Scdpha T 2010 Vincent Emilie

AVERTISSEMENT
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LIENS
Code de la Proprit Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la Proprit Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10 http://www.cfcopies.com/V2/leg/leg_droi.php http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm
UNIVERSITE HENRI POINCARE - NANCY 1
2010
___________________________________________________________________________
FACULTE DE PHARMACIE LES ALGINATES ET LEURS APPLICATIONS EN PHARMACIE ET EN INGENIERIE

APPLICATION A LA CONSTRUCTION DUN BIOMATERIAU
THESE
prsente et soutenue publiquement le 02 juillet 2010 pour obtenir
le Diplme d'Etat de Docteur en Pharmacie

par Emilie VINCENT ne le 19 fvrier 1987 Saint-Di (88)
Membres du Jury
Prsident : Juges : M. Pierre LABRUDE, Professeur M. Patrick MENU, Professeur M. Jean-Claude VOEGEL, Directeur de recherche INSERM, Universit Louis Pasteur, Strasbourg Mlle Hajare MJAHED, Docteur de lUniversit Louis Pasteur de Strasbourg, Stagiaire post-doctorale lUMR CNRS 7561.
UNIVERSIT Henri Poincar, NANCY 1 FACULT DE PHARMACIE Anne universitaire 2009-2010 DOYEN Francine PAULUS Vice-Doyen Francine KEDZIEREWICZ Prsident du Conseil de la Pdagogie Bertrand RIHN Commission de la Recherche Christophe GANTZER Mobilit ERASMUS et Communication Francine KEDZIEREWICZ Hygine Scurit Laurent DIEZ Responsable de la filire Officine : Responsables de la filire Industrie : Francine PAULUS Isabelle LARTAUD, Jean-Bernard REGNOUF de VAINS Jean-Michel SIMON
Responsable du Collge dEnseignement : Pharmaceutique Hospitalier
DOYEN HONORAIRE Chantal FINANCE Claude VIGNERON PROFESSEURS EMERITES Jeffrey ATKINSON Marie-Madeleine GALTEAU Grard SIEST Claude VIGNERON PROFESSEURS HONORAIRES Roger BONALY Thrse GIRARD Maurice HOFFMANN Michel JACQUE Lucien LALLOZ Pierre LECTARD Vincent LOPPINET Marcel MIRJOLET Franois MORTIER Maurice PIERFITTE Janine SCHWARTZBROD Louis SCHWARTZBROD
MAITRES DE CONFERENCES HONORAIRES Monique ALBERT Grald CATAU Jocelyne COLLOMB Bernard DANGIEN Marie-Claude FUZELLIER Franoise HINZELIN Marie-Andre IMBS Marie-Hlne LIVERTOUX Jean-Louis MONAL Dominique NOTTER Marie-France POCHON Anne ROVEL Maria WELLMAN-ROUSSEAU ASSISTANT HONORAIRE Marie-Catherine BERTHE Annie PAVIS
ENSEIGNANTS
PROFESSEURS
Gilles AULAGNER ...............................Pharmacie clinique Alain BAGREL.....................................Biochimie Jean-Claude BLOCK ...........................Sant publique Christine CAPDEVILLE-ATKINSON ........Pharmacologie cardiovasculaire Chantal FINANCE................................Virologie, Immunologie Pascale FRIANT-MICHEL......................Mathmatiques, Physique, Audioprothse Christophe GANTZER ..........................Microbiologie environnementale Max HENRY .......................................Botanique, Mycologie Jean-Yves JOUZEAU............................Bioanalyse du mdicament Pierre LABRUDE..................................Physiologie, Orthopdie, Maintien domicile Isabelle LARTAUD...............................Pharmacologie cardiovasculaire Dominique LAURAIN-MATTAR...............Pharmacognosie Brigitte LEININGER-MULLER ................Biochimie Pierre LEROY .....................................Chimie physique gnrale Philippe MAINCENT ............................Pharmacie galnique Alain MARSURA .................................Chimie thrapeutique Patrick MENU ....................................Physiologie Jean-Louis MERLIN.............................Biologie cellulaire oncologique Jean-Bernard REGNOUF de VAINS ........Chimie thrapeutique Bertrand RIHN ..................................Biochimie, Biologie molculaire Jean-Michel SIMON.............................Economie de la sant, lgislation pharmaceutique
MAITRES DE CONFRENCES
Sandrine BANAS ................................Parasitologie Mariette BEAUD .................................Biologie cellulaire Emmanuelle BENOIT ..........................Communication et sant Isabelle BERTRAND.............................Microbiologie environnementale Michel BOISBRUN ..............................Chimie thrapeutique Franois BONNEAUX ...........................Chimie thrapeutique Ariane BOUDIER.................................Chimie Physique Cdric BOURA....................................Physiologie Jean-Claude CHEVIN ..........................Chimie gnrale et minrale Igor CLAROT .....................................Chimie analytique Jol COULON......................................Biochimie Sbastien DADE.................................Bio-informatique Dominique DECOLIN ..........................Chimie analytique Batrice DEMORE...............................Pharmacie clinique Jol DUCOURNEAU .............................Biophysique, audioprothse, acoustique Florence DUMARCAY...........................Chimie thrapeutique Franois DUPUIS................................Pharmacologie Raphal DUVAL .................................Microbiologie clinique Batrice FAIVRE ..Hmatologie - Gnie Biologique Adel FAIZ..........................................Biophysique-acoustique Luc FERRARI .....................................Toxicologie Stphane GIBAUD .............................Pharmacie clinique Thierry HUMBERT .............................Chimie organique Frdric JORAND ...............................Sant et environnement Thierry
