COMENTARIOS Evolucin de los puntos de vista sobre la genealoga de las clulas B Resumen | Muchos conceptos fundamentales sobre el desarrollo

del sistema inmune ha cambiado sustancialmente en los ultimos anos, y los rapidos avances con modelos animales se presentan posibilidades para el descubrimiento de mas. Sin embargo, el progreso continuo requiere una comprension mas clara de las relaciones entre las celulas madre hematopoyeticas y las celulas progenitoras que reponer cada tipo de pool de linfocitos. Formacion de celulas sanguineas tradicionalmente ha sido descrita en terminos de discretos puntos de ramificacion de desarrollo, y una sola ruta se da para cada tipo de celula mayor. Como veremos en esta revision, los hallazgos recientes sugieren que el proceso de formacion de celulas B es mucho mas dinamico. El ritmo de los descubrimientos y la falta de nomenclatura estandarizada son retos para los cartografos de desarrollo del sistema inmunologico. Sin embargo, los modelos animales interesantes y los sistemas de marcado han sido desarrollados para facilitar la identificacin de importantes hechos en la hematopoyesis. Diagramas de los libros clasicos han representado el proceso hematopoyetico como una continuo de desviaciones abruptas, con un destino binario, sin embargo, un compromiso irreversible del linaje de celulas B es progresivamente adquerido durante muchas transiciones a traves de subconjuntos fenotipicamente distinguibles de celulas de medula osea. Por otra parte, los progenitores linfoides puede asumir destinos alternativos y revertir el curso en respuesta a ciertas senales del medio ambiente. Por lo tanto, ha sido dificil encontrar trminos significativos de celulas linfopoyeticos tempranas, y la linfopoyesis debe ser visto de una manera totalmente nueva. Aqui, hablamos de los primeros cambios que marcan la progenie de celulas madre hematopoyeticas (HSC), en camino de convertirse en celulas B. Nos enfocamos en las formas en que los investigadores pueden rastrear estos eventos y destacamos varias incertidumbres. Los primeros progenitores linfoides Durante mucho tiempo ha sido una meta de los inmunologos el identificar y caracterizar los primeros progenitores linfoides de la medula osea de los adultos, pero ha habido reclamos conflictivos sobre las propiedades de estas celulas. Micromatrices, RT-PCR cuantitativa y analisis de PCR multiplex han generado una gran cantidad de informacion acerca de los patrones de expresion genica temprana. Por ejemplo, muchos genes comunmente asociados con celulas T y B, tales como los que codifican CD3, el receptor de pre celulas T (TCR) cadena (pTCR), el pre receptor de celulas B (BCR) sustituto de cadenas ligeras VpreB y V5 y proteina 5 emparejado de caja (PAX5), no son activos en HSCs. Sin embargo, las celulas madre contienen transcripciones de ARNm detectable que corresponden a los genes que son expresados otros otros multiples linajes hematopoyeticos. Esto puede reflejar la capacidad general de opciones de desarrollo u opciones del estado de la cromatina en los principales loci geneticos y no necesariamente presagia el destino de celulas individuales. De hecho, este fenomeno ha sido referido como un "cebado" o "promiscuidad" de los progenitores linfoides y mieloides. Casi todos los progenitores que expresan genes linfoides tambien son positivos para las transcripciones relacionadas con granulocitos / macrofagos. En este contexto, las celulas linfopoyeticas que podrian llamarse "linfoide especificas" cuando expresan cantidades detectables de proteinas que estan normalmente restringidos a los linfocitos. Park y Osmond utilizaron por primera vez la expresion de desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT), una enzima que diversifica los sitios de combinacion del anticuerpo, como una caracteristica definitoria de lo que ellos llaman como celulas tempranas pro B. Una serie de estudios posteriores confirmaron el uso de este marcador para definir las B, las NK y celulas progenitoras linfoides T especificas, que nuestro grupo de investigacin ha denominado progenitores linfoides tempranos (PLT). Sin embargo, solo hay disponible para detectar TdT anticuerpos policlonales, que estan presente en niveles muy bajos y solo pueden ser visualizados en celulas fijadas. Afortunadamente, los genes reporteros de ratones y patrones caracteristicos de expresion de antigeno de superficie, pueden hacer posible aislar a las poblaciones altamente enriquecidas de linfocitos especificos, aunque no irrevocablemente comprometidos en el linaje linfoide. Parece ser que los PLT tienen una alta probabilidad de convertirse en linfocitos y esto se puede reproducir experimentalmente con notable eficiencia. Los genes reporteros de ratones Ratones geneticamente modificados, que permiten el seguimiento de la expresion de un gen de interes. Esto se consigue mediante la sustitucion del gen de interes (o parte de ella) por una secuencia que codifica una molecula informadora, como la proteina verde fluorescente (GFP). Cuando la region promotora del gen de interes es activado, GFP se expresa y las celulas vivas pueden ser visualizadas por citometria de flujo.

