Plasmidos y Transposones

_______________________________________________________________________
Universidad Nacional San Lus Gonzaga de Ica Facultad de Medicina Humana Daniel Alcides Carrin
CONTENIDO
A. PLASMIDOS
I.
Definicin 03
II. Clasificacin. 06 III. Estructura de un plsmido. 06 IV. Mecanismos de transferencia gentica... 06 V. Usos teraputicos .. 06
B. TRANSPOSONES
I. Definicin ... II. Clasificacin .... III. Estructura de un transposn . IV. Tipos de transposones bacterianos en funcin de su estructura .. V. Aplicaciones .
06 06 06 06 06
SEMINARIO DE MICROBIOLOGIA
_______________________________________________________________________
INTRODUCCION
_______________________________________________________________________
A. PLASMIDOS I. DEFINICION
Toda la informacin gentica esencial para la vida de la clula bacteriana, est contenida en una nica molcula de ADN de doble cadena, circular y covalentemente cerrado, a la que podemos referirnos como cromosoma bacteriano. Muchas bacterias, poseen adems ADN extra
cromosmico, tambin circular cerrado, denominado ADN plasmdico, por estar contenido en estructuras llamadas plsmidos, que portan informacin gnica para una variedad de funciones no esenciales para la clula en condiciones normales de crecimiento. En trminos bioqumicos, la composicin y estructura de los cidos nucleicos bacterianos, es la misma que para cualquier clula. Brevemente, conviene recordar que los cidos nucledos son macromolculas compuestas de nucletidos unidos en forma covalente por medio de enlaces fosfodiester entre los carbonos de las posiciones 3 y 5 de dos residuos de azcares adyacentes, que
conforman un esqueleto de azcares y fosfatos que es constante a lo largo de toda la macromolcula. La variacin entre los distintos nucletidos que conforman la cadena de cido nucleico, est dada por sus bases nitrogenadas, que en el caso del ADN son Adenina (A), Timina (T), Citocina (C) y Guanina (G), y en el caso del ARN en vez de T se encuentra Uracilo (U). A y G se denominan bases pricas o purinas, mientras que T, U, y C se denominan bases pirimidnicas o pirimidinas. De esta manera, una cadena o hebra de cido nucleico, tendr una estructura primaria determinada por la secuencia de las bases que la componen. El ADN como macromolcula, est compuesto por 2 cadenas nucleotdicas o hebras antiparalelas, que se enlazan entre si conformando una doble hlice. Los enlaces entre las dos hebras de ADN estn dados por puentes de hidrgeno entre las purinas de una cadena con las pirimidinas de la otra. De esta forma, la A forma dos puentes de hidrgeno con la T, mientras que la C forma 3 puentes de hidrgeno con la G. A esto se le llama complementariedad de bases, es decir que la A
_______________________________________________________________________
es complementaria a la T y la C lo es a la G. Estos enlaces permiten mantener estable la estructura de la doble hlice de ADN en la que pueden distinguirse pares de nucletidos o mejor dicho pares de bases (pb). Estos pb pueden utilizarse como unidad de tamao o longitud para las molculas de ADN, y de esa manera podemos decir por ejemplo que el ADN cromosmico de Escherichia coli tiene un tamao de 4,2 millones de pb o lo que es lo mismo 4.200 kilobases (Kb). Como se mencion, muchas bacterias poseen informacin gnica contenida en molculas de ADN distintas a las del cromosoma bacteriano, denominadas
plsmidos. Los plsmidos, son molculas circulares de ADN de doble cadena que constituyen una unidad de replicacin independiente del cromosoma. Por esto pueden encontrarse ms de una copia del mismo plsmido dentro de la clula bacteriana. En general los plsmidos de mayor tamao, se
encuentran en una o unas pocas copias, mientras que los ms pequeos pueden estar en hasta 100 copias por clula (plsmidos multicopia). Si bien el ADN plasmdico no porta informacin gentica esencial para la vida de la bacteria, s portan genes que le confieren nuevas propiedades fenotpicas y que en algunos casos le son muy tiles para su adaptacin al crecimiento en ciertos ambientes. Muchas bacterias potencialmente patgenas para el hombre, solo son capaces de comportarse como tales, cuando portan un plsmido en particular que contiene genes que le permiten expresar molculas de adhesin a los tejidos del husped o sintetizar sustancias txicas para ste. Como ejemplo, podemos mencionar el caso de la produccin de la toxina tetnica, por Clostridium tetani, agente causal del ttanos. En muchos casos, los plsmidos contienen genes que codifican para enzimas capaces de degradar algunos antibiticos, permitiendo que la bacteria sobreviva a la accin de los mismos. Este es el caso de la produccin de beta lactamasas por cepas Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus o Haemophylus influenzae, que poseen un plsmido que les confiere resistencia a ciertos antibiticos beta lactmicos como Penicilina y Ampicilina. Cada plsmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como un origen de replicacin u ORI (un punto inicial para la replicacin del ADN), lo cual habilita al ADN para ser duplicado independientemente del ADN cromosomal. Los plsmidos de la mayora de las bacterias son
