Lea el artculo, y explique brevemente el objetivo del trabajo. Mediante un esquema general de trabajo describa la metodologa a seguir en el artculo.

escriba los resultado ms sobresalientes Con sus propias palabras escriba las conclusiones a las que se lleg con el trabajo

Caracterizacin de la expresin serina proteasa de Agaricus bisporus y Coprinopsis cinerea mediante la protena fluorescente verde y A. bisporus SPR1 Promotor

El Agaricus bisporus una serina proteasa (SPR1) parece ser importante tanto en la nutricin y el micelio envejecimiento del cuerpo fructfero. Se presenta en la construccin de un promotor SPR:: protena verde fluorescente (GFP) de fusin de cassette, pGreen_hph1_SPR_GFP, para la investigacin de la expresin temporal y de desarrollo de SPR1 en homobasidiomycetes y para determinar cmo la expresin est relacionada con fisiolgicos y ambientales estmulos. Seguimiento de A. bisporus pGreen_hph1_SPR_GFP transformantes en medios ricos en amoniaco o con distintas fuentes de nitrgeno demostraron que SPR1 se produce en respuesta a la disponibilidad de nitrgeno. En los cuerpos de fructificacin A. bisporus, la actividad de GFP fue localizado en el estpite de poscosecha esporforos senescentes. pGreen_hph1_SPR_GFP tambin se transform en el modelo cinerea Coprinopsis basidiomicetos. endgeno C. cinerea actividad de proteinasa fue perfilado durante el cultivo de lquido y el desarrollo de cuerpos fructferos. mximo la actividad se observ en la tapa de madurez, mientras que la actividad cay durante la autolisis. Anlisis de la C. cinerea genoma revel siete genes que muestran una homologa significativa con la A. bisporus SPR1 y genes SPR2. estos Los genes contienen el cido asprtico, histidina y serina comn serina proteinasas. El anlisis de los regiones promotoras revelaron por lo menos un CREA y varios motivos zona de regulacin en todas las secuencias. fructificacin se inducidos en C. dikaryons cinerea, y la fluorescencia se determin en diferentes etapas de desarrollo. las buenas prcticas agrarias

expresin se observ en todo el ciclo de vida, lo que demuestra que la proteinasa serina pueden estar activos en todos los las etapas del desarrollo del cuerpo C. cinerea fructificacin. Serina proteinasa expresin (la fluorescencia de GFP) fue ms concentrados durante el desarrollo del tejido joven, que puede ser indicativo del volumen de ventas de alto valor proteico en la celda diferenciacin.

Agaricus bisporus, el champin cultivado, ha econmicos y la importancia biotecnolgica. Es el ms ampliamente cultivada en todo el mundo de hongos, con una produccin anual de la regin de 5 millones de toneladas (33) y es uno de los principales protegidos de cultivos en el Reino Unido, que representa el 10% de tales produccin hortcola (20). Adems de su valor como alimento de cultivos, hay un inters considerable en A. bisporus como anfitrin de pharming molecular de protenas heterlogas (21, 51, 58, 62), y tambin parece producir una serie de compuestos de biomdicas potenciales y / o la importancia nutracuticos (13). Aplicacin de la biotecnologa para A. bisporus ha aumentado considerablemente debido al desarrollo de un sistema de transformacin (14, 26) y, recientemente, Burns et al. (7) desarroll un bisporus A. "Conjunto de herramientas moleculares" que pusieron a prueba diferentes promotores para la eficiente de la expresin gnica. A pesar de estos avances recientes, el desarrollo estudios en Agaricus se han visto obstaculizados por la el tiempo y la contencin de los problemas que existen en el estudio de una gentica modificar la tensin. La seta de tinta gorra, Coprinopsis cinerea (antes Coprinus cinereus), es un homobasidiomycete bien estudiadas (12, 43, 47) que forma un excelente sistema modelo para el estudio de genes expresin en varios niveles de diferenciacin, en particular setas de desarrollo y procesos de la meiosis (46, 59). se ha ha utilizado como un objeto de los estudios del desarrollo (32), principalmente debido a su ciclo de vida relativamente corto, que puede ser completado en el laboratorio dentro de 2 semanas (44). Adems, la gentica estudios y la manipulacin experimental de todas las fases de su ciclo de vida son simples y relativamente sencillo (63). El C. cinerea secuencia del genoma fue publicado en 2003 (http:// . broad.mit.edu) y, recientemente, el silenciamiento de genes se ha demostrado en el basidiomiceto (24, 47). Nos han aprovechado de estas caractersticas de la C. cinerea para la investigacin de una serina proteinasa de Agaricus bisporus.
Una proteasa serina (SPR1) ha sido purificada a partir de una senescentes esporforos tejido de A. bisporus, que tiene un peso molecular masa de 27 kDa y un punto isoelctrico de 9,0 (11). la proteasa tiene un pH ptimo amplio, desde 6,5 hasta 11,5, y una estrecha especificidad de sustrato, lo que requiere tanto de un aminocido hidrofbico