La transicin de clula madre a ELP HSCs de repoblacion a Largo plazo (LT HSC), HSCsde repoblacion a corto plazo (ST HSC) y varios subconjuntos de celulas progenitoras multipotentes (MPP) tienen propiedades especificas que se utilizan habitualmente para su identificacion y clasificacion celular. (TABLAS 1,2) (vease S1 informacion complementaria (tablas) para una version con referencias completas). Algunos marcadores solo son utiles para determinadas cepas y edades de ratones, y otros se ven influidas por las citoquinas inflamatorias. Sin embargo, un consenso esta desarrollando que la expresion de dos clases de antigenos de superficie celular refleja la progresion de las CMH a ELPs.(fig1). Las celulas madre y todos los progenitores tempranos se encuentran dento del linaje (LIN) antigeno de celulas madre 1 (SCA1) + subconjunto KIThi (llamado el subconjunto LSK), que representa aproximadamente el 0,1% del pool total de celulas en la medula osea de ratones C57BL / 6. La perdida de potencial de autorenovacion, la caracteristica definitoria de las celulas madre, y la reposicion durante toda la vida de todos los tipos de celulas de la sangre coincide con la expresion de la tirosin quinasa relacionada con FMS3 (FLT3, tambien conocida como FLK2). Aunque no es universalmente aceptada, el aumento de los niveles de FLT3 parece marcar la separacion inicial y gradual de los destinos de clulas hematopoyeticas. Esto es, las celulas del subconjunto LSK que sobreregulan la expresion de FLT3 han reducido en gran medida el potencial para la generacion de megacariocitos y eritrocitos. Importante evidencia de apoyo se obtuvo con la generacion de una linea de raton transgenico que expresa un elemento reportero bajo el control del promotor para el factor de transcripcion ikaros (tambien conocido como IKZF1). Un tercio de las celulas LSK en estos ratones expresan el gen reportero y la mayoria de estos tambien expresaron niveles uniformemente altos de FLT3 y tenian poco potencial para desarrollar linajes de megacariocitos o eritrocitos. Otro estudio analizo el THy1.1-/subgrupo bajo LSK y la regulacion a la baja de la expresion de la molecula de adhesion celular vascular 1 (VCAM1). Una vez mas, celulas altas en FLT3 fueron eficientes progenitores de granulocitos y/o linfocitos, pero tenian poca capacidad para producir plaquetas y hematies. ELPs que pueden ser identificados de acuerdo con su expresion de gen de activacin recombinante 1 (RAG1) representan aproximadamente el 15-18% de aquellas celulas LSK que expresan los niveles mas altos de FLT3 (REFERENCIAS 5,6) y que tambien se conoce como preparado de progenitores linfoides multipotentes (LMPPs). LMPPs son progenitores potentes, y analisis de celulas individuales han revelado que un 38% de estas celulas tienen un potencial combinado para desarrollarse en celulas T, B y mieloides. Un pequeno numero de LMPPs esta restringido al linaje linfoide (es decir, las celulas B y celulas T), mientras que mas del 60% de las celulas LMPPs dio linaje NK. Aproximadamente el 31% de LMPPs expresa transcripciones linfoides, tales como RAG1, IgH esteril (cadena pesada de inmunoglobulina) y el receptor de la cadena de la interleucina 7 (IL 7R, tambien conocida como CD127), pero las celulas individuales no son uniformemente positivas. Esto esta de acuerdo con la descripcion original de ELPs, es decir, las celulas individuales que son positivas para TdT, una IgHm humana (cadena pesada de IgM) transgen o ambas. A los ratones del estudio utilizado despues en la que el gen que codifica la proteina verde fluorescente (GFP) se habian integrado en el locus RAG1 (denominado ratones knock-in Rag1GF P), de tal manera que la expresion de GFP se correlaciona con expresion la endogena de RAG1, y encontro que ELPs individuales expresaron RAG1, TdT o ambos. Asi, la especificacion de linaje linfoide se produce en las celulas FLT3hi del subconjunto LSK, pero que no implica la expresion sincronica de todos los genes linfoides. La expresion de VCAM1 se perfila como otro marcador valioso para los primeros eventos en la especificacin del linaje linfoide. Un descubrimiento inicial fue que se expreso constitutivamente por las celulas estromales de medula osea y que medio la union con el antigeno muy tardio 4 (VLA4) + de progenitores linfoides en cultivos de largo plazo. Las pantallas de micromatrices mas tarde revelarian que tambien fue expresada por las HSCs, pero se regularon a la baja en la diferenciacion de estas celulas. Importantes experimentos de Lai y Kondo demostraron que mientras qtodos los THy1.1bajo ST- HSCs y LT- HSCs expresan VCAM1, las clulas FLT3alto (es decir, LMPPs) pueden ser subdividididas de acuerdo a la expresion de este marcador. Es decir, las celulas VCAM1-LSK representan un subconjunto de LMPPs (figura 1) que no tienen el potencial de generar eritrocitos pero que rapidamente pueden generar celulas B y T. Un analisis clonal revelo estas celulas como una mezcla de mieloides restringidos, mieloide y linfoide progenitores restringidos. Utilizando Rag1GFP en ratones knock-in, aproximadamente el 82% de las celulas con estas caracteristicas (FLT3alto VCAM1) serian designados ELPs. Por lo tanto, el aumento de expresion del gen FLT3 y la perdida de la expresion VCAM1 permite la identificacion de los primeros progenitores linfoides especificados en la fraccion LSK de la medula osea (Figura 1, Tabla 1). Varios otros marcadores son utiles en el seguimiento de la progresion de la HSCs en los linajes linfoides (TABLAS 1,2). Por ejemplo, la expresion transitoria de CD4, y las integrinas MAC1 (tambien conocida como integrina M) y la integrina 2 (tambien conocido como CD49b) han sido utilizados como marcadores de ST-HSCs. En los ratones THy1.1 congenicos pero no convencionales, HSC es contenido en un 8% de celulas LSK que presentan bajos niveles de THy1.1.