_______________________________________________________________________
circulares, pero tambin se conocen algunos lineales, los cuales reensamblan superficialmente los cromosomas de la mayora de eucariontes Algunas clases de plsmidos poseen adems la propiedad conocida como "replicacin relajada", esto es, estn presentes en forma de muchas copias por clula, lo que facilita enormemente su aislamiento y purificacin. Hay algunos plsmidos
integrativos, vale decir tienen la capacidad de insertarse en el cromosoma Digamos que bacteriano. rompe el
cromosoma y se sita en medio, con lo cual, la tambin
automticamente maquinaria celular
reproduce el plsmido. Cuando ese plsmido se ha insertado se les da el nombre de episoma, puede mantenerse en contacto por un largo tiempo, ser duplicado en cada divisin celular del del husped y volverse parte bsica de su mapa gentico. Los plsmidos se utilizan en ingeniera gentica por su capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal como as tambin porque es relativamente fcil manipularlos e insertar nuevas secuencias genticas. Los plsmidos usados en Ingeniera Gentica suelen contener uno o dos genes que les confieren resistencia a antibiticos y permiten seleccionar clones recombinantes. Hay otros mtodos de seleccin adems de la resistencia a antibiticos, como los basados en fluorescencia o en protenas que destruyen las clulas sin uso de antibiticos. Estos nuevos mtodos de seleccin de plsmidos son de uso frecuente en agrobiotecnologia, debido a la fuerte crtica de grupos ecologistas contra la posibilidad de presencia de antibiticos en los organismos modificados genticamente. Los plsmidos usados en ingeniera gentica son llamados vectores. Estos son usados para transferir genes desde un organismo a otro y tpicamente contienen un marcador gentico
_______________________________________________________________________
confiriendo un fenotipo el cual puede ser seleccionado a favor o en contra. La mayora tambin contienen un polivinculador o sitio de clonado mltiple (MCS), el cual es una pequea regin que contiene los sitios de restriccin ms comnmente usados, permitiendo una fcil insercin de fragmentos de ADN en ese lugar.
II. CLASIFICACIN
SEGN SEAN AUTOTRANSMISIBLES POR CONJUGACIN O NO:
a) Plsmidos conjugativos (auto transmisibles) Son aquellos que transportan los genes para los pilis sexuales y para la transferencia de los plsmidos a otra clula. Pueden transmitirse de una clula a otra sin que la clula donadora los pierda. Algunos de estos plsmidos no slo se transfieren entre cepas de la misma especie, sino que son capaces de hacerlo entre especies y gneros muy diversos, recibiendo el muy apropiado nombre de plsmidos promiscuos o de amplio espectro de hospedadores, permitiendo transferencia horizontal de informacin gentica entre grupos bacterianos filogenticamente alejados.
b) Plsmidos no conjugativos, Carentes de esta propiedad de conjugacin, pueden transferirse de una clula a otra mediante su insercin en un plsmido conjugativo o en un cromosoma o mediante un proceso de
transformacin cuando son liberadas de una clula muerta.
_______________________________________________________________________
SEGN SU CONTROL DE REPLICACIN VEGETATIVA:
a) Plsmidos de control estricto del nmero de copias: Tienen bajo nmero de copias por cromosoma en la misma clula. Suelen ser plsmidos de tamaos medianos (unas 30 kb) a grandes (cientos de kb) P. ej., el factor F se mantiene a 1-2 copias por cromosoma.
b) Plsmidos de control relajado Alto n de copias por cromosoma (ms de 10). Suelen ser plsmidos pequeos (menos de 10 kb). Algunos de ellos tienen un sistema de replicacin especial, y son amplificables cuando a las bacterias que los poseen se les aade cloramfenicol: este antibitico detiene la sntesis de protenas, lo que afecta a la replicacin del cromosoma, ya que para que se inicie cada ciclo de replicacin cromosmica se necesita un nuevo pool de determinadas enzimas. Pero esto no afecta a la replicacin del plsmido, que de esta manera se amplifica y aumenta an ms su proporcin respecto del cromosoma. SEGN EL TIPO DE FENOTIPOS QUE CODIFICAN : a) Plsmidos R (Factores R o factores de resistencia) Confieren a las bacterias que los contienen, resistencia frente a uno o varios antibiticos. Tienen una enorme importancia desde el punto de vista clnico. Son plsmidos que contienen genes que codifican enzimas que destruyen o modifican molculas que constituyen el antibitico. Por ejemplo: B- lactamasas: son enzimas que degradan especficamente el anillo blactmico, que es la estructura de penicilinas y derivados CAT( cloranfenicol acetil transferasa): que es una enzima que acetila la molcula del cloranfenicol, inactivndola, por lo que las bacterias que secreten esta enzima sern resistentes al cloranfenicol
_______________________________________________________________________
b)
