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Hay que vencer muchos obstculos experimentales antes de que la estructura tridimensional de una macromolcula sea determinada por

difraccin de rayos X de cristales. Primero la molcula debe ser cristalizada y el cristal debe ser singular (no ms de una conformacin en el mismo arreglo) y de calidad perfecta. Innumerables esfuerzos por determinar estructuras moleculares han fallado en este parte. La cristalizacin de protenas es ms que una ciencia, un arte. Muchas molculas importantes no aparecen en el PDB porque han fallado los intentos por tener cristales adecuados. Las molculas con porciones altamente hidrofbicas no pueden ser cristalizadas, pero en algunos casos, los cristales se pueden obtener en presencia de detergentes. Esto explica la casi nula presencia de porciones transmembranales de protenas en el PDB (a pesar de que existen algunos ejemplos de protenas en soluciones de detergente resueltas por RMN). Se ha tenido mucho xito al cristalizar dominios extracelulares clonados y expresados o porciones de receptores de membrana, porciones que carecen de las regiones hidrofbicas unidas a la membrana.

Figura: un cristal de protena. Una vez que se ha obtenido el cristal, se produce un patrn de difraccin por irradiacin de rayos X. Este patrn consiste de miles de puntos que son los datos crudos.

Figura: patrn de difraccin de una protena

La posicin e intensidad de cada punto es determinada relativamente fcil, las fases de las ondas que formaron cada punto debe ser tambin determinada para producir un mapa de densidad electrnica.

Figura: mapa de densidad electrnica de una protena Resolver el "problema de la fase" es el segundo obstculo. A menudo esto se acompaa al irradiar dos o ms derivados del mismo cristal que difieren solamente en la presencia de iones de metales pesados. Este es el mtodo del "remplazo isomrfico" y requiere que los iones de metal sean incorporados en un cristal sin afectar la estructura, lo cual en ocasiones no es posible. Una solucin ms reciente para resolver el problema de la fase involucra utilizar la radiacin de zincrotrn a varias longitudes de onda y ha acelerado la velocidad para resolver estructuras cristalinas. La descripcin completa de cada reflexin - su posicin, intensidad y fase - es denominada "factor de estructura". Los factores de estructura estn disponibles en el PDB para aproximadamente 25 % de las entidades cristalogrficas. Al publicar los factores de estructura, permite a otros investigadores generar y examinar los mapas de densidad o tratar refinamientos alternativos o mtodos de fase.

Figura: posicin de los tomos resueltos por cristalografa de rayos X. Los rayos X son difractados por los electrones de las molculas en el cristal, de ah que los resultados de una cristalizacin exitosa y la solucin del problema de fase es una imagen tridimensional de las nubes electrnicas (un

mapa de densidad electrnica). Esta imagen se interpreta al construir un modelo de la protena que se ajuste al mapa. Un modelo molecular de la secuencia de aminocidos o nucletidos que se conozca mejor independientemente, es ajustado dentro del mapa de densidades electrnicas y se termina con una serie de refinamientos. El resultado es un juego de coordenadas Cartesianas X, Y, Z para cada tomo que no sea un hidrgeno en la molcula.

Figura: cmo funciona un difractmetro de rayos x? Un resultado del refinamiento es la asignacin de un factor de temperatura para cada tomo en el modelo final. Un factor de temperatura elevado sugiere desorden o movimiento trmico. Aqu desorden significa que el tomo ocupa diferentes posiciones en diferentes molculas del cristal y movimiento trmico se refiere a vibraciones de un tomo sobre su posicin de reposo. Estas posibilidades no pueden ser distinguidas nicamente a partir de los datos de difraccin. Si porciones de una cadena tienen alta movilidad o desorden, producen densidades electrnicas pobres o poco homogneas, lo que hace imposible asignar posiciones a los tomos en esas regiones. Por esta razn es comn encontrar que los extremos amino o carboxilo terminal y tal vez que uno o dos giros de una protena carezcan de coordenadas cristalogrficas. Los programas de cmputo RasMol y Chime tienen en sus mens de color un esquema designado. "temperatura". Este proceso asigna colores clidos a factores de temperatura elevados y colores fros a los bajos.

Biologa de las chaperoninas Jos Mara Valpuesta, Oscar Llorca y Sergio Marco Muchas protenas son incapaces por s solas de alcanzar su conformacin nativa. Las chaperoninas son unos complejos proteicos que facilitan el plegamiento adecuado de aqullas. "La conformacin nativa de una protena est determinada por la totalidad de sus interacciones atmicas y, por tanto, por su secuencia aminoacdica." En esta afirmacin queda enunciada una de las hiptesis que ms inters ha suscitado en

el campo de la biologa molecular en los ltimos treinta aos, la relativa al plegamiento de las protenas. De acuerdo con esa hiptesis, avanzada en 1953 por Christian Anfinsen, la informacin requerida para que una cadena de aminocidos se pliegue se encuentra en la propia secuencia. Desde los aos veinte, el progreso de la qumica permiti caracterizar las protenas como estructuras homogneas. Adems de su tamao grande, en comparacin con los lpidos o los azcares, las protenas presentan una notable complejidad. En 1953 Frederick Sanger determin la secuencia de los aminocidos componentes de la insulina. Se lograron luego las primeras sntesis de pptidos de inters biolgico, las hormonas oxitocina y vasopresina. Se realizaron tambin las primeras hiptesis sobre los tipos de estructuras que las protenas pueden adoptar en solucin (hlice a, lmina ,B y otras). Se dio un paso ms y se vincul la estructura a la funcin. Pero, mediante qu mecanismos las molculas de protena adoptan la conformacin adecuada al objeto de cumplir su funcin? Cmo se pliegan?. El principio de autoplegamiento de las protenas descrito por el equipo de Christian Anfinsen, y los experimentos subsiguientes que demostraron su validez, provocaron una revolucin en biologa molecular y crearon el nuevo campo que ha dado en llamarse del plegamiento de protenas. Anfinsen sugera en 1963 que "otra molcula (por ejemplo un anticuerpo, otra protena o incluso la misma protena) pudiera influir en el proceso de plegamiento mediante reacciones intermoleculares". Se comprob muy pronto que no basta el proceso de autoplegamiento para garantizar el plegamiento de las protenas in vivo. El plegamiento no es en muchas ocasiones espontneo, sino que requiere de la interaccin entre protenas ya existentes y de consumo de energa, de ATP. A esas acompaantes moleculares se las llam "chaperonas moleculares".
Diferentes sistemas de chaperonas moleculares Bacterias Sistema Nombre Funcin 100 ClpA Levaduras Nombre Funcin Comportamiento

