Metoda spectrofotometric de determinare a beta carotenului Metoda spectrofotometric se bazeaz pe proprietatea substanelor de a absorbi selectiv radiaiile electromagnetice i este

folosit pentru identificare, determinarea puritii i dozare. Spectrele de absorbie se obin la trecerea unui fascicul de radiaii continue prin substana de analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia. Cantitatea de energie absorbit depinde de structura i de numrul moleculelor i al atomilor substanei cu care interacioneaz fasciculul de radiaii. n funcie de domeniile spectrale n care are loc absorbia luminii se deosebesc: metode spectrofotometrice n ultraviolet (185-400nm), metode spectrofotometrice n vizibil (400-800nm) i metode spectrofotometrice n infrarou (peste 800nm). Spectrele de absorbie n ultraviolet i vizibil (spectre electronice) se datoreaz tranziiilor dintre nivelele energetice ale strilor electronice ale moleculelor. Spectrele de absorbie n infrarou se datoresc tranziiilor de rotaie-vibraie ale moleculelor. Principiul spectrofotometriei se bazeaz pe determinarea concentraiei soluiilor colorate la trecerea unui fascicul emis de o surs luminoas printr-o soluie omogen constituit din substana de analizat. Astfel se determin absorbia radiaiei luminoase, care este direct proporional cu concentraia substanei absorbante n conformitate cu legea Lambert-Beer [65] : A= D= E= lg I0/I = -lg T = L C n care: A = absorbana; D = densitatea optic; E = extincia; I0 = intensitatea luminii incidente; I = intensitatea luminii transmise; T = transmitana; L = grosimea stratului de absorbie (cm); C = concentraia soluiei absorbante (moli/l); = absorbtivitatea molar (constant caracteristic fiecrei substane absorbante). Lungimea de und a luminii incidente este cea a culorii complementare a soluiei de analizat. Legea Lambert- Beer este valabil n ntregul domeniu spectral, pentru orice lungime de und, pentru orice mediu omogen n care scderea intensitii luminii se datoreaz numai absorbiei, indiferent dac mediul absorbant este gaz, lichid sau soluie. Pentru aceeai substan absorbant, ntr-un anumit domeniu de concentraie (C< 0,001 moli/l), i n aceeai cuv, i L fiind constante se poate scrie: A=KxC

Unde: K = constant de proporionalitate K = x L Se observ c absorbana este funcie de concentraie, fiind direct proporionale. Prin reprezentarea grafic a absorbanei n funcie de concentraie (folosind diferite concentraii ale substanei etalon), pentru o anumit lungime de und, la care substana de analizat are concentraie maxim, se obine curba de calibrare. Cu ajutorul curbei de calibrare se poate afla concentraia probei de analizat prin msurarea absorbanei la lungimea de und respectiv, absorban creia i va corespunde o anumit valoare a concentraiei de pe curba de calibrare [74].Spectrofotometrul de absorbie n ultraviolet i vizibil se compune din urmtoarele pri principale: sursa de radiaii; monocromatorul; suportul pentru cuve; detectorul; amplificatorul; nregistratorul Sursa de radiaii este constituit dintr-un bec cu filament de wolfram pentrudomeniul vizibil i o lamp de hidrogen pentru domeniul ultraviolet. Monocromatorul i cuvele sunt confecionate din sticl, pentru domeniul vizibil, i din cuar, pentru domeniul ultraviolet. Dozarea beta-carotenului total se bazeaz pe msurarea spectrofotometric a intensitii culorii galbene caracteristice soluiilor sale, n intervalul lungimilor de und 300- 540 nm. Sunt doua metode de dozare: 1. Beta- carotenul se izoleaz prin extracie, dup saponificarea prealabil a substanelor lipidice. Carotenoizii se separ prin cromatografie pe coloan, iar coninutul n beta- caroten se stabilete prin msurarea extinciei soluiei respective. 2. Extractia carotenoizilor totali in benzen si determinarea concentratiei prin citirea extinctiei probei si folosirea curbei de etalonare pentru sol de beta caroten in benzen. Se determina de fapt total carotenoizi exprimati in beta caroten Metoda 2 Determinarea spectrofotometric n domeniul VIS a carotenilor totali din uleiul de ctin(exprimat n -caroten) Reactivi: -Benzen (R) --caroten 0,01g % Tehnic de lucru:

Se cntresc 0,15-0,3 g prob de ulei catina se introduce ntr-un balon cu fund rotund. Peste proba se introduc 100 ml benzen i se refluxeaz pe baia de ap timp de 30-60 min. Se rcete i se filtreaz proba apoi se aduce la semn la balon cotat de 100 ml cu benzen. Se msoar absorbana la spectrofotometru la de 460 nm fata de benzen Concentraia n -caroten se determin prin raportarea la curba etalon a -caroten-ului, Curba de etalonare se realizeaza astfel: In trei baloane cotate de 25 ml se pipeteaz 0,1; 0,2 i 0,3 ml soluie de -caroten (s.r.) 0,01% n benzen . Se completeaz volumul baloanelor la semn cu benzen i se agit puternic. Absorbanele obinute se msoar la spectrofotometru, la =460 nm, n cuva de l cm, fa de benzen. Coninutul n -caroten din ulei se calculeaz dup formula:

Cx10-3xVf x 100 0,800 x10-3 x 100 -caroten =--------------------------- x 100% = --------------------------- 100 = 111,11 mg % sursa 1 mp(mg) 0,072 Cx10-3xVf x 100 0,8733 x10-3 x 100 -caroten =--------------------------- x 100% = --------------------------- 100 = 121,29 mg % sursa 2 mp(mg) 0,072 unde: C=concentraia probei msurate la spectrofotometru (g/ml) cf curbei etalon Vf= volum sol beta-caroten mp=masa probei luate n lucru (g) ulei catina

curba etalon beta caroten = 460nm

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 y =0,2385x +0,0113 R =0,9993
2

concentratia absorbanta

0,5 1 1,5 2 2,5 3

0,1367 0,2435 0,3722 0,4807 0,6068 0,7316

Iti propun sa luam 5 grame de suc (omogenizat in prealabil) facem refluxarea in balon cu benzen, filtram si citim extinctia care trebuie sa se inscrie in intervalul curbei etalon.

Metoda 1 Determinarea beta-carotenului din ulei de ctin Principiul metodei Const n extracia beta-carotenului cu aceton i apoi eter de petrol sau n-hexan, separarea lui de alte substane colorante pe o coloan cromatografic, apoi spectrofotometrarea la lungimea de und de 430 nm fa de eter de petrol sau n-hexan. Pentru produsele care conin cantiti mari de grsimi, se realizeaz n prealabil saponificarea substanelor grase cu o soluie alcalin de hidroxid de potasiu 40% n alcool etilic. Materiale: ulei de ctin; Reactivi i aparatur: hidroxid de potasiu soluie alcoolic 40% pentru saponificare; aceton; eter de petrol; oxid de aluminiu neutru pentru cromatografie; plnii de separare; baloane cotate de 50 ml; balon pentru saponificare de 500 ml; plit electric; coloan cromatografic; spectrofotometru UV-VIS Secomam 750 S; Mod de lucru

S-au cntrit la balana analitic masele (g) din uleiul analizat i s-au supus saponificrii cu soluie de hidroxid de potasiu timp de 30 minute. Soluiile obinute s-au rcit, apoi s-au extras carotenii cu 15ml aceton. Extractele s-au introdus fiecare ntr-o plnie de separare. Peste extracte s-au turnat cu grij 30 ml eter de petrol pentru extracia carotenilor, apoi straturile de eter i aceton s-au separat. S-au cltit extractele eterice cu cte 15 ml ap i s-au separat pn cnd au devenit limpezi. Extractele acetonice i apoase s-au aruncat. Extractele eterice s-au trecut fiecare printr-o coloan cromatografi umplut cu Al2O3 pentru separarea beta-carotenului de alte substane colorante, apoi s-au colectat fiecare ntr-un balon cotat de 50 ml care s-a adus la semn cu eter de petrol. Curba etalon s-a realizat folosind soluie etalon de bicromat de potasiu. S-au citit absorbanele fiecrei soluii etalon apoi s-a trasat graficul absorban funcie de concentraie [35]. S-a efectuat citirea absorbanei extractelor de beta-caroten din ulei de ctin Calcul: Pentru calculul concentraiei de beta-caroten s-a folosit formula: -caroten = ; mg/100g Unde: A = absorbana extractului de beta-caroten la lungimea de und de 430 nm; F = factorul de pant care este media factorilor de pant pentru fiecare concentraie din scara etalon i se calculeaz cu formula: F= Unde: F1 = A1 / c1; F2 = A2 / c2; F3= a3 / c3; F4 = A4 / c4; F5 = A5 / c5; F6 = A6 / C6; A1, A2, A3, A4, A5, A6 sunt absorbanele corespunztoare celor 6 concentraii (c1-c6) cu care s-a realizat scara etalon; V = volumul la care s-a adus extractul (50 ml);F= 4,77 M = masa de ulei luat n lucru (g); Dup extracie, spectrofotometrare i efectuarea calculelor s-au obinut rezultatele 23,3 mg/100 g