en la posicin P1 y una longitud de cadena peptdica mnima (11). La protelisis ms activos de A. bisporus cultura filtrado se observado con Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA en pH neutro (10). Serina proteinasa se encontr que la proteinasa de mayor produccin por A. bisporus en esporforos durante la senescencia (9), y extracelular de micelio en el colonizado compost, donde el nitrgeno es en gran parte en forma de protenas, lo que sugiere un efecto nutricional papel de esta enzima (10). La serina proteinasa extracelular micelio se produce en mayor medida en respuesta a protena asociada con sustancias hmicas que otras protenas puras, lo que sugiere factores adicionales a la protena estn involucrados en su induccin. El cDNA de esta proteinasa ha sido clonado y secuenciado (no la adhesin. Y13805), que revel que esta proteinasa serina (SPR) pertenece a la K "proteinasa familia "(31). Expresin SPR1 gen no se detect en recin setas recolectadas, mientras que el aumento los niveles de transcripcin se observaron 1 a 3 das despus de la cosecha. Expresin de SPR1 se ms fuerte en el tejido despus de la cosecha estpite (31), un hallazgo que se correlaciona bien con el aumento de la actividad de las enzimas y protenas nivel detectado en senescentes estpite (9). El relativamente alto de la transcripcin y los niveles de traslacin de SPR en el estpite demostrar que la enzima es importante en el metabolismo de los senescentes setas. Se describe aqu la construccin de un promotor:: verde protena fluorescente (GFP) de fusin de cassette para la investigacin de la expresin temporal y de desarrollo de SPR1 en A. bisporus y C. cinerea y caracterizar la expresin en respuesta a los estmulos fisiolgicos y ambientales. tambin investig la utilidad de C. cinerea como un sistema modelo para basidiomicetos la expresin gnica y la produccin de cuerpos fructferos, desde el desarrollo de una especie de modelo para los basidiomicetos la investigacin es vital para el progreso futuro.

MATERIALES Y MTODOS Tensiones y mantenimiento de los cultivos. Escherichia coli cepa DH5? fue el anfitrin cepa de plsmidos recombinantes. Agrobacterium tumefaciens AGL1 (34) se utiliz de A. bisporus transformaciones y se cultiv como se describi previamente (17, 26). El A. bisporus cepa comercial A15 (18) se utiliz para las transformaciones. Micelio se mantienen rutinariamente a 25 C para la malta-peptona (35) placas de agar y suplementado con 25? g de higromicina B ml? 1 para seleccionar transformantes. A triptfano auxtrofo, LT2 (A6B6 trp1.1; 1,6) (4), se utiliz para las transformaciones C. cinerea. C. cinerea cepas AT8 (A43B43 trp-3 ade-8) y AmutBmut (A43mutB43mut pab1) (41, 56) se utilizaron para los estudios de fructificacin. C. cinerea micelio

se mantienen rutinariamente a 37 C en agar YMG (4), complementado en su caso con 100? g de L-triptfano ml? 1. Construir el diseo. Un 877-pb A. bisporus SPR regin putativo promotor (5? regin no traducida) se amplific a partir de una plantilla clon csmido utilizando los cebadores SPR1-fwd (TCCCCGCGGCGGGCTCAGAAGGTTTCTAT) y SPR1 (rev) m (A AATCCATGGTCGGTGAAGAGATC) que, respectivamente, introdujeron 5? SacII y 3? NcoI sitios de restriccin. El amplicn resultante fue clonado mediante el uso de pGEM-T Easy (Promega Corp.), y la integridad SPR1 promotor fue confirmado por ADN de doble cadena de secuenciacin de recombinantes. El promotor se SPR1 clonado en un pBluescript II basado en la expresin de GFP construir (pBlue-SPR-GFP) despus de la eliminacin del promotor de A. bisporus GPDII (SacII-NcoI restriccin) de el intrn-GFP vector de expresin p004iGM (6). El SPR 1,884 pb: la expresin de GFP unidad fue eliminado por SacI-KpnI restriccin y se lig en el ClaI-KpnI restringido binario pGreen_hph1 (18) por la adicin de un oligolinker ClaI-SacI (CGAGCT) para producir pGreen_hph1_SPR_GFP. Transformaciones de hongos. Plsmido de ADN para la transformacin de hongos fue preparado mediante el uso de kits de Qiagen Midi Prep. C. cinerea protoplastos cotransformations se llevaron a cabo como se describi previamente (4, 6, 22, 24) con ca. 1? G de pCc1001 (Trp1) (54) con 5? G de pGreen_hph1_SPR_GFP plsmido. PRT? transformantes se mantuvieron en agar regeneracin Coprinus (RA) (6, 16, 24). Transformantes putativos de C. cinerea se cultivaron como se describi anteriormente, y era el ADN genmico extrae como se describi previamente (36). PCR de deteccin de transformantes C. cinerea se ha realizado mediante componentes Reddymix (ABgene) con un general programa de ciclos trmicos de 95 C durante 3 minutos, seguido por 30 ciclos de 95 C durante 30 s, 50 C durante 1 minuto y 72 C durante 30 s, seguido a su vez por 72 C durante 10 min. A. bisporus se transform mediante el uso de A. tumefaciens mediada por transfeccin de tejido de las agallas como se describi previamente (6, 7, 14, 35, 42). Transformantes de A. bisporus fueron identificados mediante el uso de mtodos publicados anteriormente (18, 35), y la transcripcin tanto de HPH y GFP transgenes se confirm mediante el uso de transcripcin inversaPCR y / o cuantitativa de transcripcin inversa-PCR (24). A. bisporus transformantes para la fructificacin fueron seleccionados de un conjunto de muestras grandes mediante la cuantificacin fluoromtricos de la actividad de las buenas prcticas agrarias en el micelio (24) despus de la induccin con la fraccin de cidos hmicos Estudios de fructificacin. Dikaryons de C. cinerea se produjeron en las placas de YMGT la colocacin de bloques de micelio de AT8 y Trp LT2? transformantes situado a 5 mm de distancia a 37 C; dikaryotization fue confirmada por la presencia de clulas abrazadera. para el