Tolerancia frente a estrs Hsp 104 trmico Se une a protenas Hsp90 desnaturalizadas Se une a protenas recin SSA1-4 sintetizadas SSB1, 2 SSC1 Se une a intermediarios de plegamiento. Asiste Hsp60 en el plegamiento CCT

Tolerancia frente a estrs Citosol trmico Se une a protenas desnaturalizadas, las pliega Citosol o las lleva a su compartimento Se unen a protenas recin Citosol sintetizadas Se unen a polisomas Se une importadas a protenas Mitocondria

90

HtpG

70

DnaK

60

GroEL

Se une a protenas importadas. Asiste en el Mitocondria plegamiento Asiste en el plegamiento de Citosol actina y tubulina

40

DnaJ

Se une a protenas desnaturalizadas. MDE1 Interacciona con DnaK Interacciona con DnaK Asiste a GroEL en actividad plegadora su MGE1 Hsp10

Interacciona SSC1

con

Hsp70

Mitocondria

20-25 10

GrpE GroES

Asiste a Hsp60 en actividad plegadora

su

Mitocondria

Clasificacin de la chaperoninas moleculares, parcial y provisional. Nuevas familias se estn incorporando continuamente. En la tabla slo se muestran las chaperonas pertenecientes a procariotas (E. coli) y a eucariotas (levaduras). Muchas de estas protenas, aunque no todas, son protenas de choque trmico. Cumplen funciones muy dispares. Las chaperonas moleculares con un peso cercano a los 60kDaltons se denominan chaperoninas. El trmino lo acu Ronald Laskey en 1978 para describir las propiedades de la nucleoplasmina, una protena nuclear que interviene en el ensamblaje de los nucleosomas a partir de ADN y de histonas. La nucleoplasmina, una protena fuertemente cida, se une transitoriamente a las histonas, con lo que reduce su carga positiva e inhibe la tendencia de stas a agregarse inespecficamente con el ADN. Molcula dotada de carga negativa, la nucleoplasmina no proporciona informacin espacial a las histonas para que se plieguen adecuadamente, ni es un componente estructural de los nucleosomas, pero su interaccin con las histonas permite que las propiedades de autoplegamiento de stas predominen sobre la tendencia a unirse al ADN en razn de sus cargas opuestas. La accin de la nucleoplasmina, fugaz, ni genera ni rompe enlaces covalentes. Las chaperonas moleculares son protenas que unen y estabilizan conformaciones inestables de otras protenas. Mediante uniones y liberaciones controladas, facilitan la conformacin nativa de las protenas o el ensamblaje entre stas para crear oligmeros. De la familia de las chaperonas forman parte numerosas protenas de distinta secuencia y diverso peso molecular. Las chaperoninas, en particular, desempean un papel muy activo en el plegamiento de protenas. Las chaperoninas Sean Hemmingsen acu en 1986 el trmino chaperonina para designar una familia de protenas que comparten homologa en su secuencia aminoacdica y actan como chaperonas en cloroplastos, mitocondrias y bacterias. Su peso molecular est en torno a los 60 kilodalton. La primera chaperonina descrita como tal fue la protena que se une a la ribulosa bifosfato carboxilasa, RBP (Rubisco binding protein). La enzima Rubisco se encarga de asimilar, a partir de CO2, el carbono por los cloroplastos. El grupo de John Ellis, de la Universidad de Warwick, descubri que la subunidad grande de la Rubisco tiende a formar agregados insolubles cuando se asla. Ellis y su equipo encontraron una protena que se une a la Rubisco e impide su agregacin. Puesto que RBP, de 60 kilodalton de peso molecular, no guarda ninguna homologa con la nucleoplasmina, se pens que las dos protenas constituan casos especiales, ideados ad hoc por la naturaleza para tratar con protenas oligomricas (histonas y Rubisco), cuyo plegamiento poda presentar dificultades.

Las chaperoninas moleculares ejercen varios efectos en el plegamiento de las protenas. Chaperonas de diversos tipos se unen a polipptidos recin sintetizados en los ribosomas, a protnas que atraviesan las membranas de orgnulos o a protenas que se han desnaturalizado. Esta unin, en un nmero elevado de casos, desempea un papel protector y evita que las protnas alcancen un estado de agregacin irreversible. Sin negar que las chaperonas intervengan de forma directa en el plegamiento de las protenas, en la mayora de los casos parecen transportar los polipptidos desnaturalizados hasta las chaperoninas, donde se pliegan. En 1986, Hugh Pelham, del Laboratorio de Biologa Molecular de Cambridge, lanz la hiptesis de que RBP, la nucleoplasmina y otras protenas asociadas a estados de choque trmico o de aumento de temperatura celular (hsp, heat shock proteins) actuaran como chaperonas moleculares; sugiri tambin que el mecanismo de plegamiento podra ser un fenmeno comn en la naturaleza. Las tcnicas de comparacin de secuencias respaldaron su hiptesis. La protena que se une a la ribulosa bifosfato carboxilasa manifestaba una homologa del 50% con la secuencia de GroEL, una protena de E. Coli indispensable en la morfognesis de ciertos bacterifagos. El descubrimiento de la homologa entre RBP y GroEL provoc otros muchos ensayos parecidos a los que Anfinsen realiz tres dcadas antes: las protenas se desnaturalizan mediante la urea y se renaturalizan en presencia de GroEL. Este tipo de experimentos mostr que, para un elevado nmero de protenas, la presencia de GroEL, en el peor de los casos, acelera el proceso de plegamiento

