ENZIMAS y CINTICA ENZIMTICA

Cintica experimental

Al derivar las ecuaciones clsicas utilizadas en el estudio experimental de la cintica enzimtica se supone que la concentracin de la enzima es muy pequea comparada con la concentracin del sustrato Esto es generalmente vlido, debido a la gran eficiencia de las enzimas Si se miden las velocidades iniciales, la cantidad de productos formados es despreciable y la disminucin de la concentracin del sustrato es tambin despreciable y la velocidad de la reaccin es directamente proporcional a la concentracin

Reacciones con un sustrato Mecanismo de Michaelis Menten

Las enzimas que catalizan reacciones con un sustrato son: hidrolasas, isomerasas y la mayora de las liasas En un primer paso el sustrato se une a un sitio especfico de la enzima, llamado sitio activo, formando el complejo enzima- sustrato de acuerdo al siguiente mecanismo

E + S ES E + P Que se denomina mecanismo de MichaelisMenten

La unin del sustrato a la enzima se realiza por fuerzas de tipo fsico: fuerzas de Van der

Ecuacin de Michaelis Menten

Como la formacin del complejo se produce por interacciones de tipo fsico puede suponerse que se llega rpidamente al equilibrio y se define una constante de disociacin KS, como
@hotmail.com Ks= [E] [S] / [ES] ) Utilizando la aproximacin del equilibrio rpido Michaelis y Menten en 1913, llegaron a establecer la ecuacin

v = Vm [S] / Ks + [S] Vm es la velocidad de la reaccin cuando toda la enzima est unida al sustrato ( est saturada

Planteamiento de Briggs-Haldane
El mtodo del equilibrio rpido supone que la reaccin de formacin del producto es mucho ms lenta que el proceso de formacin del complejo, sin embargo esto no siempre se cumple Briggs y Haldane propusieron otra deduccin basada en el estado estacionario, obteniendo una ecuacin: v = Vm [S] / ( k-1+k2/k1) + [S] Donde k-1+ k2/k1 = Km Actualmente la ecuacin de Michaelis Menten se escribe V = Vm [S] / Km + [S]

Representacin grfica de la Ecuacin de Michaelis Menten

Las ecuaciones deducidas por MM y BH corresponden a una hiprbole, Ks en la deduccin de MM, es sustituida por Km, en la BH Se pueden obtener ecuaciones hiperblicas similares si se consideran varias reacciones en la etapa de formacin del producto, solo que Km ser la combinacin de ms constantes cinticas La ecuacin de Michaelis Menten responde a la cintica de muchsimas enzimas. Se dice entonces que tienen una cintica michaeliana

Cintica michaeliana

Parmetros de la ecuacin de MM

Km es la concentracin de sustrato que corresponde la mitad de la velocidad mxima Su valor depende del sistema en estudio ( naturaleza de la enzima y el sustrato ), pH y fuerza inica Es una medida de la concentracin de sustrato necesaria para lograr una catlisis eficaz Se la relaciona con la afinidad de la enzima por un sustrato dado. A mayor Km menor afinidad de la enzima por el sustrato y viceversa, sin embargo esto ser estrictamente vlido si Km = Ks ,o sea si se cumple el equilibrio rpido

La velocidad de la reaccin se puede considerar proporcional a la concentracin del complejo ES y v = kcat [ES] Cuando toda la enzima est unida al sustrato se alcanza la velocidad mxima de la reaccin Vm, entonces [ES] = Eo y Vm= kcat [Eo] kcat es una medida directa de la produccin cataltica del producto en condiciones ptimas ( enzimas saturadas) Se puede considerar como el nmero de molculas de sustrato transformadas por una molcula de enzima en la unidad de tiempo

Especificidad de la enzima
Los valores de Km y Vm(para calcular kcat) son importantes para -determinar la especificidad de una enzima respecto a cierto sustrato - decidir entre un mecanismo rpido y el estado estacionario - conocer el rol de la enzima en el metabolismo Para una enzima que puede trabajar con dos sustratos, como [ES] = [E][S]/Km v = kcat/Km [E][S]tendremos v1/v2 =(kcat/Km)1[E][S]1 / (kcat/Km)2 [E][S]2 y v1/v2 = (kcat/Km)1 / (kcat/Km)2 a concentraciones iguales de sustrato La relacin kcat/Km puede considerarse como una medida de la especificidad de la enzima por un sustrato

Clculo de Km, kcat y Vm

Km y Vm se pueden calcular a partir de las transformaciones lineales de la ecuacin de MM La determinacin de Vm, y a partir de all la de Km, utilizando la grfica hiperblica no da resultados correctos ya que el valor de Vm se tendra solo a concentracin muy grandes Para dicho clculo se pueden emplear grficos obtenidos por linealizacin de la ec de MM A partir de Vm y la concentracin empleada de la enzima, se obtiene el valor de kcat = Vm/ [Eo]

Representaciones lineales

Se han propuesto varias transformaciones de la ec. De MM que conducen a funciones lineales, las ms utilizadas son: Representacin de dobles recprocos o de Lineweaver-Burk Representacin de Eadie- Hoftee Representacin de Hanes Woolf Representacin directa de Eisenthal- Cornish Bowden

Representacin de Lineweaver- Burk

ambos trminos en la ec de MM

Se obtiene la ecuacin al tomar la inversa de 1/V = 1/Vm + Km/Vm . 1/[S]