crecimiento y la induccin de cuerpos fructferos, dikaryons en las placas se incubaron YMGT menores de 12 h de luz y 12 h de oscuridad a 25 C y con humedad del 90% en condiciones estndar de fructificacin (22, 37). La cepa C. cinerea AmutBmut se seleccionada como una cepa de control para los estudios de fructificacin, ya que muestra la formacin de la abrazadera y el desarrollo del fruto cuerpo como un dicarion y produce oidia uninucleate como un monokaryon (56). La expresin de GFP en los cuerpos de fructificacin se examin mediante el uso de una Leica MZFL111 microscopio con SPOT 2.2.1 (Diagnostic Instruments, Inc.) software de imgenes. A. bisporus esporforos fueron producidos en los cultivos de compost a pequea escala en el Universidad de Warwick transgnicos instalacin de contencin de setas, la cosecha, y se almacena como se describi previamente (18). La actividad se midi en las buenas prcticas agrarias setas cortado a 3 das despus de la cosecha mediante el uso de un medidor porttil de buenas prcticas agrarias (excitacin, 450 nm, emisin 530 nm; ajuste de la ganancia, de 55 aos [ADC biocientfica, Ltd., Reino Unido]). Lecturas medido se registraron tanto la tapa y el estpite los tejidos de los hongos y toda la cara recin cortada de forma longitudinal dividido en dos esporforos. Un mnimo de tres lecturas se replican por cada muestra tejido a partir de dos esporforos replicar. Setas seccionados fueron vistos tambin mediante el uso de un proyector LED azul (Inova X5, Energa emisivo, North Kingstown, RI) con las correspondientes conjuntos de filtros azul / amarillo (57) y fotografiado usando un Nikon Coolpix 990.
Ensayos de proteasa. Un ensayo de placa de proteinasa se llev a cabo mediante la inoculacin de C. cinerea LT2 en amonio sin placas RA que contiene 0,5% (wt / vol) desnatada leche en polvo. Para evaluar la actividad de la proteinasa, el tamao de la colonia se midi, adems de como la zona de despeje alrededor de cada colonia, producido por la degradacin de la leche capa de la actividad proteinasa extracelular. LT2 se inocul en estndar de AR los medios de comunicacin como control. Cinco placas de replicar fueron medidos por ensayo. Expresin de la actividad de la serina proteasa en cultivo lquido se determin por inoculacin de LT2 en amonio sin solucin de leche RA que contiene 0,5% (wt / vol) y en el estndar de la artritis reumatoide. Las culturas se desarrollaron durante 264 h, y las muestras fueron (8 ml) aspticamente cada 24 horas y se analiza. Serina proteasa actividad se midi en las etapas cuerpo fructfero desarrollo de homogeneizar el tejido de hongos en el 50 mM Tris (pH 8,0) y centrifugacin a 10.000? g para remover partculas material. Serina proteinasa actividad fue ensayada por la determinacin de spectrophometrically la absorbancia a 405 nm despus de la liberacin de p-nitroanilina a partir de la sntesis pptido Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (0,15 mm) en 50 mM de tampn Tris (pH 8,0).

La hidrlisis se realiz durante 30 min a 37 C. La inhibicin de la proteasa serina se realizado por la preincubacin de 0,1 M de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF; Fluka) inhibidor con la enzima a 37 C durante 30 min. Las concentraciones de protena soluble se midieron por el mtodo de tintura de unin de Bradford (5). De suero bovino albmina se utiliza como estndar. Ensayos bioqumicos se realizaron por triplicado. Anlisis de la secuencia. Las secuencias fueron analizadas mediante el uso de BLAST (NCBI) (1) y alineados con CLUSTAL W (25). La suite de manipulacin de secuencia (55) realiza la masa molecular y las predicciones isoelctrico punto. Prosite se utiliz para identificar los motivos y secuencias de la firma en las secuencias de protena deducida (3), y una secuencia de seales se identificaron mediante el uso de SignalP (48). La clasificacin estructural de las secuencias se bas en la SCOP (45). Transcripcin vinculante factor de sitios fueron predichos mediante la bsqueda en MOTIF GenomeNet (http://motif . Genome.jp /). RESULTADOS El anlisis de A. bisporus transformantes pGreen_hph1_SPR_GFP. Para investigar la expresin temporal y espacial de A. bisporus SPR1 gen, un promotor:: GFP cassette de fusin fue construido. Este vector de expresin se ha diseado para contiene un intrn 5, que ya ha demostrado ser necesarios para la expresin de GFP en A. bisporus y C. cinerea (6). PGreen_hph1_SPR_GFP plsmido se transform en A. bisporus a travs de A. tumefaciens, y los transformantes se recuper en la seleccin de higromicina. Nueve transformantes fueron seleccionados para su posterior anlisis. La presencia de la casete de expresin intactas, pGreen_hph1_SPR_GFP, fue confirmada por PCR. Cebadores SPR1Fwd (5-CCGCGCAACATATGTATGTGA GAG-3) y GFPrev (5-GTGGCGGATCTTGAAGTTC ACCTTG-3), que se unen 256 pb desde el extremo 5 del promotor y 234 pb SPR1 aguas arriba de los 3? final de el gen de la GFP, respectivamente, dieron lugar a un producto de 1226 pb PCR. Cebadores GFPFwd (5?-GGCGTGCAGTGCTTCAGCCG C-3?) Y TrpCRev (5?-GCACTCTTTGCTGCTTGGAC-3?) que se unen 222 pb de los 5? final de la GFP gen y 146 pb aguas arriba de los 3? final de la terminacin de trpC, como resultado un producto de 665 pb PCR. Positivo de amplificacin de ambos fragmentos confirm la presencia de la expresin intacta cassette. A. bisporus transformantes pGreen_hph1_SPR_GFP, de tipo salvaje A. bisporus A15, y una cepa de A. bisporus expresar el plsmido PGR4-4GiGM3? (G26), que contiene las buenas prcticas agrarias en A. bisporus promotor GPDII (6), se inocularon en una gama de medios para investigar si los cambios en los nutrientes disponibilidad que alteran la expresin de la proteasa, que se sabe que estar involucrados en la adquisicin de nutrientes. GFP expresin se control en los medios de comunicacin ricos en amoniaco (YMG, MMP, y RA), la papa dextrosa agar (PDA), y RA libre de amoniaco que contienen

