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UNIVERSIDAD NACIONAL SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO FACULTAD DE CIENCIAS FSICAS, QUMICAS Y MATEMTICAS CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA

Y BIOQUMICA

Practica de Bioqumica II
Curso: Docente: Alumnos: Tema: Hora: Bioqumica Qco. Ciro Tomaylla Torres Caviedes Judith Lindsay Laboratorio 9 Jueves 7-9pm

Cusco-Per

AISLAMIENTO DEL RNA DE LEVADURA Y CUANTIFICACION COLORIMETRICA


I. II. OBJETIVOS: Cuantificar ARN mediante el azcar que conforman los acidos ribonucleicos. Aprender a extraer el ARN MARCO TEORICO: ACIDOS NUCLEICOS Los cidos nucleicos fueron descubiertos en 1868 por Friedrich Miescher, que los llam nuclena ya que los aisl del ncleo celular.Ms tarde, se comprob que las clulas procariotas, que carecen de ncleo, tambin contenan cidos nucleicos. El papel del ARN en la sntesis de protenas fue sospechado en 1939. Severo Ochoa gan el Premio Nobel de Medicina en 1959 tras descubrir cmo se sintetizaba el ARN. En 1965 Robert W. Holley hall la secuencia de 77 nucletidos de un ARN de transferencia de una levadura, con lo que obtuvo el Premio Nobel de Medicina en 1968. En 1967, Carl Woese comprob las propiedades catalticas de algunos ARN y sugiri que las primeras formas de vida usaron ARN como portador de la informacin gentica tanto como catalizador de sus reacciones metablicas (hiptesis del mundo de ARN). En 1976, Walter Fiers y sus colaboradores determinaron la secuencia completa del ARN del genoma de un virus ARN (bacterifago MS2). En 1990 se descubri en Petunia que genes introducidos pueden silenciar genes similares de la misma planta, lo que condujo al descubrimiento del ARN interferente. Aproximadamente al mismo tiempo se hallaron los micro ARN, pequeas molculas de 22 nucletidos que tenan algn papel en el desarrollo de Caenorhabditis elegans. El descubrimiento de ARN que regulan la expresin gnica ha permitido el desarrollo de medicamentos hechos de ARN, como los ARN pequeos de interferencia que silencian genes. El ARN o RNA es un cido nuclico formado por una cadena de ribonucletidos. Est presente tanto en las clulas procariotas como en las eucariotas, y es el nico material gentico de ciertos virus (virus ARN). El ARN celular es lineal y de hebra sencilla, pero en el genoma de algunos virus es de doble hebra. En los organismos celulares desempea diversas funciones. Es la molcula que dirige las etapas intermedias de la sntesis proteica; el ADN no puede actuar solo, y se vale del ARN para transferir esta informacin vital durante la sntesis de protenas (produccin de las protenas que necesita la clula para sus actividades y su desarrollo). Varios tipos de ARN regulan la expresin gnica, mientras que otros tienen actividad cataltica. El ARN es, pues, mucho ms verstil que el ADN.

III.

MATERIALES Y REACTIVOS: MATERIALES Tubos de ensayo Bao isotrmico Espectrofotmetro Micropipeta y Pipetas Baguetas Gradilla Vasos de precipitados Balanza analtica Termmetro Congeladora pa el rotor Centrifuga sorvall WX ultra 80 REACTIVOS Solucin de fenol (900g/l) Acetato de potasio (200g/l, pH=5) Etanol absoluto ter etlico MUESTRAS Levadura seca

IV.

