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Legislao

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Resoluo - RE n 899, de 29 de maio de 2003

D.O.U. 02/06/2003

O Adjunto da Diretoria Colegiada da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, no uso da atribuio, que lhe confere a Portaria n. 238, de 31 de maro de 2003, considerando o disposto no art.111, inciso II, alnea a 3 do Regimento Interno aprovado pela Portaria n 593, de 25 de agosto de 2000, republicada no DOU de 22 de dezembro de 2000, considerando que a matria foi submetida apreciao da Diretoria Colegiada, que a aprovou em reunio realizada em 6 de maro de 2003, resolve: Art. 1 Determinar a publicao do "Guia para validao de mtodos analticos e bioanalticos" anexo Art. 2 Fica revogada a Resoluo RE no 475, de 19 de maro de 2002. Art. 3 Esta Resoluo entra em vigor na data de sua publicao. DAVI RUMEL

ANEXO GUIA PARA VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS E BIOANALTICOS MTODOS ANALTICOS 1. Consideraes gerais 1.1. As informaes contidas nesse Anexo apresentam as caractersticas a serem consideradas durante a validao de procedimentos analticos. O objetivo de uma validao demonstrar que o mtodo apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinao qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de frmacos e outras substncias em produtos farmacuticos. 1.2. Essas informaes aplicam-se a: 1.2.1. tcnicas analticas que faam uso de mtodos de cromatografia gasosa (CG) ou cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE); 1.2.2. mtodos no-cromatogrficos, desde que estes ofeream uma seletividade aceitvel (por ex. titulometria, espectrofotometria UV-VIS);

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1.2.3. testes imunolgicos ou microbiolgicos, desde que observado o grau de variabilidade usualmente associado a estas tcnicas. 1.3. A validao deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o mtodo atenda s exigncias das aplicaes analticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar especificidade, linearidade, intervalo, preciso, sensibilidade, limite de quantificao, exatido, adequados anlise. 1.4. Deve-se utilizar substncias de referncia oficializadas pela Farmacopia Brasileira ou, na ausncia destas, por outros cdigos autorizados pela legislao vigente. No caso da inexistncia dessas substncias, ser admitido o uso de padres de trabalho, desde que a identidade e o teor sejam devidamente comprovados. 1.5. Para efeito desse guia, considera-se corrida analtica as medies sucessivas de um mesmo analito, efetuadas nas mesmas condies: mtodo, analista, instrumentao, local, condies de utilizao e em intervalo de tempo curto entre as medies. 1.6. No caso de metodologia analtica descrita em farmacopias ou formulrios oficiais, devidamente reconhecidos pela ANVISA, a metodologia ser considerada validada. 1.7. No caso de metodologia analtica no descrita em farmacopias ou formulrios oficiais, devidamente reconhecidos pela ANVISA, a metodologia ser considerada validada, desde que sejam avaliados os parmetros relacionados a seguir, conforme especificado nas Tabelas 1 e 2. 1.7.1. Especificidade e Seletividade 1.7.2. Linearidade 1.7.3. Intervalo 1.7.4. Preciso 1.7.5. Limite de deteco (sensibilidade) 1.7.6. Limite de quantificao 1.7.7. Exatido 1.7.8. Robustez 1.8. No caso da transferncia de metodologias da matriz para suas subsidirias no Brasil e/ou das empresas nacionais para os centro de estudos de equivalncia farmacutica, a metodologia ser considerada validada, desde que sejam avaliados os parmetros de preciso, especificidade e linearidade. Cpia de toda a documentao original da validao da metodologia dever ser anexada, como prova de que a metodologia foi originalmente validada e dever conter, no mnimo, todos os parmetros relacionados no item 1.7. 1.9. Para a garantia da qualidade analtica dos resultados, todos os equipamentos utilizados na validao devem estar devidamente calibrados e os analistas devem ser qualificados e adequadamente treinados. 1.10. Os testes so classificados em 4 categorias, conforme a Tabela 1. Tabela 1. Classificao dos testes, segundo sua finalidade: Categoria Finalidade do teste Testes quantitativos para a determinao do princpio ativo I em produtos farmacuticos ou matriasprimas Testes quantitativos ou ensaio limite para a determinao de impurezas e produtos de degradao em produtos II farmacuticos e matrias-primas Testes de performance (por exemplo: dissoluo, liberao III do ativo)

