UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL FACULTAD DE BIOQUMICA Y CIENCIAS BIOLGICAS

CARRERA DE LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGA

Tesina de grado: Obtencin de queso de alta actividad de agua, probitico y reducido en colesterol.

Autor: Federico Fookes. Director: Dr. Sergio Daro Rozycki. Lugar de realizacin: Instituto de Tecnologa de Alimentos (ITA) FIQ - UNL.

Ao de presentacin: 2011.

Agradecimientos Al Estado Argentino por apostar a la educacin pblica y gratuita. A Sergio por orientarme, soportar mis presencias y mis ausencias. A mi familia por acompaarme y sufrir y alegrarse an ms que yo en A Leti por infinidad de razones. A Cari y los compaeros del laboratorio de lcteos del ITA por brindarme A los laboratorios del ITA e INLAIN por ceder equipos y asesoramiento A los amigos y compaeros de la facultad. A los Dint.

este proceso.

un gran apoyo durante y despus de la realizacin de este trabajo. desinteresadamente.

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--- ndice de contenidos ---

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--- ndice de figuras --Figura 1: Estructura del cido oleico..............................................................................................8 Figura 2: Modelo de subunidades de la micela de casena (Ferrandini, 2006).............................12 Figura 3: Estructura de la goma guar (Sharma, 2007).................................................................24 Figura 4: Diagrama de la interaccin entre probiticos y prebiticos (Harish, 2006)....................30 Figura 5: Estructura qumica del colesterol (http://enciclopedia.us.es/index.php/Colesterol)........31 Figura 6: Metabolismo del colesterol (http://www.ehu.es/biomoleculas/lipidos/lipid36.htm)..........32 Figura 7: Diferencia entre dos arterias con alto nivel de colesterol (izquierda) y bajo nivel de colesterol (derecha).(http://www.ehu.es/biomoleculas/lipidos/lipid36.htm)...................................33 Figura 8: Estructura qumica e imagen tridimensional de , y -ciclodextrinas. (http://www.lsbu.ac.uk/water/cyclodextrin.html#r915, Szejtli, 2004).............................................36 Figura 9: Modelo de la conformacin del complejo -CD colesterol. Tres dmeros de -CD forman un complejo con dos molculas de colesterol (Yamamoto, 2004)....................................39 Figura 10: Representacin de un fluido Newtoniano que fluye entre una placa inferior fija y una placa superior mvil, lo cual origina un perfil de velocidad (F = fuerza actuando sobre la placa, v = velocidad del fluido en movimiento) (Sharma, 2003)....................................................................41 Figura 11: Esfuerzo de corte vs. Velocidad de corte para fluidos (Sharma, 2003)........................44 Figura 12: Comportamiento de fluidos dependientes del tiempo de accin mecnica. A) Viscosidad aparente en funcin del tiempo de cizallamiento mecnico, B) Esfuerzo de corte en funcin del gradiente de deformacin (Sharma, 2003).................................................................46 Figura 13: Diferentes tipos de remetros dentro de las familias rotacionales y tubera (Steffe, 1996)...........................................................................................................................................47 Figura 14: Esquema del proceso de homogenizacin(http://class.fst.ohiostate.edu/Dairy_Tech/10.0%20Homogenization.htm)..........51 Figura 15: Esquema del modelo Box- Behnken Modificado mas las experiencias complementarias.........................................................................................................................54 Figura 16: Reograma caracterstico. El rea coloreada indica el ndice de tixotropa...................61 Figura 17: Representacin de la superficie de respuesta del modelo obtenido para k.................67 Figura 18: Representacin de las lneas de contorno del modelo obtenido para k.......................67 Figura 19: Evolucin del pH vs. tiempo de fermentacin..............................................................68 Figura 20: Evolucin de la acidez vs tiempo de fermentacin......................................................69 Figura 21: Representacin de la superficie de respuesta del modelo obtenido para cv %...........71 Figura 22: Representacin de las lneas de contorno del modelo obtenido para cv %.................71 Figura 23: Perfil tpico obtenido del anlisis del esfuerzo de corte () .........................................72 Figura 24: Superficie de respuesta del modelo obtenido para el ndice de consistencia (K).........74 Figura 25: Lneas de contorno del modelo obtenido para el ndice de consistencia (K)................74

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--- ndice de tablas --Tabla 1: Composicin de la leche (Veisseyre, 1988).....................................................................6 Tabla 2: Diferentes componentes de la fraccin proteica de leche bovina (Spreer, 1991)............10 Tabla 3 : Vitaminas de la leche y necesidades diarias (Mestres, 2004)........................................15 Tabla 4 : Composicin en aminocidos esenciales de la leche (Mestres, 2004)..........................18 Tabla 5 : Calidad nutricional de las protenas de la leche (Mestres, 2004)...................................18 Tabla 6: Protenas de la leche y sus efectos funcionales (Bar, 2001)........................................21 Tabla 7: Aporte de colesterol de los alimentos (Arauz, 1992)......................................................31 Tabla 8: Propiedades de las distintas ciclodextrinas (Szejtli, 1988)..............................................36 Tabla 9 : Valor de las constantes caractersticas de distintos alimentos (Steffe, 1996)................45 Tabla 10: Experiencias pertenecientes al plano de X2 constante................................................55 Tabla 11: Experiencias de extraccin de colesterol.....................................................................65

Objetivos I.- Objetivos. I.1.- Objetivo general. - Obtener y evaluar queso probitico reducido en colesterol, de alta actividad de agua. I.2.- Objetivos especficos. - Obtener queso untable probitico, reducido colesterol, adicionado con protenas de suero y calcio. - Evaluar la viabilidad de los microorganismos probiticos durante la vida til del producto. - Cuantificar las propiedades fisicoqumicas, reolgicas y sensoriales, durante el almacenamiento del producto, cuantificando la influencia de las variables estudiadas segn el diseo experimental seleccionado.

Introduccin II.- Introduccin. El aumento en la demanda de alimentos saludables est estimulando la innovacin y el desarrollo de nuevos productos en la industria alimenticia en todo el mundo, en especial la generacin de alimentos funcionales. Estos son productos que modulan o actan sobre determinadas funciones del organismo, brindando un beneficio que vas ms all del puramente nutricional. Los alimentos con agregado de probiticos son alimentos funcionales, ya que mejoran la salud del consumidor. Los probiticos pueden influir positivamente en el tratamiento y la prevencin de enfermedades, equilibrar la flora intestinal y mejorar el sistema digestivo. En la actualidad, las enfermedades coronarias son una de las mayores causas de muerte en los pases industrializados, siendo el nivel elevado de colesterol en sangre uno de los factores determinantes del riesgo de ocurrencia de estas enfermedades. Por otro lado el colesterol suministrado por la dieta aumenta los niveles sricos del mismo, por lo que el desarrollo de alimentos reducidos en colesterol y su inclusin en la dieta parece ser una buena medida para disminuir dichas enfermedades. Por ltimo, la adicin de aminocidos esenciales (protenas de suero) y calcio, eleva el valor nutricional de los productos, minimizando el riesgo de falta de nutrientes muy importantes, preventivos de ciertas enfermedades (desnutricin, osteoporosis, etc.). Debido a lo anteriormente mencionado, en este estudio se busc desarrollar un queso probitico de alto contenido acuoso, reducido en grasas y colesterol (< 5 mg % de colesterol). Se utiliz como modelo al queso cottage, el cual es un queso no madurado que se obtiene por coagulacin de la leche por la accin de cuajo, enzimas especficas, bacterias lcticas y cidos permitidos, solos o combinados (Cdigo Alimentario Argentino. Ley 18.284, captulo VIII Alimentos Lcteos, artculo 617 bis- (Res Conj. SPyRS y SAGPA N 33/2006 Y N 563/2006). Tanto el agregado de protenas de suero como sus propiedades probiticas, as como la cualidad de ser reducido en colesterol, le dan a este producto un alto valor nutricional adems de tener propiedades como alimento funcional y caractersticas preventivas.

Introduccin II.1. Produccin de queso untable de alta humedad. Segn el Cdigo Alimentario Argentino (CAA), los quesos no madurados se obtienen por coagulacin de la leche por la accin de cuajo, enzimas especficas, bacterias lcticas y cidos permitidos, solos o combinados; siendo este producto de muy alta humedad, adems de semigraso (CAA, Art. 605). El producto desarrollado tiene similares caractersticas que el queso Cottage y Petit-Suize, entre otros. La elaboracin de productos lcteos similares se puede llevar a cabo mediante una coagulacin mixta cido/enzimtica, lenta y sin desuerado, como en este trabajo. Al carecer de la etapa de sinresis se presenta la ventaja de tener un rendimiento mucho mayor que los productos similares del mercado y se elimina el problema de manipulacin de un efluente difcil de tratar como lo es el suero. II.2. Materias primas y aditivos. II.2.1. Leche. La leche es el producto ntegro del ordeo completo e ininterrumpido de una hembra lechera sana, bien alimentada y no fatigada. (CAA 554-2006). Constituye un sistema qumico y fsico-qumico muy complejo que est conformado por la mezcla de sustancias, de las cuales unas se encuentran en emulsin (grasa), otras en suspensin (casenas) y el resto en disolucin (lactosa, protenas del suero, sales, etc.) (Veisseyre, 1988). A lo largo de la historia, la recoleccin y transformacin de la leche ha ido adaptndose a la demanda de alimentos cada vez ms saludables, desarrollndose productos lcteos de diversa manufactura, leches enriquecidas con mltiples nutrientes, como vitaminas y minerales, leches y productos lcteos a los que se les ha reducido el contenido de materia grasa, as como otros a los que se les ha disminuido su contenido en lactosa. En la actualidad la gran variedad de productos lcteos puede resumirse de la siguiente forma: 1- Leches de consumo, no modificadas (excepto por la influencia del calentamiento y, a veces, por un desnatado parcial); 2- Leches concentradas (condensadas o evaporadas) y desecadas (leche en polvo) por la accin del calor. 3- Leches modificadas

Introduccin Leches medicamentosas, maternizadas, humanizadas. Aromatizadas esterilizadas. Leches fermentadas o acidificadas: yogur, leche acidfila, kfir. Leches reconstituidas, en las que uno de sus componentes, en general materia grasa, se sustituye por una sustancia extraa con caractersticas similares (Alais, 1985). II.2.1.1.- Composicin. La composicin determina su calidad nutritiva, su valor como materia prima para fabricar productos alimenticios y muchas de sus propiedades (Walstra, 1987). El componente principal de la leche es el agua, el cual representa las 9/10 partes. Algunos elementos de la leche estn presentes en cantidades sensibles como por ejemplo: grasa, lactosa, sustancias nitrogenadas (protenas) y sales minerales, y tambin esta compuesta por elementos que se encuentran en cantidades vestigiales como las enzimas, los pigmentos y las vitaminas (Veisseyre, 1988).
Tabla 1: Composicin de la leche (Veisseyre, 1988). Composicin media Agua Grasa Protenas Lactosa Cenizas 87.0 % 4.0 % 3.5 % 4.7 % 0.8 % Emulsin tipo aceite/agua X X X X Suspensin / emulsin coloidal Solucin verdadera

Los diferentes componentes de la leche se encuentran estabilizados y distribuidos de distintas maneras dependiendo de la naturaleza del componente: Solucin coloidal: Cuando una sustancia existe en un estado de divisin intermedio al de una verdadera solucin (por ejemplo, de azcar y agua) y una suspensin (por ejemplo, yeso en agua) se dice que se trata de una solucin o suspensin coloidal.

Introduccin Este sistema se puede desestabilizar de varias formas, por ejemplo en la leche por efecto del calor, el cual da lugar al desplegado de las seroprotenas, incrementando la interaccin entre las protenas. Emulsin: Es una suspensin de pequeas gotas de un lquido en el seno de otro. La leche es una emulsin de grasa en agua. El lquido finamente dividido se correspondera con la fase dispersa y el otro constituira la fase continua. Solucin verdadera: Las sustancias que cuando se mezclan con el agua u otros lquidos forman verdaderas soluciones, se dividen en: - Soluciones no inicas, como cuando la lactosa est disuelta en agua, donde no tienen lugar cambios importantes en la estructura molecular de la lactosa. - Soluciones inicas. Como cuando la sal comn se disuelve en agua, los cationes y aniones estn dispersos en el agua, formado un electrolito (Bylund, 2003). II.2.1.1.1.- Materia grasa. La grasa de la leche agrupa un conjunto de numerosas sustancias de estructura qumica diferente, pero todas ellas solubles en estado anhidro en solventes orgnicos apolares (hexano, cloroformo, benceno o ter). A su vez, este componente se encuentra estabilizado en la leche debido a que forma una emulsin de pequeos glbulos esfricos o ligeramente ovoides, cuyo dimetro vara de 2 a 10 m. La distribucin de la grasa se encuentra dentro del glbulo de la siguiente forma cada 100 gramos de leche: Un ncleo que contiene la grasa: triglicridos (3,8 g), cidos Una pelcula lipoproteica conocida con el nombre de La membrana impide que los glbulos grasos floculen y fundan y adems protege el contenido del ncleo. La integridad de los glbulos grasos determina la estabilidad de la materia grasa en la leche. Si se rompe la membrana el glbulo grasos libres (2,5 mg), colesterol (10-11 mg) y vitaminas liposolubles (0,2 mg). membrana: protenas (35 mg), fosfolpidos (21 mg) y colesterol (1,5 mg).

Introduccin pierde individualidad y la emulsin pierde su estabilidad (Walstra y Jenness, 1987). Segn sus propiedades, los componentes de la materia grasa de la leche se pueden dividir en dos grupos: Lpidos (representan aproximadamente el 99%de la materia grasa). Fraccin insaponificable.

A su vez, los lpidos se dividen en lpidos simples (glicridos y estridos) y lpidos complejos (lecitinas y cefalinas), en una proporcin aproximada de 99:1 (Walstra, 1987; Veisseyre, 1988). La materia grasa se sintetiza, en parte, en la glndula mamaria a partir de los cidos grasos voltiles, el resto se forma a partir de los cidos grasos que se encuentran en la sangre. El rgimen alimenticio tiene una influencia considerable sobre la cantidad y la calidad de este componente de la leche (Alais, 1985). II.2.1.1.1.1.- Lpidos simples. Son steres de cidos grasos y un alcohol (glicerol para los glicridos y esterol para los estridos), habiendo una variedad mayor de 150 cidos grasos. Los cidos grasos saturados representan el 55-60 % del total de los cidos grasos, encontrndose todos los de nmero par de carbonos desde C 4 hasta C20, siendo el mristico, el palmtico y el esterico los ms abundantes (con 14, 16 y 18 carbonos respectivamente). Los cidos grasos insaturados son muy diversos pero el cido oleico (cido graso de 18 carbonos con una instauracin, C18:1) es el que se encuentra en mayor proporcin dentro de este grupo. Este cido tiene la propiedad de no aumentar o disminuir la concentracin srica de colesterol (Veisseyre, 1988).

Figura 1: Estructura del cido oleico. (http://en.wikipedia.org/wiki/File:Oleic-acid-based-on-xtal-1997-2D-skeletal.png#filelinks)

II.2.1.1.1.2.- Lpidos complejos.

Introduccin Estos lpidos contienen una cierta cantidad de fsforo y nitrgeno. Este grupo est comprendido por: Lecitinas. Cefalinas. Fosfoesfingolpidos.

Las lecitinas estn constituidas por la unin del glicerol, cidos grasos, cidos fosfricos y una base nitrogenada (la colina). Estas molculas tienen funciones importantes en la estabilizacin de la emulsin de los triglicridos debido a su propiedad anfiptica dada por la presencia de una porcin hidrofbica y una regin hidroflica (Veisseyre, 1988). II.2.1.1.1.3.- Fraccin insaponificable. En este grupo se encuentran aquellos constituyentes que, tras la saponificacin, son insolubles en agua en medio alcalino, pero solubles en disolventes orgnicos. Este es un grupo ms diverso donde los componentes importantes son: Carotenoides: dentro de este grupo el ms importante es el caroteno, precursor de la vitamina A Tocoferoles: dentro de este grupo se encuentra el -tocoferol (vitamina E), el cual tiene un importante rol como antioxidante natural. Esteroles: grupo compuesto por alcoholes policclicos complejos. Los principales integrantes de este grupo son el colesterol (contribuye a mantener la estabilidad de la emulsin), el ergosterol y el 7dehidrocolesterol (los cuales, si son irradiados con luz UV, forman las vitaminas antirraquticas del grupo D) (Veisseyre, 1988). II.2.1.1.1.4.- Aporte de la grasa lctea al flavor de los derivados de la leche. El contenido graso en los alimentos posee una gran influencia sobre las caractersticas sensoriales y su aceptabilidad. Debido a la relacin sugerida entre los lpidos y las enfermedades cardiovasculares, se han realizado distintas recomendaciones para reducir el consumo de materia grasa. Esta idea ha sido bien aceptada por los consumidores, sin embargo los alimentos con materia grasa reducida tienen una aceptabilidad mucho menor. La reduccin del contenido de la -

Introduccin materia grasa de los alimentos da lugar a cambios importantes en la textura, el olor y el flavor de stos (Carrapiso y col., 2004). Por otro lado, la grasa de la leche tiene un sabor nico entre las grasas y aceites comestibles debido a todas sus caractersticas y agradable flavor, el cual es complejo y difcil obtener sintticamente (Kaylegian y col., 1993; Early, 2000). II.2.1.1.1.5.- Colesterol en la leche. La leche contiene de 12 a 14 mg de colesterol por cada 100 gramos de leche. Si bien la leche descremada no contiene colesterol, carece tambin de vitaminas liposolubles y cidos grasos esenciales (LCA), posee bajo valor calrico y propiedades organolpticas y texturales disminuidas con respecto a la leche entera (Park, 1999; Contarini, 2002). El colesterol se encuentra en su mayora formando parte de los glbulos grasos, el 80% del colesterol se localiza en seno del glbulo, el 10% en la membrana del mismo y el 10 % restante en el plasma exterior al glbulo (Spreer, 1991). Este componente est esterificado (forma ms polar que representa el 10% del total) y en forma libre (forma de menor polaridad que representa el 90% del total) (Spreer, 1991). II.2.1.1.2.- Compuestos nitrogenados. Este grupo representa el 3,35% p/v de la leche. Sus componentes aparecen en la siguiente tabla:
Tabla 2: Diferentes componentes de la fraccin proteica de leche bovina (Spreer, 1991). Concentracin de protenas en la leche Conc. en la leche g/Kg Casena 1-casena 2-casena -casena -casena 10 2,6 10,1 3,3 Total casena 26 -lactoalbmina -lactoalbmina Seroprotenas 1,2 3,2 79,5 3,7 9,8 30,6 8 30,8 10,1 % protena total

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Introduccin
Inmunoglobulnas Alb. del suero sanguneo Otras 0,4 0,7 0,8 Total seroprotenas 6,3 Protenas de la membrana del glbulo graso 0,4 Protena total 32,7 100 1,2 2,1 2,4 19,3 1,2

Los constituyentes mayoritarios de este grupo son las protenas (95 %), grupo muy diverso (ms de cien). Pueden clarificarse de diversas formas segn sus propiedades fsicas o qumicas, o sus funciones biolgicas; en la leche se las han clasificado en tres grandes grupos (Veisseyre, 1988; Spreer, 1991): Casenas. Protenas del suero de la leche. Protenas de las membranas del glbulo graso.