PROCEDIMIENTOS: Se realizo mediante dos pasos: A. Extraccin del ARN Se preparo 3.5g de levadura en 15ml de agua a 37C por 15 minutos, se disolvi en 20ml de fenol concentrado agitando por 30 min a temperatura ambiente, se centrifugo se supone a 3000g pero se malogro la centrifuga con el fin de romper la emulsion, se saco para remover la capa acuosa y se centrifugo otra vez se supone a 10000g por 5 minutos pero lo hicimos a 2500rpm por 30 minutos refrigerando de cuando en cuando los tubos para separar la protena desnaturalizada, separamos el sobrenadante en este se puso acetato de potasio 20g/l y etanol 2ml para precipitar el ARN luego repos en hielo por 1 hora, se centrifugo para recoger el precipitado en frio a 2000g pero fue realmente a 2500rpm por 30 minutos, llevo a bao maria y se lavo el precipitado con agua-etanol(1:3); luego solo con etanol y finalmente se lavo con ter para sacar el ARN puro y evaporar rpidamente. Segn bibliografa el peso de ARN en levaduras debe ser 4% del peso seco. B. Determinacin colorimtrica del ARN mediante ribosa Esta es una reaccin general para las pentosas y se debe a la formacin de furfural cuando se calienta la pentosa con HCl concentrado. El orcinol reacciona con furfural en presencia de cloruro frrico como catalizador, dando una coloracin verde. Solamente los nucletidos de purina dan una reaccin considerable. Descripcin del mtodo: Esta tcnica denominado mtodo de Bial (9,10) (Orcinol) se realiza en condiciones de temperatura y tiempo estables, utilizando una mezcla de cido clorhdrico, orcinol y FeCl3 El cido rompe los enlaces glicosdicos y deshidrata los monosacridos para la condensacin con el orcinol, as como para la oxidacin de los grupos cetonas libres, a una temperatura de 100 C y un tiempo de 20 min. Esto provoca la formacin de un complejo verde estable que absorbe a una longitud de onda de 670 nm. El mtodo utilizado en el ensayo se valid. Metodo:

Mezclamos 2ml de la solucin de acido nucleico con 3 ml de reactivo de orcinol. Calentamol un bao de agua hirviendo por 20 minutos, enfriamos y llevamos al espectrmetro a 660nm, el blanco fue orcinol. Se disolvi una cantidad de ARN en agua caliente:
Blanco Estandar 1 Estandar 2 Estandar 3 Estandar 4 Problema 6

Agua d ml 1.80 1.75 1.70 1.65 1.60 1.30 Estndar ribosa ml 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Sol.ARN ml 0.50 FeCl3, HCl(c) ml 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 Rvo. Orcinol ml 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 Absorbancia 660nm 0.0957 0.1209 1347 0.1509 0.1673 Concentracion mg 0.013 0.025 0.037 0.050 0.060 Se homogenizo y calent en bao de agua hirviendo por 30 minutos, hasta observar la aparicin de un color, se dejo enfriar y se llevo al espectrofotmetro. V. CUESTIONARIO: 1) Explicar la importancia del RNA en el organismo humano. Es importante decir que el ARN a diferencia del ADN se distribuye por toda la celula, esta en el citoplasma como ARN soluble y ARN ribosomal, 10% aprox. Esta en el nucleo y poco en mitocondrias. Son importantes pues cumplen diferentes funciones en el organismo, mencionare algunas: mARN: Interviene en la primera etapa de la sntesis de protenas transcripcion del ADN al mARN. El mARN va al citoplasma y es precisamente all donde, con la participacin de rebosomas y tARN, las 4 bases nucleotidicas se convierten en el cdigo de 20 tripletas que llevan la clave de la ordenacin de aminocidos en las protenas. Es metablicamente inestable es su caracterstica nica del mARN ARN ribosomal (rARN): Unido a protenas de carcter bsico, forma los ribosomas. Los ribosomas son partculas microscpicas de la celula, visibles nicamente bajo microscopio electrnico, con una composicin bastante uniforme de aproximadamente 60% de protena y 40% de ARN. Varios ribosomas pueden unirse a una cinta de mARN para formar un POLISOMA que se asemeja bastante a las cuentas de un collar de perlas. Hay dos tipos de ribosomas, el que se encuentra en clulas procariotas y en el interior de mitocondrias y cloroplastos, y el que se encuentra en el hialoplasma o en el retculo endoplsmico de clulas eucariotas. ARN de transferencia (tARN): existe un tARN especifico para cada aminocido activado al lugar de sntesis de protena. Tienen un peso molecular mas bajo que todas y gracias a esto la secuencia de nucletidos ha sido determinada para muchos de ellos. El ARN transferente o soluble es un ARN no lineal. En l se pueden observar tramos de doble hlice intracatenaria, es decir, entre las bases que son complementarias, dentro de la misma cadena. Esta estructura se estabiliza mediante puentes de Hidrgeno.