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IV

Testes de identificao

1.11. Para cada categoria ser exigido um conjunto de testes, relacionados na Tabela 2. Tabela 2. Ensaios necessrios para a validao do mtodo analtico, segundo sua finalidade: Categoria II Categoria Categoria Categoria Ensaio III IV I Quantitativo limite Sim * Sim Especificidade Sim Sim No * No Linearidade Sim Sim * * No Intervalo Sim Sim No Sim No Sim Repetibilidade Sim Preciso No ** No Intermediria ** ** Sim * No Limite de deteco No No Limite de No * No No Sim quantificao * * No Exatido Sim Sim Sim Sim No No Robustez Sim Parmetro * pode ser necessrio, dependendo da natureza do teste especfico. ** se houver comprovao da reprodutibilidade no necessria a comprovao da Preciso Intermediria. 1.12. metodologia analtica dever ser revalidada nas seguintes circunstncias: 1.12.1. mudanas na sntese da substncia ativa; 1.12.2. mudanas na composio do produto acabado; 1.12.3. mudanas no procedimento analtico. Determinadas outras mudanas podem requerer validao tambm, dependendo da natureza das mudanas. 2. Metodologia 2.1. Especificidade e Seletividade a capacidade que o mtodo possui de medir exatamente um composto em presena de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradao e componentes da matriz. 2.1.1. Para anlise qualitativa (teste de identificao) necessrio demonstrar a capacidade de seleo do mtodo entre compostos com estruturas relacionadas que podem estar presentes. Isto deve ser confirmado pela obteno de resultados positivos (preferivelmente em relao ao material de referncia conhecido) em amostras contendo o frmaco, comparativamente com resultados negativos obtidos com amostras que no contm o frmaco, mas compostos estruturalmente semelhantes. 2.1.2. Para anlise quantitativa (teor) e anlise de impurezas, a especificidade pode ser determinada pela comparao dos resultados obtidos de amostras (frmaco ou medicamento) contaminadas com quantidades apropriadas de impurezas ou excipientes e amostras no contaminadas, para demonstrar que o resultado do teste no afetado por esses materiais. Quando a impureza ou o padro do produto de degradao no estiverem disponveis, pode-se comparar os resultados do teste das amostras contendo impurezas ou produtos de degradao com os resultados de um segundo procedimento bem caracterizado (por exemplo metodologia farmacopica ou outro procedimento validado). Estas comparaes devem incluir amostras armazenadas sob condies de estresse (por ex. luz, calor umidade, hidrlise cida/bsica, oxidao). 2.1.3. Em mtodos cromatogrficos, deve-se tomar as precaues necessrias para garantir a pureza dos picos cromatogrficos. A utilizao de testes de pureza de pico (por exemplo, com auxilio de detector de arranjo de fotodiodos ou espectrometria de massas) so interessantes para demonstrar que o pico cromatogrfico atribudo

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a um s componente. 2.2. Linearidade a capacidade de uma metodologia analtica de demonstrar que os resultados obtidos so diretamente proporcionais concentrao do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado. 2.2.1. Recomenda-se que a linearidade seja determinada pela anlise de, no mnimo, 5 concentraes diferentes. Estas concentraes devem seguir os intervalos da Tabela 3. 2.2.2. Se houver relao linear aparente aps exame visual do grfico, os resultados dos testes devero ser tratados por mtodos estatsticos apropriados para determinao do coeficiente de correlao, interseco com o eixo Y, coeficiente angular, soma residual dos quadrados mnimos da regresso linear e desvio padro relativo. Se no houver relao linear, realizar transformao matemtica. 2.2.3. O critrio mnimo aceitvel do coeficiente de correlao (r) deve ser = 0,99. 2.2.4. Deve-se apresentar as curvas obtidas (experimental e a resultante do tratamento matemtico). 2.3. Intervalo O intervalo especificado a faixa entre os limites de quantificao superior e inferior de um mtodo analtico. Normalmente derivado do estudo de linearidade e depende da aplicao pretendida do mtodo (Tabela 3). estabelecido pela confirmao de que o mtodo apresenta exatido, preciso e linearidade adequados quando aplicados a amostras contendo quantidades de substncias dentro do intervalo especificado. Tabela 3. Limites porcentuais do teor do analito que devem estar contidos no intervalo de linearidade para alguns mtodos analiticos. Ensaio Alcance Determinao quantitativa do De 80% a 120% da concentrao analito em matrias-primas ou em terica do teste formas farmacuticas Do nvel de impureza esperado at 120% do limite mximo especificado. Quando apresentarem importncia toxicolgica ou efeitos farmacolgicos Determinao de impurezas inesperados, os limites de quantificao e deteco devem ser adequados s quantidades de impurezas a serem controladas De 70% a 130% da concentrao Uniformidade de contedo terica do teste De 20% sobre o valor especificado para o intervalo. Caso a especificao para a dissoluo envolva mais que um tempo, Ensaio de dissoluo o alcance do mtodo deve incluir 20% sobre o menor valor e +20% sobre o maior valor.

2.4. Preciso A preciso a avaliao da proximidade dos resultados obtidos em uma srie de medidas de uma amostragem mltipla de uma mesma amostra. Esta considerada em trs nveis. 2.4.1. Repetibilidade (preciso intra-corrida): concordncia entre os resultados dentro de um curto perodo de tempo com o mesmo analista e mesma instrumentao.