II.2.1.1.2.1.- Casenas. Este tipo de protenas son las que se encuentran en mayor proporcin dentro de las protenas totales (2,7 % p/v en el total de la leche) y forman micelas de 0,4 m. Se ha clasificado este grupo en 3 subgrupos: 1991). II.2.1.1.2.1.1.- Micela de casena. Las casenas se encuentran en la leche en forma de micelas. En la leche recin ordeada y sin refrigerar prcticamente toda la casena se encuentra en forma de partculas esfricas de 40 300 nm de dimetro. Cada micela est formada por aproximadamente 104 molculas de casena. -casenas. -casenas. -casenas.

Estos grupos son todos heterogneos y constan de 2 a 8 subgrupos (Spreer,

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Introduccin stas estn fuertemente hidratadas y adems contienen materia inorgnica, principalmente fosfato de calcio en una concentracin menor a 8 g/100 g de casena. Tambin contienen bajas cantidades de otras protenas y enzimas. Las micelas de casena tienen carga electronegativa. En el balance de los grupos ionizables de las casenas predominan los grupos cidos sobre los bsicos, debido a la gran abundancia en su composicin de aminocidos con dos grupos cidos (glutmico y asprtico), adems de la presencia de fosfoserina. En el caso de la casena se suma tambin la presencia de cido silico. Las micelas de casena, por lo tanto, contribuyen a la acidez titulable de la leche fresca. Los factores ms importantes que influencian en la estabilidad de las micelas son: Tamao: cuanto ms pequeas, ms estables. Agua de hidratacin. Carga elctrica. Un esquema de las micelas de casena se representa en la siguiente figura:

Figura 2: Modelo de subunidades de la micela de casena (Ferrandini, 2006).

II.2.1.1.2.1.2.- Submicelas de casena. Cuando la casena se encuentra en una disolucin similar al suero pero con menor contenido de calcio, se forman agregados pequeos y esfricos. Miden entre 12 y 15 nm de dimetro y cada uno de ellos contiene entre 20 y 25 molculas de casena. En estas submicelas, las molculas se mantienen unidas por enlaces hidrofbicos. Probablemente, la mayora de las partes hidrofbicas de las molculas estn encerradas en el centro de las submicelas, mientras que los grupos cargados estn orientados hacia los lmites exteriores. Existen modelos

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Introduccin que proponen que la unin inter-submicela est formada por fosfato de calcio (Mestres, 2004). II.2.1.1.2.2.- Protenas del suero de la leche. Es la fraccin proteica presente en la leche desnatada a la cual se le ha eliminado las micelas de casena. Mientras no sean desnaturalizadas por calor, estas protenas no precipitan fuera de su punto isoelctrico. Cuando se calienta la leche, parte de las protenas del suero se desnaturalizan y forman complejos con la casena, disminuyendo la capacidad de sta para ser atacada por el cuajo y ligar calcio. Tiene un alto valor nutritivo, mayor que las protenas del huevo y las casenas, ya que su composicin aminoacdica es muy cercana a la biolgicamente ptima. Estas se clasifican en: -lactoalbminas. -lactoglobulinas Inmunoglobulinas.

II.2.1.1.2.2.1.- -lactoalbminas. Estas protenas son consideradas como las tpicas protenas del suero de la leche. Estn presentes en la leche de todos los mamferos y juegan un papel importante en la sntesis de lactosa en la ubre. II.2.1.1.2.2.2.- -lactoglobulinas. Estas protenas son las ms abundantes en el suero de leche. Si la leche se calienta por encima de 60C comienza su desnaturalizacin, donde la reactividad de aminocidos que poseen azufre forman enlaces sulfuro entre -lactoglobulinas y entre stas y -lactoalbminas y -casenas. Tambin a altas temperaturas, compuestos que contienen azufre, tales como sulfuro de hidrogeno son liberados gradualmente, los que son los responsables del sabor a cocido de la leche sobretratada trmicamente (Bylund, 2003).

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Introduccin II.2.1.1.2.3.- Protenas de las membranas del glbulo graso. Estas protenas forman una capa protectora alrededor del glbulo graso, ayudando a su estabilizacin en solucin, algunas de estas contienen residuos lipdicos (lipoprotenas) las cuales son anfipticas y actan como vnculo entre el seno graso y el medio acuoso (Veisseyre, 1988; Spreer, 1991; Bylund, 2003). II.2.1.1.3- Hidratos de carbono. II.2.1.1.3.1.- Lactosa. La lactosa es un azcar que se encuentra nicamente en la leche y est presente en niveles prximos a 50 g/l, representando ms del 99,9% de los glcidos presentes en la leche. La lactosa, como hidrato de carbono, constituye una fuente muy importante de energa, est compuesta por la unin de una unidad de o -glucosa y otra de -galactosa, por lo que se forman dos ismeros: lactosa y lactosa . El contenido de lactosa en la leche vara entre 3,6 y 5,5 % (Spreer, 1991). Este azcar puede ser desdoblado por las bacterias lcticas en acido lctico, cumpliendo un rol importante en la disminucin del pH de el producto (Veisseyre, 1988; Spreer 1991). Al igual que los dems azcares, la lactosa presenta un sabor dulce; pero en comparacin con la sacarosa su poder edulcorante es cinco veces menor (Mestres, 2004). II.2.1.1.4- Sales y minerales. La leche contiene un cierto nmero de minerales, pero su concentracin es menor al 1%. Se localizan en el suero o formando parte de los compuestos de casena. Las sales mas importantes son las de calcio, sodio, potasio y magnesio que se encuentran como fosfatos, cloruros, citratos y caseinatos (Spreer, 1991). II.2.1.1.5- Vitaminas. Las vitaminas son sustancias orgnicas que estn presentes en muy bajas concentraciones en animales y plantas. Son esenciales para el normal desarrollo de la vida. La composicin qumica de las vitaminas es normalmente compleja. La leche presenta una gran variedad de ellas y se dividen en dos grupos:

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Introduccin Liposolubles: dentro de este grupo estn la vitamina A, D, E y K. Hidrosolubles: dentro de este grupo se encuentran las del grupo B (B 1 y B2, B6, B12), PP, H, cido pantotnico, cido flico (Veisseyre, 1988; Bylund, 2003). En la tabla siguiente se detallan las necesidades diarias de vitaminas de un adulto y las cantidades de cada una en la leche:
Tabla 3 : Vitaminas de la leche y necesidades diarias (Mestres, 2004). Cantidad (mg/l de leche) 0,2 - 2 0,4 1,7 5,0 - 20 0,002 Necesidades diarias de un adulto (mg) 12 12 24 30 100 0,01

Vitamina

A B1 B2 C D

Se debe tener en cuenta que en los productos derivados de la leche se producen modificaciones en la composicin vitamnica en relacin con los tratamientos sufridos, y tambin en relacin con el crecimiento de algunos microorganismos en los productos fermentados (Alais, 1985). II.2.1.2.- Propiedades nutricionales de la leche. Debido a la diversidad de sus componentes, la leche ha sido usada desde tiempos ancestrales como base de la alimentacin, por poseer un adecuado contenido de: hidratos de carbono (energa), protenas (componente estructural y fuente de aminocidos esenciales), lpidos (energa, fisiologa y fuente de cidos grasos esenciales), vitaminas (metabolismo humano) y minerales (calcio, para numerosas secuencias metablicas y calcificacin de huesos). II.2.1.2.1.- Aporte nutricional de la lactosa. Al ser hidrolizada en el organismo, libera glucosa y galactosa, como paso previo a la absorcin intestinal. En el humano este proceso ocurre a nivel del yeyuno por la accin de la -galactosidasa (lactasa). La lactosa no es considerada como nutriente esencial, dado que la galactosa, necesaria para la elaboracin de

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Introduccin cerebrsidos y glicoprotenas, tambin puede obtenerse por sntesis heptica (Porter, 1980). Existen individuos que presentan una deficiente o nula capacidad de sintetizar la lactasa, en ellos la ingestin de productos que contienen lactosa genera problemas digestivos derivados de la no asimilacin de este azcar. Dado que este azcar se encuentra prcticamente solo en la leche, la sintomatologa propia de los individuos intolerantes a la lactosa desaparece con una dieta exenta de leche y de productos lcteos ricos en lactosa. Existen muchos microorganismos que poseen la capacidad de metabolizar la lactosa, por sto este glcido se encuentra en cantidades inferiores en los productos lcteos fermentados como el yogur, leches cidas y quesos frescos. Como residuo de la lactosa aparecen en estos productos diferentes sustancias, siendo el cido lctico la de mayor importancia (Mestres, 2003). II.2.1.2.2- Aporte nutricional de los triglicridos. Aproximadamente el 50 % de la energa aportada por la leche se encuentra en los triglicridos. La grasa lctea ha contado con muy mala imagen en los ltimos aos debido a su perfil de cidos grasos saturados, asocindose su ingesta con enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, cada vez hay ms evidencia del efecto beneficioso para la salud de determinados componentes de la grasa de la leche, como el cido butrico, el cido linoleico conjugado (CLA) o los lpidos polares. Los lpidos polares, que engloban a fosfolpidos y esfingolpidos, son una clase de lpidos presentes principalmente en la membrana del glbulo graso de la leche. En los ltimos aos, estas molculas bioactivas han suscitado un gran inters por sus mltiples beneficios para la salud. La prevencin del cncer de colon, la disminucin de los niveles de colesterol, su efecto bactericida y la mejora de la funcin cerebral son algunas de sus propiedades. Diferentes estudios han vinculado la esfingomielina procedente de la dieta con la disminucin de los niveles de colesterol. Uno de los mecanismos potenciales que puede explicar dicha vinculacin se basa en el hecho de que la esfingomielina disminuye la absorcin de colesterol en el intestino.

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Introduccin Adems, en el tramo de intestino donde tiene lugar la hidrlisis de las grasas, la esfingomielina es dbilmente atacada por las enzimas, lo que permite que interaccione de manera intacta con el colesterol. Por otro lado, la composicin de cidos grasos tambin determina en gran medida la absorcin de colesterol y condiciona que la esfingomielina lctea, que contiene principalmente cidos grasos saturados de cadena larga, sea ms efectiva en la inhibicin de la absorcin del colesterol que la esfingomielina del huevo, que contiene principalmente cido palmtico (Noh, 2003, 2004; Gayoso, 2009) El cido linoleico conjugado (CLA) es un cido graso poliinsaturado esencial con una cadena de 18 carbonos y dos instauraciones (C18:2). Comnmente los dobles enlaces estn presentes en las posiciones 9 y 11 o 10 y 12. La leche es la fuente natural mas rica en este tipo de cidos grasos (2-30 mg/g de grasa). El CLA posee caractersticas poco usuales entre los componentes anticarcinognicos, ya que presenta una doble accin: reduce la incidencia de tumores en animales de laboratorio y acta como agente citotxico frente a clulas tumorales existentes. El primer efecto ha sido demostrado en modelos experimentales de ratn para cncer de piel y tumores digestivos y, en rata, para tumores mamarios. El efecto citotxico ha sido demostrado con estudios in vitro frente a melanoma, carcinoma del colon, leucemia, carcinoma ovrico y tumores mamarios (Bauman, 2002). Este cido graso tambin inhibe la aterosclerosis, contribuye con la formacin de una masa muscular ms magra y con la reduccin de peso. Tambin hay investigaciones que sugieren que los CLA estimulan y fortalecen el sistema inmunolgico adems de mejorar la sntesis de tejido seo y la prevencin de la diabetes (Morales, 2000; Silva, 2007). II.2.1.2.3- Aporte nutricional de las protenas. Las protenas de la leche tienen un alto valor biolgico, ya que por su composicin, un litro de leche cubre las necesidades de todos los aminocidos esenciales diarios, excepto los azufrados (metionina y cistena) y la fenilalanina. Adems, la absorcin de los aminocidos y la digestibilidad de las protenas de la leche es muy alta.

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Introduccin En la siguiente tabla se exponen las cantidades de cada aminocido esencial y las necesidades diarias:
Tabla 4 : Composicin en aminocidos esenciales de la leche (Mestres, 2004). En las protenas de la leche (mg/g) 27 47 95 78 33 102 44 14 64 Media de necesidades (mg/kg de masa corporal/da) 8 a 12 10 14 12 13 14 7 3,5 10

Aminocido Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina + Cistena Fenilalanina + Tirosina Treonina Triptfano Valina

La digestibilidad de estas protenas es del orden del 95%, y su grado de utilizacin proteica neta (UPN) es similar al de la protena del huevo y del orden del 85 90 %. En la siguiente tabla se detalla la digestibilidad, el valor biolgico y la utilizacin proteica neta de las protenas de la leche:
Tabla 5 : Calidad nutricional de las protenas de la leche (Mestres, 2004). Digestibilidad N. absorbido * 100 N. ingerido 95%
N. = Nitrgeno.

Valor biolgico N. utilizado para formacin de tejido * 100 N. absorbido 91%

Utilizacin proteica neta N. utilizado para formacin de tejido * 100 N. absorbido 87%

La protena de la leche ejerce un importante papel de complementariedad con las protenas de otros alimentos. As, las protenas de la leche son ricas en lisina, por lo que al ingerir conjuntamente leche con alimentos pobres en este aminocido (como los cereales o las verduras) se aumenta el valor biolgico de la protena total ingerida (Mestres, 2004; Serra Sajem, 2004).

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Introduccin II.2.1.2.4.- Aporte nutricional de los minerales. La leche tiene un alto contenido en calcio, cuya absorcin se ve favorecida por la presencia de lactosa, vitamina D y una adecuada proporcin calcio/fsforo, de esta manera los productos lcteos aportan el 60 75 % del calcio total de la dieta. La digestibilidad de estos minerales es bastante alta en la leche, debido en parte a que se encuentran conjuntamente con la casena, por esto se sostiene a la leche como la mejor fuente de calcio tanto para el crecimiento de los huesos en los jvenes como para el mantenimiento de la integridad sea en los adultos. Por otro lado estos productos tambin contienen potasio, magnesio y zinc en cantidades considerables (Serra Sajem, 2004) II.2.1.2.5.- Aporte nutricional de las vitaminas. La leche presenta una gran cantidad de vitaminas en diferente proporcin, destacndose la vitamina A. Esta se encuentra tanto en forma de retinol como de carotenos, riboflavina, cianocobalamina y niacina. Adems, y aunque el contenido es menor, tambin aporta tiamina, piridoxina y cido flico. Las vitaminas de la leche se pueden diferenciar como hidrosolubles o liposolubles, por lo que en las leches semidesnatadas o desnatadas el contenido de vitaminas liposolubles se ve reducido e incluso puede desaparecer (Mestres, 2004; Serra Sajem, 2004). II.2.2.- Leche en polvo entera. La leche en polvo se obtiene reduciendo el contenido de agua presente en la leche fluida, de forma de obtener un nivel de humedad del 2,5-5% por lo que no puede haber un crecimiento bacteriano. Actualmente este proceso de secado se realiza por Spray (atomizacin). La materia prima utilizada en este proceso tiene que ser sometida a pasteurizacin para inactivar la mayora de las enzimas lipolticas, evitando la degradacin de las grasas y aumentando su vida til. La leche en polvo tiene muchas aplicaciones en la industria: lctea, panadera, pastelera, chocolatera, sustitucin del huevo, produccin de salchichas, produccin de helados, etc (Spreer, 1991). Las leches en polvo reconstituidas pueden utilizarse para obtener cuajadas con cidos orgnicos o cultivos lcticos starters (Scott, 1998). 19

Introduccin Una vez reconstituida, la leche en polvo tiene igual valor nutricional que la leche de origen utilizada para su produccin (Serra Sajem, 2004). II.2.3.- Leche en polvo descremada. El proceso de elaboracin y sus usos son similares a los de la leche en polvo entera, solo se modifica la materia prima que para este producto es leche fluida descremada (sin grasa) y no se le hace la pasteurizacin previa que habitualmente se realiza para inactivar las enzimas proteolticas (Spreer, 1991). II.2.4.- Concentrado de Protenas de Suero (WPC). El concentrado de protenas de suero (WPC) se obtiene del residuo lquido de la produccin de quesos, y contiene alrededor del 50% de los nutrientes de la leche que se utilizada en quesera (Spreer, 1991), como ser: Protenas hidrosolubles. Lactosa. Vitaminas. Sales minerales.