Aproximadamente el 40% de estas celulas THy1.1bajas LSK expresa CD150 y, cuando se utiliza junto con un marcador adicional (CD48), esto define CD150 + CD48-LT HSCs. CD34 se expresa en las HSC fetales y neonatales, pero se dejan de expresar a las 10 semanas despues del nacimiento y solo se re-expresan en la activacin de las celulas madre. La mayoria de las LT-HSC son CD27-, mientras que ELPs se encuentra entre el 90% de las celulas LSK que muestran esta marcador. AA4.1 (tambien conocido como CD93) se expresa por el HSCs fetal, pero no en el adulto y ha sido ampliamente utilizado para estudiar la diferenciacion del linaje de celulas B en la medula osea adulta. Sin embargo, los ELPs identificados en ratones knock-in Rag1GFP fueron AA4.1 -/low (RSW, observaciones no publicadas), y un sustancial numero de precursores de linaje de celulas T puede carecer de este marcador.. La expresion de selectina L (tambien conocido como CD62L) es asobreregulada por la mayoria de RAG1+ ELPs, y este marcador se ha utilizado para enriquecer los subconjuntos de progenitores tempranos. Por lo tanto, llegamos a la conclusion de que FLT3 y VCAM1 son marcadores particularmente utiles para subdividir las celulas dentro del raro subconjunto LSK de la medula osea. Cuando estos marcadores son explotados en combinacion con otros marcadores y ratones reportero, es posible aislar y estudiar ampliamente los fundadores del sistema inmunologico. Facilitacin y apoyo de los factores de transcripcin Se ha aprendido mucho acerca de los genes necesarios para la especificacion y compromiso de linaje linfoide, y es interesante tener en cuenta aquellos que son responsables de los cambios descritos anteriormente. A pesar de las esferas de la influencia estan en bastante definidas para Ikaros, Pu.1, EBF1 (factor precoz de celulas B 1), E2A y PAX5 (protena emparejado de caja 5), ahora hay evidencia de que otros factores de transcripcin contribuyen a la especificacion y compromiso del linaje linfoide. Lasc clulas hematopoyeticas tempranas en ratones deficientes de Ikaros dejan de expresar FLT3 (REFERENCIAS 32,33). A pesar de FLT3 no esta disponible como un marcador para la identificacion de los ELPs en estos ratones, el subconjunto de celulas LSK que normalmente el estaria incluido ha sido fotografiado usando un modelo de raton reportero Ikaros recientemente desarrollado. Es importante destacar que los animales deficientes de Ikaros carecian de ELPs definidos de acuerdo con RAG1 expresion de IL 7R, y las celulas LSK de estos ratones tenian un potencial reducido para generar linaje de celulas T pero no tenia potencial de diferenciacion en lineaje de celulas B. Estos y otros estudios establecen que Ikaros es un facilitador de los eventos mas tempranos conocidos en linfopoyesis. Sera emocionante entender si Ikaros controla directamente la expresion del gen FLT3, RAG1, 7R IL y otros genes esenciales en PEL. Aiolos, un factor de transcripcin relacionado, silencia dichos genes en apropiadas etapas posteriores de diferenciacion, lo que indica que ambos miembros de esta familia, comienzan y mantienen la linfopoyesis del linaje de celulas B. Embriones de raton con deleciones del factor de transcripcion Pu.1 (el cual esta codificado por el gen Sfpi1) no son viables, y sus celulas hematopoyeticas se ven gravemente comprometidas en su capacidad de hacer celuas B-2 convencionales. Similar a los ratones Ikaros deficientes, la expresion de FLT3 no esta sobreregulada en el desarrollo de celulas hematopoyeticas, y una serie de genes intermedios de linaje de clulas B no son expresados. Por el contrario, la expresion de Pu.1 no se requiere para la generacion del subconjunto especializado de celulas B-1- de linfocitos, y su regulacion a la baja incluso puede ser determinada por la produccion de celulas B 1. Contrariamente a lo que se creia, los niveles de expresion de Pu.1 no determinan las elecciones frente al linaje mieloide y linfoide, aunque altas concentraciones de este factor puede suprimir la linfopoyesis. Claramente, Pu.1 tiene un papel de importancia, pero una funcin incompletamente entendida en las celulas linfopoyeticas tempranas. Muchos genes del linaje de celulas B son blancos directos o indirectos de la familia basica de factores de transcripcion helice bucle helice (bHLH). Estos incluyen EBF1, PAX5, 5, cadena Ig (tambien conocido como CD79a y MB 1) y RAG1 (REFERENCIAS 38,39). Uno de estos factores de transcripcion bHLH es E2A (que se compone de E47 y E12); su supresion impide totalmente la produccion de celulas B y la recombinacion de genes de inmunoglobulina en el linaje de celulas B. Sin embargo, la medula osea de ratones E2A o E47 deficientes, contiene celulas correspondientes a las primeras etapas de linfopoyesis (es decir, las celulas con un fenotipo LSK que tienen transcripciones ARNm de codificacion FLT3 y 7R IL), transcripciones reducidas para la cadena Ig (tambien conocido como CD79b y B29) y la competencia normal para producir celulas T. Ademas, lineas celulares MPP con deficiencia selectiva para linfopoyesis de celulas B han sido aisladas a partir de medula osea E2A deficiente y expandido en cultivo con citocinas. Por lo tanto, E2A es prescindible para la formacion de ELP pero importantes para los eventos de diferenciacion subsiguientes. Actividades de E2A y de otros miembros de la familia bHLH son negativamente regulados por represores transcripcionales, como inhibidor de la union al ADN 1 (ID1), ID2, ID3 e ID4 (Ref. 40). En el sistema hematopoyetico, el factor de transcripcion EBF1 se expresa casi exclusivamente en celulas del linaje B. Ademas, el gen EBF1 es activo en las clulas linfopoyeticos tempranas ordenados den ratones fetales y adultos RAG1GFP knock in. Sobreexpresion artificial de EBF1 en celulas hematopoyeticas fue suficiente para