Plsmidos bacteriocinognicos Contienen genes que codifican a una Bacteriocina, una protena de secrecin que es txica para otras clulas de la misma especie que no contengan el mismo factor Bacteriocinognico. Son protenas txicas, producidas por las bacterias para competir con bacterias de la misma especie.
c) Plsmidos toxignicos: Son plsmidos que contienen genes que codifican protenas de secrecin que son txicas para el ser humano. Son factores de virulencia. Dentro de una misma especie bacteriana, aquellas cepas que contengan un Plsmidos toxignico sern virulentas, de lo contrario no lo sern. Un buen ejemplo de esto son las cepas enterotoxignicas de E.coli, E. coli es habitante habitual del intestino, por lo que normalmente no es un microorganismo virulento, pero existen cepas que si lo son, algunas de ellas debido a la presencia de Plsmidos toxignicos que contienen genes que codifican una enterotoxina muy potente que cuando se libera en la mucosa intestinal da lugar a un cuadro diarreico d) Plsmidos que codifican factores de colonizacin Para la invasin de los tejidos de su hospedador. e) Plsmidos de cepas de Pseudomonas, Que confieren rutas metablicas capaces de utilizar como fuentes de carbono y energa sustancias que otros organismos no pueden catabolizar:
_______________________________________________________________________
i) ii) iii) plsmidos OCT (degradacin del octano); plsmidos TOL/XYL (degradacin del tolueno y xileno); plsmidos NAF (degradacin del naftaleno), etc.
Existen igualmente plsmidos que codifican ms de un tipo de fenotipos: p. ej., plsmidos que suministran resistencia a antibiticos y capacidad de virulencia. SEGN EL GRUPO DE INCOMPATIBILIDAD. Dos plsmidos son incompatibles (no pueden permanecer establemente en la misma clula) Como se sabe, desde hace algn tiempo que ciertas parejas de plsmidos (por ejm: un plsmido F y un plasmido F o dos clases diferentes de plsmidos F) no pueden replicarse de manera estable en la misma clula bacteriana. Se dice que dos de estos plsmidos son incompatibles, porque comparten un mismo sistema de replicacin y segregacin de las copias. Una coleccin de plsmidos incompatibles constituye un grupo de incompatibilidad. Una gran variedad de pruebas sugiere que los plsmidos miembros de un mismo grupo de incompatibilidad (designado por Inc, seguido de una letra mayscula y a veces de un nmero) estn estrechamente relacionados, por lo que esta propiedad es utilizada con frecuencia como sistema de clasificacin. El hecho de saber a qu grupo de incompatibilidad pertenece un plsmido, con frecuencia revela otras cosas acerca de l. Por ejemplo, los miembros del grupo de incompatibilidad IncP1 poseen todos la propiedad de ser capaces de replicarse de manera estable en una amplia gama de clulas bacterianas hospedadoras. III. ESTRUCTURA DE UN PLASMIDO IV. MECANISMOS DE TRANSFERENCIA GENETICA
_______________________________________________________________________
V. USOS TERAPEUTICOS PRODUCCIN DE VACUNAS DE DNA Recientemente se ha reportado que las muertes al ao por tuberculosis son de tres millones, las de malaria de dos millones y las del SIDA de un milln. En la actualidad, el uso de plsmidos para la produccin a gran escala de vacunas de DNA est orientado a la prevencin de enfermedades como las mencionadas, para las cuales no existen vacunas an, o su costo es muy elevado. Se considera que las vacunas de esta nueva generacin sern ms seguras, baratas, y ms fciles de producir que las convencionales. TERAPIA GNICA Otra aplicacin de los plsmidos es en terapia gnica, donde se introducen genes en clulas del cuerpo humano. Estos genes, al expresarse codifican y realizan una accin teraputica, como el tratamiento de enfermedades hereditarias monognicas o adquiridas, como la hemofilia, la fibrosis cstica, cncer, problemas vasculares y desrdenes neurolgicos. Los plsmidos utilizados con fines teraputicos y de prevencin, exhiben tres partes bsicas en su conformacin: el gen de resistencia a antibiticos, el gen insertado y el origen de replicacin. Un prerrequisito para el uso efectivo de la terapia gnica o de la vacunacin con DNA es la transferencia eficiente del material gentico a la clula receptora. Actualmente, alrededor del 24% de los protocolos en desarrollo emplean plsmidos superenrollados como vehculos de transferencia debido a que stos son ms eficientes en la transferencia del material gentico, que otro tipo de plsmidos, ya que ofrecen mayores ventajas de seguridad y de aplicacin que los vectores de tipo viral.
10