Olivier JOUBERT.................................Toxicologie, scurit sanitaire Francine KEDZIEREWICZ ....................Pharmacie galnique Alexandrine LAMBERT .........................Informatique, Biostatistiques Faten MERHI-SOUSSI..........................Hmatologie biologique Christophe MERLIN ............................Microbiologie environnementale et molculaire Blandine MOREAU ..............................Pharmacognosie Maxime MOURER................................Pharmacochimie supramolculaire Francine PAULUS ...............................Informatique Christine PERDICAKIS ........................Chimie organique Caroline PERRIN-SARRADO .................Pharmacologie Virginie PICHON ................................Biophysique Anne SAPIN.......................................Pharmacie galnique Marie-Paule SAUDER ..........................Mycologie, Botanique Nathalie THILLY .................................Sant publique Gabriel TROCKLE ...............................Pharmacologie Marie-Nolle VAULTIER........................Biodiversit vgtale et fongique Mohamed ZAIOU ...............................Biochimie et Biologie molculaire Colette ZINUTTI ................................Pharmacie galnique
PROFESSEUR ASSOCIE
Anne MAHEUT-BOSSER ......................Smiologie
PROFESSEUR AGREGE
Christophe COCHAUD .........................Anglais
Bibliothque Universitaire Sant - Lionnois (Pharmacie - Odontologie)

Anne-Pascale PARRET...... ..... .............Directeur
SERMENT DES APOTHICAIRES
Je jure, en prsence des matres de la Facult, des conseillers de lordre des pharmaciens et de mes condisciples :
honorer ceux qui mont instruit dans les prceptes de
mon art et de leur tmoigner ma reconnaissance en restant fidle leur enseignement.
exercer,
dans lintrt de la sant publique, ma profession avec conscience et de respecter non seulement la lgislation en vigueur, mais aussi les rgles de lhonneur, de la probit et du dsintressement.
ne jamais oublier ma responsabilit et mes devoirs envers le malade et sa dignit humaine ; en aucun cas, je ne consentirai utiliser mes connaissances et mon tat pour corrompre les moeurs et favoriser des actes criminels.
Que
les hommes maccordent leur estime si je suis fidle mes promesses.
Que je sois couvert dopprobre et mpris de mes confrres si jy

manque.
LA FACULTE NENTEND DONNER AUCUNE APPROBATION, NI IMPROBATION AUX OPINIONS EMISES DANS LES THESES, CES OPINIONS DOIVENT ETRE CONSIDEREES COMME PROPRES A LEUR AUTEUR .
REMERCIEMENTS Ce travail a t effectu au sein du Laboratoire de Physiopathologie, Pharmacologie et Ingnierie Articulaires (UMR 7561 CNRS-UHP). Aussi je tiens exprimer toute ma reconnaissance M. le Dr. MAGDALOU, directeur de lunit, et M. le Pr STOLTZ, directeur du laboratoire, de mavoir accueillie au sein de leur quipe de recherche. Mes plus vifs remerciements sadressent tout dabord M. le Pr Patrick MENU qui ma accueillie plusieurs reprises au sein de son quipe dingnierie vasculaire. Cest grce lui que jai pu en premier lieu effectuer un stage dinitiation la recherche qui ma donn le got de la recherche et ma permis de trouver ma voie. Ce stage a t suivi par mon inscription en master pour lequel il est mon directeur de recherche. Je tiens exprimer ma profonde reconnaissance Mr le Pr. Pierre LABRUDE qui a accept dtre mon directeur de thse ainsi que mon prsident de jury. Je le remercie tout particulirement pour sa disponibilit et son aide prcieuse sans laquelle ce travail naurait pas pu tre ralis dans des dlais aussi courts et sans fautes dorthographe !!!!! Je remercie vivement Melle le Dr MJAHED, Hajare pour nous tous au labo, davoir accept de participer mon jury mais je la remercie galement pour tous les prcieux conseils quelle ma apports au cours de ce travail. Ma gratitude sadresse galement M. le Dr Jean-Claude VOEGEL, trs troitement associ notre quipe de recherche et trs frquemment prsent nos runions, pour sa participation au jury et surtout pour les connaissances, les conseils, les avis quil ma apports au cours de mon travail. Je ne saurais passer sous silence mes collgues de bureau : Aude, Estelle et Nicolas S., ceux qui faisaient presque partie du bureau : Tunay et Camille, et celui qui en a fait partie : Nicolas B., qui ma encadr au dbut de mon master et dont jai pris la "succession", pour la science et pour les bons moments passs ensemble et les nombreux fous rireMerci ! Enfin je remercie tous les membres du laboratoire : Brigitte, Cline, Dominique, Fatima, Ghislaine, Jessica, Karine, Leti, Loc, Monique, Nacer, Nati, Philippe, Rania, Sbastien, Talar, pour leur accueil et leur bonne humeur, Sans oublier bien sr tous mes amis de la fac : Aurlie, Ellen, Pauline, Tiphanie,, et ceux de la "maison" : la famille Baltzer, Jess, la famille Mischler,
A TOUTE LA FAMILLE,
A Steph qui ma servi pendant 6 ans de "punching-ball" lapproche des examens : Ca y est, cest fini !!!
A mes parents, et grands parents pour leur soutien et leur nombreux encouragements,
A ma sur Coralie qui a toujours t prsente,
A mes beaux-parents qui sont devenus au fil du temps ma deuxime famille,
A mes beaux-frres Alex, Christophe et Gilles,
Sans oublier bien sr Valentine !!
