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SACARIFICAO DA BIOMASSA LIGNOCELULSICA ATRAVS DE PR-HIDRLISE CIDA SEGUIDA POR HIDRLISE ENZIMTICA: UMA ESTRATGIA DE DESCONSTRUO DA FIBRA VEGETAL
Autores: Larissa Canilha, Adriane M. F. Milagres, Silvio S. Silva, Joo B. Almeida e Silva, Maria G. A. Felipe, George J. M. Rocha, Andr Ferraz e Walter Carvalho INTRODUO A autossuficincia energtica tida como pr-requisito fundamental para a segurana de uma nao. Por exemplo, a crise do petrleo deflagrada na dcada de 70 acarretou em prejuzos marcantes economia global devido vaidade e onipotncia dos dirigentes de naes produtoras de petrleo localizadas no Oriente Mdio. Desde ento, diversas naes situadas em todos os continentes do globo deram incio a programas de pesquisa e desenvolvimento com o objetivo de se tornarem autossuficientes em termos energticos. No Brasil, o Programa Nacional do lcool (Prolcool), institudo pelo Governo Federal em 1975, fomentou o uso do etanol, produzido a partir do caldo da cana-de-acar, como combustvel veicular. O desenvolvimento tecnolgico gerado dentro deste programa alou o pas a uma posio de destaque no cenrio mundial. Pode-se dizer que a queda do preo do petrleo na dcada de 80 desestimulou fortemente o desenvolvimento de processos industriais baseados na utilizao de matrias-primas renovveis para a produo de bens de consumo. Assim, embora sejam notrios os avanos conseguidos pelo Brasil na produo de etanol a partir do caldo de cana-deacar (etanol de primeira gerao), pouco se investiu no desenvolvimento de tecnologias par a a produo de etanol tambm a partir do bagao de cana-de-acar (etanol de segunda gerao). Se as usinas sucroalcooleiras utilizassem no somente o caldo, mas tambm o bagao da cana como fonte de carboidratos, seria possvel aumentar significativamente a produo de etanol sem aumentar a demanda por uma maior rea de plantio da cana. Neste cenrio, a queima da palha, atualmente deixada no campo, poderia suprir, pelo menos em parte, as necessidades energticas das usinas de processamento. Nos ltimos anos, tem-se observado um aumento gradual no preo do petrleo, determinado pela reduo na oferta prevista para mdio e longo prazo. Alm disso, o aquecimento global do planeta, determinado pelo acmulo de gases do efeito estufa na atmosfera, uma realidade que impulsiona o desenvolvimento de processos industriais base de matrias-primas renovveis. Seguindo a tendncia mundial, a indstria sucroalcooleira brasileira tem manifestado interesse em tecnologias sustentveis que possam ser agregadas sua cadeia produtiva. Por exemplo, enquanto o caldo da cana utilizado para a produo de acar e etanol, a co-gerao j permite que a queima do bagao seja aproveitada tambm para a produo de bio eletricidade. Esforos esto atualmente sendo direcionados para incluir tambm a palha (deixada no campo) no ciclo de produo. Tal faanha permitir que o bagao seja ento utilizado para a produo de etanol (de segunda gerao) e de outros insumos renovveis atravs de rotas baseadas na alcoolqumica e na sucroqumica. Benefcios econmicos, sociais e ambientais so esperados como consequncia. Um dos principais problemas que limitam o aproveitamento dos acares contidos no bagao de cana para a produo de etanol diz respeito aos elevados custos envolvidos no condicionamento da matria-prima. Os acares do bagao, assim como aqueles de qualquer outro material lignocelulsico, encontram-se na forma de polmeros (celulose e hemicelulose) associados entre si e recobertos por uma macromolcula aromtica complexa (lignina), formando a microfibrila celulsica. Esta, por sua vez, constitui a parede celular (fibra) vegetal, uma estrutur a recalcitrante difcil de ser desestruturada e convertida em monossacardeos fermentescveis. Na presente reviso, procuramos sumarizar alguns dos principais aspectos envolvidos na sacarificao da biomassa lignocelulsica atravs de pr-hidrlise cida seguida por hidrlise enzimtica, uma das estratgias que podem ser utilizadas para a desconstruo da fibra vegetal. ESTRUTURA E COMPOSIO DA BIOMASSA LIGNOCELULSICA Os materiais lignocelulsicos representam a frao mais expressiva da biomassa vegetal, a maior fonte de compostos orgnicos da biosfera. So constitudos por trs fraes principais que, juntas, perfazem mais de 90% da massa seca total. So elas: celulose, hemicelulose e lignina. A celulose, constituinte mais abundante da parede celular vegetal, um homopolissacardeo constitudo por unidades de D-glucose unidas entre si por ligaes glicosdicas (14), apresentando um grau de polimerizao de at 10.000. A estrutura linear, conferida pela configurao das ligaes glicosdicas, possibilita a for-mao de ligaes de hidrognio intra e intermoleculares e acarreta na agregao das cadeias celulsicas em fibrilas elementares com alto grau de cristalinidade. Estes agregados conferem elevada resistncia tenso, tornam a celulose insolvel em um grande nmero de solventes e explicam, pelo menos em parte, a sua resistncia degradao microbiana. A hemicelulose um heteropolissacardeo comple-xo composto por D-glucose, D-galactose, D-manose, D-xilose, Larabinose, cido D-glucurnico e cido 4-O-metil-glucurnico. ramificada, apresenta um grau de polimerizao inferior a 200 e pode ser acetilada. Nas madeiras de conferas (softwoods), galactogluco-mananas e arabinoglucuronoxilanas so os principais constituintes hemicelulsicos. Por outro lado, 4-O-metil-glucuronoxilanas e