_______________________________________________________________________
PRODUCCIN DE GRANDES CANTIDADES DE PROTENAS Otro uso importante de los plsmidos es fabricar grandes cantidades de protenas. En este se deja crecer la bacteria que contiene el plsmido que encierra al gen de inters. Solo como la bacteria produce la protena que le confiere si resistencia a los antibiticos, este tambin puede ser usado para producir protenas en grandes cantidades desde el gen insertado. Esta es una forma barata y fcil de producir genes o protenas que este codifica de forma masiva, como por ejemplo insulina, o inclusive antibiticos. Estas tcnicas se emplean normalmente para la produccin de protenas en gran escala, ya que podemos hacer que una bacteria produzca una protena humana y lograr una superproduccin, como en el caso de la insulina humana, que actualmente es producida por bacterias en grandes recipientes de cultivo, denominados biorreactores. Como las bacterias se multiplican muy rpidamente y pueden expresar grandes cantidades de protenas, es posible lograr una sobreproduccin de la protena deseada. A esto justamente se dedica la biotecnologa, es decir a la utilizacin de organismos vivos o de sus productos con fines prcticos. B. TRANSPOSONES
I.
DEFINICION
Un transposn o elemento gentico transponible es una secuencia de ADN que puede moverse de manera autosuficiente a diferentes partes del genoma de una clula, un fenmeno conocido como transposicin. En este proceso, se pueden causar mutaciones y cambio en la cantidad de ADN del genoma. Anteriormente fueron conocidos como "genes saltarines" y son ejemplos de elementos genticos mviles. El transposn modifica el ADN de sus inmediaciones, ya sea arrastrando un gen codificador de un cromosoma a otro, rompindolo por la mitad o haciendo que desaparezca del todo. En algunas
11
_______________________________________________________________________
especies, la mayor parte del ADN basura (hasta un 50% del total del genoma) corresponde a transposones. A diferencia de los provirus, los transposones se integran en el ADN celular en lugares bien determinados. Su existencia fue propuesta por Barbara McClintock en el maz, sin embargo, su existencia no se demostr hasta mucho ms tarde en bacterias. Por ello fue laureada con el premio nobel en 1983. II. CLASIFICACION
Existe una amplia diversidad de elementos genticos mviles y pueden ser clasificados en base a su contenido y su estrategia y mecanismo de transposicin. SEGN CONTENIDO
Transposn simple Secuencia de insercin o elemento de insercin (IS): contienen una secuencia central con informacin para la transposasa, una enzima necesaria para la transposicin, y en los extremos una secuencia repetida en orden inverso. Esta secuencia repetida en orden inverso no es necesariamente idntica, aunque muy parecida. Cuando un transposn simple se integra en un determinado punto del ADN aparece una repeticin directa de la secuencia diana (5-12 pb).
Transposn compuesto (Tn) Contienen un elemento de insercin (IS) en cada extremo en orden directo o inverso y una regin central con la transposasa que adems suele contener informacin de otro tipo. Por ejemplo, los factores de
transferencia de resistencia (RTF), poseen informacin en la zona central para
12
_______________________________________________________________________
resistencia a antibiticos como el cloranfenicol, la kanamicina, la tetraciclina,dndole una ventaja selectiva a las bacterias que lo posean. SEGN ESTRATEGIA DE TRANSPOSICIN
Clase I o DNA transposones: Se mueven directamente de una posicin a otra en el genoma usandouna transcriptasa para copiar y pegarse en otro locus del mismo.
Clase II o retrotransposones: Se mueven en el genoma siendo transcritos a ARN y despus en ADN por retrotranscriptasa. A su vez, se clasifican en los de origen retroviral (retrotransposones con LTR) y de origen no retroviral (retrotransposones sin LTR).
Clase III o MITE, Por sus siglas en ingls "Miniature Inverted-repeats Transposable Elements".
SEGN MECANISMO DE TRANSPOSICIN
Transposicin conservativa: EL transposn sale de la sede donadora que queda vaca y se incorpora en una nueva sede (sede receptora). No aumenta el nmero de copias del transposn en el interior de la clula. Se expresa la transposasa, y realiza dos cortes de doble cadena a la misma altura en el genoma donante, dejando aislado el transposn. A continuacin localiza una secuencia diana (pongamos, ATGCA) en el genoma aceptor, y realiza un corte cohesivo. Tras eso une los
13
_______________________________________________________________________
extremos a los del transposn aislado, y la ADN Polimerasa de la clula rellena las zonas de cadena sencilla dejadas en la secuencia seal tras el corte cohesivo. Debido a esto, la secuencia seal queda duplicada. Queda, sin embargo, un hueco en el genoma donante, que puede ser letal si no se repara. Realmente, en este caso se habla ms de recombinacin que de transposicin.
Transposicin no conservativa: En este caso la transposasa realiza un corte cohesivo no solo en la secuencia diana, sino tambin en el genoma donante, dejando un corte a cada lado del transposn. A continuacin integra todo el genoma donante con el aceptor, mediante un curioso mecanismo que forma un intermediario llamado estructura entrecruzada. Esta estructura es resuelta por un segundo enzima, la resolvasa, que segn cmo lo resuelva dar lugar a una de las siguientes transposiciones:
o
Transposicin no replicativa: el genoma donante se libera, dejando el integrn en el genoma receptor. Al igual que en la transposicin conservativa, queda un hueco en el genoma donante, que puede ser letal si no se repara.