Et tout le reste de la famille quil ne mest pas possible de citer.
SOMMAIRE
INTRODUCTION ................................................................................................................. 1
PARTIE I : LES ALGINATES I. Historique ................................................................................................................................ 2 II. Classification ......................................................................................................................... 3 III. Les diffrentes sources dalginates ...................................................................................... 6 III.1. Les bactries .................................................................................................................. 6 III.1.a. Rle de la production dalginate chez les bactries ............................................. 6 III.1.b. Voie de synthse de lalginate chez les bactries ................................................. 7 III.2. Les algues ...................................................................................................................... 8 III.2.a. Intrt ................................................................................................................... 8 III.2.b. Voie de synthse de lalginate chez les algues ................................................... 9 III.2.c. Description botanique des principales familles dalgues productrices dalginate. 10 IV. Proprits physico-chimiques ............................................................................................ 15 IV.1. Dfinition de lacide alginique selon la Pharmacope Europenne, 6me dition ....... 15 IV.2. Caractres organoleptiques issus de la Pharmacope Europenne, 6me dition ......... 15 IV.3. Identification ............................................................................................................... 15 IV.4. Structure ...................................................................................................................... 16 IV.5. Proprits physico-chimiques des alginates en solution-formation des gels dalginate .............................................................................................................................................. 17 IV.6. Les gels dalginate et leurs proprits ......................................................................... 20 IV.7. Stabilit et dgradation des gels .................................................................................. 22 V. Extraction de lalginate........................................................................................................ 22 V.1. alginate de sodium ........................................................................................................ 22 V.1.a. V.1.b. 1re technique : passage par lacide alginique ..................................................... 23 2me technique : passage par lalginate de calcium ............................................. 24
V.2. autres alginates.............................................................................................................. 26 V.3. Autres paramtres importants de la production ............................................................ 26 V.3.a. V.3.b. V.3.c. Couleur ............................................................................................................... 26 Approvisionnement en eau ................................................................................. 27 Elimination des dchets ...................................................................................... 27
VI. Les diffrents emplois de lalginate ................................................................................... 28
PARTIE II : L'ALGINATE UN PRINCIPE ACTIF
A/ LES PANSEMENTS CUTANES ....................................................................................... 30 I. Les plaies .............................................................................................................................. 30 I.1. Lulcre de jambe ........................................................................................................... 30 I.1.a. I.1.b. I.1.c. I.1.d. I.1.e. I.1.f. Dfinition ........................................................................................................... 30 Etiologies ............................................................................................................ 30 Physiopathologie ................................................................................................ 31 Aspect clinique ................................................................................................... 32 Traitements ......................................................................................................... 33 Complications..................................................................................................... 34
I.2. Lescarre ......................................................................................................................... 34 I.2.a. I.2.b. I.2.c. I.2.d. Dfinition ........................................................................................................... 34 Physiopathologie ................................................................................................ 35 Les facteurs de risques ....................................................................................... 36 Classification ...................................................................................................... 36
II. La cicatrisation .................................................................................................................... 37 II.1. Dfinition ...................................................................................................................... 37 II.2. Physiologie de la cicatrisation ...................................................................................... 37 II.3. La cicatrisation dirige .................................................................................................. 39 III. Les pansements .................................................................................................................. 39 III.1. Le pansement "idal" ................................................................................................... 39 III.2. Les diffrents types de pansements ............................................................................. 40 III.3. Le choix du pansement ................................................................................................ 43 IV. Les pansements lalginate ............................................................................................... 44 IV.1. Composition et formes ................................................................................................ 44 IV.2. Proprits ..................................................................................................................... 45 IV.3. Indications ................................................................................................................... 45 IV.4. Mode dutilisation ....................................................................................................... 46 IV.5. Contre-indication, prcaution demploi .......................................................................... 46
B/ LES PANSEMENTS HEMOSTATIQUES ........................................................................ 48 I. Physiologie de lhmostase ................................................................................................... 48 I.1. Le systme plaquettaire .................................................................................................. 48 I.2. Le rle des plaquettes dans lhmostase primaire .......................................................... 49 I.2.a. I.2.b. I.2.c. Ladhsion plaquettaire ...................................................................................... 49 Lactivation plaquettaire .................................................................................... 50 Lagrgation plaquettaire ................................................................................... 50
II. La pathologie : lpistaxis.................................................................................................... 51 II.1. Dfinition ...................................................................................................................... 51 II.2. Physiopathologie ........................................................................................................... 52 II.3. Etiologies ...................................................................................................................... 52 II.4. Traitements ................................................................................................................... 53 III. Les mdicaments hmostatiques ........................................................................................ 53 III.1. Gnralits ................................................................................................................... 53 III.2. Les hmostatiques locaux ............................................................................................ 54 IV. Les hmostatiques locaux base dalginate ...................................................................... 54 IV.1. Mcanisme daction .................................................................................................... 54 IV.2. Composition et formes ................................................................................................ 55 IV.3. Indications ................................................................................................................... 55 IV.4. Interactions- prcautions demploi............................................................................... 56