una de las fuentes de nitrgeno nica siguiente: 0,094% (wt / vol) de la fraccin hmica, 0.084% (wt / vol) de cido glutmico (GA), o el 0,5% (wt / vol) de potencia desnatada leche. La expresin de GFP se observado en los transformantes pGreen_hph1_SPR_GFP crecido en los medios de comunicacin fraccin hmica, leche, GA, y PDA, mientras que no las buenas prcticas agrarias se observ expresin en YMG, MMP, y RA (Tabla 1). La figura 1A muestra la expresin de GFP en un bisporus A. SPR:: GFP transformante (TP17) en amoniaco libre RA que contiene 0,094% fraccin de cidos hmicos y su represin en la regeneracin estndar los medios de comunicacin. Como era de esperar, el GPD:: GFP control de transformante transformante (G26) mostraron una fuerte expresin de GFP en todos los medios de comunicacin, mientras que la fluorescencia de GFP no se observ en los medios de comunicacin con la cepa de tipo salvaje (Tabla 1). Seguimiento de SPR1 expresin en A. bisporus esporforos el desarrollo. Fructificacin fue inducida en A. bisporus transformantes y la expresin de GFP se detect el uso de iluminacin LED azul de setas dividido en dos (Fig. 1B). transformantes de frutos fueron seleccionados de un conjunto de muestras grandes por fluoromtricos cuantificacin de la actividad de GFP en el micelio (23) despus de la induccin con la fraccin de cidos hmicos (10). TP196 fue seleccionada como una tpica representante fenotpica de los transformantes, el cual tambin present cultura y una excelente capacidad de fructificacin. GFP expresin Se observ claramente tanto en la tapa y los tejidos estpite de recin cosecha (da 0) A. bisporus G26 cuerpos fructferos, expresando GFP bajo el control del promotor GPD (Fig. 1Ba). En setas senescentes (3 das despus de la cosecha) no la expresin de GFP se observ en un higromicina resistentes (control) transformante de A15hph (sin casete GFP, fig. 1Bb hongos, a la izquierda), mientras que la expresin de GFP se detect claramente en el tejido del estpite SPR:: GFP transformante TP196 (Fig. 1Bb, setas a la derecha). Lecturas de medida (unidades de fluorescencia relativa [RFU]) para tapa y estpite tejidos de todo y atravesada longitudinalmente setas de TP196 (SPR:: GFP), G26 (GPD:: GFP), y A15hph (sin casete GFP) se registraron tres das despus de la cosecha (Fig. 2). Actividad de GFP fue elevado considerablemente en los estpites de setas senescencia de la SPR:: GFP transformante TP196. El tejido (estpite) especficos de la expresin de GFP en TP196 es consistente con las observaciones anteriores de histoqumica de la actividad de SPR en senescencia setas (9). Los valores registrados para RFU G26 representa la fluorescencia de fondo de la fructificacin cuerpo, mientras que A15hph muestra un ligero aumento en comparacin con la RFU que debido a la autofluorescencia G26. Perfiles de expresin de las proteasas de serina en C. cinerea LT2.

Actividad de proteinasa endgena se evalu mediante la inoculacin de LT2 en amonio libre de AR con o sin un 0,5% (wt / vol) leche solucin. Zonas de compensacin, indicativo de la actividad proteinasa, se produjeron slo en los medios de comunicacin que contenga la plantilla de leche (Fig. 3A). Un perfil de expresin de proteinasa fue desarrollado para LT2 cultivaron en caldo mediante la medicin de la hidrlisis de los sintticos pptido Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA. Actividad de proteinasa se observ LT2 en cultivos crecidos en amonio libre de RA que contiene 0,5% (wt / vol) de leche solucin despus de 120 h (0.0259 absorbancia unidades [UA] / ml) y sigui aumentando hasta 240 h (1,283 AU / ml) (Fig. 3B). Una pequea disminucin en la actividad se observ en 264 horas, pero volvi a aumentar a 288 h. Preincubacin del crudo extractos de la enzima con el inhibidor de la serina proteasa PMSF dio lugar a una gran disminucin en la actividad (1,283 a 0,17 AU / ml a las 240 h), lo que confirma que la mayora de proteinasa