dirigir su diferenciacion hacia el linaje de celulas B, lo que demuestra la potente capacidad instructiva de este factor de transcripcion. Al igual que en ratones E2A deficientes, ratones EBF1-/ - tienen ELPs definidos por su potencial de diferenciarse en el linaje de celulas T, su expresin CD27 y alta expresion de FLT3, asi como su expresion de transcriptos que codifican TdT, E2A, IgH esteril y 7R IL (REFERENCIAS 35,46). Finalmente, la importancia de EBF1 se muestra por el hecho de que los progenitores celulares de ratones EBF1-/ - no muestran la recombinacion de genes de inmunoglobulinas y no activan una serie de genes esenciales. CD19 es uno de varios objetivos directos del factor de transcripcion PAX5, y su expresin casi a la perfeccion coincide con el compromiso del hacia linaje de celulas B (vease mas adelante). Ademas, PAX5 es esencial para mantener las caracteristicas del linaje de clulas B y simultaneamente la supresion de hacia otros linajes hematopoyeticos. ARNm de Pax5 no es detectable en ELPs de ratones knock in Rag1GFP o en LSK FLT3hi LMPPs. Ademas, los experimentos con ratones reportero Pax5 indican que su expresion solo es homognea en celulas de linaje CD19 + en mas maduras. Aunque menos bien estudiado, otros factores de transcripcion tambien contribuyen a la linfopoyesis de celulas B. Por ejemplo, los progenitores tomados de ratones del linfoma fetal de celulas B 11a (BCL 11a) deficientes, generan pocas celulas B y se dice que carecen de transcriptores que codifican EBF1, PAX5, IL 7R y CD19 (REF. 49), lo que indica que BCL 11a es importante en un estadio temprana. Focalizacion del protooncogen PBX1 (factor 1 de transcripcion de celulas leucemicas pre B) es tambien letal embrionario, pero HSCs de higado fetal se encontro muy comprometido con respecto a linfopoyesis celulas B. La condicional focalizacion del mismo gen en adultos demostro que no tiene ningun papel mas alla del estadio CD19 +. Por ultimo, celulas recuperadas de fetos que carecen de la caja cabeza de tenedor P1(FOXP1) generaron pocas celulas B en los ensayos de transferencia adoptivos. Hubo progenitores de celulas en el higado fetal que podieron ampliarse con citoquinas, y patrones de expresion genica sugieren que el desarrollo del linaje de celulas B no estaba totalmente bloqueado. Sin embargo, se requiere mas investigacion para ver como estos tres factores de transcripcion contribuyen a la formacion o la diferenciacion de los ELPs. Una secuencia de eventos fue sugerido por el hecho de que PU.1 regula directamente los genes que codifican EBF1 e IL 7R (REFERENCIAS 35,52). En consecuencia, la progresin del de celulas progenitoras del linaje de celulas B deficientes de PU.1, fue posible en cultivo con la introduccion artificial de EBF1 y, en menor medida, Il7ra, pero no Pax5. Los experimentos con una linea de celulas tumorales demostro que el componente E2A E12 tambien regula la expresion EBF1. Por otra parte, los defectos del linaje de celulas B fueron mas graves cuando ratones heterocigotos E2A se cruzaron con ratones heterocigotos EBF1. Aunque EBF1 es un iniciador importante de linfopoyesis de celulas B, es de destacar que sus niveles estn considerablemente aumentados en las ultimas etapas de desarrollo a traves de seales mediadas por IL 7R y STAT5 (transductor de senal y activador de la transcripcion 5). Ademas, uno de dos promotores Ebf1 son positivamente sensibles a PAX5 (REF. 56). Esto establece una situacion de proalimentacion donde la progresion y el mantenimiento de los progenitores comprometidos puede ser sostenido. Tales interrelaciones complejas se han discutido en revision recientes. Para resumir, los mecanismos responsables de la supresion del desarrollo temprano megacariocitica y eritroide, para la generacion de celulas FLT3alto VCAM1-LSK y para la iniciacion de linfopoyesis en este raro subconjunto de medula osea, no se entiende totalmente. Sin embargo, Ikaros ahora se ha demostrado ser un factor de transcripcion que es absolutamente necesario para los primeros acontecimientos de linfopoyesis, y la progresion de algunas celulas hacia el linaje de celulas T en ratones Ikaros deficientes indica un grado de determinacion del destino puede ocurrir incluso en estas primeras etapas. La investigacion de las funciones de PU.1, E2A y PAX5 ha proporcionado excelentes ejemplos de como los factores de transcripcion pueden cooperar y cruzar competencias de maneras complejas. Los primeros estmulos ambientales Otros temas importantes en linfopoyesis relaciona con los ambientes estimulantes para HSC y la naturaleza de las senales extracelulares que regulan los acontecimientos mas tempranos. El pool de los osteoblastos bajo hueso (celulas que recubren la superficie del hueso interno) siempre ha atraido la atencion como un potencial "nicho" para apoyar la hematopoyesis linfocitica temprana, pero la mayoria de las HSCs son mas centricos en la medula osea y cerca de las celulas del estroma perivascular. Sera un desafio para definir tales nichos porque las celulas con el mismo origen mesenchymal pueden asumir diferentes funciones y producir los factores que varian en funcion de su ubicacion. Por ejemplo, las lineas de celulas del estroma comunmente utilizados para apoyar la hematopoyesis de linfomas, son multipotentes y pueden ser inducidas en cultivo para convertirse en osteoblastos o celulas grasas. Progenitores linfoides se encuentran dispersos a lo largo de la medula osea y los mas tempranos preferentemente interactuan con VCAM1 + CXC quimioquinas ligando 12 (CXCL12) produciendo celulas reticulares. Aunque esta claro que CXCL12 es importante para atraer y retener a los progenitores linfoides en la medula osea, la naturaleza de otros factores importantes producidos por las celulas reticulares no