C/ LES PANSEMENTS GASTRIQUES ................................................................................. 57 I. Systme digestif .................................................................................................................... 57 I.1. Physiologie de la scrtion gastrique. ............................................................................ 57 I.2. Scrtion acide chlorhydrique. ....................................................................................... 58 II. Pathologies ........................................................................................................................... 59 II.1. Le reflux gastro-sophagien (RGO) ............................................................................ 59 II.1.a. II.1.b. II.1.c. II.1.d. Dfinition ........................................................................................................... 59 Physiopathologie ................................................................................................ 60 Clinique .............................................................................................................. 60 Traitement .......................................................................................................... 61
II.2. la maladie ulcreuse : lulcre gastrique ....................................................................... 62 II.2.a. II.2.b. II.2.c. II.2.d. II.2.e. Dfinition ........................................................................................................... 62 Physiopathologie ................................................................................................ 62 Clinique .............................................................................................................. 63 Complications..................................................................................................... 63 Traitement (figure 40) ........................................................................................ 64
III. Les mdicaments des pathologies digestives ..................................................................... 64 III.1. Les antiscrtoires ....................................................................................................... 65 III.1.a. Les antiH2 .......................................................................................................... 65 III.1.b. Anticholinergiques ............................................................................................. 66 III.1.c. Les inhibiteurs de la pompe protons (IPP) ...................................................... 66 III.1.d. La somatostatine (SMT) ..................................................................................... 67 III.2. Les antiacides .............................................................................................................. 67 III.3. Les protecteurs de la muqueuse ................................................................................... 68 IV. Les pansements gastriques ................................................................................................. 68 IV.1. Gnralits-prsentation .............................................................................................. 68 IV.2. Les pansements gastriques base dalginate .............................................................. 69 IV.2.a. Mcanisme daction- Effet de lalginate ............................................................ 69 IV.2.b. Indications .......................................................................................................... 70 IV.2.c. Effets indsirables .............................................................................................. 70 IV.2.d. Prcautions demploi interactions mdicamenteuses ...................................... 70
PARTIE III : LES ALGINATES EN PHARMACIE GALENIQUE
A/ LES ALGINATES : DES EXCIPIENTS ............................................................................ 71 I. Les excipients........................................................................................................................ 71 I.1. Dfinition ....................................................................................................................... 71 I.2. Rles des excipients ....................................................................................................... 71 I.3. Proprits des excipients ................................................................................................ 71 II. Les alginates : des excipients............................................................................................... 72 II.1. Acide alginique ............................................................................................................. 72 II.1.a. II.1.b. Chimie ................................................................................................................ 72 Catgories dexcipients- les utilisations dans la formulation des mdicament .. 72
II.1.c. II.1.d. II.1.e. II.1.f. II.1.g.
Proprits spcifiques de lacide alginique ........................................................ 73 Conditions de conservation et de stabilit .......................................................... 73 Incompatibilits .................................................................................................. 74 Donnes de scurit-toxicit .............................................................................. 74 Prcautions demploi .......................................................................................... 74
II.2. Alginate de propylneglycol ......................................................................................... 74 II.2.a. II.2.b. II.2.c. II.2.d. II.2.e. II.2.f. II.2.g. Chimie ................................................................................................................ 74 Catgories dexcipients- utilisations dans la formulation des mdicament ....... 74 Proprits spcifiques de lalginate de propylneglycol .................................... 75 Incompatibilits .................................................................................................. 75 Conditions de conservation et de stabilit .......................................................... 75 Donnes de scurit-toxicit .............................................................................. 75 Prcautions demploi .......................................................................................... 76
II.3. Alginate de sodium ....................................................................................................... 76 II.3.a. II.3.b. II.3.c. II.3.d. II.3.e. II.3.f. II.3.g. Chimie ................................................................................................................ 76 Catgories dexcipients- utilisations dans la formulation des mdicaments. ..... 76 Proprits spcifiques de lalginate de sodium .................................................. 77 Incompatibilits .................................................................................................. 77 Conditions de conservation et de stabilit .......................................................... 77 Donnes scurit-toxicit ................................................................................... 77 Prcautions demploi .......................................................................................... 78
III. Mdicaments contenant lalginate et ses drivs comme excipient ................................... 78 III.1. Liste des mdicaments contenant la substance acide alginique comme excipient : .... 78 III.2. Liste des mdicaments contenant lalginate de sodium comme excipient : ................. 79
B/ L'ALGINATE UN PROCEDE D'ENCAPSULATION ...................................................... 80 I. La micro-encapsulation ......................................................................................................... 80 I.1. Dfinition-Historique ..................................................................................................... 80 I.2. Rle de lencapsulation .................................................................................................. 80 I.3. Mcanismes de libration des substances encapsules dans des microcapsules ............ 81 II. Lalginate : support pour la microencapsulation ................................................................. 82 II.1. Techniques dencapsulation partir dalginates ........................................................... 83 II.1.a. La coacervation complexe : procd physico-chimique .................................... 83
II.1.b.