proteinasa actividad detectada pertenecan a la clase mecanicista serina. Actividad de proteinasa poca o ninguna se observ en LT2 culturas crecido en la norma AR medios de comunicacin, que es rico en amonaco (Fig. 3B). Serina proteasa actividad se midi durante el primordio, cariogamia, la meiosis, inmaduras, maduras y la autolisis etapas del desarrollo de la fructificacin del cuerpo (Fig. 3C). aumento de la actividad poco a poco desde la etapa de primordio (1,29 U / g) a la meiosis etapa (1,69 U / g), con una leve cada en la etapa inmadura (1,52 U / g), seguido por un gran aumento en la actividad durante el etapa de desarrollo maduro (6,32 U / g). Mxima actividad se detectados en la tapa de madurez (6,32 U / g), seguido por una disminucin en la actividad durante la autolisis (3,45 U / g). Del mismo modo, la preincubacin de los extractos enzimticos crudos con el inhibidor de PMSF resultado en una gran disminucin en la actividad (6,32 a 0,34 U / g en el tapa de maduro), lo que demuestra que la clase de actividad proteinasa se detect la serina proteasa (Fig. 3C). Identificacin y anlisis de secuencias de homobasidiomycete serina proteinasas. Despus de la confirmacin de la serina endgeno proteinasa actividad en C. cinerea, la identificacin de la codificacin genes se realiz mediante la publicacin del genoma C. cinerea secuencia. Dos A. bisporus serina proteinasas han sido previamente identificados (SPR1 y SPR2), y fueron sus secuencias depositados en bases de datos pblicas con los nmeros de adhesin Y13805 y AJ344211, respectivamente (30, 31). el predijo masas moleculares (Tabla 2) de larga duracin y SPR1 SPR2 se considerablemente mayor que las estimaciones experimentales? de 27 kDa de dodecil de sodio electroforesis en gel de poliacrilamiday el cido amino cDNA y la secuencia N-terminal. maduro SPR1 (286 aminocidos, 28,29 kDa) y SPR2 (aminocidos 275 cidos, 27,70 kDa) las protenas son mucho ms cercana a los 27 kDa estimado previamente observados (11, 31). BLAST anlisis (1) de

A. bisporus la SPR1 y SPR2 genes en contra de la C. cinerea base de datos revel siete genes (CC1G_04562.1, CC1G_10592.1,
CC1G_10615.1, CC1G_07792.1, CC1G_10606.1, CC1G_0.3122.1, y CC1G_04470.1) que muestra una homologa significativa con la serina proteinasas. CLUSTAL W alineaciones de estos cinerea C. genes con el SPR1 A. bisporus revel la secuencia de aminocidos los valores de identidad que van entre el 44 y el 61%, mientras que el homologa de la SPR2 con los genes de C. cinerea oscil entre 42 y 55% (tabla 3). SPR1 y SPR2 genes tienen un aminocido valor de identidad de 75%, mientras que los genes de C. cinerea tienen homologas que van entre el 31 y el 77% (tabla 3). Tres motivos fueron identificados dentro de los genes de C. cinerea que son comunes a otras serina proteinasas: el asprtico residuo cido (consenso, [STAIV]-X-[LIVMF] - [LIVM]-D[DSTA]-G-[LIVMFC]-X (2,3) - [DNH]), el residuo de histidina (Consenso, HG-[STM]-X-[CIV] - [STAGC] - [GS]-X-[LIVMA] [STAGCLV] - [SAGM]), y el residuo de serina (consenso, G-TSX-[SA]-X-P-X (2) - [STAVC] - [AG]) (31). Estos residuos se conservada entre los genes y la C. cinerea SPR1 A. bisporus y SPR2 genes, con la excepcin de C. cinerea genes CC1G_10606.1, que carecan de los residuos de serina. Esto sugiere que los genes de C. cinerea son serina proteasas, y parece que que pertenecen a la familia subtilisina. El probable cinerea C. serina proteinasa genes oscila entre 346 y 500 aminocidos de longitud (Tabla 2), y todos los contena intrones. Cada intrn comenz con GT y termin con AG, que es una caracterstica comn de los intrones de hongos y se ha observado en los genes de la serina proteasa Acremonium chrysogenum (28), Lecanicillium psalliotae (60), y Arthrobotrys conoides (61). El nmero de intrones vara entre el 2 y 14 en funcin de los genes (Tabla 2), y algunos de conservacin de intrn posicin se observ entre los genes de C. cinerea y SPR2. Las masas moleculares tericos y puntos isoelctricos para las la C. cinerea genes SPR oscilan entre 35 y 53 kDa y 5,83 y 9,97, respectivamente (Tabla 2), mientras que el terico masas moleculares y puntos isoelctricos son 39,39 y 5,93 kDa para SPR1 y 38,85 kDa y 5.53 para SPR2, respectivamente (Tabla 2). Un pptido seal prevista se observ en el cinerea C. y A. bisporus serina proteinasas, con escote que ocurren ya sea entre los aminocidos 19 y 20, los aminocidos 20 y 21, o aminocidos 21 y 22, lo que sugiere que estas enzimas son secretada. Utilizando las secuencias de mayor homologa, la prediccin estructura secundaria de estos genes se compone de entre 20 y hlices 30%, 16 a 35 hebras%, y 42 a 61% los bucles (Tabla 2), y el anlisis del grado de globularity protenas sugiere que estas enzimas existen como compacto (globulares) dominios. Un kilobase de secuencia ascendente desde el inicio ATG codn de cada gen se analiz la presencia de los reguladores motivos. Por lo menos un CREA y varios reguladores Nit2/AreA elementos fueron identificados en las regiones promotoras de la C.