Transposicin replicativa: se produce una replicacin desde los extremos 3 del genoma aceptor, lo que acaba por duplicar el transposn, y produciendo un genoma mixto llamado cointegrado. A continuacin la resolvasa rompe el cointegrado mediante una recombinacin recproca, que une los extremos del ADN aceptor original (ahora con una de las copias del integrn) y libera el genoma donante de nuevo con su transposn.
III. ESTRUCTURA DE UN TRANSPOSN
Un transposn se define como un segmento de ADN que no codifica sus propias funciones de replicacin, pero s aquellas relacionadas con la capacidad de moverse entre los elementos de ADN replicativos (plsmidos y cromosomas) sin la ayuda de la maquinaria recombinatoria del hospedador. Es un elemento mvil no replicativo.
14
_______________________________________________________________________
Una caracterstica comn en los transposones, exceptuando aquellos denominados transposones RollingCircle (RC), es que contienen secuencias repetidas en sus extremos denominadas secuencias repetidas invertidas (IR). Son dos secuencias que, siendo una idntica o prcticamente idntica a la otra, se encuentran dispuestas en orientacin inversa, una en cada hebra, generando un eje de simetra entre ellas:
En el caso de los transposones, estas secuencias generadas a cada lado del eje de simetra, no se hallan contiguas, pero an as siguen formando una repeticin invertida. Las IR de los transposones suelen tener varios pb (entre 10 y 30) y no siempre son una copia perfecta entre ellas, basta con que presenten alta homologa.
Otra caracterstica comn, exceptuando a los transposones RC, es la presencia adicional de secuencias cortas repetidas directas (DR) en el ADN diana una vez ha ocurrido el proceso de transposicin (sitio diana en azul). Su presencia es consecuencia de la insercin del transposn.
Durante el proceso de transposicin, la secuencia de insercin o transposn se inserta en este corte generado en el ADN diana. Una vez ocurrida la transposicin, hay un proceso natural de rellenado de huecos que deriva en la formacin de estas DR al duplicarse en la misma cadena:
15
_______________________________________________________________________
IV. TIPOS DE TRANSPOSONES BACTERIANOS EN FUNCIN DE SU ESTRUCTURA GENTICA.
Secuencias de insercin: IS Las secuencias de insercin son los transposones bacterianos ms pequeos. Fueron descubiertas y estudiadas, no porque transportasen ningn tipo de gen relevante, sino porque las mutaciones insercionales que provocaban implicaban la inactivacin del gen en el cual se transponan. Actualmente se conocen mltiples familias de IS. Se denominan con las siglas IS y un nmero. Las familias son: IS1, IS3, IS4, IS5, IS6, IS21, IS30, IS66, IS91, IS110, IS200/IS605, IS256, IS630, IS982, IS1380, ISAs1 e ISL3. Su estructura es sencilla, ya que codifican poco ms que la transposasa que les permite promover su propia transposicin e integrarse en multitud de sitios especficos. Esta enzima est codificada por uno o dos marcos de lectura abierta que consumen la prctica totalidad de la longitud del elemento. Como ya se ha apuntado en el apartado anterior, las IS van flanqueadas por unas secuencias repetidas invertidas, IRR e IRL (Inverted Repeat Right/Left respectivamente). Slo algunas excepciones notables carecen de ellas: son las familias IS91, IS110 e IS200/605. Tras la insercin se generan las DR en el ADN diana, que quedan flanqueando la IS. La longitud de estas DR, de entre 2 y 14 pb, es caracterstica para cada elemento y generalmente siempre se generar una duplicacin de longitud determinada, por ejemplo, para IS1 son 9 pb. Las IR tienen una doble funcionalidad: por un lado, proporcionan el sitio exacto para el reconocimiento especfico de la transposasa, y por otro son el punto de anclaje en las reacciones de corte y transferencia de cadena que llevan a la transposicin del elemento.
TRANSPOSONES COMPUESTOS (CLASE I)
Son elementos genticos mviles formados por una serie central de genes, que por si solos no podran transponerse, flanqueados por una pareja de IS del mismo tipo formando as un transposn compuesto. Una de las diferencias con una IS, es que aporta al menos una alteracin del fenotipo celular por la expresin de dichos genes centrales.
TRANSPOSONES COMPLEJOS (CLASE II)
16
_______________________________________________________________________
Se cree que los anteriores transposones de clase I surgen, por casualidad, a travs de mltiples eventos de transposicin, establecindose de manera estable entre la poblacin bacteriana portadora gracias a las propiedades que confieren y permiten a dicha poblacin sobrevivir a las fuerzas selectivas a las que normalmente se ve afectada. El origen de la generacin de esta otra clase II de transposones est mucho menos clara que el propuesto para los de clase I. Los transposones complejos pueden moverse entre el cromosoma bacteriano y los plsmidos presentes en la bacteria. La estructura gentica consta de una transposasa junto a una resolvasa, ms los determinantes de resistencia que transporte, todo ello flanqueado por una copia de una IR en cada extremo. La presencia de estas dos enzimas les permite su recombinacin e integracin en el cromosoma bacteriano o en plsmidos. Hay un grupo de transposones de clase II que pueden transferirse con una estructura circular similar a la de los plsmidos, son los transposones conjugativos.