Glification de gouttes : procd mcanique. .................................................... 84
II.2. Applications : exemple de molcules encapsules avec lalginate ............................... 84
PARTIE IV : L'ALGINATE DANS L'INGENIERIE TISSULAIRE
A/ INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE ......................................................................... 85 I. Les vaisseaux sanguins ......................................................................................................... 85 I.1. Structure gnrale ........................................................................................................... 85 I.1.a. I.1.b. I.1.c. Intima ................................................................................................................. 85 Mdia .................................................................................................................. 86 Adventice ........................................................................................................... 87
I.2. Les cellules musculaires lisses (CML) ........................................................................... 87 I.2.a. I.2.b. I.2.c. Structure ............................................................................................................. 87 Proprits ............................................................................................................ 88 Marqueurs de diffrenciation ............................................................................. 89
II. Les biomatriaux ................................................................................................................. 91 II.1. Dfinition ...................................................................................................................... 91 II.2. Alginate ......................................................................................................................... 91 II.3. Les films multicouche de polylectrolytes ................................................................... 91 III. Ingnierie tissulaire ............................................................................................................ 93 III.1. Dfinition ..................................................................................................................... 93 III.2. Rle de lingnierie tissulaire dans lathrosclrose ................................................... 94 III.2.a. Construction par feuillet cellulaire ..................................................................... 95 III.2.b. Applications de lalginate dans lingnierie tissulaire ....................................... 96 III.2.c.Applications des films multicouche de polylectrolytes dans l'ingnierie tissulaire .................................................................................................................................................. 96
B/ MATERIEL ET METHODES ............................................................................................ 99 I. Prparation du biomatriau ................................................................................................... 99 I.1. Prparation des lames de verre ....................................................................................... 99 I.2. Matriel .......................................................................................................................... 99 I.3. Protocole....................................................................................................................... 100 I.4. Enroulement du gel ...................................................................................................... 100 II. Mthode de caractrisation du biomatriau ....................................................................... 101
II.1. Microscopie confocale a balayage laser ..................................................................... 101 II.2. Mesure de la viscosit des solutions dalginate .......................................................... 102 II.2.a. II.2.b. Principe de fonctionnement .............................................................................. 102 Protocole........................................................................................................... 102
C/ RESULTATS .................................................................................................................... 104 I. Mise au point de larchitecture base du gel dalginate et de films multicouches de polylectrolytes ...................................................................................................................... 104 I.1. Formation dun gel dalginate la surface dune lame de verre .................................. 104 I.2. Elaboration dune membrane de gel dalginate dtachable.......................................... 105 I.2.a. I.2.b. Gels simples ..................................................................................................... 105 Gels stratifis .................................................................................................... 106
I.3. Elaboration de larchitecture stratifie base de gel dalginate et de films multicouches de polylectrolytes .............................................................................................................. 107 I.3.a. I.3.b. Visualisation de larchitecture en microscopie optique : topographie ............. 107 Epaisseur de larchitecture stratifie ................................................................ 108
I.4. Enroulement du gel dalginate ..................................................................................... 109 I.5. Quelques tests mcaniques prliminaires sur le rouleau du gel dalginate .................. 110 II. Suite du travail ................................................................................................................... 111
D/ DISCUSSION - PERSPECTIVES .................................................................................... 112 I. Discussion ........................................................................................................................... 113 II. Perspectives ....................................................................................................................... 115 III. Conclusion ........................................................................................................................ 117
CONCLUSION ................................................................................................. 118 ANNEXES ........................................................................................................ 120 BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................ 127
TABLE DES FIGURES
PARTIE I : LES ALGINATES

Figure 1 : portrait dE.C.C. Stanford ......................................................................................... 2 Figure 2 : monosaccharides prsents dans les diffrents polysaccharides des algues .............. 5 Figure 3 : schma simplifi de leur paroi des algues brunes ..................................................... 6 Figure 4 : voie de synthse de l'alginate chez les algues brunes ............................................... 9 Figure 5 : mcanisme d'action de la C5-pimrase. ................................................................ 10 Figure 6 : classification phylogntique des principales espces d'algues productrices dalginate ........................................................................................................................ 11 Figure 7 : Laminaria digitata .................................................................................................. 12 Figure 8 : Fucus vesiculosus et Fucus serratus ....................................................................... 13 Figure 9 : Macrocystis pyrifera ............................................................................................... 14 Figure 10 : monomres de mannuronate M et de guluronate G .............................................. 16 Figure 11 : polymre d'alginate constitu des monomres M et G lis en 1-4........................ 16 Figure 12 : liaisons covalentes des ions calcium avec les rsidus poly-G des polymres d'alginate. ........................................................................................................................ 18 Figure 13 : rtention du calcium par un rseau tridimensionnel de segments poly-M ou polyG dfinissant une structure de type "egg-box" ............................................................... 19 Figure 14 : effet de l'ajout de calcium dans une solution d'alginate ........................................ 20 Figure 15 : rseaux de gels forms partir dalginate possdant des blocs dacide guluronique de longueurs diffrentes .................................................................................................. 21 Figure 16 : premires tapes de l'extraction de l'alginate chez les algues brunes : obtention d'une solution d'alginate de sodium ................................................................................ 23 Figure 17 : extraction de l'alginate de sodium partir de la solution obtenue lors de la premire tape : technique de l'acide alginique .............................................................. 24 Figure 18 : extraction de l'alginate de sodium partir de la solution obtenue lors de la premire tape : technique de l'alginate de calcium ....................................................... 25 Figure 19 : insert oculaire contenant de l'alginate : Ocusert ................................................ 29 Figure 20 : moulage du visage ralis avec de l'alginate ........................................................ 29 Figure 21 : billes d'alginate contenant un colorant vert ainsi qu'un arme pour la cuisine molculaire...................................................................................................................... 29