Al representar 1/V frente a 1/ [S], se obtendr una recta, si la cintica es michaeliana, La intercepcin con el eje de abcisas es 1/Vm y con el eje de ordenads es -1/Km Este tipo de representacin es a menudo empleada al estudiar los tipos de inhibicin

La intercepcin de la recta con el eje de ordenadas es 1/Vm y la intercepcin con el eje de abcisas es 1/Km

Representacin de Eadie Hoftee

Multiplicando v por Km + [S] y luego dividiendo el resultado por [S] se llega a la expresin V = Vm Km V/[S] Ec de Eadie-Hoftee Esta ecuacin tiene una sola recproca y los puntos salen igualmente espaciados La ordenada es Vm La pendiente es - Km

Representacin de Eadie-Hoftee

Representacin de Hanes Woolf

Otra representacin a menudo empleada es la de Hanes-Woolf, la ecuacin correspondiente se obtiene multiplicando por[S] la ec de dobles recprocas y ordenando [S]/V = Km /Vm + 1/Vm . [S] Se debe graficar [S]/V en ordenadas y [S] en abcisas La ordenada en el origen es Km/Vm y la pendiente es 1/Vm La intercepcin de la recta con el eje de ordenadas es igual a - Km

Representacin directa

Cornish-Bowden y Eisenthal han propuesto otra forma de representar los datos cinticos Se consideran Km y Vm como variables, x e y Se grafican directamente los valores de v y [S] Los distintos pares de valores de v y S, se unen para dar distintas rectas Las varias rectas trazadas se deben cruzae en un punto cuyas coordenadas son Km y V En realidad , se promedian los valores ya que no todas las rectas se cruzan en el mismo punto

Representacin directa

La ecuacin de Michaelis Menten puede ser reordenada como Vm = V + V/ [S]. Km, donde Vm se toma como la variable y Km como la variable x, as la ordenada en el origen es V y -[S] es el valor de abcisas El punto de intercepcin de las diversas rectas que se pueden obtener con distintos valores de v y [S]tiene como coordenadas Km (x) y Vm (y)

Inhibicin enzimtica

La velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas puede disminuir o anularse en presencia de ciertas sustancias denominadas inhibidores El estudio de la inhibicion es importante desde muchos puntos de vista Muchos frmacos actan como inhibidores, el empleo de ciertos inhibidores ha permitido obtener informacin sobre el sitio activo de la enzima. Se emplean inhibidores como herbicidas

Tipos de inhibicin

Se distinguen: Inhibicin reversible- La unin del Inhibidor y la enzima es un proceso reversible que est regulado por constantes de equilibrio. La enzima puede inhibirse en mayor o menor grado Inhibicin irreversible: una vez que el inhibidor se uni a la enzima ya no se separa, y la enzima queda inutilizada , se vuelve inactiva

Tipos de inhibicin reversible

Se distinguen cuatro formas de inhibicin reversible - Inhibicin competitiva -Inhibicin acompetitiva -Inhibicin mixta -Inhibicin no competitiva. Esta ltima es solo un caso especial de la inhibicin mixta Corresponden a la inhibicin lineal o simple

Inhibicin lineal e hiperblica

En la inhibicin reversible el inhibidor forma un complejo dinmico con la enzima que posee propiedades catalticas diferentes a las de la enzima libre Si la enzima unida al inhibidor, pierde completamente su actividad cataltica cuando est saturada, se tiene la inhibicin completa o lineal( llamada as porque Km/Vm y 1/ Vm dependen linealmente de la concentracin del inhibidor) Si el complejo enzima-inhibidor, en condiciones de saturacin mantiene algo de actividad se denomina inhibicin

Inhibicin competitiva

La Enzima puede unirse al sustrato o al inhibidor pero no a ambos simultneamente

Un inhibidor competitivo es una sustancia que al combinarse con la enzima impide que sta se una al sustrato En muchos casos un inhibidor competitivo tiene una estructura anloga a la del sustrato,ocupando el sitio activo, por ejemplo la sulfanilamida se asemejan al cido paraaminobenzoico e inhibe a la enzima que participa en la sntesis del cido benzoico,vital para las bacterias

El inhibidor competitivo puede ser un anlogo o derivado del sustrato no metabolizable, un sutrato alternativo o un producto de la reaccin Se han estudiado casos de inhibicin competitiva en que el inhibidor se une a la enzima en un lugar diferente al sitio activo, pero produce un cambio en la conformacin del mismo e impide que el sustrato se una a la enzima El aumento de sustrato produce una competencia con el inhibidor por la enzima y para cierta concentracin de sustrato se puede llegar a la misma velocidad mxima

Esquema de una inhibicin competitiva

Ks E + S ES E + P + I EI A partir de este esquema se deduce la ec. V= Vm [S] / (Km + KEI [I]/) + S KEI = [I] [E]/ [EI]

KEI

KEI o KI es la constante de disociacin del inhibidor Km + [I]/Ki = Km aparente que es el valor obtenido experimentalmente

La representacin recproca es 1/V = 1/ Vm + Km(1+[I]/Ki / Vm . 1/ [S] La grafica de LB muestra una familia de rectas que interceptan en el eje de ordenadas. La intercepcin muestra que Vm tiene el mismo valor sin ihnibidor o con distintas cantidades de inhibidor, sin embargo se necesita una cantidad mayor de sustrato para obtener la misma velocidad mxima Km aparente por otro lado disminuye a medida que aumenta la concentracin de inhibidor Es muy comn en muchas reacciones con un sustrato:

Inhibicin no competitiva

El inhibidor y el sustrato se unen reversiblemente a la enzima pero en sitios diferentes. Se pueden formar 3 tipos de complejos ES, EI y ESI E + S + (ES) I ES Ks + I KESI ESI KESI E+P k2 Ks = (E) (S)/ KEI = (E)(I) / (EI) KESI = (EI) (S) /

KEI (EIS) EI + S

Se definen Ks = [E] [S]/[ES] = [EI] [S]/ ESI Ki = [E] [I]/ [EI] = [ES][I]/[ESI] Parte de la enzima est unida al inhibidor y al inhibidor y sustrato como EI y EIS, por tanto aunque se aade ms sustrato parte del complejo formado ES se une a I, y es inactivo por lo tanto la velocidad mxima disminuye y la disminucin es proporcional a la [I] Este tipo de inhibicin es rara en reacciones con un sustrato, en cambio se han observado muchos casos en reacciones multisustrato

La ecuacin correspondiente es_ Vm / (1+ [I]/Ki) . [S] V= --------------------------------Km + [S] La velocidad mxima disminuye y la Km permanece inalterada Las rectas que corresponden a distintas concentraciones de inhibidor ,se interceptan en el eje de abcisas en un punto

Inhibicin acompetitiva

Un inhibidor acompetitivo se une al complejo ES, formando un complejo ternario ESI inactivo La inhibicin acompetitiva pura es rara en sistemas de un sustrato, se observa generalmente en reacciones con 2 sustratos E + S ES E + P + I ESI

De acuerdo al esquema anterior se deduce la ecuacin Vmax/ (1+ [I]/Ki) V = ----------------------------Km/ (1+ [I]/Ki) + [S] Las grficas de dobles recprocas obtenidas sin inhibidor o en presencia de distintas concentraciones del inhibidor son rectas paralelas entre si, debido a que Vm y Km disminuyen a medida que [I] aumenta Se han observado ocos casos en reacciones con un sustrato ( inhibicin de fosfatasa alcalina de ratn con Lfenil alanina) , pero varios ejemplos en reacciones con mas de un

Gafica para la inhibicin acompetitiva

Inhibicin mixta
Se forman tanto complejos binarios ES y EI como ternario ESI Las constantes de disociacin de los complejos ternarios y binarios correspondientes al sustrato o al inhibidor son diferentes Se pueden relacionar Ki con K para la descomposicin del complejo ternario formado en ES e I, o Ks con K para la disociacin del complejo EIS en EI yS K = Ki o K = Ks

Esquema
Ks kp E + S ES E + P + + I I Ki Ki EI + S ESI Ks

La ecuacin correspondiente a la inhibicin mixta clsica es

Vmax /( 1 +[I]/Ki ) [S]

V = ------------------------------------------Ks (1 + [I]/Ki) + (1 +[I] / Ki) [S]

Las lneas que se obtienen con distintas concentraciones de inhibidor se interceptan en un punto que puede estar por encima o por debajo del eje de abcisas El valor de la abcisas que corresponde al punto de intercepcin de las rectas es - 1/ Ki La intercepcin de la lnea que corresponde a cierta concentracin del inhibidor con el eje de abcisas es - 1+[I]/Ki / 1 +[I] /Ki

Grficas obtenidas en la inhibicin mixta a distintas concentraciones del inhibidor

Diferencias entre los distintos tipos de inhibicin lineal reversible

Los distintos tipos de inhibicin lineal reversible se distinguen desde el punto de vista cintico por las diferencias entre los valores de Km y Km ap ( en presencia del inhibidor), y entre Vmax y Vmax aparente (con inhibidor), es decir por el efecto del inhibidor sobre los parmetros cinticos, antes que por el tipo de unin, dificil de determinar
Vmax Km aumenta aumenta disminuye disminuye no vara no vara aumenta aumenta

Inhibicin competitiva Inhibicin competitiva Inhibici acompetitiva Inhibici acompetitiva Inhibicin no competiva Inhibicin no competiva Inhibicin mixta Inhibicin mixta

no vara no vara disminuye disminuye disminuye disminuye disminuye disminuye

Resumen
Los casos limitantes de inhibicin lineal son: inhibicin competitiva(especfica) y acompetitiva(cataltica). En aquellos casos en donde el tipo de inhibicin no cae en ninguno de los modelos anteriores, se habla de inhibicin mixta La inhibicin pura no competitiva es un caso de inhibicin mixta donde Kei = Kesi La IUBMB recomienda considerar los distintos tipos de inhibicin basndose en los efectos sobre Vm/Km y Vm

Si Vm/Km disminuye, se dice que hay un componente competitivo Si el inhibidor no tiene efecto sobre Vm la inhibicin es competitiva Si hay el valor aparente de Vm disminuye hay un componente acompetitivo Si el inhibidor no tiene ningn efecto sobre Vm/Km la inhibicin es competitiva Si ambos componentes competitivo y acompetitivo estn presentes la inhibicin es mixta

Inhibicin irreversible
En algunos casos el inhibidor queda fuertemente unido a la enzima por enlaces covalente En este caso la queda inutilizada y pierde en forma permanente su actividad cataltica Ejemplos de este tipo de inhibicin se observa en el efecto txico de metales que forman compuestos covalentes con las enzimas

