UNIVERSIDAD ANDRES BELLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS

LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR BIO-131

GUA N 3: MICROSCOPIA II

INTRODUCCIN Cuando las ondas de luz son emitidas desde una fuente coherente (como un lser), las ondas estn en fase, o sea, los picos y los valles de las ondas coinciden. Esto tiene el efecto de reforzar las ondas y crear una mayor amplitud, que percibimos como un aumento en el brillo. Sin embargo, cuando las ondas de luz estn fuera de la fase, se interfieren entre s reduciendo la amplitud y el brillo. Cuando las ondas de luz pasan de una sustancia a otra, se curvan o se difractan y sus trayectorias cambian ligeramente. Esta difraccin altera las relaciones de la fase de las ondas, dando como resultado cantidades variables de interferencia. La cantidad de interferencia producida cuando la luz atraviesa las diferentes estructuras de una clula no es grande, y el contraste que se detecta es escaso cuando la clula se observa con un microscopio ptico comn, lo cual por su puesto es la razn por la cual las clulas deben teirse. Sin embargo, en los microscopios de contraste de fase y de interferencia diferencial, sistemas pticos especialmente diseados intensifican la escasa interferencia y proporcionan un mayor contraste. La resolucin de estos microscopios es limitada, como ocurre en un microscopio ptico comn, pero suministran una perspectiva diferente de la clula viva, mostrando aspectos difciles de detectar en otro sistema. Otra tcnica usada frecuentemente en las clulas vivas es la microscopia de campo oscuro. El haz de iluminacin llega a la muestra desde el costado y los sistemas de lentes detectan la luz reflejada por el espcimen, que aparece como un objeto brillante contra un fondo oscuro. Los rasgos de las clulas que son visibles en estas fotomicrografas, a menudo adquieren un gran relieve en las de campo oscuro. Actualmente, ocurre un rpido progreso en el uso de otras tcnicas microscpicas; por ejemplo, acoplando cmaras de televisin a los microscopios pticos es posible efectuar las observaciones en la pantalla y grabarlas en una cinta de video. Ajustando los controles, como puede hacerse en un aparato de televisin, el ruido de fondo puede reducirse, mejorar el contraste e intensificar aspectos particulares. Las tcnicas de televisin aplicadas al estudio de la clula viva estn en su infancia, pero estn generando gran excitacin, dado que revelan procesos no vistos previamente dentro de la clula. Los constantes avances en la microscopa han permitido su utilizacin en muchos aspectos de la biologa celular, fisiologa e incluso en patologa humana, uno de stos es la determinacin del nmero de clulas en suspensin. Por ejemplo, en hematologa humana no tan slo es importante conocer el tipo y caractersticas de las clulas presentes en la sangre, sino que adems el nmero de cada una de ellas presentes en un volumen determinado (por ej.: 1 ml o 1 mm3). Objetivo del prctico: En este laboratorio el objetivo principal es que el estudiante observe preparaciones frescas de sangre generando un campo oscuro; conozca la tcnica de recuento de glbulos rojos a travs de la cmara de Neubauer y determine el tamao celular en un frotis sanguneo permanente.

Recuento de glbulos rojos en cmara de Neubauer: La cmara de Neubauer (Fig. 1) es una cmara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con dos depresiones en el centro, en el fondo de las cuales se han marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve en la imagen. Cada cuadrcula es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos lneas consecutivas de 0.25 mm para los cuadrados externos (L), y de 0.20 mm el cuadrado interno. As pues, las reas sombreadas corresponden a 1 milmetro cuadrado cada una (Fig. 2). La depresin central del cubreobjetos est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico (mm3), es decir 0.1 microlitro (l) para cada superficie sombreada.

Fig. 1: Cmara de Neubauer, con una depresin superior y otra inferior (los extremos de la H formada al centro). Procedimiento para utilizar la cmara:Se coloca un cubreobjeto sobre una cmara Neubauer limpia y seca, y se deposita una gota en uno de los lados del cubreobjeto; esta gota penetra por capilaridad y rellena el retculo de la misma. (Fig. 3) Una vez preparada se espera un poco para que sedimenten las clulas en reposo, y luego se procede a colocar la cmara sobre la platina del microscopio (no colocar antes, pues el calor de la fuente de luz comienza a evaporar el lquido). Fig. 3: Procedimientos en la utilizacin de una cmara de Neubauer

Fig. 2: Dimensiones de la cuadrcula.