El concentrado se realiza mediante evaporadores, ultrafiltracin, smosis u smosis inversa dependiendo de la concentracin proteica deseada (Spreer, 1991). El suero representa una rica y variada mezcla de protenas secretadas y que poseen amplio rango de propiedades qumicas, fsicas y funcionales. Las protenas del suero suponen alrededor del 20% de las protenas de la leche de vaca, las cuales no slo juegan un importante papel nutritivo como una rica y balanceada fuente de aminocidos incluso esenciales, sino que adems, en muchos casos parecen ejercer determinados efectos biolgicos y fisiolgicos in vivo. Entre estas protenas se incluyen -lactoalbmina, -lactoglobulina, lactoferrina, lactoperoxidasa, inmunoglobulinas, glicomacropptidos y una gran variedad de factores de crecimiento. El agregado de estas protenas a los alimentos brinda beneficios tanto nutricionales como tecnolgicos.

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Introduccin Desde el punto de vista nutricional estas protenas han demostrado, en diversos estudios realizados en animales y humanos, tener un gran nmero de efectos biolgicos; una breve lista de ellos se detalla a continuacin:
Tabla 6: Protenas de la leche y sus efectos funcionales (Bar, 2001). Protena o pptido Protena de suero total Efecto funcional Anticarcinognico Inmunoestimulador Hipocolesterolmico Funcin digestiva Agonista opioide Anticarcinognico Agonista opioide Transporte y regulacion del hierro Antimicrobiano Inmunoestimulador Antiinflamatorio Crecimiento y proliferacin celular Anticarcinognico Antimicrobiano Inmunidad pasva Antibacteriano Diferenciacin y crecimiento celular Reparacin de la mucosa intestinal Reparacin de lesiones

- Lactoglobulina - Lactorfina - Lactoalbmina - Lactorfina Lactoferrina

Lactoferricina Inmunoglobulinas Lactoperoxidasa Factores de crecimiento

Albmina srica Serorfina

Agonista opioide

Las funciones prebiticas de productos de suero de leche son de importancia crtica en la fabricacin de leche fermentada, probiticos o nutracuticos (Hugunin, 2008). Por ejemplo, cuando se aade Bifidobacterium bifidum el recuento de clulas viables es significativamente ms alto cuando la leche contiene WPC. La fuente de nitrgeno en forma de pptidos o aminocidos libres presente en el concentrado de protenas de suero puede ser crucial para mejorar la viabilidad de las bifidobacterias (Dave y Shah, 1998).

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Introduccin Adems el WPC, comparado con la leche parcialmente descremada (LPD), posee mayor capacidad buffer debido al mayor contenido de sales. Si el contenido de sal disminuye, este efecto decrece notoriamente, por lo que WPC 35 (35% de protenas en base seca) se recomienda frente a WPC 80 (80% de protenas en base seca). El efecto buffer minimiza la destruccin de los cultivos probiticos, mejorando la estabilidad y actividad bajo el pH del tracto intestinal (Hugunin, 2008). Por otro lado estas protenas, una vez parcialmente hidrolizadas, sirven de fuente de numerosos pptidos que poseen actividades biolgicas y fisiolgicas (Bar, 2001). Existen muchos beneficios en el agregado de WPC en los lcteos fermentados, estos incluyen: Sinresis reducida: Al agregarse WPC aumenta la relacin -

lactoglobulna/-casena, por lo que aumentan los complejos formados por estas protenas luego del tratamiento trmico. De esta forma se aumenta la retencin de agua. Uno de los efectos mas significativos del WPC es su accin sobre la disminucin o eliminacin de sinresis durante el almacenamiento del producto, dado por su capacidad para retener el agua y el aumento de la consistencia en el tiempo, aumentando la vida til de los productos (Hugunin, 2008). Sabor mejorado: Las protenas de suero son inspidas. En comparacin con las casenas, las protenas de suero tienen una menor tendencia a enmascarar sabores. Anlisis sensoriales de los productos generalmente muestran mayores puntuaciones en apariencia, sabor, aroma, textura y aceptacin global para los lcteos fermentados a los que se les ha adicionado WPC (Requena, 2005). II.2.5.- Gelatina. La gelatina es una protena anftera que est compuesta por una nica secuencia de aminocidos, con un alto contenido de glicina, prolina e hidroxiprolina. Presentan secuencias repetidas de tripletes de Glicina-X-Y donde X e Y son prolina e hidroxiprolina, las que serian las responsables de la estructura helicoidal triple, en las cuales se inmovilizan las molculas de agua formando el gel, que en un amplio rango de concentraciones y temperaturas exhibe

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Introduccin propiedades reolgicas de naturaleza Newtoniana. Este gelificante es de nivel GRAS (generally recognized as safe) y es ingrediente en un amplio rango de alimentos que van desde gelatinas hasta vinos (Pb Leiner Gelatins, 2007). La gelatina se obtiene de la hidrlisis parcial del colgeno, el cual puede provenir de: Piel de cerdo. Piel de ganado. Huesos. Las presentaciones comerciales de este producto estn compuestas por 85% de protena y cerca de un 2% de sales minerales. Sus polipptidos contienen 18 aminocidos diferentes, 9 de los 10 aminocidos esenciales, siendo el triptfano el nico faltante. Por otro lado posee un valor energtico relativamente bajo (3,6 caloras por gramo). Cuando es disuelta en agua, se forman grnulos que pueden absorber aproximadamente 10 veces su peso en agua (http://www.gmap-gelatin.com). Adems es de fcil disolucin cuando se hidrata en un medio acuoso a temperaturas moderadamente altas (mayores a 40C) (Pb Leiner Gelatins, 2007). Generalmente gobierna la consistencia y viscosidad en los medios donde est presente, generando una matriz compacta y algo spera. Debido a su punto de fusin, cercano a la temperatura del cuerpo, en el paladar la gelatina produce una sensacin suave y cremosa no enmascarando sabores. A diferencia de la mayora de los agentes gelificantes polisacridos, la formacin de geles de gelatina no requiere la presencia de otros reactivos como la sacarosa, sales y cationes bivalentes y adems no depende del pH. Es por todo esto que la gelatina se utiliza como estabilizante espesante y texturizante en diversos productos lcteos como yogurts, helados, quesos untables y en geles lcteos (Salvador, 1998). II.2.6.- Goma Guar. Es un carbohidrato comestible que tiene propiedades espesantes que se extrae de la semilla de la planta leguminosa bianual Cyamopsis tetragonolobus. La goma guar es una cadena lineal de unidades de - D- piransido enlazadas 1,4 con una unidad - D- galactopiransido como cadena lateral. La -

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Introduccin D galactopiransido esta enlazada 1,6 con la cadena principal (Sharma, 2007). En la siguiente figura se esquematiza su estructura.

Figura 3: Estructura de la goma guar (Sharma, 2007).

Esta goma, al ser no digerible, no aporta caloras, adems retiene sales biliares precursoras del colesterol teniendo un efecto hipocolesterolmico, da sensacin de saciedad y retrasa la absorcin de los hidratos de carbono (www.casapia.com; Rideout, 2008) La presentacin comercial de esta goma es un polvo blanco que se hidrata rpidamente en agua fra formando soluciones de muy alta viscosidad a concentraciones relativamente bajas. Como espesante, tiene caractersticas pseudoplsticas, en soluciones acuosas este efecto se amplifica si estn presentes protenas de suero. Los geles formados son estables en un amplio rango de pH (1- 10,5). En la industria lctea se la utiliza para mejorar la textura y para mantener la viscosidad y color uniforme, adems aumenta la retencin de agua, efecto muy deseado en diversos productos lcteos fermentados, ya que aumenta su vida til y no modifica la distribucin de sabores en este tipo de productos (Schmidth y Smith, 1991). II.2.7.- Cloruro de calcio. La presencia de calcio en quesos es fundamental para la formacin del gel proteico, en donde hace de nexo entre las molculas de casena provocando un entrecruzamiento que es la base de la formacin del gel. El cloruro de calcio trae muchos beneficios en la formacin de los geles proteicos, sin embargo hay estudios que indican que si se supera cierta concentracin estas caractersticas desmejoran por impartir excesiva firmeza, disminuyendo el desuerado, y otorgar gusto calcreo (Veisseyre, 1988; Lucey, 1993). 24

Introduccin II.3.- Productos biotecnolgicos. II.3.1.- Cuajo. Es un complejo enzimtico en el cual predomina la quimosina o renina (> 90%). sta es especfica de la -casena, hidrolizando su enlace entre los aminocidos 105-106 (fenilalanina-metionina). Luego de su accin, esta casena se desdobla en dos partes, perdiendo su capacidad protectora hacia las dems casenas respecto al in calcio. Luego de esta hidrlisis, el calcio acciona sobre las dems casenas sensibles a l, produciendo la desestabilizacin del sistema, obteniendo la coagulacin del mismo (Spreer, 1991). II.3.2.- Cultivos acidificantes (fermentos). Los cultivos acidificantes son del grupo de las bacterias productoras de cido lctico (BAL), a partir de la lactosa, que constituyen un grupo muy heterogneo desde el punto de vista taxonmico. Tiene como caracterstica comn la de producir cido lctico como catabolito nico o mayoritario en la fermentacin de los azcares (ms del 90 %, las homofermentativas). Los miembros caractersticos son cocos o bacilos gram positivos, inmviles y catalasas negativos (Pars Farras, 1997). Estas bacterias se han empleado para fermentar o crear cultivos de alimentos durante al menos cuatro milenios. Su uso ms corriente se ha aplicado en todo el mundo a los productos lcteos fermentados, como el yogur, queso, kefir y el koumiss. Tambin se utilizan para la conservacin de alimentos como la carne (Vasquez, 2009). Estas bacterias pueden clasificarse en dos grandes grupos: Mesfilas: Gneros Lactococcus y Leuconostoc con una temperatura ptima de crecimiento de 30 33 C. Termfilas: Sc thermophilus, Lb. delbrueckii susbsp. bulgaricus, Lb helveticus y Lb. lactis con la temperatura ptima de crecimiento entre 40 45 C (Early, 2000). Adems pueden sobrevivir y desarrollarse en condiciones de pH relativamente bajo a diferencia de otros grupos microbianos con metabolismo respiratorio. Las BAL poseen un sistema de transporte simultneo de cido lctico

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Introduccin y de protones al exterior celular, que adems de contribuir a la homeostasis del pH interno, origina energa. La utilizacin de los carbohidratos disponibles en el alimento y la reduccin del pH a causa de los cidos orgnicos producidos, son el principal mecanismo de antagonismo microbiano de las bacterias lcticas. No obstante, estas bacterias tambin producen otras sustancias antagonistas dentro de las cuales se destacan el diacetilo, perxido de hidrgeno, acetaldehdo, compuestos no proteicos de bajo peso molecular y bacteriocinas (Vasquez, 2009). Los cidos orgnicos contribuyen al desarrollo de sabor, aroma y textura de los alimentos, como as tambin a su estabilidad mediante la inhibicin generada sobre otros microorganismos. La fraccin no disociada de los cidos orgnicos es la que posee mayor actividad debido a su naturaleza lipoflica, ya que pueden atravesar la membrana celular y disociarse en el citoplasma (Vasquez, 2009). II.3.2.1.- Fermento de yogur. Lo constituyen las cepas Streptococcus thermophilus (ST) y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (LB) consideradas GRAS debido a que son inofensivas para el husped, no patognicas a nivel local ni general, y no provocan reacciones alrgicas, mutagnicas o carcinognicas, tanto por parte de la clula en si como por sus productos de fermentacin o componentes celulares. Adems se caracterizan por pertenecer al grupo de las termfilas cuya temperatura ptima de crecimiento es de 40-45 C (Leveau, 2000). Estas dos cepas tienen un efecto sinrgico, ya que la actividad proteoltica del ST es menor que la del LB, el cual inicia la fermentacin proveyndole de pptidos necesarios (principalmente valina) para el ptimo desarrollo del primero. A su vez ste produce cido frmico que estimula el desarrollo del LB (Reinheimer y Zalazar, 2006). Adems, la utilizacin de cultivos starter colabora con la reduccin del oxigeno en la solucin, lo que favorece la viabilidad de las bacterias probiticas anaerbicas. II.3.2.2.- Fermentos probiticos.

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Introduccin Se llama probiticos a todos los microorganismos vivos que confieren un efecto benfico a la salud del hospedador cuando son suministrados en cantidades adecuadas (FAO-WHO, 2001). Para que un microorganismo sea considerado probitico necesita cumplir criterios como: Ser aislado de las mismas especies en la cual va a ser hospedado. Tener un efecto beneficioso demostrable en el husped. Ser no patognico. Ser capaz de sobrevivir el paso por el tracto digestivo. Durante el almacenamiento del producto debe mantener alto el nmero de bacterias viables (> 10 6 UFC/g). Existe una gran lista de microorganismos probiticos la que incluye cepas de bacilos cido-lcticos (Lactobacillus y Bifidobacterium), E. coli no patognicos (E. coli Nissle 1917, por ejemplo), Clostridium butyricum, entre otras. Tambin se han desarrollado bacterias genticamente modificadas para secretar inmunomoduladores que pueden tener potencial como probiticos (Harish, 2006). Los mecanismos de accin de los probiticos no estn completamente dilucidados, de todos modos deben cumplir con ciertas condiciones como ser: Tener buena adherencia y colonizacin en el intestino. Suprimir el crecimiento, la invasin y unin de microorganismos patgenos. Mejorar la barrera intestinal. Controlar la trasferencia de antgenos dietarios. Estimular la mucosa y la inmunidad sistmica del husped. En general, los probiticos son ingeridos con leche (debido a sus propiedades de alto contenido acuoso y nutricional). Entre los beneficios que pueden traer al consumidor la ingesta de alimentos probiticos, se resaltan: Mejora de la digestin de la lactosa. Estimulacin del sistema inmune. Control del crecimiento de la microflora indeseable. 27

Introduccin Efecto hipocolesterolmico. Deconjugacin de cidos biliares. Propiedades anticarcirognicas y antimutagnicas. Prevencin y tratamiento de diarreas. Tratamiento del sndrome del intestino irritable. Prevencin del cncer de colon. Prevencin de la pancreatitis. Prevencin de la constipacin. Tratamiento contra la gastritis crnica generada por Helicobacter pylori. Disminucin de los efectos de enfermedades relacionadas con el hgado. Existen otros factores tales como las modificaciones organolpticas, los conservantes agregados, interacciones entre los cultivos probiticos y los iniciadores que tambin se tienen que tener en cuenta a la hora de la eleccin de los fermentos (Reinheimer y Zalazar, 2006). La incorporacin de microorganismos probiticos a quesos parece ser una alternativa prometedora al problema de sobrevida de estas bacterias hasta el momento del consumo. Esto se debe a que los quesos poseen mayores valores de pH (con respecto a las leches fermentadas), tienen una matriz ms cerrada y compacta que permite un menor ingreso de oxgeno y mayor contenido de grasa, que ejerce un efecto protector sobre las cepas probiticas. (Stanton, 1998). II.3.2.2.1.- Microorganismos probiticos utilizados. II.3.2.2.1.1.- Lactobacillus casei susbsp. rhamnosus (SP1). El Lactobacillus rhamnosus es un componente principal de la poblacin de lactobacilos que habitan naturalmente el tracto gastrointestinal de humanos y animales. No posee actividad antimicrobiana contra otras bacterias cido lcticas y posee una buena adhesin a las glicoprotenas del leon humano y a los productos con fibra de la dieta (Caldern, 2007). Esta bacteria disminuye la adherencia intestinal de microorganismos patgenos (E. coli enterotoxignica y Klebsiella pneumoniae por ejemplo) (Forestier, 2001).

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Introduccin Tambin es tolerante al pH bajo y a los fluidos pancreticos y biliares (Succi y col., 2005; Caldern, 2007). Esta bacteria es tambin aerotolerante, por lo que es capaz de crecer durante la fermentacin y proporcionar buenas propiedades organolpticas (Caldern, 2007). Por otro lado, cepas de Lactobacillus rhamnosus han demostrado tener una accin como probitico generndole beneficios a la salud del consumidor, como la proteccin contra patgenos, debida a su buena adhesin a mucosas, mejoramiento del sistema inmune y de la salud del colon adems de mejorar la nutricin del husped (Minelli, 2004). II.3.2.2.1.2.- Bifidobacterium animalis susbsp. lactis (BLC1). El Bifidobacterium animalis susbsp. lactis es uno de los microorganismos ms comnmente usado como probitico. Es una bacteria gram positiva encontrada en el intestino delgado de la mayora de los mamferos. Se han reportado muchos beneficios trados por el uso de esta bacteria como probitico, entre ellos estn el mejoramiento de la salud gastrointestinal y de la inmunidad, efecto hipocolesterolmico en humanos cuando fue utilizada en leche fermentadas (Marteau, 2000; Gill, 2001). El crecimiento de las bifidobacterias en leche es generalmente lento o limitado comparado con el de las bacterias acidolcticas usadas en la fermentacin de los productos lcteos. De todos modos, aumentando la fuente de nitrgeno se mejora el crecimiento y la viabilidad de este tipo de bacterias. Adems de producir cido lctico, estas bacterias producen cido actico, lo que genera un disminucin de la actividad de bacterias Lactobacillus y Streptococcos (Samona, 1996). Estas bacterias se mantienen viables por varios meses siempre y cuando el pH del producto no sea menor de 4,6. A su vez no generan aumento de acidez a la temperatura de almacenamiento de los quesos con alto contenido acuoso (Vinderola, 2000; Roy, 2005; Gomes da Cruza, 2009).

