Regulao da Expresso Gnica em Eucariotos

Diferentes tipos celulares estrutura e funo Pensamento inicial: genes seletivamente perdidos quando a clula se diferenciava
Ovelha Dolly
Diferenciao celular

Mudanas na expresso gnica

Diferentes tipos celulares

http://www.pucrs.br/fabio/histologia/atl asvirtual/maxim/57a7leg.htm

Sem alterao na seqncia de DNA

http://psych.umb.edu/cogsci/Site/Cogni tive_Science_Minor.html

Sintetizam e acumulam RNAs e protenas

 Muitos processos comuns em diferentes (genes housekeeping)

clulas

Algumas protenas so abundantes nas clulas especializadas onde atuam, mas no em outras clulas (hemoglobina) Diferena nos tipos de mRNA subestima a variao total de diferenas no padro de produo de protenas modificaes ps-traducionais

 Alterao da expresso gnica em resposta a sinais externos (hormnios glicocorticides) Diferentes tipos celulares respondem de maneiras diversas ao mesmo sinal extracelular

Para a maioria dos genes: controle transcricional + importante (evita sntese desnecessria)

Peter J. Russell, iGenetics: Copyright Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.

Pontos de controle da expresso gnica em eucariotos

Regulao da Expresso Gnica em Eucariotos Transcrio

Promotor
A iniciao da transcrio em eucariotos envolve um grande nmero de fatores (fatores de transcrio - FT) Os FT so necessrios para a iniciao e os principais responsveis pelo reconhecimento do promotor Todos os promotores da RNA pol II tem elementos de seqncia prximos ao ponto de incio
ligao do aparato basal determinao do stio de iniciao

Seqncias mais distantes -- tipos celulares

Genes housekeeping Genes tecido-especficos

 Genes housekeeping: tem elementos de seqncia a montante que so reconhecidos por fatores ubquos Reforadores (enhancers): a vrios Kb distante do promotor
Alvos para regulao tecido-especfica e temporal

A transcrio eucaritica est nas maioria das vezes sob regulao positiva
Tamanho do genoma Mdia de 5 stios regulatrios por gene em organismos multicelulares 30000-35000 genes regulados - ???

O repressores tambm atuam na regulao

Lewin. Genes VIII

Promotor

Promotor

Watson. Molecular biology of the gene

Elementos reguladores

Procariotos x Eucariotos

3 RNApol Estrutura cromatina complexa da

Requerimento de vrios FT Complexidade RNApolII

Griff ths. Introduction to Genetic analysis 9th Ed

Fatores de transcrio

Reconhecem seqncias reguladoras presentes nos promotores e reforadores (enhancers) dos genes Podem ser de dois tipos:

Fatores gerais necessrios para a expresso de todos os genes transcritos pela RNA pol II Fatores especficos responsveis pela expresso de protenas clula-especficas (ativadores, co-ativadores, repressores e corepressores)

Fatores gerais de transcrio

TFIID: TBP + 11 TAFs Diferentes TAFs, algumas so tecido-especficas

TBP se liga cavidade menor do DNA (domnio Cterminal DNA, N-terminal interao com protenas
Ligao de TBP ao DNA inconsistente com a presena de nucleossomos Ligao de TBP ao DNA-- associao ao DNA RNApolII + fatores

RNA pol s se liga aps a ligao dos FT ao promotor

Fatores gerais de transcrio

TATAbox: - Ocorre na maioria dos genes - Principal regio promotora da transcrio - Stio primrio de adeso dos fatores de transcrio + TBP (TATA-Binding Protein)

Fatores de Transcrio (FT) - Se ligam a elementos reguladores nos promotores Modificam a taxa de transcrio No ocorre incio de transcrio na ausncia de protenas acessrias.

RNApolII A ligao de TFIID ao TATA box o primeiro passo da iniciao da transcrio em eucariotos

TFIIA ativa TBP alivia represso por TAFII230

TFIIB promove a superfcie que ser reconhecida pela RNApol TFIIF- helicase TFIIH ATPase, helicase, quinase (fosforilao da CTD da RNApol)
Watson. Molecular biology of the gene

TFIIE e TFIIH movimento da polimerase

Fatores especficos
Elementos de seqncia (curtos): eficincia e especificidade de reconhecimento do promotor. Ex: genes Hsp Vrios elementos de resposta em um gene. Ex: gene metalotioneina
~100pb distantes do ponto de incio ou + distantes (enhancers) Influenciam a freqncia (freqncia de montagem) de iniciao