que se produce en ausencia de ella, mientras que en el mejor de los casos resultaba imprescindible para el plegamiento de la protena. Al mismo tiempo que se descubra la homologa entre Rubisco y GroEL, se observ que los anticuerpos generados contra GroEL reaccionan tambin contra una serie de protenas de choque trmico y de peso molecular cercano a 60 kilodalton, pertenecientes a mitocondrias de plantas, levaduras y clulas animales. Esas protenas intervienen en el plegamiento de protenas importadas del citosol y presentan, adems, una estrecha homologa de secuencia con Rubisco y GroEL. Las chaperoninas ayudan al plegamiento de protenas, lo mismo en situaciones normales que en condiciones de estrs. Ese fenmeno contrasta con la tendencia observada en muchas protenas celulares a desnaturalizarse. De ese modo adquiri, a ojos de la ciencia, un significado ms amplio la funcin de las acompaantes moleculares. Pero ni todas las protenas de estrs trmico son chaperoninas ni todas las chaperoninas son protenas de estrs trmico; as, mientras GroEL ve aumentada su expresin cuando E. coli sufre un choque trmico, las chaperoninas cloroplsticas no se activan con el calor. La familia de las chaperoninas se cierra por ahora con el descubrimiento de un segundo tipo que se encuentra en arqueobacterias y en el citosol de organismo eucariotas. A ella pertenecen las chaperoninas termoflicas del tipo TF55 (factor termoflico 55, en referencia a su peso molecular) y la eucaritica CCT (chaperonina que contiene el polipptido TCP-1). Esta subfamilia de chaperoninas muestra una estrecha homologa entre sus miembros y una dbil aunque significativa homologa con las del primer tipo.

Plegamiento de una protena desnaturalizada. Se trata aqu de la rodanasa, enzima mitocondrial involucrada en la formacin y mantenimiento de las protenas de transporte electrnico que poseen hierro y azufre. Que se lleve a cabo el plegamieto depende de la presenciade las chaperoninas GroEL y GroES y de ATP. La rodanasa desnaturalizada no posee actividad enzimtica (A, lnea negra). Ni la presencia de GroEL (lnea azul) no la conjunta de GroEL y GroES (lnea roja) son capaces de plegar correctamente la rodanasa de manera que vuelva a ser activa; slo la adicin de GroEL, GroES y ATP (lnea verde) consigue su plegamiento eficaz.

Se descubri que CCT es una chaperonina mientras se buscaban homologas de secuencia de la TFSS. Se observ que la protena TFSS de origen termfilo guarda bastante homologa con TCP-I, protena de funcin hasta entonces desconocida. Ms tarde se conocera que la chaperonina CCT interviene en el plegamiento de la actina y la tubulina. Las chaperoninas extremfilas parecen ejercer una funcin ms inespecfica en el plegamiento de protenas. Conviene resaltar una diferencia importante entre chaperoninas del primer y del segundo tipo. Si las del segundo grupo tienden a actuar en solitario, la GroEL y dems chaperoninas del primer grupo actan en coordinacin con una chaperonina de bajo peso molecular (en torno a los 10 kilodalton), a la que se unen en presencia de ATP para formar un complejo estable. Estas protenas se llaman cochaperoninas, denominndose GroEs a la cochaperonina de GroEL. Estructura de las chaperoninas Podemos reducir a tres las funciones principales de las chaperoninas: impedir la agregacin de los polipptidos parcialmente plegados y liberados de los ribosomas, unirse a pptidos parcialmente plegados aunque atrapados en una conformacin tal que no pueden plegarse de manera espontnea y, por fin, proteger a las protenas de la desnaturalizacin debida a estrs trmico o facilitar el plegamiento si se ha producido la desnaturalizacin. Compete, pues, a las chaperoninas generar las condiciones adecuadas para un plegamiento correcto de las protenas desnaturalizadas . El porcentaje de protenas renaturalizadas in vitro guarda una relacin inversa con la concentracin de protena en el experimento y la temperatura a la que ste se realiza. De ese modo se reduce la probabilidad de interacciones incorrectas. En la clula, sin embargo, la concentracin de protena total es, al menos, dos rdenes de magnitud mayor que en los experimentos de plegamiento in vitro, concentracin que fomenta el "apelotonamiento molecular" y, por tanto, las interacciones incorrectas. Nuestro conocimiento de la estructura de las chaperonina ha avanzado con el desentraamiento de GroEL de E. coli, un oligmero constituido por catorce subunidades que, juntadas en sendos heptmeros anulares idnticos, conforman un toroide. Observados al microscopio electrnico de transmisin, los anillos del toroide encierran dos cavidades, conectadas a travs de un canal de pequeo grosor. Aunque la morfologa de "toroide de doble anillo" es compartida por todas las chaperoninas, las de eubacterias y de orgnulos eucariotas difieren de las chaperoninas de arqueobacterias y del citosol eucariota en su simetra y composicin. Las chaperoninas de eubacterias y de orgnulos eucariotas dibujan tetradecmeros compuestos por una o dos subunidades distintas, mientras que las chaperoninas de arqueobacterias y del citosol eucariota forman hexadecmeros u octadecmeros que constan de una o varias (hasta ocho) subunidades distintas. La cochaperonina GroES complementa la estructura de las cochaperoninas. Est constituida por un heptmero de la protena del mismo nombre. En presencia d GroEL y de algn nucletido (ATP, ADP o incluso algn anlogo no hidrolizable de ATP), el oligmero se une a GroEL y tapa la cavidad de uno de sus anillos. La cristalografa de rayos X vino en ayuda de la biologa, permitindole descifrar la relacin entre estructura y funcin de las chaperoninas. Los grupos de Arthur Horwich y Paul Sigler, de Yale, han sacado a la luz los dominios funcionales de

GroEL. En el monmero de GroEL se distinguen tres regiones definidas. Hay un dominio ecuatorial, donde encontramos la mayora de los aminocidos responsables de la interaccin con las subunidades del mismo anillo y todos los responsables de la interaccin con las subunidades del otro anillo. Reside en ese mismo dominio la zona de unin a la molcula de ATP, molcula que es decisiva para el mantenimiento del ciclo de funcionamiento de la chaperonina. Un segundo dominio, el apical, forma el techo de la cavidad de cada anillo. En la boca de la cavidad se aloja un grupo de aminocidos hidrfobos, implicados en la unin de GroEL con el sustrato desnaturalizado y con GroES. El tercero, o dominio intermedio, pone en contacto el dominio ecuatorial con el apical y a modo de bisagra, permite los grandes movimientos que se producen en el dominio apical durante el ciclo de funcionamiento de la GroEL.