Figure 22 : ulcre veineux au niveau de la jambe. .................................................................. 31 Figure 23 : ulcre de jambe prdominance artrielle sur le dos du pied .............................. 32 Figure 24 : eczma variqueux.................................................................................................. 32 Figure 25 : schma de l'crasement des capillaires impliquant une hypoxie tissulaire responsable de la formation de l'escarre ......................................................................... 34 Figure 26 : Escarre talonnire au stade d'ulcre bourgeonnant ............................................... 35 Figure 27 : schma du cisaillement, facteur de risque de survenue de l'escarre ..................... 36 Figure 28 : plaie en phase de granulation prsentant un aspect rouge vif en raison de la formation de no-capillaires assurant la nutrition du tissu. ............................................ 38 Figure 29 : plaie en phase d'pidermisation ............................................................................ 38 Figure 30 : compresse d'alginate et pansement Algostril ................................................... 41 Figure 31 : structure dun thrombocyte au repos et son activation la suite d'une brche vasculaire. ....................................................................................................................... 49 Figure 32 : l'hmostase : aspects molculaires de l'adhsion, de l'activation et de l'agrgation plaquettaire...................................................................................................................... 51 Figure 33 : fosses nasales prsentant une tache vasculaire conduisant un pistaxis ............ 52 Figure 34 : mche d'alginate (Coalgan) ................................................................................ 55 Figure 35 : coupe de la muqueuse stomachale et dtail des diffrentes cellules qui la composent. ...................................................................................................................... 57 Figure 36 : schma des diffrents paramtres de la scrtion acide gastrique et certaines interfrences mdicamenteuses favorisant la production acide ou s'y opposant ............ 59 Figure 37 : schma de la remonte acide dans l'sophage au cours du RGO ........................ 60 Figure 38 : physiopathologie de l'ulcration ........................................................................... 62 Figure 39 : ulcre gastrique vu par endoscopie ....................................................................... 63 Figure 40 : arbre dcisionnel de la prise en charge d'un ulcre gastrique ............................... 65 Figure 41 : pansement gastrique en suspension buvable ......................................................... 69
Figure 42 : reprsentation de l'acide alginique ........................................................................ 72 Figure 43 : reprsentation de l'alginate de propylneglycol .................................................... 74 Figure 44 : reprsentation de l'alginate de sodium .................................................................. 76 Figure 45 : microcapsules dalginate observes au microscope lectronique balayage ...... 80 Figure 46 : reprsentation schmatique du processus de coacervation complexe. ................ 83 Figure 47 : procd de glification de gouttes dalginate et structure atomique dune bille dalginate ........................................................................................................................ 84
PARTIE IV : L'ALGINATE DANS L'INGENIERIE TISSULAIRE
Figure 48 : structure de la paroi d'une artre ........................................................................... 86 Figure 49 : structure d'une cellule musculaire lisse ................................................................. 87 Figure 50 : observation en microscopie .................................................................................. 88 Figure 51 : reprsentation de CML de phnotype diffrenci (contractile) et ddiffrenci (de synthse). ........................................................................................................................ 89 Figure 52 : principe de la construction d'un film multicouche de polylectrolytes ................ 92 Figure 53 : structure chimique des polylectrolytes utiliss. PAH: poly (allylamine hydrochloride); PSS : poly (sodium 4-styrne sulfonate) ............................................... 92 Figure 54 : concept dingnierie tissulaire .............................................................................. 93 Figure 55 : vaisseaux synthtiques en ePTFe .......................................................................... 94 Figure 56 : ingnierie vasculaire : construction par feuillet cellulaire. ................................... 98 Figure 57 : flacon pulvrisateur "air-boy" ............................................................................... 99 Figure 58 : technique d'enroulement du feuillet cellulaire .................................................... 100 Figure 59 : principe de fonctionnement du microscope confocal ......................................... 101 Figure 60 : viscosimtre Low shear 30 et le principe de Couette ......................................... 102 Figure 61 : dpt dun gel dalginate de viscosit moyenne color au bleu de trypan sur lame de verre. ........................................................................................................................ 106 Figure 62 : architecture finale dveloppe ............................................................................ 107 Figure 63 : aspect de la surface du gel. ................................................................................. 108 Figure 64 : observation au microscope contraste de phase (objectif x40) des stries ralises dans le gel dalginate la suite de la modification de la technique de pulvrisation ... 108 Figure 65 : mesure de lpaisseur de gel dalginate de viscosit moyenne. .......................... 109 Figure 66 : enroulement du biomatriau final non cellularis............................................... 110 Figure 67 : ralisation de tests mcaniques succincts. .......................................................... 110
TABLE DES TABLEAUX
Tableau 1 : diffrents types de collodes existant en fonction des deux phases en prsence .... 4 Tableau 2 : proportion variable des diffrents blocs MG, MM et GG en fonction des diffrentes espces d'algues ............................................................................................ 17
Tableau 3 : tableau dcisionnel pour le choix du pansement en fonction de l'chelle colorielle de la plaie et de l'importance de l'exsudat ....................................................................... 44 Tableau 4 : diffrents pansements base d'alginate rembourss par la scurit sociale......... 45
Tableau 5 : principaux matriaux, les procds utilisables et quelques exemples d'application de la microencapsulation ................................................................................................ 82
INTRODUCTION
Les alginates, peu connus du grand public, sont pourtant des produits aujourdhui utiliss dans de nombreux domaines. Chacun de nous les consomme ou les utilise rgulirement sans mme le savoir. Cette lacune vient notamment du fait de lincomprhension des ingrdients contenus dans les produits commercialiss qui savre un dfi compliqu en raison de lutilisation de nombreux symboles. En effet, comment peut-on deviner quoi correspond lingrdient E400 sur une tiquette ?
Les emplois des alginates sont nombreux et concernent de multiples industries. Ils sont utiliss dans lindustrie textile, alimentaire, pharmaceutique, dans limprimerie, mais toutes ces industries y trouvent une proprit commune : la capacit de glification de ce produit naturel, origine qui est trs bien perue actuellement dans notre socit.
Le travail bibliographique ralis au cours de cette thse permettra de caractriser les diffrents alginates et leurs proprits physico-chimiques. Nous verrons comment ces proprits peuvent tre appliques dans les produits industriels.