Como determinar el nmero de clulas con cmara de Neubauer usando el cuadrado central: El cuadrado central posee 25 cuadrados grandes (cada uno subdivido en 16 cuadrados menores). Si cada uno de los cuadrados grandes posee 1/5 mm de lado, la superficie de 1 cuadrado grande ser:

Volumen de un cuadrado grande (1/10 mm de profundidad):

Si contamos "a" glbulos rojos en "n" cuadrados, el nmero de glbulos por cuadrado ser a / n, y si en un cuadrado de volumen 1/250 mm3 hay a / n glbulos rojos, en 1 mm3 habr X.

Siendo X el nmero de glbulos rojos existentes por cada mm3 de sangre diluida. Si la sangre se diluy a 1/100 o 1/200, habr que multiplicar el valor X por 100 o 200 Respectivamente, con lo cual obtendremos un nuevo valor, Y, que representa el nmero de glbulos rojos existentes por cada mm3 de sangre (sin diluir).

Para tener en cuenta: Observe que en la grilla de la cmara de Neubauer las reas de recuento de eritrocitos y linfocitos son diferentes, debido a que los eritrocitos se encuentran en mucha ms cantidad. Mientras que los glbulos rojos se cuentan en las reas del cuadrado central, los glbulos blancos se cuentan en las reas coloreadas de azul (los cuadrados L). (Fig. 4) Tenga en cuenta que la grilla central tiene 25 cuadrados de 1mm x 1mm de rea y 0.10 mm de profundidad. Para acelerar el conteo, se cuenta el nmero de glbulos rojos (a) en los 5 cuadrados (n) coloreados de rojo para calcular el n glbulos rojos/l. (1 l (microlitro) = 1 mm3)

Fig. 4: rea de recuento de clulas.

Cuando un eritrocito se sita en la mitad de las lneas superior y/o de la izquierda, entonces es contabilizado. Pero no se contabiliza cuando se sita en la mitad de las lneas inferior y/o de la derecha. (Fig. 5)

Fig. 5: Ejemplo de recuento de clulas en un cuadrado L. El rango normal de recuento de glbulos rojos es el siguiente: o Mujeres: 3.9-5.6 millones/l. o Hombres: 4.5-6.5 millones/l. ACTIVIDADES PRCTICAS. A.- Campo Oscuro Procedimientos y observaciones de una muestra fresca de sangre Si bien existen otros microscopios que incluyen en su mecnica la alternativa de realizar observaciones por la tcnica de microscopa de campo oscuro, el microscopio convencional de campo claro puede ser adaptado para realizar una observacin con esta tcnica de manera muy simple. Se le entregar una seccin de cartn negro, el cual Ud. deber recortar siguiendo la lnea demarcada para obtener un crculo de papel negro. Proceda a observar en una primera instancia la muestra que se le entregar con su microscopio de campo claro normal (a 4X, 10X y 40X). Luego, coloque el crculo negro sobre la fuente de luz en la parte inferior del microscopio, de manera tal que la luz pase solo por los bordes del crculo. Cul es la diferencia en la observacin con el microscopio de campo claro y el de campo oscuro? Cul es el efecto obtenido? Describa este cambio observando con el objetivo 40X.

De la misma manera es posible jugar con la luz del microscopio de campo claro de manera de transformarlo en uno de contraste de fases o de interferencia diferencial. En primer lugar, coloque su muestra en el microscopio y enfoque a un aumento de 10X. Luego, con la ayuda de un cartn negro, interponga lentamente ste entre la fuente de luz y la platina del microscopio. Observe que pasa con los contornos de las clulas.