II.3.3.- Prebiticos y su influencia en la formulacin de los alimentos probiticos.

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Introduccin Los prebiticos son ingredientes alimenticios no vivos y no digeribles, principalmente fibras dietarias que promueven selectivamente el crecimiento y/o la actividad de los microorganismos benficos actuando como sustrato. Esto trae un beneficio al husped aumentando la supervivencia e implantacin de los microorganismos vivos presentes en el sistema gastrointestinal (Cagigas Reig, 2002; Sir, 2008; Cceres, 2010). En la formulacin de los alimentos es deseado este efecto simbitico generado de la correcta eleccin de los probiticos y prebiticos presentes en el alimento, generando una potenciacin de las caractersticas nutracuticas del mismo (Gerdes, 2007). Los compuestos generalmente usados son la lactulosa, galactooligosacridos, fructooligosacridos, inulina y sus hidrolizados entre otros. En el siguiente grfico se explica el mecanismo bsico de interaccin entre probiticos, prebiticos y el organismo:

Figura 4: Diagrama de la interaccin entre probiticos y prebiticos (Harish, 2006).

II.4.- Colesterol. El colesterol es un lpido isoprenoide del grupo de los esteroides, subclase esteroles. En su forma pura es blanco y cristalino. Estructuralmente es un alcohol policclico de 27 tomos de carbono, formado por cuatro anillos de carbono unidos y una cadena hidrocarbonada.

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Introduccin El colesterol libre es una molcula hidrfoba y bastante soluble en disolvente apolares como el cloroformo, ter, benceno y hexano (Mayes, 1997). Su estructura se observa en la figura 5:

Figura 5: Estructura qumica del (http://enciclopedia.us.es/index.php/Colesterol).

colesterol

En los mamferos, el colesterol es un elemento clave en el mantenimiento de la estructura y la funcin de las membranas celulares regulando su fluidez. Adems es el precursor de los esteroides del organismo, como las hormonas de la corteza suprarrenal, las hormonas sexuales, la vitamina D y los cidos biliares. II.4.1.- Fuentes del colesterol. El colesterol existente en el organismo puede provenir de dos fuentes: Via endgena: de la sntesis del mismo organismo ya que casi todos lo tejidos con clulas nucleadas son capaces de producirlo. De todos modos la mayor parte del colesterol endgeno proviene del hgado. Via exgena: a travs de la ingesta de alimentos de origen animal. Las principales fuentes de colesterol en los alimentos se detallan en la siguiente tabla.
Tabla 7: Aporte de colesterol de los alimentos (Arauz, 1992). Fuentes de colesterol Alimento Huevos Hgado Manteca Costilla de cerdo mg colesterol/100 gr 548 389 213 121

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Introduccin A su vez, otros alimentos como: carnes rojas, rin, piel de ave, leche y derivados lcteos, son una fuente importante de colesterol (Corts Rico, 2005). II.4.2.- Metabolismo del Colesterol. En el hombre, dos tercios del colesterol plasmtico total estn esterificados y el resto circula en la membrana de los glbulos rojos. Un 60-70% es vehiculizado por las lipoprotenas de baja densidad (LDL), el 20-30% por las de alta densidad (HDL) y el 5-10% restante por las lipoprotenas de muy baja densidad (VLDL). Las LDL, tambin llamadas colesterol malo, son mediadoras de la captacin del colesterol en muchos tejidos, es decir, lo transportan desde el hgado al resto del cuerpo para que sea utilizado por las distintas clulas. La cantidad de esta lipoprotena est relacionada con las cantidades de cidos grasos saturados y colesterol ingeridas. Las HDL o colesterol bueno, remueven el colesterol libre de los tejidos y lo transportan al hgado para su conversin en cidos biliares y su posterior excrecin (Mayes, 1997; Freeman, 2008). En el siguiente grfico se esquematiza la circulacin del colesterol (circulo amarillo) en el organismo.

Figura 6: Metabolismo del colesterol (http://www.ehu.es/biomoleculas/lipidos/lipid36.htm).

II.4.3.- Problemas cardiovasculares relacionados al colesterol. El exceso de colesterol tiende a precipitar en el endotelio de los vasos sanguneos, formando las placas de ateroma que dan lugar a la ateroesclerosis que dificulta o puede llegar a impedir la circulacin normal de la sangre, causando enfermedades cerebrovasculares, coronarias y vascular perifricas (Mayes, 1997; Valenzuela, 2006).

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Introduccin En la siguiente figura se puede observar la diferencia entre una arteria de un paciente con nivel alto de colesterol (izquierda) y una arteria de un paciente con un nivel bajo de colesterol (derecha).

Figura 7: Diferencia entre dos arterias con alto nivel de colesterol (izquierda) y bajo nivel de colesterol (derecha). (http://www.ehu.es/biomoleculas/lipidos/lipid36.htm).

La Organizacin Mundial de la Salud afirma que el nmero de fallecimientos debidos a cardiopatas y accidentes cerebrovasculares, juntos, ocasionan la muerte de ms de 12 millones de personas anualmente en todo el mundo, siendo el excesivo nivel de colesterol, el responsable de un tercio de las enfermedades cerebrovasculares (OMS, 2002). Segn la Encuesta Nacional de Nutricin y Salud 2005, del Ministerio de Salud de la Nacin, una de cada cinco mujeres de 10 a 49 aos tiene colesterol elevado (OMS, 2008). Adems de un 30 a un 40% de la poblacin Argentina padece hipercolesterolemia. II.4.4.- Alimentos reducidos en colesterol. En el humano, la aterosclerosis puede ser generada por la ingesta de alimentos con alto contenido de colesterol, es por esto que se ha estudiado diferentes mtodos de extraccin del colesterol de los alimentos (Lee, 1999; Shim, 2003). La reduccin del contenido de colesterol en los alimentos puede ser total o parcial. El Cdigo Alimentario Argentino en el articulo 1378 bis (Res 305, 2603.93), establece que con la designacin de alimento diettico sin colesterol se entiende a aquellos que normalmente lo contienen pero que han sido elaborados

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Introduccin slo con materias primas que no aporten colesterol o los que mediante un adecuado proceso tecnolgico logren eliminar totalmente el colesterol de su composicin normal. Estos alimentos se rotularn con la denominacin especfica del producto original y la indicacin Sin Colesterol prxima a la misma. De acuerdo al Cdigo Alimentario Argentino Resolucin Conjunta 40/2004 de la Secretara de Polticas, Regulacin y Relaciones Sanitarias (SPR y RS) y 298/2004 de la Secretara de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentos (SAGP y A) artculo 1, se rotula a los alimentos disminuidos en colesterol del siguiente modo: Bajo en colesterol: cuando contiene como mximo 20 mg colesterol/100 g en alimentos slidos 10 mg colesterol/100ml en alimentos lquidos, y un mximo de 1,5 g de grasa saturada/100 g en alimentos slidos 0,75 g de grasa saturada/100 ml en alimentos lquidos. La energa aportada por la grasa saturada no debe ser mayor a 10% del Valor Energtico Total. Reducido en colesterol: cuando contiene una reduccin mnima de 25% en colesterol y una diferencia mayor que 20 mg colesterol/100g en alimentos slidos 10 mg colesterol/100 ml en alimentos lquidos y un mximo de 1,5 g de grasa saturada/100 g en alimentos slidos 0,75 g de grasa saturada/100 ml en alimentos lquidos. La energa aportada por las grasas saturadas no debe ser mayor que 10% del Valor Energtico Total. No contiene colesterol: cuando posee como mximo 5 mg colesterol/100 g en alimentos slidos 5 mg colesterol/100 ml en alimentos lquidos y un mximo de 1,5 g grasa saturada/100 g en alimentos slidos 0,75 g grasa saturada/100 ml en alimentos lquidos. La energa aportada por la grasa saturada no debe ser mayor a 10% del Valor Energtico Total. II.5.- Ciclodextrinas. Las ciclodextrinas (CD) son muy utilizadas en la industria alimenticia como aditivos para la estabilizacin de sabores, la eliminacin de sabores indeseados o extraccin de compuestos hidrofbicos, como el colesterol. Los tres tipos ms usados en la industria son la , y ciclodextrina, que varan entre s en la cantidad de monmeros de -D-glucopiranosa (6, 7 y 8 monmeros respectivamente).

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Introduccin stas son slidos cristalinos incoloros. Su hidrlisis cida parcial produce una mezcla de glucosa y una serie de oligosacridos lineales. A fines del siglo XIX se public la primera referencia acerca de las ciclodextrinas cuando se pudo aislar una sustancia cristalina no reductora a partir de la degradacin enzimtica del almidn y se la llam celulosina. Poco despus, la enzima ciclodextrina-transglicosilasa o ciclodextrinaglucosiltransferasa (CGT-asa), de origen bacteriano, fue aislada por primera vez del microorganismo Bacillus macerans. A esta enzima se la utiliz en la degradacin enzimtica del almidn, obtenindose mezclas de dextrinas lineales y cclicas (Szejtli, 1988). La adicin de la enzima CGT-asa a una solucin acuosa de almidn produce el corte del sexto, sptimo u octavo enlace -1,4-glucosdico. La mayora de los radicales maltodextrinil formados, en lugar de reaccionar con una molcula de agua (hidrlisis), reacciona con su propio extremo no reductor, causando las 6, 7 u 8 unidades de los macroanillos. II.5.1.- Estructura de las ciclodextrinas. Las ciclodextrinas (dextrinas cclicas) se definen, entonces, como una familia de oligosacridos cclicos naturales no reductores, compuestos por 6, 7, u 8 unidades de D (+)-glucopiranosa unidas por enlaces -1,4-glucosdicos, que se denominan -, - y - ciclodextrina, respectivamente (Szejtli, 1997). Estas molculas conforman una estructura tridimensional tronco-cnica. Los grupos hidroxilo primarios enlazados al carbono 6 de cada unidad glucopiransica (C(5)-CH2OH) quedan orientados hacia el borde ms estrecho del cono, mientras que los grupos hidroxilo secundarios situados en los carbonos 2 y 3 (C(2)C(3)OH) quedan, por consiguiente, dirigidos hacia el borde ms ancho del cono anular. As, todos los grupos hidroflicos se ubican alrededor de las aberturas de la cavidad y orientados hacia afuera. De esta forma, la ciclodextrina presenta un revestimiento externo de naturaleza altamente hidroflica, como se muestra en la siguiente figura.

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Introduccin

Figura 8: Estructura qumica e imagen tridimensional de , y -ciclodextrinas. (http://www.lsbu.ac.uk/water/cyclodextrin.html#r915, Szejtli, 2004).

En la tabla siguiente (tabla 8) se describen las propiedades de cada una de las ciclodextrinas ms utilizadas:
Tabla 8: Propiedades de las distintas ciclodextrinas (Szejtli, 1988). Propiedades Unidades de D (+)-glucopiranosa Masa molar (g/mol) Dimetro de la cavidad () Temperatura de descomposicin ( C) Solubilidad en H2O (g/100 ml a 25C) Profundidad de la cavidad () Dimetro de la periferia () Molculas de H2O en el interior de la cavidad -CD 6 973 4,7 5,3 250 - 260 14,5 7,9 14,6 8 -CD 7 1135 6,0 - 6,5 255 - 265 1,85 7,9 15,4 11 -CD 8 1297 7,5 - 8,3 240 245 23,2 7,9 17,5 17

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Introduccin

II.5.2.- Usos de las ciclodextrinas. Las ciclodextrinas pueden formar complejos de inclusin gracias a la cavidad hidrofbica formada en su interior. Los compuestos que puede contener esta cavidad pueden ser aromas, pigmentos, vitaminas, colesterol y frmacos entre otros (Lee, 1999). El agua juega un rol principal en el proceso de formacin de complejos de inclusin, ya que en una solucin acuosa la cavidad central es ocupada por molculas de agua, este fenmeno es enrgicamente desfavorable debido a la naturaleza no polar de esta cavidad. Por lo tanto, las molculas de agua, pueden ser sustituidas por una molcula husped que sea menos polar que el agua. Este fenmeno de reemplazo est principalmente incentivado por dos fuerzas motrices: Las fuerzas generadas por la repulsin entre las molculas de agua ubicadas en la cavidad central y los grupos hidrofbicos de las ciclodextrinas en la misma cavidad. Las fuerzas generadas por el desplazamiento por parte del sustrato de las molculas de agua situadas en la cavidad de las ciclodextrinas. No se forman uniones covalentes entre la molcula hospedadora y la molcula husped, las fuerzas de unin husped-hospedero son: Interacciones hidrfobas. Puentes hidrgeno entre los centros polares de las molculas. Interacciones de Van der Waals. Energa liberada por cambios conformacionales.

37

Introduccin Es por esto que se los denomina complejos de inclusin (Szejtli, 1997; Queijo, 2006). De todos modos, los factores geomtricos tambin tienen un rol importante en la determinacin del tipo de molcula husped que puede penetrar en la cavidad de la ciclodextrina, por lo tanto debe existir una compatibilidad de tamao y forma entre el sustrato y el receptor (Szejtli, 1998). Los complejos formados son estables, insolubles en agua o en grasa y pueden ser removidos del material tratado mediante filtracin o centrifugacin. II.5.3.- -ciclodextrina. La -ciclodextrina es un compuesto comestible, no txico, no higroscpico, qumicamente estable y GRAS (Generally Recognized as Safe). Dentro de las ciclodextrinas es la mas ampliamente utilizada, representando ms del 95% de todas las ciclodextrinas producidas y consumidas debido a caractersticas como su disponibilidad, precio, estado de aprobacin y dimensiones de la cavidad entre otros (Szetjli, 1997). Su uso, al igual que el resto de las ciclodextrinas, es el de formar complejos de inclusin ya sea para separar un componente de una solucin o para controlar su liberacin. Ha sido demostrado que el colesterol es eficientemente removido de matrices complejas como huevos, productos lcteos y grasas de animal, como la manteca y el sebo, por el acomplejamiento con -CD (Hedges, 1998; Lee, 1999; Shim, 2003). Esta ciclodextrina posee una menor solubilidad acuosa comparada con las dems ciclodextrinas. Esto favorece a que los complejos formados, por ejemplo con el colesterol, sean ms fciles de separar del resto del producto sin que se altere en absoluto la composicin y las propiedades nutricionales de la materia prima. En la cavidad de la -CD se forman puentes hidrgeno intramolecular entre los tomos de oxgeno y de hidrgeno, establecindose una zona secundaria que le otorga a la -CD mayor rigidez, y es probablemente la explicacin de por qu la -CD tiene la solubilidad ms baja en agua de todas (aproximadamente 10 veces menor que la - y -CD) (Szejtli, 2004).

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Introduccin II.6.- Extraccin del colesterol en leche. Debido a las propiedades y dimensiones de su cavidad interna y a su precio, la -CD es la ms apta de todas las CDs para la extraccin de colesterol. sta acomoda casi exactamente a la molcula de colesterol. Por otro lado el carcter hidrofbico potencia la formacin del complejo. El complejo de inclusin formado por la -CD y el colesterol tiene una conformacin en la cual una molcula de colesterol es acomplejada por tres molculas de -CD. Esto se concluy luego de un anlisis computacional de las dimensiones de la molcula de colesterol y de -CD y de las posibles conformaciones que podan formar entre ellas (Yamamoto, 2004). Factores como la concentracin de -CD, la temperatura y el tiempo de la mezcla (contacto -CD colesterol), la fuerza y tiempo de centrifugacin para la separacin del complejo -CD colesterol son las variables ms influyentes en el proceso de extraccin del mismo. En la figura 8 se muestra el modelo propuesto para la conformacin del complejo:

Figura 9: Modelo de la conformacin del complejo CD colesterol. Tres dmeros de -CD forman un complejo con dos molculas de colesterol (Yamamoto, 2004).

Se informan valores de extraccin de hasta un 95,3 % del colesterol en leche homogeneizada utilizando concentraciones de -CD desde 0,5 hasta 1,5% (Lee, 1999). Tambin se han alcanzado valores de extraccin del colesterol de hasta el 90% en crema de leche (36% de grasa) con el uso de una concentracin de -CD del 10% (Shim, 2003). Varios trabajos cientficos proponen y comprueban el uso de la -CD en polvo para remover efectivamente el colesterol de productos animales para mejorar sus caractersticas nutricionales. Adems, utilizando este mtodo el producto obtenido aparenta ser indistinguible del producto sin este tratamiento. Entre estos

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Introduccin productos estn la leche, mayonesa, mantequilla, manteca de cerdo, queso, yemas de huevo y crema (Lee, 1999; Shim, 2003; Kim; 2004, Alonso, 2009, Astray, 2009). A diferencia de lo que ocurre con otros mtodos, se ha demostrado que en el tratamiento de la leche, la -CD no influye de manera estadsticamente significativa en la composicin de cidos grasos y triglicridos. Otras investigaciones agregan que en general los dems mtodos son relativamente no selectivos y remueven el flavor y componentes nutricionales en paralelo a la remocin del colesterol; asimismo, muchos requieren elevada inversin y altos costos de operacin (Lee, 1999; Alonso; 2009). II.7.- Reologa. La reologa es el estudio de la deformacin y el flujo de los materiales causados por la aplicacin de un esfuerzo. La necesidad de conocer las caractersticas reolgicas de un fluido tiene una gran importancia en la industria, ya que de estas propiedades dependen procesos importantes como: Clculos necesarios para ingeniera de procesos que implican el La influencia de un ingrediente de tipo funcional sobre el desarrollo de Control de calidad del producto. diseo de tuberas, bombas, mezcladores, intercambiadores de calor entre otros. un producto.