MRE resposta a metais pesados

TRE resposta a steres de forbol Um nico gene regulado por vrios elementos

Fatores especficos

Reforadores (Enhancers)
Promotores sozinhos eucariticos no funcionam sempre

Reforadores podem ativar o promotor de locais a montante ou a jusante

Podem estar a vrios kb distantes da regio promotora ou localizado dentro do gene

Lewin. Genes VIII

Reforadores (Enhancers)
Podem aumentar a transcrio em centenas ou mais vezes Em leveduras sequence) UAS (upstream activator

Estrutura + cooperativa entre os fatores de ligao: todos os componentes requeridos

Superfcie que se liga ao complexo de coativao (auxilia complexo de pr-iniciao)

Reforadores (Enhancers)
Os reforadores atuam aumentando a concentrao de ativadores nas proximidades do promotor cis e trans-atuantes: reforando a idia da necessidade de proximidade entre promotor e reforador

Lewin. Genes VIII

Proximidade reforador-promotor
Levedura Mediador: complexo de 20 subunidades (coativador)
Peter J. Russell. iGenetics: A molecular Approach 2nd Edition

Isoladores
Os isoladores so capazes de bloquear a passagem de qualquer efeito de ativao ou inativao de reforadores, silenciadores Promovem barreiras heterocromatina contra a propagao da

Dois isoladores podem proteger a regio entre eles de efeitos externos

Lewin. Genes VIII

Watson. Molecular biology of the gene

Regulao do enhancer: isoladores

Ativadores
So FT que reconhecem promotor ou reforador seqncias especficas no Aumentam a eficincia da ligao do aparato basal ao promotor, aumentando assim a freqncia da transcrio Co-ativadores promovem a conexo entre ativador e aparato basal (RNA pol II + fatores basais) Atuao:
Watson. Molecular biology of the gene

Recrutamento da maquinaria de transcrio Recrutamento de modificadores de nucleossomos

Interagem com os fatores basais

Ativador: domnios
Possuem regies separadas independentes para ligao ao DNA e para a ativao (geralmente domnios proticos separados)
Plasmdeo reprter: promotor GAL1 fundido ao gene LacZ de E. coli

Watson. Molecular biology of the gene

Duplo hbrido
Protenas fundidas a diferentes domnios do ativador A interao entre as duas protenas possibilita que o gene reprter seja expresso
Watson. Molecular biology of the gene

Duplo hbrido

Ligao entre protena e DNA

Protenas regulatrias geralmente se ligam a seqncias especficas do DNA.

As protenas regulatrias possuem domnios de ligao ao DNA, que incluem um ou mais motivos estruturais. Os stios de ligao ao DNA para protenas regulatrias so freqentemente seqncias de DNA repetidas e/ou invertidas (palindrmicas), onde mltiplas subunidades (normalmente duas) da protena se ligam.

Motivos de ligao ao DNA em protenas regulatrias

Hlice-volta-hlice (helix-turn-helix)
Em laranja e vermelho

Motivos de ligao ao DNA em protenas regulatrias

Homeodomnio (helix-turn-helix) Homeobox codifica domnio de 60 aa Identificados originalmente no loci hometico de Drosophila Muitas vezes o homeodomnio combinado com outros motivos em FTs de animais A regio C-terminal apresenta homologia com o motivo helix-turn-

helix

Brao N-terminal: contato cavidade menor do DNA

com

Watson. Molecular biology of the gene

Motivos de ligao ao DNA em protenas regulatrias

Homeodomnio (helix-turn-helix) Podem atuar como ativadores ou repressores

Lewin. Genes VIII

Motivos de ligao ao DNA em protenas regulatrias

Dedo de zinco (zinc finger)

Watson. Molecular biology of the gene

Dedo ~23 aa Ligao entre os dedos 7-8 aa

Cys2/Hys2

Lewin. Genes VIII

Motivos de ligao ao DNA em protenas regulatrias

Dedo de zinco (zinc finger)

Lodish. Molecular cell biology

GL1 protena monomrica com 5 dedos de zinco. O dedo1 no interage com o DNA

Lewin. Genes VIII

Motivos de ligao ao DNA em protenas regulatrias

Dedo de zinco (zinc finger)

Comum em protenas eucariticas

Trs dedos de zinco ligados ao DNA

Poucos exemplos em procariotos

Receptores esterides distinta)

de (forma

Motivos de ligao ao DNA em protenas regulatrias

Os receptores de glicocorticides e estrognio tem 2 dedos de zinco (Cys2/Cys2)