Otros casos de inhbicin

Inhibidores pseudo irreversibles o fuertemente unidos Inhibidores suicidas Inhibicin por producto Inhibicin por sustrato Inhibicin feedback

Enzimas con mltiples sitios catalticos

Muchas enzimas estn constituidas por mltiples cadenas formando oligmeros de 2, cuatro, seis u ocho monmeros. Cada uno de estos monmeros puede tener un sitio activo al que se une el sustrato Estas enzimas pueden desempear un papel muy importante en el metabolismo

Se distinguen dos grupos_: - Todos los sitios son idnticos e independientes unos de otros : no presentan cooperatividad Si la presencia de una sustrato en un sitio, influye en la ocupacin de los otros sitios activos, se dice que existe cooperatividad

Enzimas con sitios no cooperativos

Considerando un dmero se pueden formar dos complejos binarios ES y SE, y ESE, ternario,todos con las mismas constantes de disociacin Ks y la misma constante cataltica E + S ES E + P + S E+ P + S ES + P

SE + S ESE SE + P

La velocidad depender de la concentracin de todos los complejos formados V = k(ES) + k(SE) +2 k (ESE) Reemplazando y simplificando se tiene V/ Vmax = S/Ks (1+ S/Ks) / (1 + S/Ks) 2 y simplificando y reordenando, se tendr V/ Vmax = S/ Ks + S ec idntica a la de MM Este tipo de enzimas darn cintica michaeliana y por lo tanto por experiencias cinticas no se pueden diferenciar de las enzimas con un sito activo

Ecuacin para un sistema multisustratos no cooperativo

Si se tiene un trmero la ecuacin que se obtiene es V/Vmax = S/Ks (1+ S/Ks)3 / (1 + S/Ks)4 Y simplificando y ordenando tambin se tendr la ecuacin de MM

Aspartato carbamoiltransferasa, activada por ATP e inhibida por CTP

Enzimas que presentan cooperatividad

S i la unin del sustrato a un sitio activo produce cambios estructurales o electrnicos en la enzima que alteran la afinidad de la enzima al siguiente sustrato que se une se presenta cooperatividad Las enzimas de este tipo no siguen la cintica michaeliana y se llaman enzimas alostricas ( otro sitio), generalmente las curvas tienen forma sigmoidea y la cintica se denomina sigmoidal

Enzimas alostricas
Generalmente la unin de la primera molcula de sustrato favorece la unin de la segunda molcula y sta de la siguiente y as sucesivamente. Se dice que hay cooperatividad positiva En algunos casos muy raros la unin de un sustrato defavorece la unin del siguiente, tenindose entonces cooperatividad negativa Cuando la unin del sustrato es la que produce cambios en el comportamiento de la enzima se habla de respuesta homotrpica

Activadores e inhibidores de las enzimas alostricas

Este grupo de enzimas es tambin sensible a la unin de otras molculas distintas del sustrato llamadas efectores o moduladores que producen alteraciones en el comportamiento de la enzimas respecto al sustrato, produciendo un aumento de la actividad ( efectores positivos o activadores) o una disminucin de la actividad (efectores negativos o inhibidores). En este caso se habla de efectos heterotrpicos.

Diferencia entre la cintica michaeliana y la cintica sigmoidal

Papel regulador de las enzimas alostricas

Las enzimas alostricas tienen las siguientes caractersticas

a)Presentan gran sensibilidad a las variaciones de concentracin del sustrato, pueden pasar de una actividad muy baja a concentraciones pequeas a gran actividad con concentraciones mayores.
En una enzima de cintica michaeliana para aumentar la velocidad de 10 % Vm a 90 % Vm , la concentracin debe aumentar 81 veces, y en una enzima alostrica, mucho menos, para 2 sitios activos es necesario que aumente solo 9 veces

b) pueden ser reguladas por otras molculas (efectores) que modifican la actividad de la enzima segn las necesidades metablicas

Tratamiento de las enzimas alostricas

Para estudiar las enzimas alostricas se pueden emplear varios mtodos - la ecuacin de Hill - la ecuacin de Adair - ecuaciones derivadas del modelo de MonodWyman-Changeaux (MWCh) - ecuaciones derivadas del modelo de KoshlanNemethy-Filmer (KNF)

Considerando una enzima alostrica con 2 sitios activos se puede llegar a la ecuacin

V/Vmax= S/Ks + S2/ a Ks 2 /1 + 2S/Ks + S2 /aKs Para una enzima con 4 sitios de unin se tendra S/Ks + 3S2/aKs2 + 3 S3/a2bKs3 + S4/a3b2cKs4 v/Vmax=--------------------------------------------------------------------1+4 S/Ks + 6S2/aKs2 + 4 S3/a2bKs3 + S4/a3b2cKs4
a, b, c etc. son los llamados factores de interrelaccin que relacionan las constantes para los distintos complejos que se pueden formar con Ks O sea son los coeficientes por los cuales se multiplican las constantes intrnsecas de los distintos complejos para dar la constante de la disociacin de ese complejo; si son valores pequeos la cooperatividad es fuerte y predominan las formas E y ES4

Ecuacin de Hill
La ecuacin de Hill se puede escribir a partir de la funcin de saturacin Y Y = (S) h / K + (S) Esta ecuacin corresponde a un sistema que presenta gran cooperatividad, es decir si el S se une a la protena inmediatamente se unirn los siguientes y el equilibrio se puede considerar entre E y Esn y K= (E) (S) n/(ES) O tambin expresando en funcin a la velocidad