B.- Reglilla Dentro de las posibilidades de resolucin del microscopio ptico, es posible medir directamente los tamaos de clulas y estructuras (ncleos, vacuolas, cloroplastos). Para realizar estas mediciones, se necesita tener una reglilla en el ocular del microscopio. Esta reglilla posee una escala que contiene 100 rayas sin unidades (Fig. 6). Por lo tanto, previo a medir una clula hay que calibrar la reglilla usando un cuadro de calibracin, como el que se muestra a continuacin a modo de ejemplo: Objetivo 4X 10X 40X Distancia en Ocular 0 a 80 rayas 0 a 100 rayas 0 a 80 rayas Distancia en Patrn conocido 1 mm 0,5 mm 0,1 mm Distancia entre 2 rayas 12,5 m 5 m 1,25 m

La calibracin se realiza usando un portaobjeto especial como patrn, que posee una lmina de vidrio en la cual existe grabada una lnea graduada de 1 mm de largo.

Fig. 6: Reglilla en forma de cruz, situada en el ocular.

Fig. 7: Diagrama de la reglilla situada en el ocular calibrada en el objetivo 4X. Determine el tamao celular promedio de un glbulo rojo y de un glbulo blanco en un frotis sanguneo permanente, midiendo 3 clulas de cada tipo para establecer un promedio y su desviacin estndar en cada caso.

C.- Determinacin del nmero de clulas 1) Su ayudante le entregar una suspensin de eritrocitos cuyo nmero de clulas por l o por ml tendr que ser determinado por Ud. 2) Saque una alcuota de 5 l de la suspensin de clulas y llvelos a 1000 l con suero o PBS (ver preparacin ms abajo). Agite bien para obtener una mezcla homognea. 3) Para determinar el nmero de clulas en una suspensin se usa una cmara de NEUBAUER. Para el recuento de clulas preparadas usaremos los 5 cuadrados marcados en rojo en la Fig. 4. La cmara se carga colocando primero un cubreobjetos sobre el reticulado y posteriormente depositando una gota en la cmara, adyacente al cubreobjetos para que entre por capilaridad. Espere unos 30 segundos para permitir que las clulas sedimenten. Enfoque el reticulado de la cmara, primero con el lente de menor aumento del microscopio y luego cambie al objetivo 10X, lo cual permite ver slo el cuadrado central de 1 mm x 1 mm en todo el campo (y los 25 cuadrados mayores que lo componen). Cuente las clulas que ve en cada uno de los cuadrados sealados anteriormente. Tenga presente que si demora mucho en el conteo, el calor de la fuente de luz comenzar a secar el lquido dentro de la cmara, afectando el resultado. 4) Saque el promedio de la cantidad de clulas por microlitro segn la frmula mostrada anteriormente. Si desea calcular el nmero de clulas por ml, simplemente multiplique la cantidad obtenida por 1000 (1 ml = 1000 l). Preparacin de 1 litro de PBS: Buffer de uso frecuente. PBS Buffer de fosfatos pH 7.4 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8 g (137 mM) NaCl 0.2 g (2.7 mM) KCl 1.44 g (10 mM) NaHPO 0.24 g (2mM) KH2PO 800 ml agua bi-destilada Ajustar pH a 7.4 con HCl Aforar a 1 litro.

Nota: Conservar a 4-8 C. Es estable por unos 3 o ms meses.

BIBLIOGRAFA: Buffer PBS. Labtox: Protocolos y tcnicas de laboratorio. (http://labtox02.blogspot.com/2006/02/pbs-buffer.html) Introduccin a la biologa celular 2a. ed. Alberts, Bruce, 1938. 2006. Biologa celular y molecular 4a. ed. Lodish, Harvey. 2002. Biologa celular y molecular de De Robertis. De Robertis, Eduardo M. F; 2000.

Materiales de laboratorio. Microscopa II Materiales por grupo (3 alumnos por grupo) Microscopios. Porta objetos. Cubreobjetos. 1 cmara Neubauer con cubre objeto. 1 crculo negro para generar campo oscuro. Un frotis de sangre.

Materiales por Laboratorio. 1 microscopio con reglilla. 2 tubos con 9 ml de PBS estril. 3 tubos de ensayo estriles. 1 micropipeta 1000 l. 1 caja con puntas azules estriles. 1 vaso pp. con alcohol para desechos. 1 jeringa de 3 o 5 ml. 1 tubo con anticoagulante (EDTA) de 3 o 5 ml.