cinerea y los genes de A. bisporus (Tabla 2). No hay otras regiones del homologa se detectaron entre los promotores. Anlisis de la C. cinerea transformantes pGreen_hph1_SPR_GFP. Desde una pantalla preliminar de 100 Trp? cotransformants RA en los medios de comunicacin (rico en amonaco) y libre de amoniaco que contienen RA 0.094% (wt / vol) de la fraccin hmica como el nitrgeno nica fuente, el 32% de los transformantes se encontraron para expresar las buenas prcticas agrarias en el fraccin de cidos hmicos, que se correlaciona bien con la tasa de notificacin de cotransformacin (30 a 49% (6). Sin embargo, la expresin de GFP se no se observa en la AR los medios de comunicacin. Cuatro buenas prcticas agrarias? transformantes, no transformadas LT2, y una cepa C. cinerea (PG78Gr) que expresan GFP bajo el control del promotor del A. bisporus GPDII (24) se seleccionados para estudios posteriores. La expresin de GFP se control en los medios de comunicacin ricos en amoniaco (YMG y RA), PDA y ammoniafree RA que contienen la fraccin 0.094% (wt / vol) hmicos, 0.084% (wt / vol) GA, el 0,5% (wt / vol) de leche, como el nitrgeno nica fuente. LT2 no mostraron fluorescencia en cualquier medio, mientras que PG78Gr expresa GFP en todos los medios de comunicacin. la fluorescencia de GFP se observ en los transformantes crecido en la fraccin de cidos hmicos, leche, GA, y la patata dextrosa medios de comunicacin, mientras que no fluorescencia de GFP se observado en los medios de comunicacin RA (Tabla 1). El transformante slo para exhibir fluorescencia en los medios de comunicacin YMG se T47. C. cinerea transformantes se aparearon con AT8, y el dikaryons se inocularon en una amplia gama de medios de comunicacin y deteccin para la expresin de GFP. Perfiles de expresin similares se observaron tanto para monokaryons y dikaryons (Tabla 1). Figura 4 muestra C. cinerea transformante T47 monokaryon y dicarion expresin de GFP en amonaco libre RA que contiene 0,094% (wt / vol) de la fraccin hmica y la represin de las buenas prcticas agrarias en la norma la regeneracin de los medios de comunicacin. Seguimiento de SPR1 expresin en el cuerpo de fructificacin C. cinerea el desarrollo. La fructificacin se induce en el dicarion C. cinerea cepas y el control de la tensin AmutBmut. diferentes de desarrollo las etapas del cuerpo fructfero se examinaron microscpicamente de fluorescencia. Los bajos niveles de fluorescencia se observado en el nudo de hifas (Fig. 4BA). La fluorescencia se tambin se observa en la etapa de primordio, pero no fue localizado (Fig. 4BB). Una observacin similar se hizo para karogamy etapa, pero la localizacin GFP empezaron a producirse en el borde de la la formacin de agallas tejido (Fig. 4AC). GFP aparecido ms localizadas en la formacin de tejido de las agallas durante la meiosis (Fig. 4BD), mientras que en la GFP etapa inmadura se observ en lo alto de la estpite cerca de la tapa (Fig. 4BE). En esporforos madura, la fluorescencia

se observ en la tapa, pero fue ms concentrada en la unin del tallo y la tapa (Fig. 4Bf), mientras que la fluorescencia se redujo en el estpite (Fig. 4GB). Durante la autolisis, fluorescencia se redujo considerablemente en la tapa (Fig. 4Bh), pero se concentr en el tejido estpite (Fig. 4Bi). En el control cepa AmutBmut algunos autofluorescencia se observ a lo largo de las etapas de desarrollo diferentes. Figura 4C representa un esquema de la fluorescencia de GFP bajo el control del promotor de A. bisporus SPR1 todo el cinerea C. del ciclo de vida. DISCUSIN A. bisporus SPR1 ha sido demostrado ser importantes tanto en la nutricin y la senescencia de micelio del hongo fructificacin (8-10). Se utiliz un SPR:: fusin GFP construir investigar la expresin temporal y de desarrollo de SPR1 en A. bisporus y heterloga de acogida C. cinerea en respuesta a estmulos fisiolgicos y ambientales. Los estudios de desarrollo en bisporus A. siguen enfrentndose por el tiempo y la contencin temas que se dan cuando se estudia un modificado genticamente tensin. C. cinerea ofrece un sistema modelo para los estudios de de la expresin gnica durante el desarrollo de hongos (47, 59), y la expresin heterloga del promotor de A. bisporus SPR1 la fusin es una nueva demostracin de la utilidad del host inkcap como especies modelo. GFP se ha utilizado ampliamente como una molcula de reportero o como un fluorescentes de etiquetas para las protenas de fusin (53) y ahora es un valioso herramienta para el anlisis molecular de los hongos filamentosos (38). La uso de las buenas prcticas agrarias en los hongos ascomicetos ha sido ampliamente reportado (2, 27, 49), y la expresin en homobasidiomycetes tambin recientemente ha conseguido (6, 39, 40). El objetivo del presente estudio fue realizar un estudio comparativo el anlisis molecular de las proteasas de serina en ambas C. cinerea y A. bisporus. Con este fin, la identificacin de C. cinerea genmica SPR secuencias se realiz para establecer la homologa entre Agaricus y genes Coprinus SPR. La bioinformtica se utiliza para ayudar a predecir si los genes se regula de una forma similar moda, proporcionando evidencia de la idoneidad de C. cinerea como una serie heterloga de A. bisporus SPR1. BLAST anlisis de la secuencia genmica de A. bisporus SPR1 cDNA y SPR2 la base de datos C. cinerea revel siete genes que muestran homologa significativa. La conservacin del cido asprtico, histidina, y residuos de serina en los genes sugiere que son serina proteasas de la familia de la subtilisina. Sin embargo, la falta de un residuo de serina en el sitio activo de CC1G_10606.1 sugiere que algunos de ellos son "pseudogenes" que sera incapaz de cdigo de enzimas activas. Pptido seal Los anlisis son indicativos de la actividad extracelular y protenas globularity infiere que las enzimas que existen ms compacto