Muestra en la que se han incubado chaperoninas GroEL y GroES en presencia de ATP. GroEL es un oligmero formado por 14 subunidades de una sla protena, dispuestas en dos anillos heptamricos, y con una estructura cilndrica. Al microscopio electrnico GroEL posee dos tipos de vistas. En una de ellas, la llamada frontal (1), GroEL semeja una rosquilla con una cavidad en el centro de la partcula. En la otra vista, denominada lateral (2), se observan en la partcula cuatro bandas o estras; cada par de las mismas corresponden a uno o dos anillos del oligmero. La vista frontal y lateral de GroEL corresponden al cilindro dispuesto de manera vertical y horizontal, respectivamente, sobre la rejilla del microscopio electrnico, pero detectable cuando est unido a GroEL. En presencia de nucletidos de adenina, GroES se une al extremo de uno de los anillos de GroEL en forma de caperuza (3). El complejo GroEL-GroES se denomina asimtrico. En condiciones fisiolgicas y en presencia de ATP, un oligmero de GroES se une a cada uno de los anillos de GroEL (4) y el simtrico forman parte del ciclo de plegamiento de GroEL. Se ha determinado tambin la estructura atmica de GroES. Ese nivel de resolucin lo ha conseguido el grupo de Johan Deisenhofer en la Universidad de Texas. El heptmero desarrolla una cpula que, al unirse a GroEL, tapa la cavidad del anillo. La regin que interacciona con GroEL est formada por un grupo de residuos hidrofbicos carentes de estructura secundaria. Gracias a los trabajos del grupo de Helen Saibil, del Colegio Birbeck de Londres, y el de nuestro laboratorio, conocemos los cambios conformacionales que experimenta la estructura de GroEL cuando interacciona con ATP o con GroES. Dichos cambios estructurales tienen que ver con movimientos del dominio apical con respecto al dominio ecuatorial. La adicin de ATP a GroEL genera un

movimiento del dominio apical hacia el exterior y hacia arriba, que produce una apertura de la boca del anillo y del volumen de la cavidad. Para que GroES se una a GroEL se necesita, como condicin previa, el cambio conformacional inducido por el nucletido. La utilizacin de varios tipos de nucletidos y de diversas concentraciones de stos ha permitido observar los numerosos cambios conformacionales que sufren los dos anillos de GroEL y, con ello, una caracterizacin ms completa de los cambios estructurales ligados al ciclo funcional de las chaperoninas. Estos estudios han permitido mostrar que los dos anillos del toroide no se comportan de igual manera ante la unin de nucletidos, sustrato y GroES.

Reconstruccin tridimensional de GroEL y de los distintos complejos formados por GroEL y GroES. Cada uno de los dos anillos de GroEL posee una cavidad a la que se accede por su extremo. Este extremo cambia su morfologa cuando se une a l GroES (complejo GroES-GroEL), de tal manera que la cavidad se hace ms grande. La unin de GroES a los dos anillos de GroEL para formar el complejo simtrico GroEL-GroES (GroEL-GroES2) promueve el mismo cambio en los dos anillos. La unin entre nucletidos y GroEL muestra una cooperatividad positiva con el primer anillo y, negativa, con el segundo. Cuando se aade ATP a una solucin de GroEL, el nucletido se une rpidamente a uno de los dos anillos. La unin de ATP a los siete monmeros de un anillo modifica la configuracin de stos de tal manera que el nucletido no se une con la misma facilidad a los siete monmeros del segundo anillo. Adems, la unin de ATP al segundo anillo genera otra seal hacia el primero, que sirve para mantener el ciclo en funcionamiento. Existe, pues, una intercomunicacin entre los dos anillos. La unin entre el nucletido ATP y uno de los anillos de GroEL permite el engarce de GroES en GroEL. De esto resulta un complejo asimtrico, porque slo uno de los dos anillos tiene unido un oligmero de GroES. Durante cierto tiempo se pens que el complejo GroES-GroEL era la nica forma de unin de entrambos. Pero en 1994, y de manera independiente, cuatro grupos, incluido el nuestro, descubrieron que, en presencia de ATP o de AMP-PNP (un anlogo no hidrolizable de ATP), GroES se enlaza simultneamente a los dos anillos de GroEL y forma un complejo simtrico GroEL-GroES. Los complejos simtricos producidos en presencia de ATP son inestables; aparecen y desaparecen continuamente. El nucletido ATP se hidroliza y se libera de GroEL, lo que posibilita el desarrollo incesante del ciclo.

De la estructura de muchas otras chaperoninas carecemos de informacin a resolucin atmica. Mediante microscopa electrnica y tcnicas de procesamiento digital de imagen podemos obtener su estructura a baja-media resolucin (20 A). La comparacin de sus secuencias revela que la homologa ms estrecha se concentra en el dominio de unin a ATP, mientras que la regin de mayor variabilidad corresponde al dominio apical. Situacin razonable, si consideramos que las chaperoninas comparten seguramente el mecanismo bsico de funcionamiento, del que forma parte el dominio de unin a ATP, y difieren en el reconocimiento del sustrato a plegar, en el que tiene un papel primordial el dominio apical. Funcin de las chaperoninas El mecanismo plegador de las chaperoninas opera de un modo pasivo. Sostienen algunos que el sustrato se pliega dentro de la cavidad de GroEL; ello exige que el sustrato se una primero al dominio apical de GroEL. Pero, en cuanto GroES interacciona con GroEL, el complejo arroja al sustrato dentro de la cavidad del anillo de GroEL. En ese modelo, la cavidad funciona como una caja de Anfinsen en la cual el polipptido alcanza su conformacin natural ("nativa"). Opinan otros que el polipptido, una vez libre en la cavidad de GroEL, no alcanza all su conformacin natural, sino otra precursora, que es la que presentara cuando aparece en el exterior. Podra entonces adquirir all su adecuada conformacin en un primer intento; si no lo consigue, se unira otra vez a GroEL donde se sometera a un nuevo ciclo de liberacin en la cavidad y posteriormente al exterior de ella. A tenor de los experimentos, las dos hiptesis podran ser correctas. En razn del sustrato a plegar, operara un mecanismo u otro. Pero cul es el mecanismo por el que la chaperonina reconoce el sustrato desnaturalizado?
Clasificacin de las chaperoninas Chaperonina Organismo Sustrato Localizacin conocido Homologa N de N con subunid Cochaperespecto a: en cada subunid ronina diferentes GroEL TF55 anillo

Grupo I GroEL Eubacterias Plasma 40% protenas sintetizadas --Dbil 7 1 GroES mtcpn10 ch-cpn10

mt-cpn60 RBP

Eucariotas Plantas

Proteinas Mitocondria mitocondriales 50% importadas Cloroplasto Subunidades de la rubisco 50%