Formam dmeros quando se ligam ao DNA

Dedo de zinco ( esquerda) determina a seqncia de DNA que ser reconhecida Dedo de zinco ( direita) controla o espaamento entre os stios alvo reconhecidos por cada subunidade do dmero
Lodish. Molecular cell biology

Lewin. Genes VIII

Receptor de glicocorticide C4

zinc finger

Motivos de ligao ao DNA em protenas regulatrias

Os receptores de glicocorticides e estrognio diferem pela composio de aminocidos no dedo de zinco

GR - TGTTCT MR - TGTTCT AR - TGTTCT ER -TGACCT

Lewin. Genes VIII

Motivos de ligao protenaprotena em protenas regulatrias

Alm de motivos de ligao ao DNA, as protenas regulatrias possuem motivos de ligao a outras protenas

RNA polimerase Outras protenas regulatrias Outras subunidades da mesma protena regulatria

Motivos de ligao protena-protena em protenas regulatrias

Zper de leucina (Leucine zipper)
Um motivo leucine zipper ligado ao DNA. Resduos de Leu so mostrados em vermelho.

Cada hlice parte integrante de uma cadeia polipeptdica, mantidas ligadas pelo motivo leucine zipper na formao do dmero.

Muito encontrado em eucariotos. Pouco encontrado em procariotos.

Motivos de ligao protena-protena em protenas regulatrias

O zper de leucina uma hlice anfiptica que dimeriza
O zper possui uma regio bsica adjacente que se liga ao DNA A dimerizao forma o motivo bZIP (braos que se ligam ao DNA) no qual duas regies bsicas simetricamente ligam repeties invertidas no DNA Ex: Ativador AP1 (formado por protena Jun e Fos) Jun forma homo e heterodmeros Fos s forma heterodmeros
Watson. Molecular biology of the gene

Seqncias alvo: repeties invertidas sem espaamento

Lewin. Genes VIII

Motivos de ligao protenaprotena em protenas regulatrias

Hlice-ala-hlice (helix-loop-helix) Protenas HLH Motivo de 40-50 aa (2 hlices anfipticas de 15-16 aa separadas por uma ala) Formam homo e heterodmeros Um nico par de Leu liga as hlices (vermelho no topo)

Ala permite liberdade para as 2 hlices interagirem independentemente

Motivos de ligao protenaprotena em protenas regulatrias

A maioria das HLH possuem uma regio adjacente ao motivo HLH que altamente bsica Protenas bHLH Dmero com ambas subunidades bHLH podem ser ligar ao DNA

Possibilidade de associao combinatria

Combinaes particulares possuem funo diferente com relao ligao ao DNA e regulao transcricional
Watson. Molecular biology of the gene

Controle combinatrio
Ativadores trabalham sinergicamente para integrar os sinais
Em alguns casos vrios sinais so necessrios para ligar um gene
Peter J. Russell. iGenetics: A molecular Approach 2nd Edition

O controle permite um complexidade

combinatrio aumento na

Dois ativadores podem recrutar um mesmo complexo ou diferentes

Controle combinatrio
A sinergia pode tambm resultar do auxlio mtuo entre ativadores para ligao ao stio de atuao Ligao cooperativa

Watson. Molecular biology of the gene

Controle combinatrio
Genes do tipo acasalante em leveduras

Watson. Molecular biology of the gene

Remodelamento da cromatina
+ comum: alterar a organizao dos nucleossomos Gasto de ATP para o remodelamento

Alguns ativadores podem se ligar ao DNA na superfcie do nucleossomo

Gene ativo: estrutura da cromatina no promotor e na regio prxima

Lewin. Genes VIII

Remodelamento da cromatina

Lewin. Genes VIII

Remodelamento da cromatina
Acetilao das histonas pelas histonas acetiltransferases (HAT)

As HAT podem ser recrutadas pelos ativadores

Complexo de remodelamento da cromatina (SWI/SNF) estimulam a ligao de fatores de transcrio (subunidades com atividade helicase)
Regio N-terminal

Co-ativador Ativador

Co-repressor

Repressor

Lisina

Grupo Acetil (Ac)

Histonas acetiladas: Cromatina ativa

Histonas desacetiladas: Cromatina inativa

Acetilao das histonas

Todo o core de histonas pode ser acetilado Principais alvos: lisinas da cauda N-terminal da H3 e H4 Cromatina acetilada mais sensvel a DNaseI Ativadores conhecidos suem atividade HAT Momentos: Replicao ativao gnica TAFII145: acetilase HAT A: transcrio HAT B: montagem do nucleossomo pose