POS DE TRANSPOSONES EN FUNCIN DE LA TRANSPOSASA
Transposones DDE:
Las transposasas de la mayora de los transposones con mecanismo conservativo, y tambin las de otras como Tn3, transposn con mecanismo replicativo, poseen una caracterstica comn: la presencia de tres aminocidos esenciales para su actividad: dos cidos asprtico (D) y un cido glutmico (E), de ah la denominacin DDE. Estos tres aminocidos no estn prximos en el polipptido, pero s lo estn en el centro activo cuando se genera la protena. Estas enzimas pertenecen a una antigua superfamilia de protenas que catalizan reacciones de transferencia de grupos fosforilo (PO4) a travs de mecanismos basados en la presencia de dos iones metlicos. Un centro activo tal que ste se puede hallar tambin en otras conocidas protenas como la integrasa del VIH y la protena RAG1 (generacin de anticuerpos en vertebrados) entre otros. Recientemente se ha determinado este centro activo en la transposasa codificada por IS1. La funcin de las TnpA de estos transposones es atrapar y mantener dos iones Mg2+ que participan en la fragmentacin del enlace fosfodister del ADN durante el proceso de transposicin.
17
_______________________________________________________________________
Transposones Y2: Transposones Rollingcircle (TnRC)
Las transposasa de este tipo de transposones poseen dos tirosinas esenciales en su centro activo, de ah la denominacin Y2. Su representante es IS91. En este caso, el mecanismo de transposicin no pasa por un intercambio de hebras, como ocurre en los transposones DDE, sino que implica un movimiento RC para integrarse en el ADN diana. En todos los casos donde se da un movimiento gentico por RC, la protena ejecutora tiene una tirosina en su centro activo cuya funcin es unirse covalentemente al grupo fosfato en el extremo 5 del ADN implicado en el proceso de replicacin o transferencia. Ejemplo de este tipo de mecanismo es uno de los tres tipos de replicacin en plsmidos. Transposones S e Y.
Existe otra clase de elementos genticos que se transfieren sin utilizar ni TnpADDE ni TnpAY2. Segn posean en su centro activo una tirosina o una serina, se denominan transposones Y y transposones S. Este tipo de elementos estn a medio camino entre integrasas y transposasas. Los transposones Y y S se transponen por un mecanismo de recombinacin nohomloga especfica de sitio.
V.
APLICACIONES
Transposones como vectores para transgnesis estable de genes a clulas madre y generacin de
18
_______________________________________________________________________
clulas madre pluripotentes inducidas. Tecnologas basadas en transposones pueden ser eficaces para transferir genes a cultivos celulares. Por ejemplo se pueden introducir horquillas (hairpins) cortas en cromosomas para obtener un sistema de bloqueo mediante interferencia por ARN. Los transposones son vectores prometedores para terapia gnica y celular. La eficiencia en la transferencia estable de genes por el sistema SB es similar a la obtenida con vectores virales.
El reciente descubrimiento de las clulas madre pluripotentes inducidas (iPSCs: induced Pluripotent Stem Cells) abre un futuro prometedor para la medicina regenerativa. Con slo inducir la expresin de los genes que codifican las protenas Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc se consigue transformar clulas somticas en clulas pluripotentes con capacidades similares a las clulas madre embrionarias. Inicialmente esto solo poda conseguirse mediante retro o lenti-viral transduccin, limitando su aplicacin clnica por motivos de seguridad. La variante hiperactiva SB y los transposones piggyBac muestran una eficiencia comparable a la de los vectores virales en la transgnesis. Adems el mecanismo cortar y pegar muchas veces no se completa y en los casos en los que se corta sin pegarse el transposn desaparece. Esto permite la eliminacin del transgen una vez completada la reprogramacin. Ya se ha conseguido generar iPSCs mediante el sistema de trasposicin piggyBac y la eliminacin del transgen que contena los factores responsables de la reprogramacin celular. Es cierto que an falta cerrar del todo la posibilidad de que el transposn salte a una nueva localizacin durante su proceso de eliminacin del genoma, pero la reprogramacin celular usando transposones como vector augura un futuro brillante a la medicina regenerativa.
TRANSGNESIS EN OOCITOS Y EMBRIONES
En vertebrados, los mtodos clsicos para expresar genes no presentes en el genoma se basan en la micro-inyeccin de construcciones de genes en oocitos o en huevos fertilizados. Esto tiene varios problemas como:

Baja tasa de integracin Integracin de varias copias repetidas seguidas, lo que muchas veces causa el silenciamiento de su expresin
19
_______________________________________________________________________
La integracin se produce tarde en el desarrollo lo que causa mosaicismo con respecto al transgen.
Todos estos problemas se pueden solucionar usando transposones. En este sentido se ha desarrollado ya un sistema basado en la transposasa hiperactiva SB100X que permite una transgnesis del 45% en embriones de ratn.
MUTAGNESIS A ESCALA GENMICA
La mutagnesis de genes especficos permite diseccionar su funcin pero en la mayora de los casos la funcin de un gen no puede analizarse aisladamente. Es necesario estudiar cada gen dentro de las rutas biolgicas en las que participa. La mutagnesis insercional a escala de genoma realizada con transposones permite este tipo de estudios globales y es una de la las tecnologas ms productiva y verstil de las existentes para bloquear y manipular genes a escala de genoma.
La mutagnesis insercional en clulas somticas plantea el reto de trabajar con genomas diploides. La inactivacin de las 2 copias de un gen suele ser siempre necesaria para detectar cambios fenotpicos, pero la probabilidad de generar mutaciones biallicas de un mismo locus es extremadamente baja. Las clulas embrionarias deficientes en Blm tienen una elevada tasa de recombinacin homloga con lo que tienden a perder la heterocigosidad y en muchos casos pueden convertir una mutacin simple en una bi-allica. El sistema Blm se usa para realizar mutagnesis insercional a escala genmica en clulas somticas. Se ha usado el transposn piggyBac en clulas madre embrionarias de ratn Blm-deficientes, para buscar componentes involucrados en la reparacin de ADN. Este sistema fue capaz de detectar 4 genes involucrados en reparacin de ADN mientras que previos estudios que usaban como vector retrovirus slo fueron capaces de detectar 2 genes.
En el sistema experimental de 2 componentes la transposicin est controlada por la transsuplementacin de la transposasa. En este sistema se acopla por un lado la transposasa, y por otro un sistema de captura de genes (gene-trapping) que se encarga de la mutagnesis y de proporcionar una seal detectable para poder seleccionar los mutantes. Las construcciones para captura de genes
20
_______________________________________________________________________
llevan en 3 un sitio para splicing alternativo, un gen que codifica una protena reporter que sea fcilmente detectable directa o indirectamente (fluorescencia, color) y en 5 una secuencia poli-A que determina la terminacin de la transcripcin. El sistema de 2 componentes al insertarse en un intrn bloquea la expresin del gen en el que se inserta, pero permite la transcripcin del gen reportero que sirve para seleccionar los mutantes. Se han usado sistemas de transposicin de 2 componentes basados en el uso los transposones SB, Minos, PiggyBac y Tol2.
MUTAGNESIS CON LINE-1
El uso del retrotransposon LINE-1 para mutagnesis tiene varias ventajas:
Como su mecanismo de transposicin es de tipo copiar y pegar el donante se mantiene estable.
Se pueden disear de forma que la transposicin se produzca una sola vez La retro-transposicin puede controlarse usando sistemas como Cre-loxP
Un problema del uso de LINE-1 es que un 90% de las transposiciones se asocian con reordenamientos y esto puede dificultar la determinacin de los nuevos sitios de insercin.
TRANSPOSONES EN SISTEMAS EXPERIMENTALES DE CNCER
SB ha sido usado en ratn para sobre-expresar genes y generar modelos animales de cncer experimental. El sistema es similar al basado en retrovirus pero permite establecer tumores en regiones como hgado y cerebro en las que antes no era posible. El sistema que asocia SB a un sistema de captura de oncogenes permite tanto bloquear la expresin de oncogenes como sobre expresarlos.
21
_______________________________________________________________________
22