Dbil 7 Dbil 7

1 2

Grupo II La mayor parte de las Dbil --protenas celulares

TF55

Arqueobacterias Plasma

No

Termosoma Arqueobacterias Plasma

La mayor parte de las Dbil 60% 8 protenas celulares Actina, Tubulina Dbil 40% 8

No

CCT

Eucariotas

Citosol

8-9

Caractersticas y propiedades de las chaperoninas de tipo I y de tipo II. Las chaperoninas de tipo I son de origen procariota y simbionte, como las mitocondriales y cloroplsticas; de origen eucariota o procedente de arqueobacterias, las de tipo II. En presencia de sustrato, ste se introduce en la cavidad de las chaperoninas. A la derecha se pueden observar imgenes promedio de vistas frontales y laterales de los dos tipos de chaperoninas

Aunque se crey en un principio que el dominio apical de las chaperoninas reconoce segmentos de estructura secundaria del tipo a-hlice, los ensayos posteriores han demostrado que tambin se reconoce la estructura de lmina b. Se requiere, en cualquier caso, la presencia, en los polipptidos desnaturalizados, de zonas con aminocidos hidrofbicos expuestos en la superficie. Los residuos aminoacdicos del dominio apical de GroEL involucrados en el reconocimiento del sustrato plegable son tambin hidrofbicos. La liberacin del sustrato en la cavidad, al forjarse el complejo GroES-GroEL, podra hacer que los residuos hidrofbicos del polipptido, libres del riesgo de interaccionar con los de otros polipptidos, se convirtiesen en factor de nucleacin alrededor del cual comenzase su plegamiento. En el plegamiento, el sustrato desnaturalizado se une al dominio apical; GroES se engarza en ste y lo desplaza hacia la cavidad. All lo suelta. Pero, en virtud de qu mecanismo se deshace GroES del sustrato? Cul es el motor del ciclo de plegamiento? La respuesta est en la hidrlisis de ATP y en los consiguientes cambios conformacionales y seales entre los anillos que genera el nucletido. La energa liberada en la hidrlisis de ATP no se transmite al sustrato renaturalizable, sino que se utiliza para mantener un ciclo de cambios conformacionales concertados entre los dos anillos. En 1994, el grupo de Arthur Horwich, en Yale, indujo numerosas mutaciones en los aminocidos del dominio ecuatorial involucrados en la interaccin entre los anillos. Y produjo un oligmero de GroEL formado por un solo anillo. Este anillo, capacitado para unir nucletidos, sustrato y GroES, se muestra incapaz de liberar este ltimo y, por tanto, tampoco el sustrato. Aunque los monmeros del anillo hidrolizan el ATP, no se libera la GroES. Ahora bien, en cuanto se desprende la cochaperonina, el sustrato aparece correctamente plegado. Cada anillo de GroEL constituye una unidad funcional de plegamiento. Sin

embargo, para que el oligmero de GroES se libere, se requiere una seal procedente del otro anillo. De ello se desprende que ambos anillos deben de operar de comn acuerdo. La chaperonina GroEL persiste asimtrica a lo largo de todo el ciclo. No se trata slo de una asimetra estructural (los dos anillos tienen distinta estructura en todo momento), sino tambin funcional: en cada momento del ciclo, difiere la afinidad de cada anillo por el ATP o por el sustrato. Para hacernos una idea general del comportamiento de la GroEL, GroES y el sustrato, imaginmonos un oligmero de la chaperonina GroEL en ausencia de nucletidos (situacin que no ocurre in vivo). El polipptido desnaturalizado reconoce el dominio apical de uno de los dos anillos y se une a l; y aunque puede enlazarse tambin con GroEL en presencia de nucletidos, posee ms afinidad hacia GroEL en ausencia de stos.

Comparacin de las estructura de GroEL obtenidas por microscopa electrnica y difraccin de rayos X en la que se observa cmo las dos tcnicas, cada una a su nivel de resolucin, reflejan los mismos detalles estructurales. En (a) se presenta la reconstruccin tridimensional de un complejo asimtrico GroEL-GroES obtenida por microscopa electrnica y procesamiento de imgenes, mientras que en (b) se muestra la proyeccin de toda la masa del mismo complejo. En (c) se observan las estructuras de los monmeros de GroEL y GroES obtenidas mediante difraccin de rayos X. En los tres casos, la cochaperonina GroES se visualiza como el disco que tapa la cavidad superior del oligmero de GroEL. El ATP se inserta en el sitio de unin de cada monmero de un anillo. La unin y posterior hidrlisis del ATP genera dos seales. Una se dirige al dominio apical, que sufre un movimiento hacia fuera y hacia arriba al pivotar sobre la bisagra formada por el dominio intermedio. Gracias a esa modificacin estrica, puede engarzarse un oligmero de GroES y producirse un mayor movimiento del dominio apical hacia arriba. La unin de GroES desplaza al polipptido hacia el interior de la cavidad; all lo suelta. La segunda seal se transfiere, a travs del dominio ecuatorial, al otro anillo. La unin de GroES a este segundo anillo forma un complejo simtrico, que puede mantener encerrado un polipptido en cada cavidad. El complejo as constituido, muy inestable, no tarda en desaparecer. La unin del ATP en el segundo anillo enva una seal al primero para que el oligmero de GroES se libere, con lo cual el polipptido puede salir al medio, ya sea plegado en su conformacin nativa o bien dispuesto a alcanzarla en el exterior. Este anillo, tras soltar luego el ADP y el fosfato inorgnico producto de la hidrlisis de ATP, se