esta definido. Claramente diferentes de las celulas reticulares, VCAM1 + celulas estromales producen IL 7, que es necesaria para mantener la supervivencia y la expansion de los progenitores, asi como para la recombinacion de genes de inmunoglobulina. Una posible situacion similar se ha encontrado en la medula osea humana donde una serie de progenitores linfoides, fueron alineados en estrecha colaboracion con el estroma celular VCAM1 + /CD10 + . Ademas de estos componentes de los estudios knock-out de medula osea indican que las celulas endoteliales, y los osteoclastos pueden tambien contribuir de alguna manera en la hematopoyesis. Ademas, el desarrollo de HSCs residen y / o circulan en otros organos. Dada la complejidad y la incertidumbre acerca de las celulas que componen los nichos en la medula osea es de extranar que, se esta avanzando en la identificacion de moleculas que producen que el control de la supervivencia, la actividad mitotica y diferenciacion de clulas hematopoyeticas. Ligandos de muesca, factor de celulas madre (SCF), trombopoyetina, IL-3,IL-11, IL-6, factor de crecimiento similar a la insulina 2, factor de crecimiento de fibroblastos y WNT3a se han utilizado para apoyar la expansion modesta de las LT HSCs sin perdida de potencial de auto-renovacion. Sin embargo, experimentos de marcado de genes todava tienen que demostrar que cualquiera de estas moleculas o de sus receptores son absolutamente esenciales para la hematopoyesis linfocitica. El subconjunto LSK se define por los altos niveles de expresion de la protena transmembrana receptor tirosin quinasa (KIT), y ELPs son sensibles a su ligando correspondiente, SCF. Aunque esta claro que este par de moleculas mantiene la homeostasis de HSC, un papel importante en linfopoyesis de las celulas B para las senales asociadas KIT-SCF es obvio solo varias semanas despues del nacimiento. Como se menciono anteriormente, la regulacion positiva de la proteina tirosina quinasa relacionada estructuralmente FLT3, paralela a la formacion de ELPs, sin embargo, la marcacion de este receptor de protein-quinasa tiene solo efectos modestos sobre el desarrollo de linaje de celulas B. Esta discrepancia podria explicarse por la posible presencia de otro, receptor aun desconocido, para la citoquina ligando correspondiente FLT3 (Flt3L), como deficiencias mas sustanciales en los precursores de celulas B se han encontrado en ratones, precursores de celulas B que carecen de esta citoquina. Sin embargo, los numeros y las funciones de HSC en ratones deficientes Flt3L eran normales, y que podrian generar celulas T. Asi que, ningn HSC expresado o receptor citoquina expresada MPP ha sido aun identificado lo que es absolutamente y selectivamente necesario para la generacion de los componentes bsicos del sistema inmunologico. Aunque la eliminacion simultanea de Kit y Flt3 ha demostrado que estos receptores relacionados funcionalmente cooperan, sera importante saber si ellos inducen la expresion de Ikaros, que se requiere para la iniciacion de linfopoyesis celulas B. Impresionantemente alta eficiencia de la clonacion de linaje de celulas B fueron reportados cuando cultivos LMPPs fueron enriquecidos con ELP en condiciones relativamente simples, es decir, cultivos libres de suero que contenia SCF, Flt3L e IL-7 (ref. 8). A pesar de la expansion clonal es aun mayor en cultivos de celulas estromales companeras, esta claro que estos tres factores actuan de forma secuencial y cooperativa para apoyar a las HSCs, la MPPs y las etapas tempranas de linfopoyesis de celulas B. Ademas de estos reguladores positivos, hay muchos factores que limitan la expansion clonal y la progresion de linaje en esta primera etapa. Casi todos los HSCs de la medula osea de adultos, y la mayora de los ELPs pasan una considerable cantidade de tiempo en estado de reposo, estado G0 del ciclo celular. Este estado puede ser importante para el control de tamano de la poblacin y la integridad de las celulas de larga duracion que reponen el sistema inmunologico. Algunos mecanismos por los que esta regulacion puede ocurrir que se han propuesto. Se cree que Angiopoyetinas y la osteopontinas regulan el numero de celulas madre, pero se carece de informacion acerca de sus efectos sobre las celulas linfoides muy tempranas. La formacin de ELPs a partir de ELPs esta bloqueada por IL-6, y progenitores parecen ser redirigidos un destino de celulas mieloides por esta citoquina. Curiosamente, IL-6 no tiene ninguna influencia negativa y, de hecho, aumenta la proliferacion de ELPs. Accion especifico de etapas, tambien puede ser una caracteristica de las prostaglandinas, que aunque por mucho tiempo se sabe que inducen la apoptosis en las celulas progenitoras de linaje B, que recientemente se han descrito como estimulantes para la auto-renovacion de HSC. Tambien hay evidencia sustancial que sugiere que