPTLC determination of derivatives of the polyether antibiotic salinomycin in fermentation broths and animal feed preparations.

EURACHEM-R
Technick 5, 166 28 Praha 6 www.eurachem.cz
KVALIMETRIE 8 KVALIMETRIE 9 O. Mestek, M. Suchnek: Zklady metrologie v chemii (1998) Kalibrace chemickch men; referenn materily; metrologick zabezpeen analytick laboratoe Vhodnost analytickch metod pro dan el. Laboratorn pruka pro validaci metod a souvisejc innosti (1999) Oficiln peklad Pokynu EURACHEM The fitness for Purpose of Analytical Methods: A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. Kdy je teba validovat postup; kdo m validovat; jak se validuje; pouvn blank, standard a replikt; pouvn validovanch metod; validan daje pi zen jakosti, dokumentovn postup. Kolektiv autor: Jakost v analytick laboratoi 2000 (2000) Odpovdi manaerm jakosti. Sbornk stejnojmennho semine k zavdn normy SN EN ISO/IEC 17 025. Stanoven nejistoty analytickho men (2001) Oficiln peklad druhho, rozenho a doplnnho vydn Pokynu EURACHEM/ CITAC Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. V eskm jazyce vydn tet. Prvodce jakost v analytick chemii. Pomcka k akreditaci (2003) Oficiln peklad anglickho vydn Pokynu CITAC/EURACHEM Guide to Quality in Analytical Chemistry. An Aid to Accreditation. Kolektiv autor: Odhad nejistot chemickch a mikrobiologickch men (2003) Metodick pruka. Z obsahu: Vyuit daj z validac, zen jakosti a zkouen zpsobilosti k odhadu nejistoty; odhad nejistoty kvalitativnch analz, mikrobiologickch zkouek a vsledk empirickch metod aj. Nvaznost chemickch men. Prvodce k dosaen porovnatelnch vsledk men. Oficiln peklad Pokynu EURACHEM/CITAC Traceability in Chemical Measurement. K. Biovsk, J. Dempr, L. Dohnal, B. Friedeck, J. Kratochvla, J. Kuera, Z. Plzk: Pouvn referennch materil v chemick analze. Metodick pruka. Z obsahu: Vbr vhodnho RM; pouit RM k hodnocen; RM pi penosu hodnot; zachzen s RM; pouit RM v laboratorn medicn; pklady.

KVALIMETRIE 10 KVALIMETRIE 11

KVALIMETRIE 12 KVALIMETRIE 13

KVALIMETRIE 14

Objednvky: e-mailem: koruna@vuv.cz faxem: 224 319 783 potou: EURACHEM-R, c/o ASLAB, Vzkumn stav vodohospodsk T. G. Masaryka, Podbabsk 30, 160 62 Praha 6

992