halla listo para unir otra vez sustrato, ATP y GroES y continuar as el ciclo funcional. En ninguna fase del ciclo coinciden los anillos. Mientras uno atrapa al polipptido desnaturalizado, el otro ya lo ha liberado en su cavidad. GroEL funciona como un motor de dos cilindros en el que el combustible es el ATP y su movimiento se produce por la hidrlisis del nucletido. Tambin en la chaperonina mitocondrial y cloroplstica rige, as parece, el mecanismo de funcionamiento descrito. Distinto pudiera ser el caso de la chaperonina CCT, dada su especificidad para con la actina y la tubulina. Hemos observado en nuestro laboratorio que, en una suerte de mecanismo de plegamiento parecido a GroEL, la chaperonina CCT atrapa la actina desnaturalizada, que se instala en la cavidad central de la chaperonina. La unin de ATP a las subunidades del anillo a la que la actina se ha unido genera un cambio conformacional en la chaperonina que permite el plegamiento de la actina. En este caso, y a diferencia de GroEL, ciertas subunidades pudieran tener un papel especfico en el ciclo de plegamiento. Quedan varios aspectos por resolver. De entrada, el tamao de la cavidad de los anillos de las chaperoninas. En GroEL y otras chaperoninas la hendidura admite protenas de hasta 55 kilodalton de peso molecular, ms o menos desplegadas. Pero, qu ocurre con protenas de mayor tamao? Se ignora tambin la cantidad de sustrato que en un momento determinado puede plegar la poblacin de GroEL de una clula. Se ha sugerido que GroEL, in vivo, slo puede plegar el 10% de las protenas que requieren de ayuda en tal menester. Quin pliega el 90% restante de protenas? Mecanismos de defensa celulares Las chaperoninas protegen, pues, la funcin y la estructura de las clulas a travs de la proteccin de sus componentes. Pero su misin no acaba aqu. En mamferos, las chaperoninas podran defender de las infecciones mediante el envo de seales al sistema inmunitario, del que son uno de los ms potentes estimuladores. La estimulacin procede en dos frentes; en un primer nivel, las chaperoninas activan los mecanismos innatos de defensa, puestos en operacin por los fagocitos. En un segundo frente, las chaperoninas actan sobre los mecanismos de defensa adquiridos, mediante la estimulacin de la produccin de anticuerpos y linfocitos T.

Cambios conformacionales que sufre GroEL durante el ciclo de plegamiento. Comprense las imgenes que se muestran en B, obtenidas por microscopa electrnica y procesamiento de imgenes, con la estructura de los dos monmeros de GroEL mostrados en A, obtenida por difraccin de rayos X. Cada monmero pertenece a un anillo del oligmero de GroEL. Los cambios conformacionales se generan por la unin de ATP al sitio de unin del ATP de los siete monmeros de un anillo a la vez. La seal se transmite desde all en dos direcciones: una hacia al dominio apical a travs del dominio intermedio, la otra va hacia el monmero del otro anillo con el que est interaccionando, a travs de los puntos de contacto 1 y 2. De esta manera, los cambios conformacionales que se producen en un anillo afectan al otro, por lo que ambos anillos actan de manera concertada. Si partimos de un oligmero de GroEL que no tiene nucletido (a), la unin de ATP a uno de los anillos genera un cambio conformacional de ste (b). La unin de GroES a los dominios apicales de este anillo genera un movimiento de los dominios apicales del anillo an mayor (c), con la consiguiente apertura de la cavidad del anillo. Si se aade al oligmero de GroEL una cantidad mayor de ATP, se produce un cambio conformacional de los dominios apicales de ambos (d). La adicin de Groes produce primero un complejo asimtirco GroEL-GroES (e) y luego un complejo simtrico. En ese mismo marco de la defensa, las chaperoninas se relacionan con los factores de crecimiento en los mamferos. El factor temprano de la gestacin ("Early-pregnancy factor"), que aparece en el suero materno a las pocas horas de la fecundacin, interviene en la proliferacin celular, posee propiedades inmunosupresoras y regula el crecimiento de todo tipo de clulas, normales o neoplsicas. Adems, su acumulacin en las plaquetas denuncia su participacin en los procesos de cierre de heridas. Se ha sugerido tambin su implicacin en los mecanismos de inflamacin. El factor temprano de la gestacin, con tan numerosas propiedades biolgicas, ha resultado ser la cochaperonina mitocondrial mt-cpn 10, ayudante de la chaperonina mitocondrial en el plegamiento de protenas. Del estudio del papel de las chaperoninas en los mecanismos de defensa celular podran generarse en el futuro aplicaciones mdicas de este tipo de protenas. Aspectos biotecnolgicos de las chaperoninas La produccin industrial de protenas constatuye un fenmeno en expansin creciente. El sector alimentario y el farmacutico promueven la expresin de

protenas en organismos diferentes de los que se encuentran en la naturaleza, por lo comn, bacterias, levaduras o clulas eucariticas. Se consigue este resultado mediante la introduccin del gen que cifra la protena deseada en el organismo husped. Sin embargo, este procedimiento no se halla exento de problemas, siendo el ms espinoso la falta de reconocimiento por parte del organismo de la protena que est expresando, lo que da lugar a los cuerpos de inclusin. As se llaman los agregados de protena, insolubles, aunque en algunos casos se solubilizan con urea u otros agentes desnaturalizantes.

El ciclo de plegamiento de GroEL podra ser muy parecido a ste. Una molcula de protena desnaturalizada se une a los dominios apicales de un anillo de GroEL (anillo

de abajo en 1). El oligmero est representado por un complejo asimtrico, en el que en el anillo de arriba hay una molcula desnaturalizada protegida por un oligmero de GroES. Este anillo ha hidrolizado su ATP de tal manera que ahora posee molculas de ADP (D) en todos sus monmeros.
Pero la tcnica de la solubilizacin no es ni barata, ni rpida ni siempre segura. En muchos casos, el problema de la insolubilidad de la protena sobreexpresada se ataja con el aumento de chaperoninas nativas o la expresin contempornea de chaperoninas nativas y forneas. De inters biotecnolgico es la generacin de chaperoninas hbridas, dotadas con propiedades de las progenitoras; por ejemplo, chaperoninas construidas con la eficacia e inespecificidad plegadora de la GroEL de E. coli y la estabilidad de una chaperonina proveniente de un organismo extremfilo. En el estudio del plegamiento de protenas acaban de hacer su entrada las minichaperonas. El grupo de Alan Fersht, de la Universidad de Cambridge, ha conseguido, mediante la eliminacin del dominio ecuatorial y el intermedio, generar un monmero estable de GroEL en el que slo se encuentra el dominio apical; en este dominio se mantiene intacta la zona de interaccin con el polipptido desnaturalizado. La minichaperona posee capacidad para plegar protenas (no todas) sin necesidad de hidrlisis de ATP. El grupo de Fersht, tras unir la minichaperona a una resina de cromatografa, ha renaturalizado las protenas mediante el paso de stas por una columna empaquetada con el complejo resinaminichaperona. BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA PROTEIN FOLDING IN THE CELL: THE ROLE OF MOLECULAR CHAPERONES HSP70 AND HSP60. F. U. Hartl, J. Martin y W. Neupert en Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure, vol. 21, pginas 293-322, 199l. PROTEIN FOLDING IN THE CELL. M. J. Gething y J. Sambrook en Nature, vol. 355, pginas 33-45, 1992. THE CHAPERONINS. Dirigido por R. J. Ellis. Academic Press, 1996. GROEL-MEDIATED PROTEIN FOLDING. W. A. Fenton y A. L. Horwich en Protein Science, vol. 6, pginas 743-760. 1997.