A su vez, de manera indirecta, se puede evaluar la microestructura del fluido y el efecto de varios factores sobre dicha microestructura (Muller, 1978). II.7.1.- Caracterizacin de los materiales. Uno de los principales objetivos de la reologa es la definicin y clasificacin de los materiales. Una forma de clasificar a los materiales es a travs de los trminos viscoso, elstico o viscoelstico. Material viscoso: un fluido viscoso ideal es incapaz de almacenar cualquier energa de deformacin. ste es deformado irreversiblemente cuando

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Introduccin se lo somete a cualquier esfuerzo; fluye y la energa de deformacin se disipa como calor. Los gases y los lquidos se describen normalmente como este tipo de fluidos (Bylund, 2003). Material elstico: un material elstico ideal almacena toda la energa de deformacin que se le imponga y una vez liberado del estrs se recupera totalmente. Los slidos presentan normalmente este comportamiento (Bylund, 2003, Sharma, 2003). Material viscoelstico: son materiales que muestran propiedades viscosas, elsticas y/o ms frecuentemente como una combinacin de ambas (Osorio Tobn, 2005), ya que almacenan parte de la energa de deformacin en su estructura, mientras que otra parte la pierden mediante flujo. Existen muchos ejemplos entre los diferentes alimentos, como ser geles, queso, etc. (Bylund, 2003). Los fluidos se caracterizan porque sus elementos se desplazan uno respecto a otro ante la aparicin de un esfuerzo. En la figura siguiente se representa un esquema del desplazamiento de un fluido.

Figura 10: Representacin de un fluido Newtoniano que fluye entre una placa inferior fija y una placa superior mvil, lo cual origina un perfil de velocidad (F = fuerza actuando sobre la placa, v = velocidad del fluido en movimiento) (Sharma, 2003).

El desplazamiento (concretamente, el perfil de la velocidad) para un nivel de esfuerzo aplicado puede variar de muchas formas. El perfil de velocidad puede ser proporcional o no al esfuerzo. Por otra parte, el fluido puede resistir un determinado nivel de esfuerzo antes de empezar a fluir. Si durante la aplicacin

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Introduccin de este esfuerzo inicial se deforma sin llegar a fluir (se recupera al cesar el esfuerzo), entonces es un fluido viscoelstico. La reologa de los fluidos estudia la relacin que existe entre la fuera motriz que provoca el movimiento (esfuerzo de corte, ) y la velocidad de flujo que se origina (el gradiente del perfil de velocidades, D). Estos conceptos pueden definirse como: Esfuerzo de corte (): Es la fuerza por unidad de rea aplicada Gradiente de velocidad (D): El esfuerzo de corte provoca el paralelamente al desplazamiento. desplazamiento ordenado de los elementos del fluido, que alcanzan velocidades relativas estacionarias (V). El gradiente de deformacin se define como el gradiente del perfil de velocidades: D= dVX / dy , o sea, mide la variacin de la velocidad en una direccin perpendicular (y) a la direccin del movimiento (x). Por otro lado, de la relacin de estas dos variables se infiere la viscosidad aparente: a = / D

sta nos indica la facilidad que tiene determinada sustancia para fluir ante la aplicacin de un esfuerzo cortante en condiciones determinadas. II.7.2.- Modelos reolgicos para alimentos fluidos. La descripcin precisa del flujo requiere una ecuacin que exprese la relacin entre y D en cualquier punto. Observando el comportamiento de diversos fluidos, se hace una clasificacin segn la relacin entre estas dos variables, formndose dos grande grupos: Fluidos Newtonianos. Fluidos no-newtonianos. II.7.2.1.- Fluidos Newtonianos. Los fluidos Newtonianos son aquellos que tiene una viscosidad constante, que depender de la temperatura pero no del esfuerzo de corte aplicado, presentando una proporcionalidad directa entre el esfuerzo de corte y el gradiente de velocidad o deformacin, que se obtiene en situacin de flujo laminar, siendo la

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Introduccin viscosidad la constante de proporcionalidad (Muller, 1977; Walstra, 1984; Bylund, 2003; Sharma, 2003). La ecuacin que relaciona el esfuerzo de corte y el gradiente de deformacin para este tipo de fluido es: = K . D Donde K es el ndice de consistencia, que en este tipo de fluidos coincide con la viscosidad. De esta forma, un fluido Newtoniano puede definirse mediante un nico valor de viscosidad para una determinada temperatura, denominada viscosidad verdadera () (Bylund, 2003). II.7.2.2.- Fluidos no-newtonianos. En este tipo de fluidos su viscosidad depende, adems de la temperatura, del gradiente de velocidad, no exhibiendo una respuesta lineal entre el esfuerzo de corte y el gradiente de velocidad. De esta forma, se puede definir una viscosidad aparente (a). La mayora de los alimentos muestran un comportamiento No-Newtoniano. A los productos lcteos se adicionan polmeros como espesantes o estabilizantes que tienen la propiedad de aumentar a, siendo agregados en baja cantidad (Muller, 1977; Walstra, 1984; Bylund, 2003; Sharma, 2003). Dentro de los llamados fluidos no-newtonianos se puede hacer una subclasificacin segn si la viscosidad, adems de variar con el esfuerzo de corte, varia durante el tiempo de aplicacin de tal esfuerzo. Independientes del tiempo: estos fluidos se pueden clasificar dependiendo de si tienen o no esfuerzo umbral (lmite de fluencia), es decir, si necesitan un mnimo valor de esfuerzo de corte para que el fluido se ponga en movimiento. I) Fluidos sin esfuerzo umbral: Fluidos pseudoplsticos y dilatantes: Muestran una relacin no lineal entre y D. La relacin entre estas dos variables en estos fluidos se puede representar por la ley de la potencia. = K . Dn 43

Introduccin K y n son parmetros del modelo de flujo. K se denomina ndice de consistencia y se relaciona directamente con la consistencia y viscosidad, mientras que n es el ndice de flujo. Para los fluidos pseudoplsticos se cumple que n es menor a 1, mientras que para los dilatantes n es mayor a 1. II) Fluidos con esfuerzo umbral: Este tipo de fluido se comporta como un slido hasta que sobrepasa un esfuerzo de corte mnimo (0 = lmite de fluencia) y a partir de dicho valor se comporta como un fluido. Son llamados plsticos. Plsticos de Bingham: requieren de la aplicacin de un esfuerzo

mnimo ( 0) antes de empezar a fluir, por lo que son representados por: = 0 + K . D Donde 0 es el esfuerzo necesario para iniciar el flujo. ecuacin: = 0 + K . D n En la siguiente grafica se compara el comportamiento de los distintos fluidos mencionados. Plsticos generales o Herschel-Bulkley (HB): representan un comportamiento ms general que engloba al de todos los anteriores con la

Figura 11: Esfuerzo de corte vs. Velocidad de corte para fluidos (Sharma, 2003).

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Introduccin

Los fluidos pseudoplsticos, Bingham y HB son aquellos que continuamente disminuyen su consistencia y viscosidad con el tratamiento mecnico (D), que son la mayora de los sistemas. Los dilatantes se comportan en forma contraria.
Tabla 9 : Valor de las constantes caractersticas de distintos alimentos (Steffe, 1996). Fluido Herschel-Bulkley Newtoniano Pseudoplstico Dilatante Bingham K >0 >0 >0 >0 >0 N 0<n 1 0<n<1 1<n 1

0
>0 0 0 0 >0

Ejemplo Pasta de pescado picado Agua, leche Salsa de manzana, pur de banana Algunos tipos de miel, solucin de almidn de maz. pasta de dientes

Dependientes del tiempo: Este tipo de fluidos se clasifican en dos tipos: Fluidos reopcticos: son aquellos en los cuales su viscosidad aumenta con el tiempo de aplicacin de la fuerza o accin mecnica, pudiendo volver total o parcialmente a su estado anterior tras un tiempo de reposo. Las emulsiones concentradas en grasa responden a este comportamiento. Fluidos tixotrpicos: son aquellos en los que su viscosidad disminuye al aumentar el tiempo de aplicacin del esfuerzo cortante, pudiendo recuperar su estado inicial despus de un reposo prolongado. Un sistema tixotrpico puede visualizarse como un fluido en que los enlaces qumicos (enlaces no covalentes: puente hidrgeno, hidrofbicos, fuerzas de Van der waals, etc.) se rompen, o en el que las partculas se alinean al aumentar el gradiente de velocidad, disminuyendo el rozamiento interno y, por ende, la viscosidad. En el comportamiento de flujo dependiente del tiempo el status quo se alcanza lentamente, a diferencia de los fluidos independientes del tiempo donde el estado estacionario se alcanza muy rpidamente (Quintns Riveiro, 2008). En las siguientes grficas se comparan los distintos comportamientos de los fluidos en relacin al tiempo. 45

Introduccin

Figura 12: Comportamiento de fluidos dependientes del tiempo de accin mecnica. A) Viscosidad aparente en funcin del tiempo de cizallamiento mecnico, B) Esfuerzo de corte en funcin del gradiente de deformacin (Sharma, 2003).

II.7.3.- Medicin de los parmetros reolgicos. Para estudiar el comportamiento reolgico de un fluido de forma rigurosa es necesario realizar medidas de viscosidad aparente en varias condiciones de esfuerzo de corte y de gradiente de deformacin. Las medidas de viscosidad se realizan con aparatos denominados viscosmetros o remetros. Este ltimo trmino se reserva para aparatos ms complejos que son capaces de explorar un amplio intervalo de esfuerzos de cortes y gradientes de deformacin, as como de registrar variaciones de los parmetros reolgicos con el tiempo de cizallamiento o accin mecnica. Las medidas de viscosidad siempre se han de llevar a cabo en un rango representativo de gradientes de velocidad y temperatura relacionados con el proceso en estudio (Bylund, 2003). El uso de remetros de espacio angosto se limita a gradientes de deformacin relativamente pequeos y, generalmente, movimiento oscilatorio de muy escasa amplitud, siendo por esto un mtodo no

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Introduccin destructivo de la muestra. A elevados gradientes de deformacin, el mtodo se convierte en destructivo (Sharma, 2003). Los diferentes remetros se clasifican por el fundamento en el que basan la medida, esta puede ser originando un flujo mediante una presin conocida (viscosmetros de flujo), o bien originando un movimiento circular en el interior de un receptculo (viscosmetros rotacionales) (Steffe, 1996). En la siguiente figura se muestran los diferentes remetros:

Figura 13: Diferentes tipos de remetros dentro de las familias rotacionales y tubera (Steffe, 1996).

II.7.3.1.- Viscosmetros de flujo. Estos son ms sencillos y dan buenos resultados cuando el fluido est libre de partculas en suspensin y el rango de viscosidad a medir es moderado. No sirven para medir fluidos dependientes del tiempo. Pueden ser usados en lnea. Existen diferentes tipos. Tipo Canon-Fenske: Un tubo capilar de cristal en el que el fluido cae por gravedad. Slo sirve para fluidos newtonianos de baja viscosidad, a un nico . El rango de aplicacin es limitado.

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Introduccin Capilar a alta presin: Mide el caudal de fluido que se establece al

establecer una presin en un extremo. Es rpido, sencillo, y requiere un caudal bajo de fluido. Tipo tubera: Como el anterior, pero usando cualquier tubera. Se basa en medir el caudal que provoca una cada de presin a travs de una longitud de una tubera cualquiera. Al igual que el anterior, requiere flujo laminar (que en este caso es ms difcil de conseguir que en el capilar) y el conocimiento del modelo de flujo (Steffe, 1996). II.7.3.2.- Viscosmetros rotacionales. Estos son equipos muy verstiles que pueden estudiar el comportamiento reolgico en cualquier rango, incluso en fluidos con partculas en suspensin. Son de gran precisin. Pueden estudiar tambin fluidos viscoelsticos. No pueden ser usados en lnea. En los viscosmetros de cilindros concntricos (como el Haake Rotovisco serie RV), un sensor gira dentro del fluido otorgndole un movimiento circular o tratamiento mecnico (cizallamiento). Por el principio de accin y reaccin el fluido responde intentando oponerse al movimiento que le impone el sensor, torsionando un resorte helicoidal calibrado que mide el torque necesario para vencer la resistencia viscosa. El grado de torsin del resorte es proporcional a la viscosidad del fluido, siendo detectado por un transductor (Sharma y col., 2003). Los de aspas o de agitador son probablemente los ms verstiles, pero por su geometra, la relacin D no puede ser deducida directamente, sino que el dispositivo ha de ser previamente calibrado con un fluido de reologa conocida en el rango a ensayar (Steffe, 1996). II.8.- Diseos experimentales. Un experimento diseado es una prueba o serie de pruebas en las cuales se inducen cambios deliberados en las variables de entrada de un proceso o sistema, de manera que sea posible observar e identificar las causas de los cambios en la respuesta de salida (Montgomery, 1991).

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Introduccin Para poder realizar y analizar un experimento de manera correcta, es necesario que se tenga una idea clara sobre el problema que se va a estudiar, el modo de la recoleccin de datos y su anlisis. Ms en particular se deben tener en cuenta aspectos como: Comprensin y planteamiento del problema en estudio. Eleccin de factores y niveles. Los factores son las variables manipuladas en el experimento (estas pueden ser tanto cualitativas como cuantitativas). Los niveles son los valores en los que se van a analizar las variables manipuladas. Seleccin de la variable de respuesta. Seleccin del diseo experimental. Realizacin del experimento. Anlisis de datos. Conclusiones. El experimentador debe extraer conclusiones prcticas de los resultados y recomendar un curso de accin. II.9.- Anlisis sensorial. La valoracin sensorial es una funcin que la persona realiza consciente o inconscientemente al aceptar o rechazar los alimentos de acuerdo con las sensaciones experimentadas al observarlos o ingerirlos. El juicio sensorial que da un consumidor sobre un producto alimenticio est influenciado por el mismo individuo, el alimento y el contexto social, por lo que a resumidas cuentas se puede decir que el valor que se le otorga a un alimento depende de: Caractersticas fsico-qumicas y estructurales del alimento. Propiedades fsicas del alimento. Condiciones fisiolgicas del individuo. Condiciones psicolgicas del individuo. Condiciones tnicas y sociolgicas. La necesidad de adaptarse a los gustos del consumidor obliga a que, de una forma u otra, se intente conocer cul ser el juicio crtico del consumidor en la valoracin sensorial que realizar del producto alimentario (Sancho, 1999). 49

Introduccin II.9.1.- Pruebas hednicas o de aceptacin. Estas pruebas se utilizan para evaluar la aceptacin o rechazo de un producto determinado. El grupo de individuos evaluadores deben ser catadores inexpertos que pueden ser elegidos al azar o bien seleccionados por aspectos concretos (edad, sexo, hbitos sociales de consumo, entre otros). La formulacin de la pregunta debe cuidarse en extremo, ya que en estos casos puede condicionar la respuesta, sobre todo si se llama la atencin sobre aspectos que normalmente no son claramente diferenciados por el consumidor. Generalmente los ensayos de aceptabilidad se suelen llevar a cabo en ambientes lo ms prximos a la realidad, en ensayos de situacin natural, de campo, aunque tambin pueden realizarse en laboratorios y en condiciones ms controladas (Sancho, 1999). Las muestras a evaluar son presentadas en forma simultnea y el sujeto debe determinar cuanto le gusta o disgusta el producto y marcar en la posicin de la escala segn corresponda. La naturaleza de esta prueba es su simplicidad relativa. Las instrucciones que acompaan la escala son breves. Permiten al sujeto hacer sus propias inferencias sobre el significado de las categoras de escala y determinar cmo las aplicar a las muestras (ASTM, 1968). La Escala Hednica est determinada por una escala verbal numrica impar (con nueve categoras diferentes), con los lmites desde me gusta muchsimo hasta me disgusta muchsimo. II.10.- Aspectos tecnolgicos. II.10.1.- Procesos utilizados en la elaboracin. II.10.1.1.- Tratamiento trmico. Este proceso es realizado con el fin de: Eliminar las formas vegetativas de los microorganismos patgenos. Reducir la poblacin microbiana total en ms de un 99%. Las bacterias viables que queden en la mezcla de fermentacin van a aumentar su poblacin (sobre todo los microorganismos mesfilos), pudiendo afectar el desarrollo de las bacterias lcticas del cultivo iniciador y las

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Introduccin caractersticas organolpticas y tecnolgicas del producto final. Este proceso tambin busca aumentar la solubilidad de los componentes de la mezcla adems de desnaturalizar parcialmente las protenas de suero, mejorando la textura del producto final y reduciendo la sinresis (separacin del suero durante la conservacin del queso) (Spreer, 1991). II.10.1.2.- Homogeneizacin. La homogenizacin estabiliza la mezcla, debido a que disminuye el tamao de los glbulos grasos, aumentando de cuatro a seis veces la superficie de la interfase grasa/suero debido al efecto de varios factores, como turbulencia y cavitacin. Los nuevos glbulos grasos se estabilizan debido a la incorporacin de casena en sus membranas. Adems esta etapa colabora con la disolucin de algunos componentes de la mezcla de fermentacin que no pueden ser disgregados con agitacin (Spreer, 1991). Un esquema del proceso de homogeneizacin se muestra a continuacin.