Les emplois que nous dtaillerons seront axs sur lingnierie, quelle soit pharmaceutique ou tissulaire : Nous prciserons plus particulirement les emplois en pharmacie. En effet
lindustrie pharmaceutique est un gros consommateur dalginates pour sa production de mdicaments, que ce soit en tant que principe actif ou pour la ralisation des mdicaments en tant quexcipient ou matriau pour la microencapsulation. Enfin un travail de recherche viendra enrichir les parties prcdentes. Il y sera
dvelopp les applications des alginated dans lingnierie vasculaire. Ce travail consiste mettre au point un biomatriau fonctionnalis base dalginate afin de crer un feuillet de cellules musculaires lisses en vue de lobtention dun substitut vasculaire ncessaire au remplacement dun vaisseau dans lathrosclrose.
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I. Historique
Le dcouvreur de lalginate est Edward C. C. Stanford (figure 1). E. C. C. Stanford (1837-1899) est un pharmacien et chimiste britannique. Fils de pharmacien, il a t lve de lcole de la Pharmaceutical Society o il a reu en 1857 des mdailles sur tous les sujets
denseignement et o il fut dmonstrateur (assistant) chez le Pr Redwood. Il devint ultrieurement membre vie de la
Pharmaceutical Society , son entre dans la socit datant de 1860. Il fut aussi lun des fondateurs de la Confrence pharmaceutique britannique dont il fut le prsident au congrs dEdimbourg en 1892 (cf. extrait de la confrence de 1892 en annexe). Il a galement t membre de lInstitut de chimie et de la Socit chimique, ainsi que juge de paix du comt du Dumbarton. Il tait trs original et ingnieux, il avait toujours de nouvelles ides en tte et il concevait des appareils et des procds. Il tait un exemple typique de pharmacien impliquant ses connaissances de chimie dans une large gamme dactivits en dehors de la pratique pharmaceutique ordinaire. Sa confrence sur les emplois conomiques des algues marines devant la Society of arts en novembre 1862 attira lattention et il reut pour cette prsentation la mdaille dargent de la socit. Il sinstalla en Ecosse en 1863 et il y devint un grand connaisseur de la cte ouest de lEcosse et des Hbrides quil avait frquemment visites dans la cadre de son mtier en relation avec la prparation de liode et dautres produits issus des algues marines. Puis, en 1864, il fonda lindustrie cossaise des algues. 2 Figure 1 : portrait dE.C.C. Stanford
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Il avait collect de nombreux renseignements sur les substances utilises par les habitants de ces rgions en tant que colorants et aussi en tant que mdicaments. Il a manifest une grande attention lutilisation des algues du large et ceci le conduisit breveter un procd de prparation de lalginate partir de ces vgtaux (notamment des laminaires) par diverses techniques, en particulier le bicarbonate de sodium, et en vue dusage mdicaux : lalginate de fer tant lun des sels le plus insipides de ce mtal, le got de ce mtal tant gnant pour les usages pharmaceutiques. Une de ses dernires recherches a port sur les composs iods de la thyrode de laquelle il a extrait une prparation rpute contenir le principe total de la glande dans sa combinaison naturelle, la thyroxine (Pharm. J., 1899,1964).
II. Classification
Les alginates sont classs dans les collodes. En effet, le mot collode dsigne toute substance comportant deux phases distinctes, et dont les particules d'une phase, discontinue, sont trs petites, et diffusent dans l'autre phase. On distingue diffrentes catgories de collodes selon la nature des phases en prsence. Dans le cas de lalginate, la phase disperse correspond une phase liquide alors que le milieu correspond une phase solide afin dobtenir un gel, tout comme la glatine qui est galement, comme on peut le voir sur le tableau 1, un collode. Pour prciser la classification on peut dfinir lalginate et la glatine comme des hydrocollodes car ils sont solubles dans leau o ils se dissolvent pour former un gel avec des proprits rhologiques particulires. Lorsque un collode est issu dalgues, on parle de phycocollodes. Une des sources majeures de la production dalginate est une extraction partir de certaines algues qui seront cits dans les paragraphes suivants. On peut donc galement regrouper lalginate dans les phycocollodes. Les principaux collodes extraits des algues sont des polysaccharides qui constituent gnralement la matrice extracellulaire de ces organismes.
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Tableau 1 : diffrents types de collodes existant en fonction des deux phases en prsence (daprs http://fr.wikipedia.org/wiki/Colloide )
Phase disperse Milieu / Phase Gaz Liquide Solide
Aucun Gaz (Tous les gaz sont miscibles)
Arosol liquide Exemples : brouillard, brume, nuage
Arosol solide Exemples : fume, particules ariennes
Mousse Milieu continu Liquide Exemples : crme fouette, mousse au chocolat
mulsion Exemples : lait, mayonnaise, savon liquide
Sol Exemples : peinture, encre
Mousse solide Solide Exemples : arogel, polystyrne expans,
Gel Exemples : glatine, gele, fromage, alginate
Sol solide Exemple : verre
Les polysaccharides sont des polymres dous dune capacit de glification. En effet il est ncessaire que ces vgtaux soient relativement flexibles en raison de leur environnement. En milieu marin la gravit exerce sur ces vgtaux est diffrente de celle observe sur les vgtaux terrestres. A lheure actuelle trois principales classes dalgues sont utilises et chacune dentre elle possdent ses polysaccharides caractristiques : lacide alginique et les fucanes pour les Phaeophyceae les carraghnanes et lagar-agar (glose) des Rhodophyceae les polysaccharides complexes des Chlorophyceae. 4
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La constitution de chacun de ces polysaccharides varie et on retrouve des monosaccharides diffrents pour chaque type comme lindique la figure 2.