las hormonas esteroides inhiben selectivamente linfopoyesis celulas B en condiciones latentes. Mas polemicas son las funciones asociadas con los miembros de la familia de molculas complejas WNT. Por ejemplo, hay informes contradictorios acerca de la importancia fisiologica de Wnt3a en el mantenimiento de las HSCs. Un reciente informe concluye que aunque la senalizacion de WNT es al menos necesario para linfopoyesis normal de las celulas T, que se lleva a cabo sin la dependencia de sus senaladores companeros cannicos o catenina. Sin embargo, la estimulacion artificial de la via de senalizacion canonica frecuentemente utilizada por Wnt3a inhibe considerablemente, e incluso se invierte la progresion de linaje. Es decir, causa rrestriccion a los progenitores mieloides o linfoides para convertirse en multipotentes. Por otra parte, WNT5a parece limitar la expansion de las celulas de linaje B en una etapa posterior, y otras moleculas relacionadas con WNT merecen estudio adicional. Un efector multifacetico de linfopoyesis es Notch (muesca). Ligadura transitoria de los receptores Notch inhibe linfopoyesis de celulas B, mientras que la estimulacion sostenida de la via de senalizacion Notch es necesaria para apoyar la progresion en el linaje de celulas T. Este determinante critico de celulas T frente a la

diferenciacion linaje de celulas B ha sido ampliamente estudiado, y muchos tipos distintos de celulas de medula osea puede ser afectada por las senales Notch (vease mas adelante). De particular interes es el hecho de que la sensibilidad de los progenitores linfoides a las senales Notch esta regulada en multiples formas. Por ejemplo, el factor de transcripcion represor relacionado con leucemia / linfoma (LRF) normalmente bloquea los eventos de senalizacion Notch proximal en clulas de medula osea y el aumento de la sensibilidad de los progenitores LRF deficientes, provoca la diferenciacion en el linaje de celulas T en lugar del linaje de celulas B. Como otro nivel de control, las celulas de linaje B son las unicas en que las senales Notch resultan en la degradacion del factor de transcripcion esencial E2A9. Por lo tanto, se ha identificado un impresionante numero de moleculas extracelulares que apoyan el inicio y la progresion dentro de la linea linfoide B. Ninguna de ellos es unica y totalmente necesaria, y sus acciones son opuestas por una serie de otros factores. Por ejemplo, ciertas circunstancias de enfermedades, se puede desviar los efectos de la IL-6 a un proceso de diferenciacion HSC alternativo; mas tarde hablamos de como los productos de patogenos pueden hacer lo mismo. Los experimentos con la familia de moleculas WNT sugieren que al menos algunos de los primeros pasos de la linfopoyesis de las celulas B pueden ser reversibles. Subsiguientes etapas de linfopoyesis La progenie de ELP son conocidas por una variedad de nombres, pero ellas representan una serie de progenitores que son progresivamente mas tendientes a convertirse en linfocitos (TABLAS 1,2). En un documento historico, Kondo y sus colegas describen progenitores linfoides comunes (CLPS) LSK IL 7R + en la medula osea de raton y demostraron que al menos algunas celulas individuales de estas caracteristicas tenian el potencial de diferenciarse en celulas T y celulas B. La misma fraccion tambien genero celulas NK al ser trasplantadas, pero ningn signo de diferenciacion linfoide se observo en el momento. Estudios posteriores establecieron que CLPs representan formas intermedias mas importantes de vias linaje de celulas B y NK, pero no estan totalmente dedicadas a esos destinos (revisado en ref. 58). Por ejemplo, varios investigadores han encontrado que CLPs altamente purificados de forma transitoria puede producir pequenas cantidades de celulas dendriticas (DC) y clulas mieloides. Es importante destacar que hay un consenso cercano de que CLPs no contribuyen sustancialmente al desarrollo linaje de celulas T. Aunque los linfocitos linaje de celulas T se pueden generar cuando progenitores IL 7R + se inyectan en el timo son o cultivadas con la linea de celulas estromales OF9 que expresan el ligando similar a Notch delta 1 (DLL1; un proceso conocido como el sistema OF9-DLL1), que es poco probable que lo hagan en circunstancias normales. Los investigadores deben especificar cuidadosamente las condiciones de separacion de celulas, y puede ser el momento para un taller de trabajo internacional en el que se considere una terminologia normalizada. Por ejemplo, nuestro laboratorio utiliza el termino CLP para referirse a las celulas con el fenotipo exacto en que fue originalmente descrito por Kondo y sus colegas. Sin embargo, Allman y sus colegas usaron CLP para referirse a celulas de la medula osea LIN-IL 7R + + AA4.1 SCA1low / -, mientras que Hardy y sus colegas se refieren ahora CLPs como Lin-ILR + KIT + celulas CD24bajasCD43bajasAA4.1alto. Sin embargo, hay acuerdo en que la adquisicion de la expresion de IL 7R por Lin-celulas con niveles excepcionalmente bajos de expresion de KIT representa un hito importante en la produccion de celulas B. Importantes estudios paralelos tambien estan llevando a cabo con las celulas humanas (Cuadro 1). La mayoria de los pasos de diferenciacion posteriores estan bien representados en el esquema de gran utilidad desarrollado por Hardy y sus colegas. Se clasifican los subconjuntos de celulas progenitoras B en multiples fracciones: Fraccion A (que incluye pre pro celulas B), fraccion B (que incluye a pro celulas