Figura 14: Esquema del proceso de homogenizacin(http://class.fst.ohiostate.edu/Dairy_Tech/10.0%20 Homogenization.htm).

II.10.1.3.- Fermentacin.

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Introduccin El proceso de fermentacin se realiza a 39C y comienza con el agregado de los fermentos y el cuajo. Durante la fermentacin se produce la coagulacin de la casena de la leche, la formacin del gel y aumento de la viscosidad. En este proceso se intenta conseguir una viscosidad elevada para evitar que el gel pierda suero por exudacin y para que adquiera su consistencia tpica cremosa y untable (Spreer, 1991). El gel se desarrolla de forma ptima cuando la mezcla permanece en reposo total durante la fermentacin. Se intenta disponer las etapas de fabricacin y las instalaciones tecnolgicas de tal forma, que el gel est expuesto a los menores esfuerzos mecnicos posibles (Spreer, 1991).

II.10.1.4.- Enfriamiento. Una vez que la mezcla, a travs de la fermentacin, llega al pH deseado, debe frenarse este proceso, ya que si siguiese, el pH disminuira demasiado, afectando la consistencia y desmejorando las caractersticas organolpticas del producto final. Para tal fin, luego de finalizada la fermentacin se lleva a al queso a una temperatura menor a los 5 C, la cual, junto con el pH bajo tienen un efecto sinrgico en la disminucin de la actividad de las bacterias fermentativas y de bacterias que puedan deteriorar las caractersticas del producto (Spreer 1991). II.10.1.5.- Almacenamiento. Luego de terminada la fermentacin y enfriado el producto, es de fundamental importancia mantenerlo a una temperatura inferior a los 5 C para evitar el crecimiento de levaduras, hongos y bacterias que puedan afectar las caractersticas del producto disminuyendo su vida til.

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Materiales y Mtodos III.- Materiales y Mtodos. III.1.- Diseo estadstico. Se utiliz un diseo cbico denominado Box-Behnken (Montgomery, 1991), que permite estudiar la influencia de tres variables en tres niveles {X1 = porcentaje de materia grasa (%MG) = 6,5; 8,25 y 10%; X2 = R1 = relacin PS/LPD [% de reemplazo de LPD por WPC 35 (para aumentar un 5 % los S.T.) = 0; 50 y 100 % ; X3 = R2 = Relacin entre microorganismos probiticos = SP1/BLC1 (SP1= Lactobacillus casei ssp. Rhamnosus y BLC1 = Bifidobacterium animalis ssp. Lactis) = 0, 50 y 100 % BLC1 respecto a la dosis recomendada, el resto es SP1] }. El nmero total de experiencias es 19, con 15 correspondientes al diseo Box-Behnken original (puntos azules + 2 repeticiones en el centro), 2 correspondientes a los CS y CI (cuadrados verdes), y 4 experiencias complementarias (puntos rojos). Su representacin es:

Figura 15: Esquema del modelo BoxBehnken Modificado mas las experiencias complementarias.

Se agregaron experiencias adicionales; dos denominadas centros superior e inferior (CS y CI) dando lugar al diseo Box-Bhenken modificado (DBBM), y 4 experiencias complementarias. Esto posibilita realizar tres estudios factoriales, de 2 variables en 3 niveles, parametrizando en el valor central de la tercer variable no analizada en cada caso (X1 y X2, manteniendo constante X3 en su valor medio; X1

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Materiales y Mtodos y X3 , manteniendo constante X2 en su valor medio y X2 y X3 , manteniendo constante X1 en su valor medio).

X1 = cte , varan X2 y X3. X2 = cte , varan X1 y X3. X3 = cte , varan X1 y X2.

Planos factoriales, manteniendo constantes c/u de las variables de diseo, en su valor medio.

Esto permite aplicar la metodologa de Superficie de Respuesta y Lneas de Contorno, logrndose realizar anlisis ms pormenorizados. De las tres posibilidades, en este trabajo se analizaron las respuestas correspondientes a X2 constante (2,5 % de agregado de WPC 35 y 2,5 % de LPD).
Tabla 10: Experiencias pertenecientes al plano de X2 constante. Variables Codificadas N Exp. 2 4 CM 11 13 CS CI 17 19 CM CM X1 % MG 10 6,5 8,25 10 6,5 8,25 8,25 10 6,5 8,25 8,25 X3 % SP1 0 0 50 100 100 100 0 50 50 50 50 X1 1 -1 0 1 -1 0 0 1 -1 0 0 X3 -1 -1 0 1 1 1 -1 0 0 0 0

55

Materiales y Mtodos III.2.- Experiencias en Planta Piloto. III.2.1.- Etapas de elaboracin. III.2.1.1.- Obtencin de la mezcla base inicial sin colesterol. III.2.1.1.1.- Reconstitucin de la leche en polvo entera y disolucin de la crema de leche. Las diferentes concentraciones de materia grasa se obtuvieron utilizando distintas relaciones de leche en polvo entera y crema de leche con 50 % MG. Se mezcl leche en polvo entera (LPE) y la crema de leche (Cotapa S.A.) en cantidades adecuadas para obtener el % grasa segn diseo. Para lograr la correcta disolucin de estos componentes se los disolvi en agua a 50C, se agit durante 10 minutos, se calent a temperatura de pasteurizacin (75 C) y se homogeneiz (Gaulin Corp.; Berln, Alemania) en una etapa a 150 atm (Spreer, 1991). Posteriormente se enfri a 20 C y se agreg -ciclodextrina en concentraciones entre 1,5 y 3 %, segn el % de grasa manteniendo la relacin 1 % -CD/3,5 % MG, para formar el complejo con el colesterol. Se agit durante 20 minutos (tiempo de contacto -CD/colesterol) y se centrifug a 700 ges durante 30 minutos (MSE, Mistral 4L), con el fin de separar en el precipitado el complejo (-CD)-colesterol y obtener, en el sobrenadante, la mezcla base inicial para queso sin colesterol (< 5mg%). III.2.1.2.- Produccin de queso probitico sin colesterol. A la mezcla base inicial se le agregaron los gelificantes (0,1% de goma guar y 0,05% de gelatina, Gelfix S.A.), estabilizante (0,24%, Veneto S.A.), CaCl2 (200 ppm, Cicarrelli S.R.L.) y leche parcialmente descremada y/o WPC 35 (Milkaut S.A.) en cantidades segn el diseo. Se agit durante 10 minutos, se calent a 85 C durante 15 segundos con el fin de reducir la carga microbiana de la mezcla y favorecer la disolucin de los componentes, homogeneizndose a 100 atm para evitar la posible formacin de agregados. Posteriormente se adicion el cuajo bovino (0,3 mL / 200 g de muestra, dilucin 1/100), los microorganismos probiticos (0,025 g / 200 g de muestra) y el cultivo iniciador/acidificante de yogur (0,004 g / 200 g de muestra).

56

Materiales y Mtodos Se envas en frascos de vidrio estriles que se colocaron en un bao termosttico (Haake Thermostatic S.L.) a la temperatura de fermentacin 40 0,1 C. La fermentacin se continu durante 8-12 hs, hasta lograr un pH de 4,9 , luego de lo cual se homogeniz a baja presin (100 atm, 10 s) para otorgarle adecuadas caractersticas texturales (suavidad superficial y brillo). Posteriormente se enfri la muestra hasta 5 C, almacenndose a esta temperatura. Todas las cantidades fueron optimizadas en experiencias preliminares. Durante la fermentacin se extrajeron muestras cada 40 minutos aproximadamente a la cuales se les determin acidez titulable y pH. Todos los pasos se realizaron bajo estrictas condiciones de esterilidad. III.3.- Experiencias en laboratorio. III.3.1.- Cuantificacin del colesterol en la mezcla inicial. En la mezcla inicial obtenida luego del tratamiento con -ciclodextrina, se cuantific la concentracin de colesterol para verificar que posee la cantidad necesaria para cumplir con dicha condicin y poder clasificarla como exenta de colesterol. Se midieron 6 ml de la mezcla inicial diluida 1/2 para las muestras de 6,5% de grasa, y a 1/3 para las muestras de 8,25% y 10% de grasa, a fin de utilizar la tcnica empleada para la determinacin de colesterol en leche (3 % materia grasa) y se colocaron en un tubo falcon de 50 ml. Se adicion 7,5 ml de KOH etanlico 2M y se sumergi en un bao termosttico a 80 C 0,1C. Se mantuvo a esta temperatura durante 1 hora (saponificacin). Se dej enfriar la muestra a temperatura ambiente. Se le adicion 5 ml de agua destilada y se mezcl el contenido en un vrtex (Decalab; Norces S. A., Sta. Fe, Arg.) durante 20 segundos. Se adicion 5 ml de n-hexano (Cicarelli S.R.L.). Se mezcl nuevamente por 20 segundos en un vrtex y se centrifug. Se extrajo de la capa superior (fase orgnica que contiene el colesterol) 3 ml de n-hexano y luego se verti este volumen en un tubo de vidrio de boca ancha. Se repiti este procedimiento agregndo un total de 15 ml de n-hexano, extrayndose en total 12 ml y llevndo posteriormente los tubos a estufa a baja temperatura (40-45 C) durante 24 horas. Luego se terminaron de secar por completo con una corriente de nitrgeno. 57

Materiales y Mtodos El residuo seco se redisolvi en 200 L alcohol isoproplico. Se tom una alcuota de 20 L y se le agreg 1 ml de reactivo color preparado en el momento, segn las indicaciones del fabricante. Los tubos conteniendo el reactivo se colocaron en bao de agua a 37C durante 15 minutos. Una vez transcurrido dicho tiempo se dej enfriar a temperatura ambiente y luego se ley la absorbancia en un espectofotmetro UV-Visible (Milton Roy; Nueva York, EEUU), a una longitud de onda de 510 nm contra blanco de reactivo. El testigo se prepar con una solucin de colesterol estndar de concentracin 2 g/L tomando una alcuota y adicionndole 1ml de reactivo color. Las muestras, el testigo y el blanco de reactivo se incubaron al mismo tiempo. La concentracin de colesterol en la muestra se calcul segn la Ley de Lambert-Beer como: At = K . C t Am = K . C m entonces Cm = Ct * Am At

Donde: At = Absorbancia del testigo (patrn). Am = Absorbancia de la muestra incgnita. Ct = Concentracin de colesterol en el testigo (2 g/L). Cm= Concentracin de colesterol en la muestra incgnita. III.3.2.- Determinaciones fisicoqumicas. III.3.2.1.- Determinacin de pH y acidez. Se determin el pH con un pHmetro potenciomtrico (Herizau modelo 508 A), y la acidez Dornic por titulacin directa con Na(OH) N/9 (AOAC, 1995), tomando muestras durante la fermentacin, cada 40 minutos aproximadamente hasta obtener un pH=4,9. Adems se determin el pH a las 24 hs y una semana despus de finalizada la fermentacin. III.3.2.2.- Clculo de los parmetros cinticos de acidificacin. Para calcular la constante de velocidad de las reacciones de acidificacin y el orden de reaccin, a travs de regresin no lineal (Statistica, 1993), se utilizaron los valores de acidez Dornic obtenidos durante la fermentacin, para calcular la

58

Materiales y Mtodos concentracin de cido lctico (tomado como referencia), y se aplic el Modelo Cintico Integral (Rozycki, 2003; Rozycki, 2007): C = [k . (1 n) . t + C0(1-n) ]1 / (1-n) (10) Donde: C = concentracin de cido lctico [mol/l] a cada instante t. C0 = concentracin de cido lctico [mol/l] inicial. t = tiempo de fermentacin [min]. k = constante global especfica de velocidad de reaccin [min-1]. n = orden global de reaccin [adimensional]. III.3.2.3.- Determinacin de retencin de agua (IRA %). Se pes una muestra de queso untable (aproximadamente 50 g) a 5 C, se centrifug a 500 ges durante 20 minutos. Posteriormente se elimin el suero liberado y se volvi a pesar. Se calcul el ndice de retencin de agua porcentual (IRA %) (Kalab, 1976): IRA % = 100 - [(P1 P2) /] 100 P1 P1 = Peso de la muestra antes de la centrifugacin. P2 = Peso de la muestra despus de la centrifugacin. III.3.3.- Determinaciones reomtricas. Luego de 24 hs de obtenido el producto, y una semana despus, se realizaron experiencias reolgicas para cuantificar las caractersticas de flujo y tixotrpicas, y la influencia que las variables del diseo tienen sobre las mismas (Clark, 1987). Se realizaron los reogramas de esfuerzo de corte () en funcin del gradiente de deformacin (D), utilizando un viscosmetro de cilindros concntricos (Rotovisco Haake RV2, Mess-Technik, Germany, sensor MVIII celda 500 N x cm), variando el gradiente de deformacin en forma ascendente primero, desde 0 hasta 130 s-1, y descendente despus, desde 130 a 0 s-1.

59

Materiales y Mtodos Aplicando un modelo reolgico adecuado se cuantificaron los parmetros reolgicos que definen el tipo de flujo del producto (K y n) (Rozycki, 1995). Dicho modelo fue: Ley de Potencia: = Esfuerzo de corte (mPa). K = ndice de consistencia (mPa.sn). n = ndice de comportamiento. A partir de este modelo: a = viscosidad aparente. Linealizando esta ltima ecuacin se obtiene K de la ordenada al origen y n de la pendiente de la recta obtenida: Ln a = Ln K + (n - 1) Ln D III.3.3.1.- Viscosidades caractersticas. Se calcularon tres viscosidades caractersticas: i , 50 , f. La primera (viscosidad inicial = i) se calcula como la pendiente en el origen, del reograma: vs D, y representa el esfuerzo mximo inicial que debe vencer el sistema de impulsin del producto (bomba), para poder mover el fluido. La segunda (viscosidad en la masticacin o de Kokini = 50) se calcula como el cociente entre el esfuerzo de corte, medido a un gradiente de deformacin de 50 s-1, y dicho gradiente, y representa la viscosidad con que el producto se comporta en una masticacin normal, durante su evaluacin sensorial. La tercera (viscosidad final = f) se calcula como el cociente anterior, utilizando el gradiente de deformacin mximo ensayado (130 s-1), y representa aproximadamente el gradiente que posee el producto en estudio al trasladarse a travs de una caera, ya que los productos viscosos presentan, en esta situacin, gradientes entre 100 y 200 s-1 (Rozycki y Seguro, 1995). = K. D n = K. D n-1 D = K. D n

/ D = a = K. D n-1

60

Materiales y Mtodos III.3.3.2.- Tixotropa. III.3.3.2.1.- ndice de tixotropa. Se calcul el ndice de Tixotropa (IT), puesto de manifiesto por el bucle de histresis obtenido en los reogramas experimentales, a partir del rea encerrada entre las curvas ascendentes y descendentes (fig. 16). Este ndice muestra la dependencia de las caractersticas reolgicas en funcin del tiempo de accin mecnica sobre el producto. El IT est relacionado con los enlaces no covalentes, como puentes de hidrgeno, interacciones hidrofbicas e interacciones electrostticas, entre otros.

Figura 16: Reograma caracterstico. El rea coloreada indica el ndice de tixotropa.

El rea se calcul con la ecuacin siguiente: IT = D. (sup - inf) Donde: IT: ndice de tixotropa [mPa/s]. sup: medido en la curva superior a intervalos de D = 15 s-1 [mPa]. inf: medido en la curva inferior a intervalos de D = 15 s-1 [mPa]. D: variacin del gradiente de deformacin (15 s-1).

61

Materiales y Mtodos III.3.3.2.2.- Determinacin del esfuerzo de corte en funcin de tiempo de cizallamiento. Para cuantificar parmetros tixotrpicos que permitan caracterizar este comportamiento, se monitore la evolucin del esfuerzo de corte en funcin del tiempo de cizallamiento a un D = 50 s-1 constante (gradiente utilizado en una masticacin normal), utilizando el viscosmetro antes descripto. Se modelaron las propiedades dependientes del tiempo a travs de un modelo reolgico adecuado, como el Modelo de Weltman (Rozycki y Seguro, 1995): a = A + B . Ln t Donde: a: viscosidad aparente [mPa.s]. A: tensin mxima inicial [mPa.s]. B: coeficiente de ruptura tixotrpica [mPa.s]. t: tiempo [s]. La tensin mxima inicial (A) es una medida de la resistencia inicial de la matriz alimenticia a ser deformada o alterada estructuralmente y B es una medida de la velocidad de destruccin estructural que sufre el sistema debido a la accin mecnica ejercida, lo cual depende principalmente del gradiente de deformacin utilizado y la temperatura. Conjuntamente estos parmetros representan la resistencia de la estructura reticular tridimensional que presenta un sistema (Rozycki y Seguro, 1995). III.4.- Evaluaciones sensoriales. Se realizaron ensayos de evaluacin de aceptabilidad general, con evaluadores no entrenados, en las 3 experiencias que, en principio, permitieron obtener las mejores caractersticas desde el punto de vista textural y de sabor. stas se termostatizaron a 10 C y se presentaron codificadas con nmeros aleatorios de tres cifras. Se evaluaron dos caractersticas: sabor y untabilidad utilizando un descriptor por grado de gusto con una escala de 9 niveles, que vari de me disgusta muchsimo a me gusta muchsimo.