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A repetibilidade do mtodo verificada por, no mnimo, 9 (nove) determinaes, contemplando o intervalo linear do mtodo, ou seja, 3 (trs) concentraes, baixa, mdia e alta, com 3 (trs) rplicas cada ou mnimo de 6 determinaes a 100% da concentrao do teste; 2.4.2. Preciso intermediria (preciso inter-corridas): concordncia entre os resultados do mesmo laboratrio, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes. Para a determinao da preciso intermediria recomenda-se um mnimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes. 2.4.3. Reprodutibilidade (preciso inter-laboratorial): concordncia entre os resultados obtidos em laboratrios diferentes como em estudos colaborativos, geralmente aplicados padronizao de metodologia analtica, por exemplo, para incluso de metodologia em farmacopias. Estes dados no precisam ser apresentados para a concesso de registro. A preciso de um mtodo analtico pode ser expressa como o desvio padro ou desvio padro relativo (coeficiente de variao) de uma srie de medidas. A preciso pode ser expressa como desvio padro relativo (DPR) ou coeficiente de variao (CV%), segundo a frmula,

em que, DP o desvio padro e CMD, a concentrao mdia determinada. O valor mximo aceitvel deve ser definido de acordo com a metodologia empregada, a concentrao do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do mtodo, no se admitindo valores superiores a 5%. 2.5. Limite de Deteco Limite de deteco a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porm no necessariamente quantificado, sob as condies experimentais estabelecidas. 2.5.1. O limite de deteco estabelecido por meio da anlise de solues de concentraes conhecidas e decrescentes do analito, at o menor nvel detectvel; 2.5.2. No caso de mtodos no instrumentais (CCD, titulao, comparao de cor), esta determinao pode ser feita visualmente, onde o limite de deteco o menor valor de concentrao capaz de produzir o efeito esperado (mudana de cor, turvao, etc). 2.5.3. No caso de mtodos instrumentais (CLAE, CG, absoro atmica), a estimativa do limite de deteco pode ser feita com base na relao de 3 vezes o rudo da linha de base. Pode ser determinado pela equao,

em que: DPa o desvio padro do intercepto com o eixo do Y de, no mnimo, 3 curvas de calibrao construdas contendo concentraes do frmaco prximas ao suposto limite de quantificao. Este desvio padro pode ainda ser obtido a partir da curva de calibrao proveniente da anlise de um nmero apropriado de amostras do branco; IC a inclinao da curva de calibrao. 2.6. Limite de Quantificao

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a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com preciso e exatido aceitveis sob as condies experimentais estabelecidas. O limite de quantificao um parmetro determinado, principalmente, para ensaios quantitativos de impurezas, produtos de degradao em frmacos e produtos de degradao em formas farmacuticas e expresso como concentrao do analito (por exemplo, porcentagem p/p ou p/V, partes por milho) na amostra. 2.6.1. O limite de quantificao estabelecido por meio da anlise de solues contendo concentraes decrescentes do frmaco at o menor nvel determinvel com preciso e exatido aceitveis. Pode ser expresso pela equao,

em que: DPa o desvio padro do intercepto com o eixo do Y de, no mnimo, 3 curvas de calibrao construdas contendo concentraes do frmaco prximas ao suposto limite de quantificao. Este desvio padro pode ainda ser obtido a partir da curva de calibrao proveniente da anlise de um apropriado nmero de amostras do branco; IC a inclinao da curva de calibrao. 2.6.2. Tambm pode ser determinado por meio do rudo. Neste caso, determina-se o rudo da linha de base e considera-se como limite de quantificao aquela concentrao que produza relao sinal-rudo superior a 10:1. 2.7. Exatido A exatido de um mtodo analtico a proximidade dos resultados obtidos pelo mtodo em estudo em relao ao valor verdadeiro. Vrias metodologias para a determinao da exatido esto disponveis: 2.7.1. Frmaco 2.7.1.1. aplicando-se a metodologia analtica proposta na anlise de uma substncia de pureza conhecida (padro de referncia); 2.7.1.2. comparao dos resultados obtidos com aqueles resultantes de uma segunda metodologia bem caracterizada, cuja exatido tenha sido estabelecida; 2.7.2. Forma Farmacutica 2.7.2.1. na anlise de uma amostra, na qual quantidade conhecida de frmaco foi adicionada a uma mistura dos componentes do medicamento (placebo contaminado); 2.7.2.2. nos casos em que amostras de todos os componentes do medicamento esto indisponveis, aceita-se a anlise pelo mtodo de adio de padro, no qual adiciona-se quantidades conhecidas do analito (padro de referncia) ao medicamento. 2.7.3. Impurezas 2.7.3.1. anlise pelo mtodo de adio de padro, no qual adiciona-se quantidades conhecidas de impurezas e/ou produtos de degradao ao medicamento ou ao frmaco; 2.7.3.2. no caso da indisponibilidade de amostras de certas impurezas e/ou produtos de degradao, aceita-se a comparao dos resultados obtidos com um segundo mtodo bem caracterizado (metodologia farmacopica ou outro procedimento analtico validado). A exatido calculada como porcentagem de recuperao da quantidade conhecida do analito adicionado