Adems de los nucletidos de Adenina, Guanina, Citosina y Uracilo, el ARN transferente presenta otros nucletidos con bases modificadas. Estos nucletidos no pueden emparejarse, y su existencia genera puntos de apertura en la hlice, produciendo bucles. En el ARNt se distinguen tres tramos (brazos). En uno de ellos 1, aparece una secuencia de tres nucletidos, denominada anticodon. Esta secuencia es complementaria con una secuencia del ARNm, el codon. En el brazo opuesto 2, en el extremo 3' de la cadena, se une un aminocido especfico predeterminado por la secuencia de anticodon. La funcin del ARNt consiste en llevar un aminocido especfico al ribosoma. En l se une a la secuencia complementaria del ARNm, mediante el anticodon. A la vez, transfiere el aminocido correspondiente a la secuencia de aminocidos que est formndose en el ribosoma. ARN heteronuclear (ARNhn): El ARN heteronuclear, o heterogneo nuclear, agrupa a todos los tipos de ARN que acaban de ser transcritos (pre-ARN). Son molculas de diversos tamaos. Este ARN se encuentra en el ncleo de las clulas eucariotas. En clulas procariotas no aparece. Su funcin consiste en ser el precursor de los distintos tipos de ARN. 2) Explique la funcin que cumplen los reactivos: fenol, acetato de potasio, etanol absoluto y ter etlico en el aislamiento de RNA. Fenol: La solucin concentrada de fenol rompe los enlaces de hidrogeno en las macromolculas, causando desnaturalizacin de protenas. La suspensin turbia se centrifuga y aparecen dos fases: la inferior de fenol contiene ADN y la superior acuosa contiene carbohidratos y ARN. La protena desnaturalizada esta presente en ambas fases y puede removerse por centrifugacin. Acetato de potasio: Enlaza al ARN para hacer posible el precipitado. Etanol: Precipita al ARN. No contiene ADN pero esta contaminado con polisacridos. ter etlico: ARN mas soluble en este compuesto, se usa con fines practicos lavar y secar rpidamente. 3) Cuales son las posibles reacciones?

4) Cmo se obtuvo la cantidad de RNA en la muestra de levadura? Se preparo 3.5g de levadura en 15ml de agua a 37C por 15 minutos, se disolvi en 20ml de fenol concentrado agitando por 30 min a temperatura ambiente, se centrifugo se supone a 3000g pero se malogro la centrifuga con el fin de romper la emulsion, se saco para remover la capa acuosa y se centrifugo otra vez se supone a 10000g por 5 minutos pero lo hicimos a 2500rpm por 30 minutos refrigerando de cuando en cuando los tubos para separar la protena desnaturalizada, separamos el sobrenadante en este se puso acetato de potasio 20g/l y etanol 2ml para precipitar el ARN luego repos en hielo por 1 hora, se centrifugo para recoger el precipitado en frio a 2000g pero fue realmente a 2500rpm por 30 minutos, llevo a bao maria y se lavo el precipitado con agua-etanol(1:3); luego solo con etanol y finalmente se lavo con ter para sacar el ARN puro y evaporar rpidamente. Segn bibliografa el peso de ARN en levaduras debe ser 4% del peso seco. VI. CONCLUCIONES: La determinacin de ribosa es una tcnica colorimtrica que cuantifica pentosas y se emplea con el objetivo de conocer el contenido exacto de la misma en una muestra de producto purificado. Adems es empleada como control final segn la OMS en las vacunas conjugadas de Haemophilus influenzae. VII. BIBLIOGRAFIA: Validacin de una tcnica colorimtrica para la determinacin de carbohidratos Carmen Soto, Maribel Cuello, Yusim Alfonso, Osmir Cabrera y Gustavo Sierra. Instituto Finlay. Centro de Investigacin-Produccin de Vacunas y Sueros. Ciudad de La Habana, Cuba. Adams, R R P, Bunder, RH, Campbell, AM y Smellie, RN, Davidsons The Bioquemistry of the Nucleic Acids, 8va edicin, Londres. Grossman, L y Moldave, K. methods in enzymology, vol.12, nucleic Acids, Nueva York. Academic Press 1968. Biologa 2 ed. Bruo.