25 ISOLASI DAN KARAKTERISASI ANTIGEN EKSKRETORI/SEKRETORI STADIUM L3 Ascaridia galli ABSTRAK Penelitian telah dilakukan untuk menyiapkan antigen

ekskretori/sekretori larva (L3) A. galli. L3 diperoleh dari usus halus 100 ekor ayam tujuh hari setelah pemberian dosis 6000 L2 melalui oesofagus ayam. Sebanyak 5 10 ekor L3 dikultur secara in vitro dalam setiap ml medium Rosswell Park Memorial Institute (RPMI 1640), pH 6,8, tanpa merah fenol dalam inkubator pada temperatur 37oC dan 5% CO2 selama 3 hari. Medium ditambahkan 100 units ml-1 penicillin G, 100 g ml-1 streptomycin, 5 g ml-1 gentamycin, and 0.25 g ml-1 kanamycin. Antigen ekskretori/sekretori dipreparasi dari produk metabolisme L3 yang dilepaskan ke dalam medium kultur. Untuk mendapatkan antigen ekskretori/sekretori, medium kultur dipekatkan dengan vivaspin 30.000 MWCO, dan kuantitas protein antigen dihitung dengan metode Bradford. Berat molekul antigen ekskretori/sekretori ditentukan dengan sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE). Hasil menunjukkan bahwa konsentrasi protein antigen ekskretori/sekretori adalah 0,595 mg/ml dengan berat molekul 28 kDa. Ekskretori/sekretori L3 A. galli kemungkinan dapat dikembangkan sebagai antigen untuk memicu respons imun terhadap penyakit parasitik yang disebabkan oleh A. galli. Kata kunci: Ascaridia galli, ekskretori/sekretori, antigen, larva ABSTRACT A study was carried out to prepare excretory/secretory antigen of Ascaridia galli from larval stage. A. galli L3 were recovered from intestines of 100 heads chickens 7 days after oesophagus inoculation with 6000 L2. L3 recovered in this manner were cultured (5 10 ml-1) in flasks containing RPMI 1640 media, pH 6.8, without phenol red and suplemented with 100 units ml-1 penicillin G, 100 g ml-1 streptomycin, 5 g ml-1 gentamycin, and 0.25 g ml-1 kanamycin. Cultures were incubated at 370C in 5% CO2 and culture fluid was collected after 3 days in culture. Excretory/secretory antigen was prepared from metabolic product of L3 released in culture medium. To prepare excretory/secretory antigen, culture medium were concentrated with vivaspin 30.000 MWCO, and antigen protein concentration were counted as described in Bradford method. The molecular weight of excretory/secretory antigen was determined with sodium dodecyl polyacrylamid gel electrophoresis (SDS PAGE). The result showed that antigen protein concentration is 0,595 mg/ml. The molecular weight of excretory/secretory antigen was 28 kDa. Our results suggest the possibility of developing an excretory/secretory antigen to trigger immune responses against parasitic diseases caused by A. galli. Key words: Ascaridia galli, excretory/secretory, antigen, larvae

26 PENDAHULUAN

Cacing nematoda umumnya melepaskan ekskretori/sekretori sebagai produk metabolisme parasit. Peneliti terdahulu melaporkan bahwa