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glucomananas so os principais polissacardeos encontrados na hemicelulose das madeiras de folhosas (hardwoods). As gramneas, por sua vez, apresentam as glucuronoarabinoxilanas como principais constituintes hemicelulsicos. A lignina uma macromolcula complexa, formada pela polimerizao radicalar de unidades fenil-propano (lcool pcumarlico, lcool coniferlico e lcool sinaplico). Constitui a frao no polissacardica mais abundante da lignocelulose. Envolve- as microfibrila celulsicas, conferindo proteo degradao qumica e/ou biolgica, e pode formar ligaes covalentes com a hemicelulose. Enquanto as paredes celulares de gram-neas apresentam os menores teores de lignina, aquelas de madeiras de conferas (softwoods) so as mais ricas neste componente. Do ponto de vista tecnolgico, os acares contidos nas fraes celulsica (glucose) e hemicelulsica (xilose, arabinose, glucose, manose e galactose) representam os substratos que podem ser utilizados para a produo de etanol por via fermentativa. Entretanto, conforme ilustrado na Figura 1, a ntima associao entre as trs fraes principais (celulose, hemicelulose e lignina) tal que impe dificuldades para a recuperao dos acares constituintes na forma de monmeros com elevado grau de pureza. CONVERSO DA BIOMASSA LIGNOCELULSICA EM ACARES FERMENTESCVEIS Diversas estratgias para a converso de materiais lignocelulsicos em acares fermentescveis tm sido demonstradas em escala laboratorial e piloto. O conceito geral envolve pr-tratar a matria bruta para, ento, submet-la hidrlise enzimtica. Embora o pr-tratamento possa ser conduzido por princpios bastante variados, tem por finalidades alterar ou remover a hemicelulose e/ou a lignina, aumentar a rea superficial e diminuir o grau de polimerizao e a cristalinidade da celulose, o que acarreta em aumento na digestibilidade enzimtica e, consequentemente, no rendimento em acares fermentescveis. Para que a sacarificao enzimtica da celulose seja eficiente, necessrio que as enzimas consigam chegar at ela. Entretanto, a parede da clula vegetal imperme-vel a grandes molculas, incluindo protenas como as celulases. Para superar esta barreira, reagentes que incluem (mas no se restringem a) cidos e bases devem ser utilizados para solubilizar a hemicelulose e/ou a lignina e, assim, aumentar a porosidade da matriz. Pr-tratamentos puramente fsicos tambm podem ser utilizados para aumentar a reatividade do material pr-tratado frente s enzimas hidrolticas. Por exemplo, a reduo da granulometria do material de partida por moagem, embora altamente desfavorvel do ponto de vista de consumo energtico, aumenta a rea superficial disponvel e diminui a cristalinidade da celulose, favorecendo a sacarificao enzimtica. Pr-tratamentos biolgicos, com fungos e bactrias que promovem a degradao seletiva da lignina e/ou da hemicelulose, representam outra opo, entretanto as velocidades de biodegradao so lentas. Pr-tratamentos que combinam princpios fsicos e qumicos representam as melhores opes para fracio-nar a biomassa lignocelulsica, sendo que o pr-tratamento adequado deveria idealmente: 1) maximizar a digestibilidade enzimtica, 2) minimizar a perda de acares, 3) otimizar a produo de subprodutos (ligni-na, por exemplo), 4) no requerer a adio de reagentes que venham a inibir as enzimas hidrolticas e os micro-organismos fermentativos, 5) minimizar o uso de energia, reagentes e equipamentos, e 6) permitir a transposio para escala industrial.