Si la cooperatividad es muy fuerte y los coeficientes de interaccin son muy pequeos la ecuacin queda reducida a v/Vmax = [S] h / K' + [S]h Ecuacin de Hill Donde K = a3 b2c Ks4 para un tretrmero, es decir es una constante que relaciona la Ks con los factores de interaccin h es un coeficiente que se determina experimentalmente,que no tiene un significado fsico, es>1 si hay cooperatividad positiva y<1 si la cooperatividad es

La ecuacin de Hill se puede linealizar , escribiendola en la forma V / Vmax v = [S]h /K Llevando a logaritmos Log v/ Vmax-v = hlog [S] - log K La pendiente es el valor de h, coeficiente de Hill cuyo valor est relacionado con el nmero de sitios de unin

Ecuacin de Adair
Adair propuso una descripcin ms real de la unin de un ligando a una protena, para un tetrmero consider 4 equilibrios y cuatro constantes de disociacin. Considerando una Enzima con 4 sitios de unin E'+ S = ES K1 = (ES)/(E)(S) ES + S = ES2 K2 = (ES2) / (ES) (S) ES2 + S = ES3 K3 = (ES3) /(ES2)(S) ES3 + S = ES4 K4= (ES4)/ (ES3) (S) K1,K2,K3, y K4 son las macroscpicas de disociacin, que pueden relacionarse con las constantes microscpicas o intrnsecas

Fraccin de saturacin
La fraccin de saturacin de sitios activos puede expresarse en funcin de la concentracin del ligando libre,(S) y, en el caso de una enzima con 4 sitios activos, se llega a (S)/K1+2(S)2/K1K2+ 3(S)3/K1K2K3+4(S)4/K1K2K3K4 Y= ---------------------------------------------------------------------4[1+(S)/K1+(S)2/K1K2+(S)3/K1K2K3+ (S)4/K1K2K3K4] La relacin entre las constantes de disociacin y las constantes intrnsecas K'1K'2K'3 y K'4 son: K1 =1/4K K2= 2/3K'2 K3 = 3/2 K'3 K4= 4K'4

Las constantes macroscpicas Ki se refieren a la disociacin de un complejo ESi sin tener en cuenta la posicin del sustrato S + ESi ES i+1 Las constantes intrnsecas o microscpicas se refieren a la disociacin de un complejo definido es decir teniendo en cuenta la posicin del Por ejemplo si consideramos la concentracin de todos los compejos que tienen 2 molculas de sustrato[ ES2] y la concentracin de cada uno de los posibles complejos con distinta posicin de los 2 sustratos [ ES2] total = 6[ ES2] para cada posicin

Constantes macroscpicas y microscpicas

Relaciones entre K y K'

En un tetrmero
K1 = K'1
4

K2 = 2/3 K2

K3 = 3/2K'3 y

K4 = 4K'

Y as la ecuacin anterior,considerando una enzima, se transforma en:

v/Vm= S/K'1 + 3S2/K'1K'2+ 3S3/K'1K'2K'3+S4/K'1K'2K'3K'4 1 + 4S/K'1+6S2/K'1K'2+4S3/K'1K'2K'3+S4/K'1K'2K'3K'4 Donde Vm = 4 kcat. Cuando la cooperatividad es muy alta el termino de S4/ es mucho mayor que los otros y la ecuacin puede simplificarse a v/Vm = S4 / K' + S4 ecuacin de Hill

Factores o coeficientes de interaccin.

En muchos casos la ecuacin anterior se expresa en funcin a los factores de interaccin a,b,c etc, siendo a= K'2/K' b = K'3/K'2 K'3=abK'1 c= K'4/cK'3 K'4= abcK'1 y la ecuacin anterior queda
S/Ks + 3S2/aKs2 + 3 S3/a2bKs3 + S4/a3b2cKs4 v/Vmax=--------------------------------------------------------------------1+4 S/Ks + 6S2/aKs2 + 4 S3/a2bKs3 + S4/a3b2cKs4

Modelo de Monod-Wyman-Changeaux (modelo concertado)

Se propuso este modelo para explicar el comportamiento de las enzimas alostricas En el oligmero hay al menos un eje de simetra La conformacin de una unidad depende de la interaccin con otra unidad El oligmero puede existir en 2 estados conformacionales R (relajado) y T (tenso), que presentan distinta afinidad para un ligando Ambas formas existen en un equilibrio R / T El sustrato se une a la forma R del protmero La forma R es catalticamente activa y la forma T inactiva

Los efectores o moduladores se unen preferentemente a una de las formas T o R, por ej, si un efector se une a la forma T el equilibrio se desplaza de R hacia T, disminuye la cantidad de R y se forma menos ER Si el efector (activador) se une a la forma R, el equilibrio se desplaza de T a R y aumen ta la posibilidad de formrse ms complejos ES

Los valores de KR KT y L son los mismos para todos los complejos que se pueden formar ESn

Ecuaciones
Se suelen evaluar dos cantidades Y y R
La fraccin de saturacin es:
Lc(1+c)n-1 + (1+) nY = --------------------------------L (1+c)n + (1+)n (1 + ) n R = --------------------------L(1+c) n + ( 1+ ) n La cooperatividad es mayor cuanto mayor es L y menor es c =[S] libre / KR