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amostra, ou como a diferena porcentual entre as mdias e o valor verdadeiro aceito, acrescida dos intervalos de confiana. A exatido do mtodo deve ser determinada aps o estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de, no mnimo, 9 (nove) determinaes contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja, 3 (trs) concentraes, baixa, mdia e alta, com 3 (trs) rplicas cada. A exatido expressa pela relao entre a concentrao mdia determinada experimentalmente e a concentrao terica correspondente:

2.8. Robustez A robustez de um mtodo analtico a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variaes dos parmetros analticos. Indica sua confiana durante o uso normal. Durante o desenvolvimento da metodologia, deve-se considerar a avaliao da robustez. Constatando-se a susceptibilidade do mtodo variaes nas condies analticas, estas devero ser controladas e precaues devem ser includas no procedimento. A Tabela 4 relaciona os principais parmetros que podem resultar em variao na resposta do mtodo. Tabela 4. Fatores que devem ser considerados na determinao da robustez do mtodo analtico.

Estabilidade das solues analticas Tempo de extrao Variao do pH da soluo Espectrofotometria Temperatura Diferentes fabricantes de solventes Variao do pH da fase mvel Variao na composio da fase mvel Cromatografia Lquida Diferentes lotes ou fabricantes de colunas Temperatura Fluxo da fase mvel Diferentes lotes ou fabricantes de colunas Cromatografia Gasosa Temperatura Velocidade do gs de arraste Preparo das Amostras MTODOS BIOANALTICOS 1. Definies Amostra termo geral que abrange: controles, brancos, amostras processadas e desconhecidas. Amostra branco amostra de uma matriz biolgica na qual nenhum analito foi adicionado, utilizada para avaliar a especificidade do mtodo bioanaltico. Amostra de Controle de Qualidade (CQ) amostra de matriz biolgica adicionada do analito, usada para monitorar o desempenho de um mtodo bioanaltico e para avaliar a integridade e validade dos resultados das amostras desconhecidas analisadas numa corrida individual. Amostra processada extrato final (anterior anlise instrumental) de uma amostra que foi submetida a vrias manipulaes (ex.: diluio, extrao, concentrao). Amostra desconhecida amostra biolgica que objeto de anlise.

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Analito composto qumico especfico a ser mensurado, podendo ser o frmaco no-transformado, biomolcula ou seu derivado, metablito ou produto de degradao em uma matriz biolgica. Corrida analtica (ou lote) conjunto completo de amostras em estudo, com um nmero apropriado de padres e CQs para sua validao e que tem sua anlise completa nas mesmas condies. Especificidade habilidade do mtodo bioanaltico de medir e diferenciar o analito de componentes que possam estar presentes na amostra, tais como metablitos, impurezas, compostos de degradao ou componentes da matriz. Estabilidade parmetro que visa determinar se um analito mantm-se quimicamente inalterado numa dada matriz sob condies especficas, em determinados intervalos de tempo. Exatido representa o grau de concordncia entre os resultados individuais encontrados e um valor aceito como referncia. Faixa de quantificao corresponde a uma faixa de concentrao, incluindo o LSQ e o LIQ, que pode ser confivel e reprodutivelmente quantificada com exatido e preciso, por meio da relao concentrao-resposta. Limite de Deteco (LD) menor concentrao de um analito que o procedimento bioanaltico consegue diferenciar confiavelmente do rudo de fundo. Limite Inferior de Quantificao (LIQ) menor quantidade de um analito numa amostra que pode ser determinada quantitativamente com preciso e exatido aceitveis. Limite Superior de Quantificao (LSQ) maior quantidade de um analito numa amostra que pode ser determinada quantitativamente com preciso e exatido. Linearidade corresponde capacidade do mtodo de fornecer resultados diretamente proporcionais concentrao da substncia em exame (analito). Matriz biolgica material distinto de origem biolgica, que pode ser amostrado e processado de modo reprodutvel. Mtodo descrio compreensvel de todos os procedimentos usados em anlises de amostras. Padro de calibrao matriz biolgica a qual foi adicionada uma quantidade conhecida de analito. Os padres de calibrao so usados para construir a curva de calibrao, com a qual so determinadas as concentraes do analito nos CQs e nas amostras desconhecidas em estudo. Padro Interno (PI) composto, geralmente com caractersticas estruturais similares ao analito, adicionado aos padres de calibrao e amostras em concentraes conhecidas e constantes, para facilitar a determinao do analito. Preciso representa o grau de repetibilidade entre os resultados de anlises individuais, quando o procedimento aplicado diversas vezes numa mesma amostra homognea, em idnticas condies de ensaio. Recuperao eficincia de extrao de um mtodo analtico, expressa como a porcentagem da quantidade conhecida de um analito, obtida da comparao dos resultados analticos de amostras branco acrescidas de padro e submetidas ao processo de extrao, com os resultados analticos de solues padro no extradas. Reprodutibilidade preciso entre dois laboratrios. Tambm representa a preciso do mtodo sob as mesmas condies operacionais, num curto perodo de tempo. Validao parcial modificao no mtodo bioanaltico validado que no requer a necessidade de uma revalidao total. Validao total estabelecimento de todos os parmetros de validao de um mtodo bioanaltico, aplicveis anlise das amostras.