62

Materiales y Mtodos Para realizar esta prueba se cont con 91 evaluadores. Cada evaluador unt tres galletitas de agua con cada una de las muestras a testear, realizando en ese momento la evaluacin de untabilidad. Luego degust cada una de las muestras otorgndole la puntuacin correspondiente. Entre muestra y muestra el evaluador tom un vaso de agua, para minimizar el efecto de memoria del sabor anterior. III.5.- Recuento de microorganismos probiticos. Se realiz un recuento selectivo (para inhibir la microflora acidificante: S. thermophilus y L. delbrueckii, ssp. bulgaricus) y diferencial de ambos microorganismos probiticos mediante la tcnica de recuento de clulas viables en superficie, utilizando el medio de cultivo MRS agar suplementado con Cloruro de Litio y Propianato de sodio (MRS- LP) (Vinderola y Reinheimer, 2000). Se verific previamente que el medio de cultivo empleado es capaz de inhibir el desarrollo de la microflora acidificante sin inhibir el desarrollo de las bacterias probiticas empleadas. Se realizaron diluciones decimales (1:10) del queso untable en agua de peptona 0,1%. Se seleccionaron las diluciones ms apropiadas (generalmente: 10-4, 10-5 y 10-6) y se sembraron (0,1 ml) en superficie en placas de Petri conteniendo agar MRS-LP. Las placas se incubaron en anaerobiosis (GenBox, Biomrieux) por 72 hs a 37 C. Se contaron las colonias tpicas para L. casei (colonias redondas blancas, 2-3 mm dimetro) y bifidobacterias (colonias puntiformes planas, 1 mm dimetro), cuya morfologa celular se confirm luego por observacin directa (gota fresca) por microscopia ptica de contraste de fases (1000x).

63

Resultados y Discusin IV.-Resultados y discusin. Se analiz el plano factorial que mantiene constante la variable X2 en su valor medio, o sea, agregado de 2,5% de WPC 35 y 2,5% de leche en polvo descremada, para aumentar el % de slidos finales del producto, estudiando la variacin del % de grasa en la formulacin inicial (X1) y la relacin entre ambos microorganismos probiticos (X3 = R2 = SP1/BLC1 (SP1 = Lactobacillus casei ssp. Rhamnosus y BLC1 = Bifidobacterium animalis ssp. Lactis). IV.1.- Eficiencia extraccin de colesterol en la mezcla base inicial. Se comprob, en 3 muestras del diseo, tomadas al azar y con diferentes contenidos de MG, que el % extraccin de colesterol (% EC) siempre fue superior al 85 %, obtenindose muestras con un contenido del mismo < 5 mg%.
Tabla 11: Experiencias de extraccin de colesterol. Concentraciones de colesterol (mg %) X1 X3 Cinicial a Cfinal b %SP1 (% MG) 10 0 36,52 2,16 4,82 8,25 50 29,13 1,87 3,23 6,5 100 22,85 1,54 2,19

N Exp. 2 CM 13
a b

% EC 86,8 88,9 90,4

= Concentracin de colesterol en la mezcla base lctea inicial. = Concentracin de colesterol en la mezcla base lctea final, luego de la extraccin.

Se observa que se cumple que cuanto mayor es el % de grasa lctea, menor es el % de extraccin del colesterol, habida cuenta que al incrementarse este componente, la homogenizacin es menos eficiente (Spreer, 1991), lo cual produce una disminucin de la cantidad de colesterol liberado desde el glbulo graso, dificultndose su extraccin por estar menos disponible para el acomplejamiento con la -CD. IV.2.- Determinaciones fsicas. IV.2.1.- Determinacin de los parmetros cinticos de la velocidad de acidificacin. Se calcularon los valores del coeficiente global de velocidad de acidificacin (k) y el orden de las reacciones de acidificacin (n) para cada experiencia, a travs de regresin no lineal, utilizando el Modelo Cintico Integral (MCI) (tabla 12). 65

Resultados y Discusin
Tabla 12: Valores de los parmetros de la cintica de velocidad de acidificacin. Variables Codificadas X1 X3 N Exp. X1 X3 k (min-1) n %SP1 (% MG) 2 10 0 1 -1 0,0023 1,2 4 6,5 0 -1 -1 0,0388 1,96 CM 8,25 50 0 0 0,0216 2,03 11 10 100 1 1 0,0129 1,92 13 6,5 100 -1 1 0,0297 1,94 CS 8,25 100 0 1 0,0256 1,99 CI 8,25 0 0 -1 0,0308 1,96 17 10 50 1 0 0,0151 1,97 19 6,5 50 -1 0 0,0276 1,93 CM 8,25 50 0 0 0,0221 2,05 CM 8,25 50 0 0 0,0209 2,01

r2 0,94 0,92 0,92 0,89 0,93 0,92 0,95 0,91 0,85 0,91 0,94
2

El modelo cintico integral ajust adecuadamente, obtenindose valores de r mayores a 0,85.

El promedio de k para el grupo analizado fue 0,0225 min-1 con un valor mximo de 0,0388 min-1 perteneciente a la experiencia 4 y un valor mnimo de 0,0023 min-1 en la experiencia 2. El modelo obtenido es el siguiente: k (min-1) = 0,02249 0,01097 * X1 0,0006166 * X3 + 0,004925 * X1 * X3 r2= 0,8372 De este modelo se infiere, comparando los coeficientes de los trminos lineales de las variables, utilizadas en forma codificada, que al disminuir el porcentaje de materia grasa k aumenta. Se observa el mismo comportamiento al disminuir la relacin entre SP1/BLC1, aunque la influencia de X 1 es mucho mayor (casi veinte veces mayor) que X3. El aumento de la materia grasa conlleva a una mayor compactacin y gomosidad de la matriz, hacindose menos prorosa (Scott, 1998; Reinheimer y Zalazar, 2006), lo que podra disminuir la movilidad de los distintos componentes y su posterior transformacin, por ejemplo de la lactosa a cido lctico, disminuyendo el k. Adems, esta menor movilidad podra producir una acumulacin temporal de cido lctico alrededor de las bacterias productoras del mismo, incrementando su efecto inhibidor sobre ellas. Hay interaccin directa y estadisticamente significativa, entre las variables, que indica que la influencia de una de ellas depende del nivel de la otra variable. 66

Resultados y Discusin La superficie de respuesta y las lineas de contorno obtenidas para este modelo respresentan en las siguientes grficas:
Design-Expert Software K 0.0388 0.0023 X1 = A: X1 X2 = B: X3
0.039

0.02975

0.0205

K
0.01125 0.002 -1

A: X1

0 0 1 -1

B: X3

Figura 17: Representacin de la superficie de respuesta del modelo obtenido para k.

Design-Expert Software
1

K Design Points 0.0388 0.0023 X1 = A: X1 X2 = B: X3

0.0284048
0

0.0231076 3

0.0178104

0.0125131 0.033702

-1 -1 0 1

X1: A: X1 X2: B: X3

Figura 18: Representacin de las lneas de contorno del modelo obtenido para k.

Del anlisis de los datos obtenidos para n, se resalta que el valor promedio de n fue 1,905 con un valor mximo de 2,05 en el punto central del modelo y un valor mnimo de 1,2, correspondiente a la experiencia 2, siendo valores elevados que indican que la velocidad de acidificacin depende fuertemente de la concentracin de cido lctico.

67

Resultados y Discusin No se pudo obtener un modelo, pero existe una tendencia (0,70 < r 2 < 0,80) que indica que n depende en forma directa de X1 , por lo que se puede predecir que un aumento de la materia grasa eleva esta dependencia descripta para la velocidad de acidificacin, respecto a la concentracin del cido lctico, posiblemente por la compactacin de la matriz y la acumulacin zonal del cido, antes mencionados. IV.2.2.- Determinacin de pH y acidez durante la fermentacin. El pH siempre decreci en funcin del tiempo de fermentacin. La acidez aument continuamente. Ambas evoluciones presentan una forma sigmoide observndose, a los menores y mayores tiempos de fermentacin, una menor velocidad de cambio de estos parmetros (plateau). A cortos tiempos de fermentacin se debe a que los fermentos responsables de generar estos cambios se agregan liofilizados, y necesitan un tiempo de solubilizacin y acondicionamiento al medio (activacin). A largos tiempos de fermentacin esto se debe al efecto inhibitorio parcial de los mismos cidos generados, principalmente el cido lctico, sobre los fermentos.

Figura 19: Evolucin del pH vs. tiempo de fermentacin.

68

Resultados y Discusin

Figura 20: Evolucin de la acidez vs tiempo de fermentacin.

En todos los casos el pH, luego de una semana de almacenamiento, tuvo valores entre 4,4 y 4,8 , con una acidez final entre 100 y 140 D. IV.2.3.- Determinacin del coeficiente de variacin porcentual del pH durante el almacenamiento (cv%). Con el fin de observar como el tiempo de almacenamiento influa en el pH, lo que podra afectar la vida til del producto, se analiz la variacin porcentual del pH tomando como punto inicial el pH en el final de la fermentacin y como punto final, el pH despus de pasada una semana. Los valores de cv% aparecen en la siguiente tabla:
Tabla 13: Valores de los coeficientes de variacin de pH. N Exp. 2 4 CM 11 13 CS CI 17 19 CM CM X1 (% MG) 10 6,5 8,25 10 6,5 8,25 8,25 10 6,5 8,25 8,25 X3 % SP1 0 0 50 100 100 100 0 50 50 50 50 cv% 3,64 7,33 4,68 5,84 8,51 7,33 2,06 1,54 8,51 4,72 4,51

69

Resultados y Discusin Mediante regresin mltiple, se observ la relacin entre el contenido de materia grasa, la relacin entre los microorganismos probiticos y el coeficiente de variacin porcentual de pH, obtenindose el siguiente modelo: cv %= 4,6600 2,22167 * X1 + 1,44167 * X3 + 0,25500* X1 * X3 + 1,23500 * X12 r2= 0,8037 Del anlisis del modelo obtenido se puede inferir que ambas variables afectan en un orden similar al coeficiente de variacin porcentual, aunque en mayor medida la grasa, adems hay interaccin estadisticamente significativa entre las variables, con influencia positiva. Del anlisis de cmo influye en particular cada variable segn el modelo obtenido, se observa que un aumento de Bifidobacterium animalis ssp lactis (disminucin de X3) se relaciona con un aumento de la estabilidad del pH del producto obtenido (menor cv %), lo que puede ser debido a que las bifidobacterias no poseen alta actividad a la temperatura de refrigeracin (5 C) y adems producen pequeas cantidades de acido actico, el cual posee un leve efecto inhibitorio sobre otras bacterias como Lactobacilos y Streptococos (Samona, 1996). Por otro lado, el aumento en la materia grasa tambin genera un menor cv % y, por ende, una estabilizacin en el pH del producto, el cual podra estar relacionado a una menor disponibilidad de nutrientes por parte de las bacterias encargadas de la acidificacin, debido a la mayor compactacin de la matriz alimenticia que genera la grasa. Los siguientes grficos muestran la superficie de respuesta y las lneas de contorno que describen lo mencionado:

70

Resultados y Discusin
Design-Expert Software cv % 8.51 1.54 X1 = A: X1 X2 = B: X3
9.4

7.425

5.45

cv %

3.475

1.5 1

-1 0 1 -1

B: X3

A: X1

Figura 21: Representacin de la superficie de respuesta del modelo obtenido para cv %.

Design-Expert Software
1

cv %

cv % Design Points 8.51 1.54 X1 = A: X1 X2 = B: X3

6.86111
0

8.08222

5.64

3 4.41889

3.19778

-1 -1 0 1

X1: A: X1 X2: B: X3

Figura 22: Representacin de las lneas de contorno del modelo obtenido para cv %.

IV.2.4.- Determinacin del ndice de Retencin de agua (IRA). El % RA, en condiciones aceleradas (centrifugacin), fue siempre superior al 98 %, luego de 1 semana de almacenamiento. En ms del 75 % de las muestras el cogulo no liber suero (IRA = 100 %) mostrando una gran estabilidad.

71

Resultados y Discusin IV.3.- Determinaciones microbiolgicas. Se eligieron 5 muestras al azar, con diferentes contenidos de materia grasa y protenas de suero. A cada una se le cuantific la concentracin de cada microorganismo probitico (MP) una vez por semana, durante toda su vida til (un mes), obtenindose, en todos los casos, un conteo > 10 7 UFC/g. En todos los casos se observ una disminucin de la concentracin de los microorganismo probiticos (MP) entre la 2da y 3er semana de almacenamiento, siempre menor al 30 % y manteniendo el valor > 10
7

UFC/g. Esto se podra

explicar a travs de una inhibicin parcial de los mismos, por efecto de la disminucin de pH producida principalmente por las bacterias del yogur. El leve aumento hacia el final de la vida til (10 a 20 %) se podra originar por la acumulacin de sustancias prebiticas producto del metabolismo de los microorganismos presentes (cido frmico, valina, etc.) (Reinheimer y Zalazar, 2006). IV.4.- Determinaciones reolgicas. IV.4.1.- ndice de consistencia (K) y de comportamiento (n). Las curvas obtenidas presentan la siguiente forma:

. vs. D

400,0 350,0 300,0 (mPa) 250,0 200,0 150,0 100,0 50,0 0,0
10 6 11 9 13 2 26 13 40 53 66 79 92 0

D. 1/s

Figura 23: Perfil tpico obtenido del anlisis del esfuerzo de corte ( ) vs gradiente de deformacin (D) (experiencia 15).

72

Resultados y Discusin Los valores del ndice de consistencia (K) fueron calculados con el modelo reolgico propuesto, y se muestra en la siguiente tabla:
Tabla 14: Valores de K y n de las curvas ascendentes. X1 (% MG) 10 6,5 8,25 10 6,5 8,25 8,25 10 6,5 8,25 8,25 X3 % SP1 0 0 50 100 100 100 0 50 50 50 50

N Exp. 2 4 CM 11 13 CS CI 17 19 CM CM

Ka (mPa.s) 699,24 379,93 788,39 477,23 601,84 742,48 528,48 1452,43 772,78 804,32

r2 0,994 0,999 0,999 0,999 0,999 0,999 0,999 0,987 0,994 0,989

K a = Valores de ndice de consistencia obtenidos de la parte ascendente de la curva.

Se observa que el modelo elegido, deducido de la Ley de Potencia, ajusta bien el comportamiento de la curva ascendente (r2 > 0,99, en todos los casos). Los valores de K ascendentes pudieron calcularse obtenindose un valor promedio de 724,71 Pa.sn con un valor mximo de 1452,43 Pa.sn (para la experiencia 19) y un valor mnimo de 379,93 Pa.sn (para la experiencia 4). De estos valores se pudo obtener un modelo que predice el ndice de consistencia teniendo en cuenta las variables analizadas. Dicho modelo es: K (mPa.s)= 727,29 912,87* X1 187,73* X12 + 961,54*X1*X32 r2= 0,8703 Este modelo muestra que el contenido de materia grasa es la nica variable estadsticamente influyente. Al aumentar sta la consistencia disminuye, lo que podra deberse a que al aumentar el contenido de materia grasa disminuye la concentracin de casena, ya que el % ST es constante, lo cual hace disminuir el nmero de sitios activos para la gelificacin, habida cuenta que la casena de la leche posee una funcionalidad (f) cercana a 2,5 (Rozycki, 2008), lo cual indica que existe ese nmero de sitios disponibles para la generacin de enlaces covalentes intermoleculares (crosslinking), con produccin de cadenas ramificadas (network),

73

Resultados y Discusin que son los que generan la firmeza y resistencia a fluir, en la matriz del cogulo formado. Esto adems aumenta el efecto lubricante que ejerce la grasa en estas estructuras. La superficie de respuesta y las lneas de contorno obtenidas fueron:
Design-Expert Software K 1452.43 379.933 X1 = A: X1 X2 = B: X3
1500

1025

550

K
75 -400 -1

-1 0 0 1 1

B: X3

A: X1

Figura 24: Superficie de respuesta del modelo obtenido para el ndice de consistencia (K).

Design-Expert Software
1

K Design Points 1452.43 379.933 X1 = A: X1 X2 = B: X3

1148.14
0

843.852 3

539.561 235.271-69.0194

-1

539.561
-1 0 1

X1: A: X1 X2: B: X3

Figura 25: Lneas de contorno del modelo obtenido para el ndice de consistencia (K).