Enzimas K y V
De acuerdo a este modelo la cooperatividad en la unin de ligandos se debe a que la proteina esta preferentemente en uno de los estados (por ej T) y el ligando se une a la forma R, al unirse y formar RS el equilibrio se desplaza de T a R, Al aplicar el modelo a las enzimas es ms conveniente utilizar Vmax y Km Las dos formas de la enzima tendrn distintas afinidades por las formas R y T (Enzimas K)o distinta actividad cataltica (Enzimas V)

Efectores o moduladores de la teora MW-Ch

Los efectores o moduladores de las enzimas alostricas actan sobre el equilibrio RT En las enzimas K,la unin del efector modifica la afinidad de la enzima por el sustrato variando Km Ej aspartato cabamoiltransferasa activada por ATP e inhibida por CTP En las enzimas V , el sustrato tiene la misma afinidad por las dos formas sin embargo ambas difieren en su actividad cataltica, el efector desplaza el equilibrio RT , variando Vm Ej. fosforilasa b, activada por AMP

Modelo de Koshland-Nemethy-Filmer
En ausencia de ligandos la enzima est en una forma conformacional determinada Al unirse un sustrato experimenta un cambio Los cambios conformacionales son secuenciales, las formas van cambiando a medida que los ligandos se van uniendo Las interacciones entre las distintas subunidades pueden ser positivas o negativas La expresin para la fraccin de saturacin se puede obtener a partir de los equilibrios entre las distintas formas, y sus constantes de disociacin

Esquema para un tetrmero

Cada constante de disociacin se considera que tiene 3 componentes - Una constante de disociacin para la unin de la subunidad ms favorecida - una constante de equilibrio para el cambio de conformacion - constantes de interaccin que depende del grado de estabilidad de los complejos entre las subunidades en relacin a la estabilidad del complejo solo Las ecuaciones derivadas son ms complejas que las correspondientes al modelo MWCh

Comparacin de ambos modelos

Ambos modelos el concertado de MWCh y el secuencial de KNF puede ser considerados como los extremos de un modelo ms general que considera todas las conformaciones posibles y de estados de unin al ligando protena unida al ligando Este modelo da lugar a ecuaciones extraordinariamente complejas

En algunos casos la enzima se comporta de acuerdo a uno de los dos modelos y en otros no Se pueden establecer 3 diferencias entre ambos modelos -el modelo concertado no explica la cooperatividad negativa -La observacin de cambios conformacionales se pueden monitorear en algunos casos y determinar R e Y la grfica de R vs Y es lineal en el modelo secuencial y curva en el concertado

Las interacciones alostricas permiten un alto grado de regularizacin del metabolismo

Mtodos para estudiar enzimas reguladoras

Tipo de informacin mtodo de estudio
Se realizan estudios de actividad Se observan las grficas si hay o no linealidad Se emplean mtodos como equilibrio de dilisis, de ultracentrifugacin Prueba sobre efectos de los El nmero de subunidades puede Determinarse por M, simetra, y otros

En los estudios cinticos se observa cooperaatividad Se observa cooperatividad en los estudios de ligando? Las molculas reguladoras Consiste la enzima en varias subunidades?

se unen a sitios diferentes alS? Moduladores en las curvas cinticas

Mecanismos de enzimas con dos sustratos

Enzimas que actan en reacciones con dos sustratos diferentes

Muchas enzimas trabajan con dos sustratos diferentes, las deshidrogenasas por ejemplo se unen al sustrato que se oxida y al NAD+ aceptor de los protones y electrones En la mayora de los casos, se puede estudiar este tipo de reacciones teniendo en cuenta la cintica de un sustrato, cuando se mantiene constante la concentracin de uno de los sustratos y se vara la concentracin del otro

Se distinguen los siguientes tipos de mecanismos Cuando se distingue un compuesto ternario Mecanismo secuencial ordenado Mecanismo secuencial aleatorio Cuando no se distingue un compuesto ternario Mecanismo ping-pong Mecanismo Theorell-Chance

Mecanismo secuencial ordenado

Los sustratos se unen a la enzima en un orden determinado, y los productos tambin siguiendo cierto orden A B P Q

E EA EAB EPQ EQ E Este tipo de mecanismo se observa en las deshidrogenasas que actan con NAD*, donde la coenzima se fija en primer lugar y luego el sustrato que se oxida. La unin del dinucletido produce una modificacin de la enzima favoreciendo la unin del sustrato As tambin se libera primero el producto y luego el NADH

Mecanismo aleatorio o al azar

Los sustratos pueden unirse en cualquier orden y la liberacin de los productos tambin se hace en forma aleatoria A EA B P \/ Q E EAB EPQ B EB A Q P

Mecanismo de Theorell- Chance

Es un caso de mecanismo ordenado en que el complejo ternario no se acumula,y no se observa en las condiciones en que se realiza la reaccin Este tipo de mecanismo se observa en la alcohol deshidrogenasa de hgado de caballo A B P E EA -------- EQ ------E + Q Se libera primeramente acetaldehido y luego el NADH

Mecanismo ping-pong o de doble desplazamiento

En este mecanismo no se forma compuesto ternario La enzima se une primero a un sustrato, se forma el complejo binario y se libera un producto y la enzima queda modificada en forma covalente, esta forma se une luego al segundo sustrato, se forma el complejo correspondiente y se libera otro producto, la enzima vuelve a la forma inicial E + A EA E + P E + B EB E + Q Este mecanismo se observa en muchas