Las Protenas
Informacin sobre protenas y alimentos con protenas

Los aminocidos son las unidades qumicas o "bloques de construccin" del cuerpo que forman las protenas. Las sustancias proteicas construidas gracias a estos 20 aminocidosforman los msculos, tendones, rganos, glndulas, las uas y el pelo. Existen dos tipos principales de aminocidos que estn agrupados segn su procedencia y caractersticas. Estos grupos son aminocidos esenciales y aminocidos no esenciales. Los aminocidos que se obtienen de los alimentos se llaman "Aminocidos esenciales". Los aminocidos que puede fabricar nuestro organismo a partir de otras fuentes, se llaman "Aminocidos no esenciales". El crecimiento, la reparacin y el mantenimiento de todas las clulas dependen de ellos. Despus del agua, las protenas constituyen la mayor parte del peso de nuestro cuerpo. A continuacin puedes ver una lista detallada con las caractersticas y propiedades de cada aminocido.

Aminocidos esenciales
Se llaman aminocidos esenciales aquellos que no pueden ser sintetizados en el organismo y para obtenerlos es necesario tomar alimentos ricos en protenas que los contengan. Nuestro organismo, descompone las protenas para obtener los aminocidos esenciales y formar as nuevas protenas.

Histidina
Este aminocido se encuentra abundantemente en la hemoglobina y se utiliza en el tratamiento de la artritis reumatoide, alergias, lceras y anemia. Es esencial para el crecimiento y la reparacin de los tejidos. La Histidina, tambin es importante para el mantenimiento de las vainas de mielina que protegen las clulas nerviosas, es necesario para la produccin tanto de glbulos rojos y blancos en la sangre, protege al organismo de los daos por radiacin, reduce la presin arterial, ayuda en la eliminacin de metales pesados del cuerpo y ayuda a la excitacin sexual.

Isoleucina
La Isoleucina es necesaria para la formacin de hemoglobina, estabiliza y regula el azcar en la sangre y los niveles de energa. Este aminocido es valioso para los deportistas porque ayuda a la curacin y la reparacin del tejido muscular, piel y huesos. La cantidad de este aminocido se ha visto que es insuficiente en personas que sufren de ciertos trastornos mentales y fsicos.

Leucina
La leucina interacta con los aminocidos isoleucina y valina para promover la cicatrizacin del tejido muscular, la piel y los huesos y se recomienda para quienes se recuperan de la ciruga. Este aminocido reduce los niveles de azcar en la sangre y ayuda a aumentar la produccin de la hormona del crecimiento.

Lisina

Funciones de este aminocido son garantizar la absorcin adecuada de calcio y mantiene un equilibrio adecuado de nitrgeno en los adultos. Adems, la lisina ayuda a formar colgeno que constituye el cartlago y tejido conectivo. La Lisina tambin ayuda a la produccin de anticuerpos que tienen la capacidad para luchar contra el herpes labial y los brotes de herpes y reduce los niveles elevados de triglicridos en suero.

Metionina
La Metionina es un antioxidante de gran alcance y una buena fuente de azufre, lo que evita trastornos del cabello, piel y uas, ayuda a la descomposicin de las grasas, ayudando as a prevenir la acumulacin de grasa en el hgado y las arterias, que pueden obstruir el flujo sanguneo a el cerebro, el corazn y los riones, ayuda a desintoxicar los agentes nocivos como el plomo y otros metales pesados, ayuda a disminuir la debilidad muscular, previene el cabello quebradizo, protege contra los efectos de las radiaciones, es beneficioso para las mujeres que toman anticonceptivos orales, ya que promueve la excrecin de los estrgenos, reduce el nivel de histamina en el cuerpo que puede causar que el cerebro transmita mensajes equivocados, por lo que es til a las personas que sufren de esquizofrenia.

Fenilalanina
Aminocidos utilizados por el cerebro para producir la noradrenalina, una sustancia qumica que transmite seales entre las clulas nerviosas en el cerebro, promueve el estado de alerta y la vitalidad. La Fenilalanina eleva el estado de nimo, disminuye el dolor, ayuda a la memoria y el aprendizaje, que se utiliza para tratar la artritis, depresin, calambres menstruales, las jaquecas, la obesidad, la enfermedad de Parkinson y la esquizofrenia.

Treonina
La treonina es un aminocido cuyas funciones son ayudar a mantener la cantidad adecuada de protenas en el cuerpo, es importante para la formacin de colgeno, elastina y esmalte de los dientes y ayuda a la funcin lipotrpica del hgado cuando se combina con cido asprtico y la metionina, previene la acumulacin de grasa en el hgado, su metabolismo y ayuda a su asimilacin.

Triptofano
Este aminocido es un relajante natural, ayuda a aliviar el insomnio induciendo el sueo normal, reduce la ansiedad y la depresin y estabiliza el estado de nimo, ayuda en el tratamiento de la migraa, ayuda a que el sistema inmunolgico funcione correctamente. El Triptofano ayuda en el control de peso mediante la reduccin de apetito, aumenta la liberacin de hormonas de crecimiento y ayuda a controlar la hiperactividad en los nios.

Valina
La Valina es necesaria para el metabolismo muscular y la coordinacin, la reparacin de tejidos, y para el mantenimiento del equilibrio adecuado de nitrgeno en el cuerpo, que se utiliza como fuente de energa por el tejido muscular. Este aminocido es til en el tratamiento de enfermedades del hgado y la vescula biliar, promueve el vigor mental y las emociones tranquilas.

Alanina
Desempea un papel importante en la transferencia de nitrgeno de los tejidos perifricos hacia el hgado, ayuda en el metabolismo de la glucosa, un carbohidrato simple que el cuerpo utiliza como energa, protege contra la acumulacin de sustancias txicas que se liberan en las clulas musculares cuando la protena muscular descompone rpidamente para satisfacer las necesidades de energa,

como lo que sucede con el ejercicio aerbico, fortalece el sistema inmunolgico mediante la produccin de anticuerpos.