dominios globulares. La secuenciacin del genoma A. bisporus es actualmente en curso (http://www2.warwick.ac.uk/fac/sci/whri / Research / agaricusgenome /), que puede revelar ms homlogos SPR. Todos los genes de C. cinerea contena intrones, con los nmeros que varan entre 2 y 14, slo dos genes tenan menos de 10 intrones, seis de los siete analizados contenan entre 11 y 14 intrones. Exones cortos y de alta densidad intrn en basidiomicetos y la conservacin relativamente pobres del intrn secuencias de empalme en comparacin con otros hongos pueden dar lugar a algunas imprecisiones
inexactitudes cuando intrn software predictivo se utiliza. Esto puede explicar por el bajo nmero de intrones identificados en CC1G_10615.1 y CC1G_04470.1. En A. bisporus, dos serina proteinasas (SPR1 y SPR2) fueron aislados del clon csmido mismo, dentro de los 30 kb de el uno al otro (30). Del mismo modo, tres C. cinerea serina proteinasas (CC1G_10592.1, CC1G_10606.1 y CC1G_10615.1) estaba a menos de 50 kb de unos a otros en el genoma, lo que sugiere ya sea local o la duplicacin de un ancestro comn. Conservacin de las posiciones intrn observado en estos genes es indicativo de las duplicaciones local. Actividad de la proteasa endgena se investig en C. cinerea. Un ensayo preliminar de la placa base como resultado una zona de despeje alrededor de las colonias de hongos, lo que confirma la presencia de proteasas en el basidiomiceto. Como ya se ha demostrado en A. bisporus (10), poco o nada de actividad de la serina proteasa se detectadas en las culturas C. cinerea producidas en amonaco-rich media. Se observ actividad en cultivos crecidos en amonaco libre RA que contengan leche como la nica fuente de nitrgeno despus de 120 horas y sigui aumentando hasta 240 h, con un ligero descenso en 264 horas antes de otro aumento a 288 horas, que puede ser indicativo de la aparicin de la autolisis. La expresin de SPR1 en respuesta a las fisiolgicas y estmulos ambientales se analiz mediante la inoculacin de la A. bisporus y C. cinerea pGreen_hph1_SPR_GFP transformantes en una variedad de medios para investigar si los cambios en la disponibilidad de nutrientes podran alterar la expresin de la proteasa. Por lo menos un CREA y la transcripcin de varios Nit2/AreA unin del factor de sitios fueron identificados, tanto en el A. bisporus y C. cinerea SPR secuencias promotoras, lo que significa la regulacin de factores tales como fuentes de carbono y nitrgeno. Conservacin de la estos sitios no se observ a travs de los promotores. Experimental pruebas para la regulacin de las proteasas de serina en la respuesta fuentes de nitrgeno se suministra de C. bioqumicos cinerea perfiles en caldo de cultivo; proteinasa serina no fue detectados en amonaco-rich media RA, pero se observ en

sin amoniaco RA complementa con la leche. GFP expresin se observ en A. bisporus y C. transformantes cinerea producidas el anteproyecto de presupuesto y de amonaco libre fraccin RA que contiene cidos hmicos, la leche, o el glutamato como la nica fuente de nitrgeno. GFP expresin no se observ en YMG, MMP, o la regeneracin de los medios de comunicacin (ricos de amonio), con la excepcin de C. cinerea transformante TP47. La expresin de GFP se observ en TP47 crecido en YMG los medios de comunicacin, que pueden resultar de mltiples eventos de insercin, sin embargo, este perfil de expresin fue atpico de la poblacin de C. transformantes cinerea analizada. Perfiles de expresin eran similares tanto para monokaryons y dikaryons. En conjunto, estos resultados sugieren que tanto la C.

cinerea y A. bisporus producir serina proteinasas en respuesta a la disponibilidad de nitrgeno. La regulacin del desarrollo de la expresin de la serina proteasa se investig. La actividad de la serina proteasa ha sido previamente inform durante el desarrollo del cuerpo fructfero de A. bisporus (9). De las etapas 2 a 6 de desarrollo (23), la actividad fue relativamente actividades de baja, y la gorra y el estpite fueron similares. A. bisporus desarrollo las etapas 2 a 6 corresponden aproximadamente a los primordios, cariogamia, la meiosis, inmaduro, y las etapas maduras de C. cinerea desarrollo. En nuestro SPR ensayos bioqumicos de actividad, fue relativamente baja en las primeras cuatro etapas de desarrollo de C. cinerea pero aument rpidamente en la etapa madura. GFP expresin estaba en todas partes en la etapa de primordio, que puede ser el resultado de una mayor densidad de citoplasma en el primordio en desarrollo. La expresin de GFP se observ en todo el karogamy y meiosis etapas, aunque la localizacin de la fluorescencia comenzaron a ocurrir en el borde del tejido que forman agallas en la etapa de la cariogamia y se hizo ms pronunciada en el etapa de la meiosis. C. cinerea es descrito como teniendo una rupthymenial modo de himenforo desarrollo, donde las branquias se prev como la ampliacin hacia la periferia de la tapa como un diferenciador se mueve frente a, y la diferencia de la basidiocarpo (50). Dado que la mayor parte de las branquias se encuentra en el margen de la PAC, el frente de diferenciacin tambin se est moviendo hacia arriba, hacia el pice de la tapa (52). La fluorescencia de GFP fue ms concentrada en la base de las branquias en la fase de karogamy y se movi hacia arriba hacia el pice de la tapa en la meiosis, lo que sugiere que SPR1 promotor de la actividad se increment durante el desarrollo de tejidos jvenes, que pueden ser indicativos del volumen de ventas de alto valor proteico durante la diferenciacin celular. Esto tambin podra resultar de autolisis del tejido conectivo como las branquias comienzan a separarse de la estpite, es decir, la creacin de una zona de abscisin. En la etapa inmadura,