Plasmidos y Transposones

Transféré par

Informations du document

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Plasmidos y Transposones

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

_______________________________________________________________________

cromosoma y se sita en medio, con lo cual, la tambin

automticamente maquinaria celular

SEGN SEAN AUTOTRANSMISIBLES POR CONJUGACIN O NO:

transformacin cuando son liberadas de una clula muerta.

transferencia de resistencia (RTF), poseen informacin en la zona central para

SEGN MECANISMO DE TRANSPOSICIN

III. ESTRUCTURA DE UN TRANSPOSN

TRANSPOSONES COMPUESTOS (CLASE I)

TRANSPOSONES COMPLEJOS (CLASE II)

POS DE TRANSPOSONES EN FUNCIN DE LA TRANSPOSASA

Transposones Y2: Transposones Rollingcircle (TnRC)

TRANSGNESIS EN OOCITOS Y EMBRIONES

MUTAGNESIS A ESCALA GENMICA

MUTAGNESIS CON LINE-1

El uso del retrotransposon LINE-1 para mutagnesis tiene varias ventajas:

Como su mecanismo de transposicin es de tipo copiar y pegar el donante se mantiene estable.

TRANSPOSONES EN SISTEMAS EXPERIMENTALES DE CNCER

Vous aimerez peut-être aussi