Remodelamento da cromatina

Peter J. Russell. iGenetics: A molecular Approach 2nd Edition

Histona - acetilase

Complexo de remodelamento da cromatina

Ativao de um promotor
Predominncia de regulao positiva em eucariotos: armazenamento do DNA na cromatina

Silenciamento gnico
Histonas podem ser deacetiladas por histonas deacetilases (HDACs) Deacetilao de histonas est relacionada represso gnica

Ausncia de acetilao de histonas uma das caractersticas de heterocromatina

Peter J. Russell. iGenetics: A molecular Approach 2nd Edition

HDAC

Metilao do DNA e histonas

A metilao do DNA e histonas est relacionada cromatina inativa Locais para metilao de histonas: 2 lisinas na cauda da H3 e uma arginina na cauda da H4 A maioria dos stios de metilao do DNA: ilhas CpG CpG em heterocromatina: metiladas Conexo entre metilao de DNA e histonas: algumas HMT contm stios para ligao a CpG metilado (o contrrio observado em leveduras). De-acetilao -- metilao

Peter J. Russell. iGenetics: A molecular Approach 2nd Edition

Watson. Molecular biology of the gene

Metilao do DNA

Peter J. Russell. iGenetics: A molecular Approach 2nd Edition

Efeito da Metilao do DNA

Watson. Molecular biology of the gene

Metilao do DNA

Peter J. Russell. iGenetics: A molecular Approach 2nd Edition

Insulin-like growth factor 2

Metilao do DNA e imprinting

Sasaki et al., 2000. JB Review

Metilao do DNA e imprinting

Inativao do cromossomo X
Xic (X-inactivation center): regio de ~450 kb Xic contm o gene Xist, expresso no cromosso X inativo
X inativo: sem acetilao, metilao da seqncias CpG Metilao do promotor Xist no X ativo

Repressores
a menos comum em eucariotos

Watson. Molecular biology of the gene

Repressores
Ativador Superfcie de ativao Repressor

TATA

Stio de ligao do repressor Stio de ligao do ativador

TATA

Stio de ligao do ativador

Stio de ligao do repressor Stio de ligao do ativador Stio de ligao do repressor

TFIID
Alberts

TATA

Repressores

Represso do gene GAL1 na presena de glicose

Watson. Molecular biology of the gene

Mig1 recruta complexo repressor Tup1 que recruta a deacetilase E tambm inibe a maquinaria de transcrio

Peter J. Russell. iGenetics: A molecular Approach 2nd Edition

Regulao da utilizao de galactose em levedura

Peter J. Russell. iGenetics: A molecular Approach 2nd Edition

Ao do hormnios peptdicos e hormnios esterides

Modelo para a ao de hormnios esterides

Lewin. Genes VIII

Peter J. Russell. iGenetics: A molecular Approach 2nd Edition

Modelo para a ao de glicocorticide em clulas de mamferos

Peter J. Russell. iGenetics: A molecular Approach 2nd Edition

Regulador com atividade localizao nuclear

controlada

por

Silenciamento gnico mediado por RNA de interferncia

Dicer siRNA

Dicer = endonuclease ~ a RNAaseIII stRNA = small temporal RNA

Silenciamento gnico mediado por RNA de interferncia

O mecanismo de RNAi em plantas: defesa contra vrus Pode controlar a atividade de transposons Micro RNAs (miRNAs) podem inativar genes do mesmo modo que o siRNA Mecanismo prtico e eficiente para silenciamento gnico siRNAs 21-23 nt: 2 bases na ext. 3so no pareadas

RNA-induced silencing complex (RISC)

Barbosa e Lin. Arq Bras Endocrinol Metab vol 48 n 5 Outubro 2004

Watson. Molecular biology of the gene

Splicing alternativo

Gene Sex-lethal em moscas (s nas fmeas) Sexo determinado pela relao entre cromossomos sexuais e autossomos

Splicing alternativo
Gene Sex-lethal em moscas (s nas fmeas) Sxl auto-regulao samento) (proces-

Watson. Molecular biology of the gene

Vrios mRNA eucariticos esto sujeitos a represso traducional

Controle traducional
Gcn4 ativador transcricional protenas da biossntese de aminocidos

Watson. Molecular biology of the gene