Empleando el esquema de Cleland A P _________ EA E'P E'Q B

_

E'B

EQ

Este tipo de mecanismo es muy comun en muchas enzimascomo transaminasas y flavoenzimas por ejemplo la aspartato transaminasa que pqrticipa en la reaccin Glutamato+Epiridoxal 2oxoglutarato +Epiridoxamina Oxaloacetato + Epiridoxamina aspartato + Epiridoxal

Las grficas que se obtienen cuando se mantiene la concentracin de un sustrato constante y se vara el otro,y se toma 1/v vs. 1/ [S] son rectas paralelas entre s Este tipo de mecanismo se observa tambin en varias enzimas de transferencia de fosfatos, como la fosfoglicerilmutasa Se produce primero una reaccin donde un grupo fosforilo se transfiere a la enzima dando un derivado fosforilenzima, el grupo fosfato es transferido luego a un segundo sustrato y la enzima se separa en su forma inicial

En el mecanismo Ping-pong el grupo G es transferido dos veces del 1er sustrato a la enzima y de esta al 2do sustrato, se denomina por eso de doble desplazamiento Los mecanismos con formacin de compuesto ternaario donde el grupo G se transfierre una sola vez se denomina de desplazamiento simple Esta divisin fue introducida por Koshland y se refiere ms a aspectos qumicos que cinticos

Ecuaciones en cintica de dos sustratos

Para obtener las ecuaciones de velocidad en la cintica de dos sustratos se puede aplicar el mtodo de King y Altman,considerando diversos mecanismos posibles o no, sin embargo esto da lugar a mltiples ecuaciones y es ms til emplear otros caminos Por ej para el mecanismo ordenado la ecuacin hallada contiene 13 coeficientes, cuando solo puede haber 8 constantes de velocidad

Recomendaciones de la IUBMB
Las constantes consideradas pueden reducirse a 3 tipos: Velocidades limitantes (Vm) Constates de Michaelis (Km) Constantes de inhibicin (Ki) Las Km respecto a A o B corresponde a la Km en la cintica de un sustrato Las Ki respecto a A o B corresponde a Ki cuando A (oB) se consideran como producto inhibidor de la reacin inversa Si se conoce la (E) puede calcularse las constantes catalticas y calcularse las

Ecuaciones
Para el mecanismo al azar, suponiendo el equilibrio rpido se puede llegar a
V+ (A)(B) v= V-(A) (B) KiQ KmP KiA KmB

1+(A)/KiA+(B)/KiB+(P)/KiP+(Q)/KiQ+(A)(B)/KiAKMQ+(P)(Q)//KipKmq Sin embargo si se toman las velocidades iniciales donde las concentraciones iniciales de productos son despreciables y multipliando por KiAKmB la ecuacin se reduce a V(A)(B) v= ---------------------------------------------- KiAKmB + KmB (A) + KmA(B) + (A)(B)

 Vm o V es la velocidad lmite cuando la enzima est saturada con ambos sustratos Si la concentracin de uno de los sustratos es mucho mayor que la del otro , por ej B, la ecuacin se reduce a v = V(A)/ KmA +(A) Asi se puede definir KmA como el valor de la constante lmite de Michaelis para A cuando B est en una concentracin saturante De igual modo KmB es el valor de Km para B cuando A est en concentracin saturante

Parmetros aparentes
Para estudiar la cintica de las reacciones con dos sustratos se debe repetir varias veces la experiencia, manteniendo en cada la concentracin de un sustrato constante, por ej B y variando el otro La ecuacin tomar la forma v= V(B)/KmB(B) (A) / KiAKmB+ KmB(B)/KmB+(B) y KiAKmB +KmA(B)/ KmB + (B) = Kmap

donde ser constantes V(B)/ KmB(B) = V ap

Los parmetros Vmap, Kmap y Vmap/Kmap son funcin de la concentracin de B

Grficas primarias y secundarias en los mecanismo con complejo ternario

Los datos obtenidos experimentalmente se pueden llevar a cualquiera de los grficos lineales L-B H-W o E-H,tales grficas se denominan primarias En la representacin de L-B se obtienen rectan que se interceptan en el 2do cuadrante en un punto cuya abcisa es -1/KiA y la ordenada 1/V(1-KmA/KiA) Esta grfica da directamente el valor de KiA, los otros parmetros se obtienen de grficas secundarias Vap vs o Vap/Kmap vs (B) corresponden a hiprbolas y la grafica de dobles inversan dan rectas Representando 1/Vap vs 1/(B) se obtiene una recta cuya pendiente es KmB/V y en el eje de abcisas -1/KmB Kmap/(B) vs 1/(B) da como pendiente KiAKmB/V

Grficas en el mecanismo pingpong

En ausencia de productos la velocidad inicial es v= V (A) (B) / KmB (A) + KmA (B) + (A)(B) Si se toman valores constantes de B y se vara A se tiene Vap = V(B) / KmB + (B) Kap = KmA (B) / KmB + (B) y Vap/Kmap = V/ KmA, valor que no depende de (B) Ls grficas de 1/v vs 1/ (A) son rectas paralelas entre s

Retroinhibicin o inhibicin feed-back

En muchas vas metablicas importantes se observan casos de la llamada inhibicin feedback o retroinhibicin, cuando un producto final de una va metablica se encuentra en exceso , acta como inhibidor de una enzima que participa en una reaccin al comienzo de la va, disminuyendo as la velocidad de la reaccin dada y por lo tanto disminuyendo tambin el producto considerado A B C D
E1 E2 E3 El exceso de D acta como inhibidor de la enzima E1