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2. Consideraes gerais 2.1. As informaes contidas neste guia aplicam-se a mtodos bioanalticos, tais como cromatografia gasosa (CG), cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) e estas combinadas com espectrometria de massa (MS) tais como LC-MS, LC-MS-MS, CG-MS, CG-MS-MS, utilizados na determinao quantitativa de frmacos e/ou metablitos em matrizes biolgicas, tais como sangue, soro, plasma ou urina. Tambm se aplica a outras tcnicas analticas, tais como mtodos microbiolgicos e imunolgicos, ou para outras matrizes biolgicas, embora, nestes casos, pode-se observar um alto grau de variabilidade. 2.2. A validao deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o mtodo atenda s exigncias das aplicaes analticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar preciso, exatido, linearidade, limite de deteco e limite de quantificao, especificidade, reprodutibilidade, estabilidade e recuperao adequadas anlise. Desse modo, importante ressaltar que todos os equipamentos e materiais devem apresentar-se devidamente calibrados e os analistas devem ser qualificados e adequadamente treinados. 2.3. Deve-se utilizar substncias qumicas de referncia e /ou padres biolgicos oficializados pela Farmacopia Brasileira ou por outros cdigos autorizados pela legislao vigente. Sero admitidos estudos utilizando padres secundrios desde que seja comprovada sua certificao, na ausncia de substncias qumicas de referncia e/ou padres biolgicos farmacopicos. 2.4. Para os estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalncia deve-se utilizar padro interno, sempre que mtodos cromatogrficos forem utilizados. Deve-se justificar a impossibilidade de sua utilizao. 2.5. Deve ser realizada validao total antes da implementao de um mtodo bioanaltico para a quantificao de um frmaco e/ou metablitos. 2.6. Devem ser realizadas validaes parciais quando ocorrerem modificaes no mtodo bioanaltico j validado. Os ensaios de validao parcial podem ser desde uma pequena determinao, como a determinao da exatido e preciso intra-ensaio, at prximo de uma validao total. As mudanas tpicas que podem requerer uma validao parcial incluem, entre outras: 2.6.1. transferncias de mtodos entre laboratrios e analistas; 2.6.2. mudanas na metodologia analtica, por exemplo, substituio do sistema de deteco; 2.6.3. mudana de anticoagulante na coleta das amostras; 2.6.4. mudana de matriz, por exemplo, de plasma para urina; 2.6.5. mudana no procedimento de preparao da amostra; 2.6.6. mudanas relevantes na faixa de concentrao; 2.6.7. mudanas de instrumentos e/ou softwares; 2.6.8. demonstrao de seletividade do analito na presena de medicaes concomitantes; 2.6.9. demonstrao de seletividade do analito na presena de metablitos especficos. 2.7. A avaliao da robustez deve ser considerada durante a fase de desenvolvimento do mtodo. Constatando-se suscetibilidade a variaes nas condies analticas, estas devero ser adequadamente controladas ou precaues devero ser includas no procedimento. Exemplos de variaes: 2.7.1. estabilidade das solues analticas. 2.7.2. tempo de extrao. Variaes tpicas em cromatografia lquida:

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2.7.3. influncia da variao de pH da fase mvel. 2.7.4. influncia da variao da composio da fase mvel. 2.7.5. diferentes colunas (diferentes lotes e/ou fabricantes). 2.7.6. temperatura. 2.7.7. velocidade de fluxo. Variaes tpicas em cromatografia gasosa: 2.7.8. diferentes colunas (diferentes lotes e/ou fabricantes); 2.7.9. temperatura; 2.7.10. velocidade de fluxo. 3. Validao pr estudo 3.1. Especificidade 3.1.1. Deve-se analisar amostras da matriz biolgica (sangue, plasma, soro, urina, ou outra) obtidas de seis indivduos, sendo quatro amostras normais, uma lipmica e uma hemolisada, sob condies controladas referentes ao tempo, alimentao e outros fatores importantes para o estudo. Cada amostra branco deve ser testada utilizando o procedimento e as condies cromatogrficas propostas. Os resultados devem ser comparados com aqueles obtidos com soluo aquosa do analito, em concentrao prxima ao LIQ. 3.1.2. Qualquer amostra branco que apresentar interferncia significativa no tempo de reteno do frmaco, metablito ou padro interno, deve ser rejeitada. Caso uma ou mais das amostras analisadas apresentarem tal interferncia, novas amostras de outros seis indivduos devem ser testadas. Caso uma ou mais das amostras deste grupo apresentarem interferncia significativa no tempo de reteno do frmaco, o mtodo deve ser alterado visando elimin-la. 3.1.3. Os interferentes podem ser componentes da matriz biolgica, metablitos, produtos de decomposio e medicamentos utilizados concomitantemente ao estudo. A interferncia da nicotina, cafena, produtos de venda isenta de prescrio e metablitos deve ser considerada sempre que necessrio. 3.1.4. Caso o mtodo seja destinado quantificao de mais de um frmaco, cada um deve ser injetado separadamente para determinar os tempos de reteno individuais e assegurar que impurezas de um frmaco no interfiram na anlise do outro. 3.1.5. A resposta de picos interferentes no tempo de reteno do frmaco deve ser inferior a 20% da resposta do LIQ. As respostas de picos interferentes no tempo de reteno do frmaco e do padro interno devem ser inferiores, respectivamente, a 20% e 5% da resposta na concentrao utilizada. 3.2. Curva de calibrao/linearidade 3.2.1. A curva de calibrao representa a relao entre a resposta do instrumento e a concentrao conhecida do analito. Deve-se gerar uma curva de calibrao para cada frmaco e corrida analtica, a qual ser usada para calcular a concentrao do frmaco nas amostras, utilizando-se a mesma matriz biolgica proposta para o estudo. A curva de calibrao deve incluir a anlise da amostra branco (matriz biolgica isenta de padro do frmaco e do padro interno), da amostra zero (matriz biolgica mais o padro interno) e de, no mnimo, 6 (seis) amostras contendo padro do frmaco e padro interno, contemplando o limite de variao esperado, do LIQ at 120% da concentrao mais alta que se pretende analisar. 3.2.2. Para a determinao da curva de calibrao, deve-se analisar amostras extradas da matriz apropriada, no mnimo 6 (seis) concentraes diferentes. Procedimentos alternativos devem ser justificados, como na obteno de uma correlao no-linear, em que um maior nmero de concentraes de padres sero necessrios.

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3.2.3. Os resultados devem ser analisados por mtodos estatsticos apropriados como, por exemplo, o clculo de regresso linear pelo mtodo dos mnimos quadrados. Deve-se apresentar as curvas obtidas (experimental e a resultante do tratamento matemtico), o coeficiente de correlao linear, o coeficiente angular e o intercepto da reta. 3.2.4. Critrios de aceitao da curva de calibrao: 3.2.4.1. desvio menor ou igual a 20% (vinte por cento) em relao a concentrao nominal para o LIQ; 3.2.4.2. desvio menor ou igual a 15 % (quinze por cento) em relao concentrao nominal para as outras concentraes da curva de calibrao; 3.2.4.3. no mnimo quatro de seis concentraes da curva de calibrao devem cumprir com os critrios anteriores, incluindo o LIQ e a maior concentrao da curva de calibrao; 3.2.4.4. o coeficiente de correlao linear deve ser igual ou superior a 0,98. 3.3. Preciso 3.3.1. A repetibilidade do mtodo verificada utilizando-se, no mnimo, 3 (trs) concentraes (baixa, mdia e alta), contemplando a faixa de variao do procedimento, realizando-se, no mnimo, 5 (cinco) determinaes por concentrao. 3.3.2. A preciso deve ser determinada em uma mesma corrida (preciso intra-corrida) e em corridas diferentes (preciso inter-corridas). 3.3.3. Pode ser expressa como desvio padro relativo (DPR) ou coeficiente de variao (CV%), no se admitindo valores superiores a 15%, exceto para o LIQ, para o qual se admite valores menores ou iguais a 20%, segundo a frmula:

onde, D P o desvio padro e C M D, a concentrao mdia determinada. 3.4. Exatido 3.4.1. A exatido do mtodo deve ser determinada utilizando-se, no mnimo, 3 (trs) concentraes (baixa, mdia e alta), contemplando a faixa de variao do procedimento, realizando-se, no mnimo, 5 (cinco) determinaes por concentrao. 3.4.2. A exatido deve ser determinada em uma mesma corrida analtica (exatido intra-corrida) e em corridas diferentes (exatido inter-corridas). 3.4.3. O desvio no deve exceder 15%, exceto para o limite de quantificao, para o qual se admite desvios menores ou iguais a 20%. 3.4.4. A exatido expressa pela relao entre a concentrao mdia determinada experimentalmente e a concentrao terica correspondente:

3.5. Limite inferior de quantificao (LIQ)

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3.5.1. Estabelecido por meio da anlise de matriz biolgica contendo concentraes decrescentes do frmaco at o menor nvel quantificvel com preciso e exatido aceitveis. 3.5.2. Pode-se, tambm, utilizar a razo de 5:1 entre o sinal e o rudo da linha de base, devendo-se especificar o mtodo utilizado para determinao do LIQ. 3.5.3. O LIQ deve ser, no mnimo, cinco vezes superior a qualquer interferncia da amostra branco no tempo de reteno do frmaco. 3.5.4. O pico de resposta do frmaco no LIQ deve ser identificvel e reprodutvel com preciso de 20% (vinte por cento) e exatido de 80 120 % (oitenta a cento e vinte por cento), atravs da anlise de, no mnimo, 5 (cinco) amostras de padres. 3.6. Limite de deteco (LD) Estabelecido por meio da anlise de solues de concentraes conhecidas e decrescentes do frmaco, at o menor nvel detectvel. Recomenda-se que o LD seja de 2 a 3 vezes superior ao rudo da linha de base. 3.7. Recuperao A recuperao mede a eficincia do procedimento de extrao de um mtodo analtico dentro de um limite de variao. Porcentagens de recuperao do analito e do padro interno prximos a 100% so desejveis, porm, admite-se valores menores, desde que a recuperao seja precisa e exata. 3.7.1. Este teste deve ser realizado comparando-se os resultados analticos de amostras extradas a partir de trs concentraes (baixa, mdia e alta), contemplando a faixa de linearidade do mtodo, com os resultados obtidos com solues padro no extradas, que representam 100% de recuperao. 3.7.2. O clculo da recuperao deve ser feito em funo da relao de rea do padro extrado e no extrado, tanto para o analito quanto para o padro interno separadamente. 3.8. Controle de qualidade (CQ) 3.8.1. CQ do limite inferior de quantificao (CQ-LIQ): mesma concentrao de LIQ. 3.8.2. CQ de baixa concentrao (CQB): menor ou igual 3 x LIQ. 3.8.3. CQ de mdia concentrao (CQM): aproximadamente a mdia entre CQB e CQA 3.8.4. CQ de alta concentrao (CQA): 75 a 90% da maior concentrao da curva de calibrao. 3.9. Estudo de estabilidade do frmaco em lquidos biolgicos: 3.9.1. Consideraes especficas relevantes Para a realizao do estudo de estabilidade devem ser observados os parmetros de exatido, preciso, linearidade, limite de deteco, limite de quantificao, especificidade, limite de variao e robustez, previamente validados. A estabilidade do frmaco em lquidos biolgicos depende de suas propriedades qumicas, da matriz biolgica e do material de acondicionamento utilizado. A estabilidade determinada para um tipo de matriz e de material de acondicionamento especfico no pode ser extrapolada para outros. As condies de realizao dos ensaios de estabilidade devem reproduzir as reais condies de manuseio e anlise das amostras. Deve ser avaliada a estabilidade do analito durante a coleta e manuseio da amostra, aps armazenagem de longa durao (congelamento) e curta durao ( temperatura ambiente), aps ciclos de congelamento e descongelamento e nas condies de anlise. Deve-se incluir tambm avaliao da estabilidade do analito nas solues-padro, preparadas com solvente apropriado em concentraes conhecidas.