B) y la fraccion C (que incluye a grandes celulas B pre). Ademas, se ha perfeccionado a lo largo de los anos, la explotacion de los nuevos avances en la citometria de flujo y la disponibilidad de nuevos marcadores. Los progenitores tempranos de la serie original de los subgrupos definidos por Hardy y sus colegas (B220 + CD24bajo; Fraccion A) es probable que sea aguas abajo de ELPs y CLPs, e incluye una sorprendente variedad de celulas linfoides, celulas NK, DC plasmocitoide (pDC) y otros linajes de DC. Como ejemplo, la fraccion A incluye B220 + KITlbajoCD19-NK1.1-celulas de la medula osea referidas por Rolink y sus colegas como progenitores tempranos con potencial linfoide y mieloide (EPLM). Con la excepcion de expresion B220, estos EPLMs son muy similares a CLPs. Es importante destacar que algunos EPLMs se ha demostrado generan celulas T y B, y que retienen algo de potencial residual para generar macrofagos en cultivos con las celulas del estroma. El tratamiento de ratones con Flt3L resultan en la expansion del numero de EPLMs a expensas de las celulas B, lo que sugiere que podra haber sido dirigido a destinos de DC. Otra poblacion dentro Fraccion A se cree que tienen potencial de linaje combinado de celulas B y celulas T, y se les ha designado como el subconjunto CLP2. Hasta ahora solo ha sido identificado en ratones transgenicos reportero pTCR y difiere de EPLMs en el que expresa bajos niveles de KIT (TABLA 2). La adquisicion del senalamiento celular de la Fraccion A del CD122 (la cadena de la IL-2 y del receptor de IL 15) para el linaje de celulas NK y es seguido por NK1.1 y

expresion DX5. Ademas, los subconjuntos Ly6C+ y/o CD4+ de Fraccion A representan linajes de DC. B220 + Ly6C + CD11c + CD19-CD43 + DX5 de pDCs en la medula osea estn estrechamente relacionados con las celulas B y pueden subdividirse en al menos dos subconjuntos estables. Un subconjunto esta particularmente relacionado con el linaje de celulas B con respecto a la expresion de RAG1, EBF1, Ig y 11 BCL. Aunque este tipo de pDC contiene transcripciones Pax5, carece de la expresion de CD19 de la superficie celular y esta presente en ratones Pax5-/ -. Similar a las celulas B, el desarrollo de pDC esta bloqueada por senalizacion a traves de la via Notch. Hardy y colegas posteriormente reduce aun mas la definicion de Fraccion A B220+CD24baja a celulas Ly6C-AA4.1alta CD43lbajaKITbajaIL 7R+, de nuevo difiriendo de CLPs por la expresion de B220. Esta definicion revisada ahora excluye la mayoria de las celulas con un potencial de diferenciarse en celulas del linaje mieloide, aunque la fraccion todavia contiene algunas celulas que en la cultivo, pueden ser inducidas a diferenciarse en el linaje de celulas T. Una conclusion importante de los estudios de estos y otros es que la adquisicion de la expresin B220 por si sola no senala la restriccion al linaje de celulas B. El rasgo cardinal de las celulas en la fraccion B de Hardy es la expresion de CD19, y este evento es totalmente dependiente de su seleccion por PAX5 (REF. 100). Hay muchas otras selecciones Pax5 dependientes, y un importante papel de este factor de transcripcion es inhibir la capacidad de los progenitores del linaje de celulas B para convertirse en otros linajes. Esto fue demostrado en experimentos de seleccion de un gen condicional que mostraron una amplia auto-renovacion, las lineas celulares pluripotentes podran establecerse a partir de ratones knock-out Pax5. Similar a EPLMs, estas lineas celulares eran B220 + pero por lo demas similar a CLPs. Es notable que las celulas B maduras pueden ser inducidas a convertirse en celulas T con solo privarlas de PAX5, y podria ser posible que PAX5 puede llegar a ser regulados a la baja en algunos tumores malignos relacionados con el linaje de celulas B. La expresion CD19 es probable que se produzca despues de la regulacion al alza de B220 por la mayoria de progenitores de celulas B. Sin embargo, Dorshkind y sus colegas describen celulas CD45RA + CD19 + B220- raras (0.1-0.4% de celulas nucleadas de la medula osea) que se desarrollan exclusivamente en linfocitos los subgrupos celulares B 1a y 1b B220bajoIgMalto IgDbajoCD43 + CD23 + CD5MAC1 + / -. Estos progenitores B 1 restringidos fueron IL 7R + y clonalmente expandido en presencia de IL 7. Aunque algunos de ellos tambien se produjeron un pequeno numero de macrofagos en cultivo, que eran poco sensibles al factor de crecimiento y diferenciacion de celulas mieloides. Expresion de B220 es dependiente de PU.1 (un factor de transcripcion codificado por Sfpi1), y por ello es interesante que la supresion condicional de Sfpi1 en progenitores CD19 + sesga su diferenciacion hacia celulas B 1. La produccion de celulas convencionales B1 y B2 normalmente pueden ser apoyadas por linfopoyetina timica estromal (TSLP) e IL 7, respectivamente, sin embargo, es interesante observar que estas dos importantes citoquinas son redundantes cuando son hechas artificialmente en las concentraciones apropiadas. Progenitoras de los linfocitos B 1 son incapaces de producir celulas T, celulas NK o DCs, y estan en su mayoria pero no exclusivamente, presentes durante la vida fetal. Dada la importancia aparente de las celulas B 1 de la inmunidad innata, la relacion de estos progenitores que son responsables de generar las celulas B convencionales, merecen mas estudio. Otras decisiones de diferenciacion de linaje celular son igualmente incrementales y las celulas NK son un ejemplo. La Fraccion A original