GFP se observ en lo alto de la cerca de estpite de la tapa. Estudios de C. cinerea elongacin estpite han revelado que es variable a lo largo de su longitud y el alargamiento que es mayor en el midupper parte (el estpite que est encerrada por el desarrollo PAC), el vrtice y la base del tallo muestra elongacin poco (15, 29). El rpido aumento de longitud se debe principalmente a celulares elongacin (29), pero las divisiones tambin contribuir, junto con las clulas doble en el nmero y el aumento de seis a ocho veces en la longitud (19). La fluorescencia observada en el estpite medio-superior muestra que el promotor es la actividad SPR1 upregulated durante elongacin y es probable que el apoyo del estpite alargando por proveer los aminocidos libres a travs de la degradacin de protenas. El ms alto se registr la actividad en la tapa maduro, con un poco menos actividad en el estpite madura, en contraste con los niveles registrados de A. bisporus. En el cuerpo fructfero madura, la fluorescencia de GFP se observ en la tapa, pero fue ms concentrado en la salida del tallo y la tapa. Esto puede deberse a una alta densidad de clulas donde los jvenes an se est desarrollando el tejido resultando en elevados protena de movimiento. Con A. bisporus etapa de desarrollo 7, gran aumento de la actividad en el estpite y un pequeo aumento en el tapa se produce (9), y aumenta an ms se observan en la etapa 7 setas progreso de la senescencia. Durante la autolisis C. cinerea serina proteinasa actividad disminuy y fue fluorescencia reducido en gran medida en la tapa, pero estaba muy concentrado en estpite tejidos. La acumulacin de proteinasa serina en el estpite durante autolisis sugiere un papel importante en la exportacin de nutrientes del el estpite de la tapa de tejido durante la senescencia. Del mismo modo en A. esporforos bisporus, el ms alto de la SPR:: La actividad de GFP o observado
en los tejidos senescentes estpite, lo que sugiere que el estpite puede actuar como una "fuente de alimentacin activa" en la exportacin de nutrientes reproductiva espora tejidos. Los resultados aqu presentados confirman que el promotor de A. bisporus (SPR1) es capaz de regular la serina proteinasa micelial produccin en respuesta a las fuentes de nitrgeno especfico y tienen tejido demostrado especficos (Stipe-localizada) en la expresin individual esporforos. El uso de la SPR:: GFP construccin de fusin, junto con la minera de datos del genoma, sugiere que la serina proteinasas tambin juegan un papel integral en el desarrollo de C. cinerea esporforos. Los enfoques desarrollados aqu debe sustentar el anlisis de promotor ms en estos homobasidiomycete setas y puede permitir la caracterizacin de un promotor elementos que regulan la expresin diferencial y nutricional regulacin de las proteasas de serina. Adems, C. cinerea ha han validado como un modelo potencial para la expresin y regulacin

Los estudios de A. bisporus genes. AGRADECIMIENTOS Damos las gracias a Chris Thorogood para la produccin del ciclo de vida C. cinerea ilustracin. Damos las gracias a Nicols Royat, que ayud a numerosos A. pantalla bisporus transformantes. Investigacin en las Universidades de Bristol y Warwick fue financiado por subvenciones de BBSRC y DEFRA.

Figura. 1. (A) las buenas prcticas agrarias expresin en el SPR A. bisporus:: GFP transformante TP17 cuando se crece en la AR, con o sin 0.094% fraccin de cidos hmicos bajo el microscopio de contraste de fase y de la luz UV. Micelio en crecimiento activo fueron examinados usando 40 objetivos en un Leitz Dialux 20 investigaciones microscopio con filtros de excitacin de 450 a 490 nm, un filtro dicroico en 510 nm y un filtro de emisin a 515 nm. Las imgenes muestran claramente las buenas prcticas agrarias fluorescencia en TP17 crecido en la fraccin de cidos hmicos, mientras que no fluorescencia se observ cuando se crece en la AR. (B) Stipe-localizada la fluorescencia de GFP en A. bisporus transformante TP196. Fructificacin fue inducida en A. transformantes bisporus, y dividido en dos hongos fueron estudiados en luz blanca (WL) y el azul de iluminacin LED (BL). (a) Las imgenes muestran claramente positiva en el la tapa y los tejidos estpite de recin cosecha (da 0) A. bisporus G26 cuerpos fructferos, expresando GFP bajo el control del promotor GPD. (b) Para las setas senescentes (despus de la cosecha en 3 das) no la expresin de GFP se observ en un higromicina transformantes resistentes de A15 (sin casete GFP, setas a la izquierda), mientras que la expresin de GFP se detect claramente en el tejido del estpite SPR:: GFP transformante TP196 (seta ms a la derecha).