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As determinaes de estabilidade devem utilizar um conjunto de amostras, preparadas a partir de uma soluo estoque recente do frmaco em anlise, adicionado matriz biolgica isenta de interferncia. 3.9.2. Estabilidade aps ciclos de congelamento e descongelamento Deve-se testar a estabilidade do frmaco aps trs ciclos de congelamento e descongelamento, utilizando-se, no mnimo, trs amostras das concentraes baixa e alta determinadas na validao do mtodo analtico, nas seguintes condies: as amostras devem ser congeladas temperatura indicada para o armazenamento e mantidas por 24 horas, sendo ento submetidas ao descongelamento temperatura ambiente. Quando completamente descongeladas, as amostras devem ser novamente congeladas temperatura indicada para o armazenamento, por 12 a 24 horas e, assim sucessivamente, at contemplar os trs ciclos, quantificando-se o frmaco nas amostras aps o terceiro ciclo. Os resultados devem ser comparados com aqueles obtidos da anlise das amostras recm-preparadas. 3.9.3. Estabilidade de curta durao Para verificao dessa estabilidade utilizam-se, no mnimo, trs amostras das concentraes baixa e alta determinadas na validao do mtodo analtico. Cada uma delas dever permanecer temperatura ambiente de 4 (quatro) a 24 (vinte e quatro) horas (baseado no tempo em que as amostras do estudo sero mantidas temperatura ambiente) e analisadas. Os resultados devem ser comparados com aqueles obtidos da anlise das amostras recm-preparadas. 3.9.4. Estabilidade de longa durao 3.9.4.1. O tempo de armazenamento para o estudo de estabilidade de longa durao deve exceder o intervalo de tempo compreendido entre a coleta da primeira amostra e a anlise da ltima, de acordo com o cronograma apresentado no protocolo de estudo de biodisponibilidade relativa/bioequivalncia. 3.9.4.2. A temperatura utilizada no ensaio deve reproduzir a recomendada para armazenamento das amostras, normalmente igual a -20 C. 3.9.4.3. Para verificao dessa estabilidade utilizam-se, no mnimo, trs amostras das concentraes baixa e alta determinadas na validao do mtodo analtico. As concentraes de todas as amostras de estabilidade devem ser comparadas com a mdia dos valores anteriormente calculados para as amostras do primeiro dia do teste. 3.9.5. Estabilidade ps-processamento Em caso de utilizao de equipamentos que empregam sistemas automticos de amostragem/injeo, deve-se realizar estudo de estabilidade do frmaco, na amostra processada para anlise, incluindo o padro interno, na temperatura sob a qual o teste ser realizado e por perodo de tempo superior durao da corrida analtica. Utiliza-se, no mnimo, trs amostras das concentraes baixa e alta determinadas na validao do mtodo analtico. Os resultados devem ser comparados com aqueles obtidos da anlise das amostras recm-preparadas. 3.9.6. Estabilidade das solues-padro 3.9.6.1. Deve ser avaliada a estabilidade das solues-padro do frmaco e do padro interno, mantidas temperatura ambiente por, no mnimo, 6 (seis) horas aps preparao. 3.9.6.2. Em caso de tais solues serem armazenadas sob refrigerao ou congelamento, a estabilidade tambm deve ser avaliada, contemplando a temperatura e o perodo de armazenamento das mesmas. 3.9.6.3. Os resultados desse teste devem ser comparados com aqueles obtidos utilizando-se solues recentemente preparadas do frmaco e do padro interno. 3.9.7. Anlise dos resultados As amostras sero consideradas estveis quando no se observar desvio superior a 15% do valor obtido das amostras recm-preparadas, com exceo do LIQ, para o qual se aceita desvio de at 20%. Qualquer que seja o mtodo estatstico utilizado para avaliar os resultados dos estudos de estabilidade, este dever estar descrito claramente no procedimento operacional padro (POP).

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4. Critrios de aplicao do mtodo bioanaltico validado 4.1. A anlise de todas as amostras de um analito em matriz biolgica deve ser concluda dentro do perodo de tempo para o qual a estabilidade tenha sido determinada. 4.2. Uma corrida analtica deve conter: amostras de CQ, padres de calibrao e amostras desconhecidas de um ou mais voluntrios do estudo. prefervel que todas as amostras de um mesmo voluntrio sejam analisadas numa nica corrida. 4.3. No permitido estimar a concentrao das amostras atravs de extrapolao da curva de calibrao abaixo do LIQ ou acima do maior padro. Em vez disso, a curva deve ser redefinida ou as amostras de concentraes superiores devem ser diludas e re-analisadas. 4.4. No uso rotineiro do mtodo analtico validado, sua preciso e exatido devem ser monitoradas regularmente para assegurar a continuidade do desempenho satisfatrio. Para atingir este objetivo, amostras de CQ devem ser analisadas juntamente com as demais amostras, em cada corrida analtica. 4.5. As amostras de CQ devem ser incorporadas em intervalos adequados, dependendo do nmero total de amostras da corrida, sempre em igual nmero de replicatas de cada concentrao (CQB, CQM e CQA). 4.6. O nmero de amostras de CQ (em mltiplos de trs) a ser incorporado em cada corrida analtica no deve ser inferior a 5% (cinco por cento) do nmero de amostras desconhecidas. Para corridas analticas constitudas de at 120 amostras, pelo menos 6 (seis) CQs (uma duplicata de cada concentrao) devem estar presentes. 4.7. Os resultados das amostras de CQ serviro de base para aceitao ou rejeio da corrida analtica. No mnimo, 67% (quatro de seis) das amostras de CQ devem estar dentro de mais ou menos 15% dos seus respectivos valores nominais, exceto para o LIQ, para o qual se admite desvios menores ou iguais a 20%; 33% (duas de seis) amostras de CQ podem estar fora destes limites, mas no para a mesma concentrao.

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