descrito por Hardy y colegas incluye los recientemente descritos DCs productores de interferon asesino (IKDCs) B220 + Ly6C-X5 + NK1.1 + CD11c + que parece tener celula una celula hibrida NK y propiedades de DC. A pesar de que se parecen mucho a las celulas NK en lo que respecta a la produccion de IFN, la dependencia del represor transcripcional ID2, la capacidad de respuesta IL-15 y las actividades citotoxicas, IKDCs se deriva de manera mas eficiente primeros progenitores. Por el contrario, las celulas NK mas convencionales parecen originarse en CLPs. Aunque hay un intenso debate sobre cual de los progenitores de la medula osea repone el timo de adultos, hay acuerdo en que muchos tipos de celulas muy diferentes presentes en la medula osea y la sangre pueden ser inducidas a convertirse en celulas T en condiciones experimentales. Entre ellos, ELPs comparten muchas propiedades con los progenitores tempranos del linaje de celulas T (ETPs), amplian al menos 20.000 veces cuando se trasplantan y producen timocitos (CD4 + CD8 +) doble positivos durante 12 semanas (RSW, observaciones no publicadas). Equivalentes a los MPPs de medula osea de adultos, ELPs y CLPs se han encontrado en la sangre, y retienen la capacidad de hacer tanto celulas del linaje T y B. Sin embargo, esto no excluye la posibilidad de que un pequeno subconjunto de estas celulas es el linaje de celulas T restringido y es probable que colonizen el timo. Ademas, la sseleccion de Notch o LRF interrumpe la linfopoyesis de celulas B en la medula osea, mientras que apoyan la progresion de linaje de celulas T. Es importante destacar que, el compromiso con el linaje de celulas T no es completa, y timocitos tempranos conservan la posibilidad de producir algunos NK, DC y celulas de linaje mieloide. Reminiscencias de la situacion con celulas NK y DCs, por lo menos algunos pasos en la diferenciacion de linaje de celulas T puede ocurrir fuera del timo. Sera importante saber si las celulas hechas en diferentes lugares y formas son funcionalmente especializados y estables. En resumen, la perdida de potencial mieloide es gradual y no coincidente con los cambios en algun marcador celular de superficie (Fig. 2). ELPs tienen una baja capacidad de expandirse clonalmente con los factores que inducen la

diferenciacion de celulas mieloides, mientras que CLPs y varios progenitores relacionados producen un pequeno numero de macrofagos. Este potencial residual se extinguio finalmente en la mayoria, pero no todas, las celulas CD19 +. Muchos subconjuntos de medula osea pueden generar celulas T, pero PEL son los mejores candidatos para la renovacion del timo en condiciones normales. Las clulas madre expresan receptores Toll-like Los receptores de antigenos especificos se expresan por los linfocitos maduros y se utilizan como puntos de control para seleccionar las celulas que seran mas eficaces para el sistema inmune adaptativo, mientras que las celulas del sistema inmune innato reconocen productos bacterianos y virales a traves de los receptores tipo Toll (TLRs). Se penso durante mucho tiempo que los progenitores hematopoyeticos eran incapaces auto discriminacion y no autodiscriminacion, pero ahora sabemos que expresan TLR funcionales. Ademas, la exposicion de las celulas madre altamente purificada a ligandos TLR2 o TLR4 los conduce a proliferar y estimulan su diferenciacion, mientras que los progenitores mieloides rpidamente generan macrofagos con estimulacion similar (Fig. 3). CLPs son tambien sensibles a ligandos de TLR, y los estudios mas recientes revelaron que TLR9 pueden mediar en su direccin nueva a los linajes de DC durante la infeccion viral (RSW, RP y PWK, observaciones no publicadas). Estos hallazgos muestran que el compromiso no es irreversible en el estado Pro linfocito / CLP y los progenitores siguen siendo sensibles a las senales ambientales. Observaciones finales El reconocimiento de que los progenitores linfoides son flexibles plantea varias preguntas importantes. Por ejemplo, hay una ventaja de supervivencia en el rapido aumento del numero de efectores inmunes innatos durante infecciones que ponen la vida en riesgo? .Los DCs derivados de progenitores linfoides y los que son parientes cercanos de las celulas B (como pDCs) tienen funciones unicas? La estimulacion repetida con ligandos TLR en la infeccin cronica va en detrimento de HSCs y podria esto contribuir a su envejecimiento prematuro?. Puede proveer la expresion de estos receptores una explicacion de por que las HSCs se encuentran fuera de la medula osea? Hay muchos ejemplos de celulas del linaje B siendo conviertidas experimentalmente a otros destinos, pero las celulas B normales no se vuelven inestables y causan enfermedades como se cree que es el caso de las celulas T? Esta mezcla heterogenea de cuestiones importantes es un reto agradable, al igual que los mecanismos moleculares subyacentes. Un grado de consenso esta siendo alcanzado sobre los pasos implicados en la progresion de HSCs a los progenitores que estan destinados a convertirse en las celulas B, y hay un creciente reconocimiento de que es un proceso gradual. Estamos lejos de comprender la forma en que este responde a los desafios, pero el uso de la cartografia de destino y los modelos de enfermedades infecciosas aportan importantes conocimientos. Por otra parte, ya es posible ver como la manipulacion y reprogramacion de celulas hematopoyeticas podra utilizarse algun dia para reparar y restaurar las defensas inmunitarias.