ekskretori/sekretori dilepaskan oleh cacing nematoda seperti Ascaris suum pada babi (Rhoads et al. 1997), Ostertagia ostertagi pada sapi (Cock et al. 1993), Ostertagia circumcincta, Haemonchus contortus dan Trichostrongylus spp. pada ruminansia (Knox dan Jones 1990), dan Onchocerca gipsoni pada sapi (Harnett et al. 1997). Ekskretori/sekretori dapat berperan sebagai molekul antigen pemicu respons imunitas inang definitif (Rhoads et al. 1997). Sumber antigen dapat diperoleh dari cairan tubuh cacing (body fluid) (Yoshihara et al. 1993) atau sel somatik (somatic antigen) (Siles-Lucas dan Cuesta-Bandera 1996), dan produk ekskretori/sekretori (McKeand et al. 1995; Siles-Lucas dan Cuesta-Bandera 1996; Vervelde et al. 2003; Darmawi et al. 2006b) pada setiap stadium kehidupan cacing. Cacing dapat melepaskan ekskretori/sekretori pada kondisi in vivo dan in vitro. Secara in vivo, ekskretori/sekretori dilepaskan selama cacing menjalani proses infeksi dan establish pada inang definitifnya. Secara in vitro, ekskretori/sekretori dilepaskan sebagai akibat metabolisme, dan sebagai upaya cacing untuk mendapatkan nutrisi dari lingkungannya (Cock et al. 1993). Campos et al. (2004) melaporkan bahwa antigen somatic dan ekskretori/sekretori larva L3 Anisakis simplex ditemukan dengan uji EnzymeLinked Immunosorbent Assay (ELISA) 24 jam pascainfeksi di dalam serum tikus yang sudah diinfeksi dengan cacing tersebut. Secara in vitro, antigen dilepaskan selama cacing menjalani kultivasi di dalam medium kultur yang sesuai. McKeand et al. (1995) melaporkan bahwa eksplorasi antigen ekskretori/sekretori Dictyocaulus viviparus (cacing paru pada sapi) dapat dipanen dalam setiap interval waktu 24 selama tiga hari masa kultivasi di dalam medium Rosswell Park Medium Institute (RPMI 1640). Satrija et al. (2004) melaporkan bahwa konsentrasi protein antigen yang dilepaskan oleh cacing pita Raillietina echinobothrida sebelum dipekatkan berkisar antara 0,286 0,361 mg/ml, sedangkan setelah dipekatkan dengan

27 vivaspin mengandung protein antigen 0,691 mg/ml. Yoshihara et al. (1993) membuktikan bahwa dalam setiap ml cairan tubuh cacing A. suum betina dewasa ditemukan 40 mg kandungan protein. Penelitian Timanova et al. (1999) dan Jordanova et al. (2005) pada tubuh A. galli dewasa mengandung poliprotein yang disebut A. galli fatty acid-binding protein (AgFABP), bersifat sebagai allergen yang mengikat asam lemak dan retinoid dengan affinitas yang kuat. Visualisasi antigen ekskretori/sekretori stadium L2 dan stadium dewasa A. galli menunjukkan berat molekul masingmasing protein adalah 35 dan 40 66 kDa (Tiuria et al. 2003). Namun, informasi tentang produk ekskretori/sekretori larva A. galli belum pernah dilaporkan. Ekskretori/sekretori L3 A. galli diduga mengandung protein sebagai bahan antigen. Penelitian ini dirancang untuk menyiapkan antigen dari ekskretori/sekretori larva stadium L3 A. galli. Stadium L3 dipilih menjadi fokus penelitian karena pada stadium tersebut larva A. galli akan mengalami fase histotrofik, dimana larva mengekskresi/sekresikan metabolit untuk menembus barrier pertahanan selaput lendir mukosa saluran cerna. Kajian terhadap ekskretori/sekretori dilakukan karena molekul biologi aktif tersebut berperan sebagai faktor invasif yang memudahkan migrasi larva ke jaringan. Ekskretori/sekretori juga berpotensi sebagai antigen karena dianggap sebagai benda asing oleh inang definitif. Dengan demikian, ekskretori/sekretori berperan untuk memfasilitasi interaksi antara cacing A. galli sebagai parasit dengan ayam petelur sebagai inang definitif. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui karakter antigen ekskretori/sekretori yang dilepaskan oleh L3 A. galli berdasarkan kuantitas protein dan berat molekul antigen.

METODE PENELITIAN

Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Kandang Unggas, dan Laboratorium Imunologi, Departemen Ilmu Penyakit Hewan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Waktu Penelitian berlangsung 6 bulan dari bulan Desember 2005 sampai dengan bulan Mei 2006.