Aminocidos no esenciales
Los aminocidos no esenciales son aquellos que pueden ser sintetizados en el organismo a partir de otras sustancias.

Arginina
Este aminocido est considerado como "El Viagra Natural" por el aumento del flujo sanguneo hacia el pene, retrasa el crecimiento de los tumores y el cncer mediante el refuerzo del sistema inmunolgico, aumenta el tamao y la actividad de la glndula del timo, que fabrica las clulas T, componentes cruciales del sistema inmunolgico. La Arginina, ayuda en la desintoxicacin del hgado neutralizando el amoniaco, reduce los efectos de toxicidad crnica de alcohol, que se utiliza en el tratamiento de la esterilidad en los hombres, aumentando el conteo de espermatozoides; ayudas en la prdida de peso, ya que facilita un aumento de masa muscular y una reduccin de grasa corporal, ayuda a la liberacin de hormonas de crecimiento, que es crucial para el "crecimiento ptimo" msculo y la reparacin de tejidos, es un componente importante del colgeno que es bueno para la artritis y trastornos del tejido conectivo y ayuda a estimular el pncreas para que libere insulina.

cido Asprtico
El cido Asprtico aumenta la resistencia y es bueno para la fatiga crnica y la depresin, rejuvenece la actividad celular, la formacin de clulas y el metabolismo, que le da una apariencia ms joven, protege el hgado, ayudando a la expulsin de amoniaco y se combina con otros aminocidos para formar molculas que absorben las toxinas y sacarlas de la circulacin sangunea. Este aminocido tambin ayuda a facilitar la circulacin de ciertos minerales a travs de la mucosa intestinal, en la sangre y las clulas y ayuda a la funcin del ARN y ADN, que son portadores de informacin gentica.

Cistena
La Cistena funciona como un antioxidante de gran alcance en la desintoxicacin de toxinas dainas. Protege el cuerpo contra el dao por radiacin, protege el hgado y el cerebro de daos causados por el alcohol, las drogas y compuestos txicos que se encuentran en el humo del cigarrillo, se ha utilizado para tratar la artritis reumatoide y el endurecimiento de las arterias. Otras funciones de este aminocido es promover la recuperacin de quemaduras graves y la ciruga, promover la quema de grasa y la formacin de msculos y retrasar el proceso de envejecimiento. La piel y el cabello se componen entre el 10% y el 14% de este aminocido.

cido Glutmico
El cido Glutmico acta como un neurotransmisor excitatorio del sistema nervioso central, el cerebro y la mdula espinal. Es un aminocido importante en el metabolismo de azcares y grasas, ayuda en el transporte de potasio en el lquido cefalorraqudeo, acta como combustible para el cerebro, ayuda a corregir los trastornos de personalidad, y es utilizado en el tratamiento de la epilepsia, retraso mental, distrofia muscular y lceras.

Glutamina
Es el aminocido ms abundante en los msculos. La Glutamina ayuda a construir y mantener el tejido muscular, ayuda a prevenir el desgaste muscular que puede acompaar a reposo prolongado en cama o enfermedades como el cncer y el SIDA. Este aminocido es un "combustible de cerebros" que aumenta la funcin cerebral y la actividad mental, ayuda a mantener el equilibrio del cido alcalino en el

cuerpo, promueve un sistema digestivo saludable, reduce el tiempo de curacin de las lceras y alivia la fatiga, la depresin y la impotencia, disminuye los antojos de azcar y el deseo por el alcohol y ha sido usado recientemente en el tratamiento de la esquizofrenia y la demencia.

Glicina
La Glicina retarda la degeneracin muscular, mejora el almacenamiento de glucgeno, liberando as a la glucosa para las necesidades de energa, promueve una prstata sana, el sistema nervioso central y el sistema inmunolgico. Es un aminocido til para reparar tejidos daados, ayudando a su curacin.

Ornitina
Este aminocido ayuda a pedir la liberacin de hormonas de crecimiento, lo que ayuda al metabolismo de la grasa corporal (este efecto es mayor si se combina con la arginina y carnitina), es necesario para un sistema inmunolgico saludable, desintoxica el amoniaco, ayuda en la regeneracin del hgado y estimula la secrecin de insulina. La Ornitina tambin ayuda a que la insulina funcione como una hormona anablica ayudando a construir el msculo.

Prolina
Funciones de este aminocido son mejorar la textura de la piel, ayudando a la produccin de colgeno y reducir la prdida de colgeno a travs del proceso de envejecimiento. Adems, la Prolina ayuda en la cicatrizacin del cartlago y el fortalecimiento de las articulaciones, los tendones y los msculos del corazn. La Prolina trabaja con la vitamina C para ayudar a mantener sanos los tejidos conectivos.

Serina
Este aminocido es necesario para el correcto metabolismo de las grasas y cidos grasos, el crecimiento del msculo, y el mantenimiento de un sistema inmunolgico saludable. La Serina es un aminocido que forma parte de las vainas de mielina protectora que cubre las fibras nerviosas, es importante para el funcionamiento del ARN y ADN y la formacin de clulas y ayuda a la produccin de inmunoglobulinas y anticuerpos.

Taurina
La Taurina fortalece el msculo cardaco, mejora la visin, y ayuda a prevenir la degeneracin macular, es el componente clave de la bilis, la cual es necesaria para la digestin de las grasas, til para las personas con aterosclerosis, edema, trastornos del corazn, hipertensin o hipoglucemia. Es un aminocido vital para la utilizacin adecuada de sodio, potasio, calcio y magnesio, ayuda a prevenir el desarrollo de arritmias cardiacas potencialmente peligrosas. La taurina se ha utilizado para tratar la ansiedad, epilepsia, hiperactividad, mal funcionamiento cerebral y convulsiones.

Tirosina
Es un aminocido importante para el metabolismo general. La Tirosina es un precursor de la adrenalina y la dopamina, que regulan el estado de nimo. Estimula el metabolismo y el sistema nervioso, acta como un elevador del humor, suprime el apetito y ayuda a reducir la grasa corporal. La Tirosina ayuda en la produccin de melanina (el pigmento responsable del color del pelo y la piel) y en las funciones de las glndulas suprarrenales, tiroides y la pituitaria, se ha utilizado para ayudar a la fatiga crnica, la narcolepsia, ansiedad, depresin, el bajo impulso sexual, alergias y dolores de cabeza.