Se encontr una tendencia donde se observa que el ndice de comportamiento (n) se ve principalmente afectado por la materia grasa. Al aumentar X1, el ndice de comportamiento aumenta por lo que su comportamiento tiende a ser mas

74

Resultados y Discusin Newtoniano disminuyendo la influencia del trabajo mecnico realizado sobre las caractersticas del producto (viscosidad, consistencia, firmeza). Por otro lado, los valores de la curva descendente no pudieron ajustarse cuantitativamente con el modelo reolgico propuesto. An as, se observa que el tratamiento mecnico ejercido sobre la muestra, durante el ensayo, produce un comportamiento muy cercano al de un fluido Newtoniano (recta), fluidificando la muestra. Esto debe tenerse en cuenta al desarrollar un sistema de produccin, donde las materias primas y el producto son sometidos a operaciones qumicas como: agitacin, bombeo, homogenizacin, transporte por caeras, etc., para obtener las caractersticas deseadas en el producto final (consistencia y viscosidad). IV.4.2.- Viscosidades caractersticas. Se calcularon tres viscosidades caractersticas (i, 50 , f) al da siguiente al de la fermentacin, y a la semana. Los resultados se exponen en la tabla siguiente:
Tabla 15: Valores de las viscosidades caractersticas. Variables no Da de N Exp. codificadas i (cP) 50 (cP) anlisis 2 4 CM 11 13 CS CI 17a 19 CM CM
a

f (cP) 2,36 2,56 1,85 1,69 2,87 3,22 2,24 3,26 1,97 2,08 2,48 2,56 1,37 1,36 1,04 1,24 2,84 3,22 2,89 3,23

10 6,5 8,25 10 6,50 8,25 8,25 10 6,50 8,25 8,25

0 0 50 100 100 100 0 50 50 50 50

da uno semana da uno semana da uno semana da uno semana da uno semana da uno semana da uno semana da uno semana da uno semana da uno semana da uno semana

393,00 393,00 67,37 117,90 294,75 294,75 280,01 393,00 132,64 106,11 294,75 294,75 176,85 314,40 76,64 176,85 294,75 294,75 294,75 294,75

6,41 7,87 5,52 5,16 8,07 9,16 6,30 8,85 6,41 6,81 7,39 8,53 4,37 3,83 5,63 5,27 8,08 9,16 8,04 9,15

= Esta muestra fue desechada por dar un comportamiento anmalo.

75

Resultados y Discusin Se correlacionaron las variables de diseo, codificadas, con las viscosidades caractersticas obtenidas de los reogramas realizados el da despus de la produccin de los quesos y a la semana. Se obtuvieron los siguientes modelos: i = 88,38 + 14,53 * X1 + 3,60 * X3 11,40 * X1 * X3 21,20 * X32 (r2 = 0,8062) 50 = 8,07 + 2,44 * X1 + 0,63 * X3 2,00 * X32 2,24 * X1 * X32 f = 2,87 + 1,83 * X1 + 0,18 * X3 0,83 * X32 1,63 * X1 * X32 (r2 = 0,8146) (r2 = 0,8732)

Estos resultados muestran una dependencia de las tres viscosidades caractersticas con las dos variables tecnolgicas utilizadas, donde se observa que ambas influyen en forma directa, aumentando las viscosidades, influyendo la grasa en bastante mayor medida que la relacin entre SP1 y BLC1 (entre 4 y 10 veces ms segn el tipo de viscosidad). A modo de ejemplo se muestran los reogramas de una experiencia (11), donde se muestra la diferencia de los perfiles obtenidos al da siguiente y a una semana de la fermentacin:
vs. D
700,0 600,0 500,0 (mPa) 400,0 300,0 200,0 100,0 0,0
10 6 11 9 13 2 13 26 53 79 92 0 40 66
.

Reograma del da uno Reograma luego de una semana

D. (1/s)

Figura 26: Reogramas de la experiencia 11, el da despus de la fermentacin y luego de una semana.

Por otro lado, generalmente se vio una fuerte tendencia en el aumento de las viscosidades caractersticas con el tiempo de almacenamiento, siendo mayor el aumento en aquellas muestras que tienen un mayor contenido de materia grasa.

76

Resultados y Discusin Estos datos son importantes a la hora de formular el producto segn se desee tener gran resistencia inicial a deformarlo o untarlo (i), su comportamiento durante la masticacin (50) o el comportamiento cuando fluye por caeras, por ej. hasta ingresar al dosificador de una mquina envasadora (f ), debido a que para productos viscosos, como este, el gradiente de deformacin vara entre 100 y 200s-1 (Rozycki y Seguro, 1995). IV.4.3.- Tixotropa. La tixotropa es una propiedad que permite cuantificar la influencia de los esfuerzos mecnicos sobre las caractersticas reolgicas del producto, que influyen en su textura. Esta propiedad puede evaluarse adecuadamente a travs de IT (indice de tixotropa) que se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 16: ndices de tixotropa (IT) obtenidos. X3 % SP1 0 0 50 100 100 100 0 50 50 50 50 ndices de tixotropa (mPa/s) ITa 19281 22020 24075 15993 24246 24212 17106 25753 24125 23980 ITb 23185 19007 25582 24726 23972 27089 14589 24555 25540 25612 IT 3904 -3014 1507 8733 -274 2877 -2517 -1199 1415 1632

N Exp. 2 4 CM 11 13 CS CI 17 19 CM CM

X1 (% MG) 10 6,5 8,25 10 6,5 8,25 8,25 10 6,5 6,5 6,5

ITa: ndices de tixotropa obtenidos del anlisis al da siguiente de la fermentacin. ITb: ndices de tixotropa obtenidos del anlisis a la semana de la fermentacin. IT: Diferencia entre ITb y ITa.

Se analiz la relacin entre la tixotropa medida al da despus de la fermentacin (ITa), con las variables del diseo. Se observ que existe una tendencia a que ITa disminuya con el aumento de X1. Por lo que el aumento de la materia grasa disminuye la tixotropa y la dependencia del comportamiento reolgico del producto con el tratamiento mecnico ejercido. Por otro lado se analiz la variacin de tixotropa ( IT) con el tiempo de almacenamiento (una semana). Se vio que en general esta diferencia aument y

77

Resultados y Discusin obtuvo un valor mximo de 8733 en la experiencia 11 y un valor mnimo de 3904 en la experiencia 2. Se pudo modelar la diferencia de tixotropa ( IT) en funcin de X1 y X3. El modelo obtenido fue: IT (mPa/s) = 1682,51 + 3761,12 * X1 + 2160,37 * X3 r2= 0,9131 El modelo muestra que tanto X1 como X3 aumentan la variacin de tixotropa, aunque X1 (materia grasa) tiene mayor influencia. En este tipo de fluidos esto se debe a la generacin de enlaces no covalentes (puente H, hidrofbicos, electrostticos, etc.) durante el almacenamiento (Lucey, 2000). Para el caso de la variable ms influyente, X1, este aumento de tixotropa podra deberse a la generacin de enlaces hidrofbicos. La superficie de respuesta y las lneas de contorno que representan el modelo son las siguientes:

Design-Expert Software Dif Tix 8732.78 -3013.67 X1 = A: X1 X2 = B: X2

9000

5500

Dif Tix

2000

-1500

-5000

1 0 0 -1 -1

B: X2

A: X1

Figura 27: Superficie de respuesta del modelo obtenido para IT.

78

Resultados y Discusin
Design-Expert Software
1

Dif Tix

Dif Tix Design Points 8732.78 -3013.67 X1 = A: X1 X2 = B: X2

0

5630.17

3656.34 -291.316 1682.51 3

-2265.15

-1 -1 0 1

X1: A: X1 X2: B: X2

Figura 28: Lneas de contorno obtenidas para IT.

IV.4.4.-Variacin del esfuerzo de corte en funcin del tiempo de cizallamiento. Con el modelo de Weltman se analizaron los datos experimentales. Los datos obtenidos se detallan en la siguiente tabla:
Tabla17: Valores de A y B obtenidos a travs del modelo de Weltman. X1 (% MG) 10 6,5 8,25 10 6,5 8,25 8,25 10 6,5 6,5 6,5 X3 % SP1 0 0 50 100 100 100 0 50 50 50 50 r2 0,8601 0,9348 0,9450 0,8807 0,9698 0,9529 0,9520 0,9787 0,9623 0,9138

N Exp. 2 4 CM 11 13 CS CI 17 19 CM CM

A (mPa.s) B (mPa.s) 29,76 4,03 19,70 2,58 41,08 5,65 31,57 4,69 20,94 2,63 34,19 4,35 19,75 2,81 28,06 3,75 41,18 5,72 40,08 5,55

Los datos experimentales se ajustaron adecuadamente al modelo (el r2 fue siempre mayor a 0,86). La resistencia mecnica inicial (A), present un valor promedio de 30,63 mPa.s con un valor mximo en de 41,18 mPa.s en una de las repeticiones del punto central del diseo y un valor mnimo de 19,70 mPa.s en la experiencia 4.

79

Resultados y Discusin Se encontr un modelo que ajusta adecuadamente los valores experimentales entre la resistencia mecnica inicial y las variables en estudio, codificadas: A (mPa.s)= 39,19 + 6,36 * X1 + 2,92 * X3 13,21 * X32 r2= 0,8562 Se observ que A aument con ambas variables, siendo la materia grasa la de mayor influencia (un poco ms del doble que la relacin entre los microorganismos probiticos).

Design-Ex pert Softw are A 41.18 19.698 X1 = A: X1 X2 = B: X3

46

38.5

31

A
23.5 16

1 0 0 -1 -1

B: X3

A: X1

Figura 29: Superficie de respuesta del modelo obtenido para la resistencia mecnica inicial (A).

El coeficiente de ruptura estructural, B, tuvo un valor promedio de 4,17 mPa.s mostrando en la experiencia 4 un valor mnimo (2,58 mPa.s) y un valor mximo en una de las repeticiones del centro del modelo (5,72 mPa.s). Se encontr un modelo que ajust adecuadamente la variacin de B con ambas variables: B (mPa.s) = 5,42 + 1,04 *X1 + 0,38 * X3 1,91* X32 r2= 0,9095 Se observa un comportamiento similar al anterior, en cuanto a que B depende directamente del contenido de materia grasa y de la relacin SP1/BLC.

80

Resultados y Discusin
Design-Expert Software B 5.721 2.58 X1 = A: X1 X2 = B: X3
6.5

5.4

4.3

B
3.2 2.1 1 0 0 -1 -1

B: X3

A: X1

Figura 30: Superficie de respuesta del modelo obtenida para el coeficiente de ruptura estructural (B).

IV.5.- Evaluacin sensorial. Se realiz un ensayo de aceptabilidad para el sabor y la untabilidad del producto. En las figuras 31 y 32 se muestran los resultados.
Aceptabilidad, n=91
40%

30% 100% BLC1 - 10 % Mat. Grasa 2,5% WPC - 2,5% LPD

20%

10%

100% BLC1 - 8,25% - Mat. Grasa 5% WPC

0%
ife re nt e ho po co o m o en te en te ho o er ad am m uc in d

st a

re su lta

st a

di sg

gu

er ad

us ta

gu

100% BLC1 - 6,5 % Mat. Grasa 2,5% WPC - 2,5% LPD

uc

po c

m uc

h si

st a

us ta

uc

am

st a

sg us ta

M e

gu

M e

Figura 31: Ensayo de aceptabilidad con evaluadores no entrenados.

di

81

di

sg us ta

gu

M e

m od

di sg

od

h si

Resultados y Discusin

Untabilidad, n= 91

50% 40% 30% 20% 10% 0%

te en te en te po co m uc h sim m uc ho m od er ad am da m m uc ho po co re n di sg us ta gu st a di sg us ta gu st a m uc h in di fe si m o o

100% BLC1 - 10 % Mat. Grasa 2,5% WPC - 2,5% LPD 100% BLC1 - 8,25% - Mat. Grasa 5% WPC

100% BLC1 - 6,5 % Mat. Grasa 2,5% WPC - 2,5% LPD

er a

lt a

di sg us ta

gu st a

Figura 32: Ensayo de untabilidad con evaluadores no entrenados.

Aproximadamente el 80 % de las muestras tiene buena y muy buena aceptabilidad respecto al sabor e incluso algo mayor respecto a la untabilidad, concluyndose que la untabilidad influy marcadamente en la puntuacin de las muestras. En el rango de me gusta muchsimo y me gusta mucho, las personas prefieren la mezclas bases de mayor contenido de MG, que imparte cremosidad y buen sabor debido al aporte de componentes spidos. Recibieron puntuacin con el descriptor me disgusta, en cualquiera de sus niveles, un porcentaje de muestras inferior al 5 %, concluyndose que las muestras seleccionadas poseen una gran aceptabilidad general. La textura y aceptabilidad del producto se encuentran influenciadas principalmente por el contenido de MG. Esta variable es la que mejor describe la textura y aceptabilidad del producto.

82

di sg us ta

gu st a

m od

re su

Conclusiones V.- Conclusiones. El colesterol de la mezcla inicial, se extrajo en aproximadamente un 90 %, lo que permiti obtener un producto lcteo que cumple con la normativa vigente respecto a este compuesto, para ser clasificado como sin colesterol. Se logr desarrollar un queso untable probitico con muy buenas caractersticas reolgicas, texturales y sensoriales, reducido en grasas con respecto a los productos similares existentes en el mercado. La matriz del queso mostr ser muy estable con una sinresis muy reducida. El recuento de microorganismos probiticos en la matriz del alimento fue siempre mayor a 10 7 UFC/g por lo que puede ser clasificado como probitico. Se pudo correlacionar las dos variables en estudio con la mayora de las respuestas evaluadas, y en la gran mayora de los casos se obtuvieron modelos matemticos predictivos y descriptivos del sistema, a travs de regresin mltiple. Se observ que el contenido de materia grasa (X1) tiene una influencia mucho mayor que la relacin entre los microorganismos probiticos (X3 = relacin SP1 / BLC1 = L. casei / Bifidobacterium) sobre la velocidad de acidificacin, a travs de una relacin inversa, donde el aumento del contenido graso produce una disminucin de la velocidad de acidificacin. El aumento de X1 favoreci la estabilidad del pH durante el tiempo de almacenamiento analizado (una semana); la disminucin de X3 tuvo un efecto similar. Al aumentar el contenido de materia grasa disminuy la consistencia (K) del queso untable, debido al poder lubricante que otorga la grasa promoviendo untuosidad y cremosidad, obtenindose adems un comportamiento reolgico ms Newtoniano y, en consecuencia, menos dependiente del tratamiento mecnico. Las viscosidades caractersticas (i, 50 y f) aumentaron al incrementarse ambas variables, principalmente el contenido de materia grasa aumentando entonces la friccin interna. Durante el almacenamiento las tres viscosidades se incrementaron, principalmente en aquellas muestras con mayor concentracin de grasa. posiblemente debido a que sta provoca una matriz ms compacta (menos porosa)

84

Conclusiones El queso obtenido mostr tener un comportamiento tixotrpico, el cual disminuye con el aumento del contenido de grasa. Durante el tiempo de almacenamiento la tixotropa (IT) aument, ms an en aquellas muestras que tenan mayor concentracin de materia grasa. En tanto, la resistencia mecnica inicial del cogulo (A) y el coeficiente de ruptura estructural (B), se vieron directa y principalmente influidos por el contenido de materia grasa de la muestra. Del estudio realizado se observa que la materia grasa gobierna la gran mayora de las caractersticas, parmetros y atributos estudiados. Se concluye que el queso probitico con colesterol reducido, desarrollado en este trabajo, puede considerarse como un alimento funcional debido a que demostr poseer muy baja concentracin de colesterol, lo que colaborara a reducir los riesgos relacionados al desarrollo de enfermedades cerebrovasculares y coronarias, y podra ser utilizado como vehculo para la viabilidad y el aporte de microorganismos probiticos que mejoren la salud de los consumidores, adems de minerales de gran actividad biolgica (calcio, etc.).

85

Bibliografa VI.- Bibliografa. Alais, Charles; Lacasa Godina, Antonio (1985). Ciencia de la Leche: Alonso, L.; Cuesta, P.; Juarez, M. y Gilliland, S. E. (2009). Use of betaPrincipio de tcnica lechera. Cuarta ed. Editorial Revert. cyclodextrin to decrease the level of cholesterol in milk fat. J. Dairy Sci. 92 (3): 863-869. AOAC. (1995). Official methods of analysis of AOAC International. 16ta. ed. Arauz, A. G.; Jimnez, J. G. (1992). Pautas para el tratamiento diettico y ASTM special technical publication. (1968). Manual on Sensory Testing Astray, G.; Gonzalez Barreiro, C.; Mejuto, J. C.; Rial Otero, R. y Simal Vol. II. Virginia, EEUU. farmacolgico de las Dislipoproteinemias. INCIENSA/INCAP/OPS, 1992. Methods. American Society for Testing and Materials. Philadelphia, Pa. Gndara, J. (2009). A review on the use of cyclodextrins in foods. Food Hydrocolloids. 23: 1631-1640. Bar, L.; Jimnez. J.; Martnez-Frez, A.; Bouza, J.J.. (2001). Pptidos y protenas de la leche con propiedades funcionales. Ars Pharmaceutica, 42:3-4; 135-145. Bauman D E. (2002). Conjugated linoleic acid (CLA) and milk fat: A Good News Story. Proceedings of the 1st Annual Arizona Dairy Production Conference, Tempe, Ariz., Oct. 17. (http://animal.cals.arizona.edu/azdp/papers/2002/bauman.pdf) Bylund Gsta , M. (2003). Manual de las industrias lcteas. Ed. Tetra Pak CAA. Cdigo Alimentario Argentino. Ley 18.284. Actualizado a septiembre Cceres R., Paola y Gotteland R., M. (2010). Alimentos probiticos en Cagigas Reig, A. L. y Blanco Anesto, J. (2002). Prebiticos y probiticos, Caldern, O.; Padilla, C.; Chaves, C.; Villalobos, L. y Arias, M. L. (2007). Hispania S. A. Madrid, Espaa. de 2010. (www.alimentosargentinos.gov.ar/programa_calidad/Marco_Regulatorio/CAA.asp.) Chile: qu cepas y qu propiedades saludables? Rev. Chil. Nutr. 37 (1): 97-109. una relacin beneficiosa. Rev. Cubana Aliment. Nutr. 16 (1): 63-68. Evaluacin del efecto del cultivo probitico Lactobacillus rhamnosus adicionado a yogurt natural y con probiticos comerciales sobre poblaciones de Staphylococcus

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