28 Rancangan Penelitian Sebanyak 5 10 ekor L3 dikultur secara in vitro dalam setiap ml medium Rosswell Park Memorial Institute (RPMI 1640). Antigen ekskretori/sekretori dipreparasi dari produk metabolisme L3 yang dilepaskan ke dalam medium kultur. Medium kultur dipekatkan dengan vivaspin 30.000 MWCO (Tiuria et al. 2003), dan kuantitas protein antigen dihitung dengan metode Bradford. Berat molekul antigen ekskretori/sekretori ditentukan dengan sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE).

Preparasi Antigen Ekskretori/Sekretori L3 A. galli Larva A. galli diinkubasi dalam sumur cell culture plate, masing-masing sumur diisi 25 50 larva dalam 5 ml medium Rosswell Park Memorial Institute (RPMI 1640, Sigma-Aldrich), pH 6,8, tanpa merah fenol yang ditambahkan 100 unit ml-1 penisilin G, 100 g ml-1 streptomisin, 5 g ml-1 gentamisin, dan 0,25 g ml-1 kanamisin dalam inkubator CO2 selama 3 hari. Campuran medium dengan ekskretori/sekretori L3 A. galli disentrifus pada 1000 g dengan temperatur 4oC selama 10 menit. Supernatan disaring dengan membran filter 0,45 m Minisart (Sartorius), ditampung ke dalam tabung vivaspin 30.000 MWCO dan disentrifus pada 1000 g dengan temperatur 4oC selama 10 menit. Filtrat dicuci dengan larutan Phosphate Buffered Saline (PBS) dan disentrifus kembali 3 menit. Filtrat diambil dan dijadikan sebagai bahan antigen ekskretori/sekretori L3 A. galli (Hintz et al. 1998).

Kuantitas Protein dari Ekskretori/Sekretori L3 A. galli Sepuluh mg Bovine Serum Albumin (BSA) dilarutkan dengan 10 ml aquadestilata dan dibuat 15 tingkatan konsentrasi sebagai standart. 100 l dari masing-masing tingkatan ditempatkan dalam tabung reaksi steril lainnya dan ditambahkan dengan 5 ml larutan Bradford. Sebagai blanko digunakan 3 tabung reaksi steril masing-masing diisi dengan 100 l aquadestilata dan ditambahkan dengan 5 ml larutan Bradford. Sebanyak 100 l sampel antigen

ekskretori/sekretori L3 A. galli diisi kedalam tabung reaksi steril dan masingmasing ditambahkan dengan 5 ml larutan Bradford. Standart, blanko, dan sampel

29 masing-masing dimasukkan ke tabung kuvet untuk dilihat hasil absorbansinya dengan Spectrophotometer (Siles-Lucas dan Cuesta-Bandera 1996).

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamid Gel Electrophoresis (SDS PAGE) Visualisasi berat molekul antigen dilakukan dengan menggunakan arus listrik tegangan 40 volt dengan kuat arus 12 mA pada suhu kamar selam 2 jam. Pada elektroforesis ini disiapkan dengan poliakrilamid 12,5%, gel pengumpul 4%, buffer elektroda dan buffer sampel. Marker (penenda berat molekul protein) yang digunakan phosphprilase b (97 kD), albumin (66 kD), ovalbumin (45 kD),

carbonic anhydrase (30 kD) Tripsin inhibitor (20,1 kD) dan -lactalbumin (14,4 kD). Sampel dan marker masing-masing dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis (Laemmli 1970). Gel diwarnai dengan Comassie blue R 250 (Serva Germany) selama 30 menit dan dipucatkan dengan larutan pencuci sampai pitapita protein tampak jelas.

Analisis Data Data kuantitas protein ekskretori/sekretori larva A. galli dianalisis berdasarkan persamaan regresi kurva standar Y = ax + b dari pengenceran BSA, dimana Y adalah besarnya absorpsi, a adalah koefisien regresi, x adalah konsentrasi sampel, dan b adalah suatu konstanta.