En muchos casos una va metablica se difurca, y a partir de un metabolito se pueden formar dos o ms productos por caminos diferente

En el esquema anterior los productos G y J pueden inhibir a la primera enzima de la va E1 o actuar solamente sobre la enzima donde se inicia la bifurcacin correspondiente E4 o E7 respectivamente En el primer caso disminuiran todos los metabolitos desde B en adelante, en el segundo caso, disminuira la va correspondiente, si afecta a E4, E,F y G, o si afecta a E7 , H I y J

Inhibicin por 2 inhibidores

Se suelen distinguir los distintos tipos de inhibicin Competitiva Cooperativa Concertada Aditiva Acumulativa Secuencial

Inhibicin cooperativa

Dos inhibidores diferentes X e I se unen a la enzima a distintos sitios de unin La unin de cualquiera de los inhibidores X o I,puede actuar solo, impidiendo la unin del sustrato X solo o I solo, tienen efecto inhibitorio, pero la accin conjunta tienen un efecto mayor que la que tendra X solo o I solo auna concentracin equivalente a la concentracin total de ambos Se pueden formar EXI, EXIS A nivel de saturacin cualquiera de los inhibidores puede hacer que la velocidad llegue a cero Ejemplo Fosforibosilaminasintetasa

Esquema de retroinhibicin
E 10 E11 E12

FG H I
E1

E2

E3

E4

E9 E5

S B C D N J K L X
E6 E7 E8

Inhibicin concertada

La inhibicin se produce solamente con la accin simultnea de los dos inhibidores Ni X ni I tienen ningn efecto solos (por ejemplo EX yEI tienen la misma afinidad por el sustrato pero EXS y EIS son catalticamente activos, pero EXI no puede unirse al sustrato y por los tanto no forma producto La unin de X o I a la enzima aumenta la afinidad por el otro inhibidor Ejemplo: algunas aspartil quinasa

Imhibicin acumulativa

Cada producto final es un inhibidor parcial., I solo ni X solo pueden hace que la velocidad de la reaccin se anule. Esto implica que EX e Ei se unen a S pero no tan bien como S, o que EXS o EIS no son tan activos como ES Ejemplo: gutamina sintetasa

Inhibicin aditiva

Hay dos enzimas diferentes que son inhibidas, cada una sensible a un retroinhibidor o dos sitios catalticos en la enzima de modo que ambos pueden ser ocupados simultneamente por ambos inhibidores Ejemplos_ algunas aspartilquinasas

Inhibicin secuencial

I inhibe a una enzima de la ruta metablica y X inhibe a otra enzima que acta ms adelante Cuando ambos inhibidores X e I tienen concentraciones altas, los dos procesos se inhiben y aumenta la cantidad de un metabolito N puede inhibir a otra enzima

Enzimas interconvertibles
El control de la actividad enzimtica se puede realizar por medio de modificaciones covalentes reversibles que permiten que la enzima pase de un estado ms activo a otro menos activo, o vicecersa, de acuerdo a las necesidades metabolicas. Las enzimas que pueden experimentar este tipo de transformacin se llaman enzimas interconvertibles Las modificaciones covalentes se realizan por accin de otras enzimas que se denominan enzimas convertidoras

Fosforilacin
Uno de los ejemplos ms estudiados es el de la fosforilasa,
que catalisa la fosforilacin del glicgeno ATP Fosforilasa b E-CH2- OH PO3-ADP Fosforilasa a E-CH2-O-PO3 H2O Esta enzima puede existir en dos formas:

La reaccin de b a a requiere ATP y Mg, esta catalizada por la fosforilasa quinasa La reaccin de a hacia b, libera fosfato y est catalizada por la fosforilasa fosfatasa

Regulacin por fosforilacin

Existen numerosas enzimas y protenas cuya actividad est regulada por mecanismos de fosforilacin-desfosforilacin. La forma fosforilada puede se la ms activa o no , dependiendo de la protena Se han observado otros mecanismos de regulacin covalente en protenas, la adenilacin,ribosilacin, metilacin, acetilacin, miristilacin, pero en enzimas adems de las fosforilacin que es el mecanismo ms comn se conocen ejemplos de adenilacin ( en glutamino sintetasa de E.coli) y ribosilacin en varias enzimas ( nitrogenasa, RNA polimerasa y otras)

La modificacin covalente se produce en residuos de serina, treonina , tirosina y otros Las enzimas que participan en la fosforilacin son las protena quinasas, y las que catalizan las desfosforilaciones son las protenas fosfatasas La adenilacin de la glutamino sintasa se produce en un resto de tirosina, y la forma adenilada muestra poca actividad La nitrogenasa de Rodospirillum rubrum es regulada por la ribosilacin de una arginina, y la forma ribosilada es menos activa

Caractersticas de la regulacin covalente

La conversin de una forma de la enzima a la otra est regulada por la accin de otra enzima, lo que produce un cambio rpido en la cantidad de enzima activa presente y una gran amplificacin de una seal inicial La modificacin reversible permite una respuesta mucho mejor controlada a los diferentes requerimientos del metabolismo Las enzimas convertidoras a su vez generalmente responden a una seal hormonal Todo este proceso permite una cascada de amplificacin como respuesta a las necesidades metablicas