Dentre os diferentes mtodos de pr-tratamento, a hidrlise dos acares presentes na frao hemicelulsica de materiais lignocelulsicos com cidos diludos, seguida ou no por descompresso sbita (exploso), tem se mostrado bastante eficiente, sendo tambm rpida e simples. Esta tcnica apresenta vantagens como minimizao da formao de produtos de degradao e aumento da susceptibilidade a celulose hidrlise enzimtica subseqente, desde que

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as condies de hidrlise sejam otimizadas. Trata-se de uma tecnologia amplamente reportada na literatura, testada em escala piloto e com potencial de aplicao em escala industrial. Durante a hidrlise com cidos diludos, o material lignocelulsico misturado com um cido (H2SO4, tipicamente) diludo em gua - catalisador - e aquecido por certo tempo. Grupos acetil ligados hemicelulose so clivados e tambm atuam como catalisadores da hidrlise. Conforme ilustrado na Figura 2, grande parte da hemicelulose removida. Por outro lado, a remoo da lignina ocorre de maneira bastante limitada. Embora haja fuso e despolimerizao desta frao durante o pr-tratamento, tambm h repolimerizao e redistribuio superficial intensas. Estas reaes acarretam em alteraes radicais na estrutura da parede celular vegetal, favorecendo a acessibilidade das enzimas para a hidrlise subseqente da celulose. Trs classes de enzimas constituem o complexo celuloltico: 1) exo-1,4--D-glucanases (EC 3.2.1.91), que hidrolisam a cadeia celulsica a partir de suas extremidades liberando celobioses, 2) endo-1,4--D-glucanases (EC 3.2.1.4), que hidrolisam a cadeia celulsica internamente de maneira aleatria, e 3) 1,4--D-glucosidases (EC 3.2.1.21), que promovem a hidrlise da celobiose em glucose e podem tambm clivar unidades glucosdicas a partir de celuoligossacardeos. Coletivamente chamadas de celulases, atuam em sinergia para hidrolisar a celulose criando stios acessveis umas para as outras e aliviando problemas de inibio pelos produtos . Dependendo do tipo e das condies empregadas durante o pr-tratamento, parte da hemicelulose pode permanecer no material pr-tratado e prejudicar a hidrlise enzimtica da celulose. Neste caso, a hidrlise eficiente do material prtratado requer, em adio s celulases, o emprego de hemicelulases. O sistema hemiceluloltico requerido para a hidrlise da hemicelulose mais complexo que o sistema celuloltico, j que a hemicelulose apresenta natureza heterognea. Inclui, entre outras enzimas: 1) endo-1,4--D-xilanases (EC 3.2.1.8), que hidrolisam ligaes glicosdicas internas aleatoriamente na cadeia de xilana, 2) 1,4--D-xilosidases (EC 3.2.1.37), que atacam xilo-oligossacardeos a partir das pontas no redutoras da cadeia de xilana liberando xilose, 3) endo-1,4--D-mananases (EC 3.2.1.78), que clivam ligaes internas na cadeia de manana, 4) 1,4--Dmanosidases (EC 3.2.1.25), que clivam mano-oligossacardeos em mano-se, e 5) enzimas que removem os grupos substituintes laterais (ramificaes), como -D-galactosidases (EC 3.2.1.22), -L-arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55), -D-glucuronidases (EC 3.2.1.139), acetil xilana esterases (EC 3.1.1.72) e feruloil esterases (EC 3.1.1.73).