HASIL PENELITIAN

Preparasi Antigen Ekskretori/sekretori L3 A. galli Setiap tabung vivaspin 30.000 MWCO yang digunakan untuk mengeksplor antigen ekskretori/sekretori larva A. galli mempunyai volume 20 ml dengan kapasitas hole 1,5 ml concentrator. Rata-rata 5 10 ekor larva dikultur dalam setiap ml medium kultur. Total medium yang digunakan untuk kultivasi 76.195 ekor larva adalah sebanyak 7 liter RPMI 1640. Dari 7 liter medium kultur berhasil diperoleh 525 ml antigen metabolit larva A. galli.

30 Kuantitas Protein dari Ekskretori/Sekretori L3 A. galli Nilai absorbansi terhadap protein ekskretori/sekretori larva A. galli adalah 0,32. Berdasarkan persamaan regresi Y = 0,7225X 0,0073 (R2 = 0,99) standar protein, rata-rata kuantitas protein ekskretori/sekretori larva A. galli sebelum pemekatan adalah 0,065 mg/ml dan setelah pemekatan adalah 0,595 mg/ml. Hasil uji kuantitas protein standar terhadap BSA pada UV spektrofotometer dengan panjang gelombang 280 nm (R2 = 0,99) disajikan pada Tabel 2.

Tabel 2. Kuantitas protein ekskretori/sekretori larva A. galli Kuantitas protein (mg/ml) No. sampel 1 2 3 4 5 Rata-rata _____

Sebelum pemekatan Setelah pemekatan__ 0,057 0,048 0,072 0,085 0,063 0,065 0,636 0,685 0,574 0,560 0,520 0,595 ______

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamid Gel Electrophoresis (SDS PAGE) Visualisasi pita protein melalui SDS PAGE setelah pemekatan dengan Vivaspin 30.000 MWCO menunjukkan berat molekul antigen adalah 28 kDa (Gambar 8).
kDa 97 66 45 30 20 14

M S

28

Gambar 8. Berat molekul antigen ekskretori/sekretori L3 A. galli M=marker, S= sampel

31 PEMBAHASAN

Hasil

yang

diperoleh

pada

penelitian

ini

menunjukkan

bahwa

ekskretori/sekretori larva A. galli mengandung protein dengan konsentrasi 0,065 mg/ml dan setelah dipekatkan dengan vivaspin 30.000 MWCO meningkat menjadi 0,595 mg/ml (Tabel 2). Konsentrasi tersebut diperoleh dari kultivasi 4 10 L3 A. galli dalam setiap ml RPMI 1640. Berat molekul protein ekskretori/sekretori larva A. galli adalah 28 kDa (Gambar 8). Penelitian terdahulu membuktikan bahwa konsentrasi protein yang dilepaskan oleh 10 ekor A. galli betina dewasa yang dikultur dalam 20 ml medium RPMI adalah 0,380 mg/ml (Darmawi 2003). Hasil penelitian ini mendukung temuan peneliti terdahulu bahwa sumber antigen dapat diperoleh dari cairan tubuh cacing (body fluid) (Yoshihara et al. 1993) atau dari sel somatik (somatic antigen) (Siles-Lucas dan Cuesta-Bandera 1996), dan dari produk ekskretori/sekretori (McKeand et al. 1995; Siles-Lucas dan Cuesta-Bandera 1996; Vervelde et al. 2003). Antigen cacing nematoda dapat juga diperoleh pada setiap stadium kehidupannya. Tiuria et al. (2002) telah membuktikan bahwa berat molekul antigen ekskretori/sekretori stadium L2 dan cacing dewasa A. galli berturut-turut adalah 35 kDa dan 40 66 kDa sedangkan antigen somatiknya adalah 45 66 kDa. Pada tubuh A. galli dewasa dibuktikan oleh Timanova et al. (1999) dan Jordanova et al. (2005) mengandung poliprotein. Protein yang dikenal sebagai A. galli fatty acid-binding protein (AgFABP) dikaraterisasi melalui deduksi rantai asam amino AgFABP merefleksikan bahwa poliprotein ini bersifat sebagai antigen yang dapat memicu alergi. Alergen mengikat asam lemak dan retinoid dengan affinitas yang kuat. Secara in vitro, ekskretori/sekretori yang dilepaskan cacing nematoda seperti Ostertagia circumcincta dan Onchocerca gipsoni pada sapi (Harnett et al. 1997), Ascaris suum pada babi (Rhoads et al. 2001), Haemonchus contortus pada domba (Vervelde et al. 2005), dan A. galli pada ayam petelur (Darmawi et al. 2006a) dapat berperan sebagai molekul biologik aktif pemicu respons imunitas inang definitif.

32 Antigen cacing nematoda sering berubah-ubah seiring dengan kejadian molting yang dialaminya. Taylor et al (1995) melaporkan bahwa cacing nematoda Onchocerca volvulus yang sering ditemukan pada manusia di Afrika dan Amerika Selatan mempunyai beberapa antigen yang terdapat pada hypodermis dan kutikula. Berat molekul antigen polipeptida mikrofilaria O. volvulus adalah 42 kDa, pada stadium L3 dilaporkan dua jenis antigen protein masing-masing dengan berat molekul 52 dan 65 kDa, sedangkan pada stadium dewasa antigen O. volvulus tidak terdeteksi. Yoshihara et al. (1993) menemukan antigen dengan berat molekul 105 kDa pada cairan tubuh cacing dewasa A. suum. Selama stadium transisi L3 L4 A. suum, cacing yang ditemukan pada babi, melepaskan aminopeptidase dengan berat molekul 293 kDa. Tsuji et al (2001) membuktikan pula bahwa cDNA L3 A. suum yang mengkode protein dengan berat molekul rendah 14 kDa apabila diikat dengan subunit tiksin B kolera dapat berperan sebagai antigen untuk menginduksi imunitas protektif terhadap infeksi A. suum pada mencit. Variasi berat molekul antigen juga ditemukan pada cacing nematoda yang lain. Pada stadium L4, cacing Ostertagia ostertagi melepaskan ekskretori/sekretori dengan berat molekul 66, 70, dan 100 kDa (Cock et al. 1993). Ekskretori/sekretori stadium L1 Trichinella spiralis mempunyai berat molekul 25 55 kDa (Todorova 2000). Hadas dan Stankiewicz (1997) melaporkan bahwa berat molekul proteinase pada L3 dan cacing dewasa H. contortus dan Trichostrongylus colubriformis berkisar antara 35 200 kDa. Todorova (2000) menyatakan bahwa perbedaan berat molekul

ekskretori/sekretori cacing nematoda yang dilepaskan pada masing-masing stadium diperlukan untuk proses biologik parasit. Ekskretori/sekretori cacing terlibat dalam proses penetrasi ke jaringan, nutrisi parasit, anti-koagulasi, dan pengelakan respons imun inang definitif. Rhoads et al. (1997) melaporkan bahwa pelepasan ekskretori/sekretori disebabkan oleh proses perkembangan dan survival parasit seperti penetasan telur, molting, dan exsheatment. Selain itu,

ekskretori/sekretori merangsang respons imunitas dan berpotensi sebagai alergen (Jordanova et al. 2005).

33 KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa stadium L3 A. galli melepaskan ekskretori/sekretori yang mengandung protein 0,065 mg/ml dan setelah pemekatan dengan vivaspin 0,595 mg/ml dengan berat molekul 28 kDa.

SARAN

Dari hasil penelitian ini disarankan agar diteliti lebih lanjut tentang potensi ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli sebagai pemicu respons humoral ayam petelur. Imunoglobulin Yolk (IgY) yang didepositkan ke dalam kuning telur agar dipurifikasi, dan diuji kemungkinan aplikasinya pada imunisasi pasif terhadap ascaridiosis pada ayam petelur.

34