A maior parte das enzimas envolvidas na hidrlise de carboidratos so protenas modulares, constitudas por um mdulo cataltico e por um mdulo de ligao a carboidratos (MLC). A funo do MLC promover o contato ntimo entre o substrato e o mdulo cataltico da enzima, assegurando a orientao correta entre ambos. Entretanto, quando o substrato um material lignificado, a lignina pode promover intensa adsoro inespecfica das enzimas utilizadas para a hidrlise da celulose e/ou da hemicelulose. A frao de celulases e hemicelulases tornadas improdutivas devido a esta ad-soro pode chegar a 70% do total adicionado. Isto inclusive impede a reciclagem das enzimas, uma estratgia que tem um grande impacto na viabilidade econmica do processo. Para superar esta limitao, outras protenas (albumina, por exemplo), surfactantes no inicos (Tween 20, por exemplo) ou polmeros (polietilenoglicol, por exemplo) tm sido adicionados mistura reacional com a finalidade de minimizar adsores indesejveis. Prtratamentos direcionados solubilizao da lignina com reagentes apropriados (NaOH, por exemplo) tambm tm sido propostos. Alm de minimizar a adsoro improdutiva das enzimas, estes pr-tratamentos geralmente acarretam em aumento na acessibilidade celulose.

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Do ponto de vista de utilizao dos hidrolisados enzimticos como substratos em processos fermentativos, pode-se afirmar que o uso de hidrolisados com elevadas concentraes de acares fermentescveis permite a obteno de caldos fermentados com altas concentraes de produto, o que reduz os custos de separao e purificao. Entretanto, a conduo da hidrlise enzimtica na presena de elevadas concentraes de substrato (celulose) apresenta duas grandes limitaes: Concentraes de glucose relativamente baixas (1-14 mM) acarretam em inibio das -glucosidases, levando ao acmulo de celobiose no meio reacional. A celobiose, por sua vez, um potente inibidor das celobiohidrolases, resultando em limitaes severas na hidrlise da celulose. Para superar esta li-mitao, a sacarificao enzimtica (da celulose em glucose) e a fermentao (da glucose em etanol) de-vem ser processadas simultaneamente (SFS) de forma a evitar o acmulo de glucose no meio. A utilizao de concentraes de substrato (celulose) superiores a 15 % acarreta em viscosidade excessiva, dificultando a mistura (homogeneizao) e aumentando o consumo de energia.

Para contornar este problema, a SFS deve ser operada em modo batelada alimenta-da. Inicia-se a hidrlise com uma concentrao de substrato inferior a 10 % e, na medida em que h liquefao da celulose e reduo na viscosidade do meio, adiciona-se mais substrato de forma gradativa (51,52). A Figura 3 apresenta uma viso simplificada dos principais mecanismos que limitam a hidrlise enzimtica da celulose. Conforme abordado nos pargrafos anteriores, a compreenso destes mecanismos tem permitido o desenvolvimento progressivo de estratgias para superar as limitaes. Assim, embora a utilizao de enzimas em escala industrial ainda seja economicamente proibitiva, os prognsticos apontam para um futuro promissor. CONCLUSO Sabe-se que a hidrlise total dos polissacardeos lignocelulsicos (hemicelulose + celulose) com cidos diludos problemtica em termos de degradao de acares. A hidrlise com cidos concentrados, embo-ra permita a obteno de rendimentos de sacarificao prximos ao terico, implica em custos e riscos elevados. Neste contexto, a hidrlise enzimtica promete solues para os problemas evidenciados pelas rotas concorrentes, ou seja, faz uso de catalisadores especficos e ambientalmente amigveis que operam sob condies amenas de pH, temperatura e presso. Entretanto, para que a sacarificao enzimtica seja eficiente, preciso que as enzimas tenham amplo acesso ao substrato. Em outras palavras, necessrio abrir a estrutura da fibra vegetal de forma a permitir uma rpida digesto da celulose na presena de baixas concentraes de enzimas que, idealmente, possam ser utilizadas repetidamente. Conforme apresentado nesta reviso, a pr-hidrlise com cidos diludos uma entre as muitas opes de prtratamento disponveis.

AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o apoio financeiro recebido da FAPESP, CNPq, CAPES e USP para o desenvolvimento de projetos de pesquisa relacionados com a temtica da presente reviso.