Figure 2 : monosaccharides prsents dans les diffrents polysaccharides des algues (Jouanneau, 2010)
Dautres polymres sont galement prsents comme la cellulose des Chlorophyceae, les mannanes, les xylanes, lhmicellulose, les pectines, ect (Bruneton, 1999).
Les polysaccharides cits ci-dessus sont considrs comme des polysaccharides structuraux puisquils dfinissent la structure principale de ces vgtaux et constituent principalement la paroi des vgtaux (figure 3).
Cependant ct de ces derniers polysaccharides, il existe des polysaccharides nomms de rserve tels que lamidon par exemple. 5
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Figure 3 : schma simplifi de leur paroi des algues brunes (Jouanneau, 2010)
III. Les diffrentes sources dalginates
On trouve deux sources principales dalginate : les bactries et essentiellement les algues brunes. III.1. Les bactries III.1.a. Rle de la production dalginate chez les bactries
Lalginate peut tre produit par des bactries arobies fixatrices dazote telles que Azobacter vinelendii et la bactrie pathogne opportuniste Pseudomonas aeruginosa. La production partir dalgues brunes est beaucoup plus courante de par son prix beaucoup plus attractif qu partir des bactries. Cependant cette technique est dpendante des conditions climatiques et de pollution ; cest pourquoi la commercialisation dalginates bactriens issus dA. vinelandii se dveloppe. De plus, la production bactrienne permet une parfaite matrise de la structure de la chane polymre grce au progrs de la gnomique (Mjahed, 2009). Dans le cas des bactries, seule A. vinelandii est utilisable car elle est la seule produire un alginate prsentant des structures de type copolymres en blocs.
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La production dalginate par les bactries prsente pour les bactries elle-mmes un rle trs important de protection. Le polysaccharide forme une capsule visqueuse, compose majoritairement d'alginate et d'un autre expopolysaccharide qui entoure P. aeruginosa et lui permet de se protger de l'action non spcifique des cellules phagocytaires, de la dshydratation et des antibiotiques.
Les alginates reprsentent l'un des principaux facteurs de virulence de P. aeruginosa, en provoquant l'augmentation de l'adhrence de la bactrie sur les cellules de l'pithlium trachobronchique. De plus, l'augmentation de la viscosit du mucus par la prsence de ces exopolysaccharides tend diminuer l'activit ciliaire et donc l'limination du mucus pulmonaire infect. Les alginates, en formant une capsule autour de la bactrie, vont la protger de l'action des antibiotiques, et lui permettre d'chapper au systme immunitaire et la phagocytose (http://www.ephe.univ-montp2.fr/)
III.1.b. Voie de synthse de lalginate chez les bactries
La biosynthse de lalginate chez Pseudomonas aeruginosa se ralise en deux tapes successives :
La premire tape utilise la voie de Enter-Doudoroff, voie secondaire du
mtabolisme du glucose : le produit darrive de cette voie est le fructose-6-phosphate. La particularit de cette voie mtabolique chez P. aeruginosa est son caractre cyclique qui permet la formation de fructose-6-phosphate alimentant la voie de biosynthse des alginates partir du cycle de Krebs.
La deuxime partie est identique celle dcrite pour les algues : le fructose-6-
phosphate est transform en alginate par une cascade enzymatique (voir plus loin 2.b).
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III.2. Les algues III.2.a. Intrt
Lutilisation des algues est une pratique courante et ancienne en Extrme-Orient notamment dans lalimentation : au japon on consomme rgulirement du Nori (prparation partir de Porphyra), du Kombu (laminaria schs), ou encore du Wakame (Undaria sals ou schs). La consommation en France, bien quencore marginale, crot de faon rgulire de mme quen Europe. En effet, ces vgtaux suscitent un intrt croissant du fait de leur pauvret en lipides et de leur richesse en polysaccharides non digestibles (souvent reconnus comme fibres alimentaires) et en lments minraux (tels que liode, le fer) et vitamines. Pour exemple la France reconnu en 1990, onze espces dalgues comme lgumes occasionnels ou comme condiments dont notamment : Fucus vesiculosus, Ascophyllum nodosum, Cependant ces algues doivent rpondre une rglementation bien particulire et principalement des critres toxicologiques et microbiologiques prcis : taux limit en arsenic, iode, cadmium, mercure, coliformes, Clostridium. Cest pourquoi la production mondiales dalgues est en constante augmentation et reprsente aujourdhui 90% de lapprovisionnement du march. En 2005 la production mondiale reprsentait 7,8 millions de tonnes dalgues brunes et 4,8 millions dalgues rouges. Les principaux pays producteurs sont la Chine, lIndonsie, le Japon et les Philippines. Les algues prsentent galement un intrt conomique intressant. Le principal march des algues est lindustrie agro-alimentaire. En effet ces vgtaux sont une source importante de polysaccharides aux proprits paississantes et glifiantes. La production la fin des annes 1980 reprsentait 55000 tonnes dalginates, dagar-agar et de carraghnanes (Bruneton, 2009). La pharmacie est galement une industrie qui sintresse de prs aux algues pour les proprits rhologiques des gels obtenus avec ces collodes. Cependant elle sintresse galement aux proprits thrapeutiques des mtabolites secondaires tels que les terpnoides, les polyphnols halogns ou les substances azotes.
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Bien dautres dbouchs soffrent aux algues galement : lindustrie agricole pour la production de fertilisants, la cosmtique, la thalassothrapie,
III.2.b. Voie de synthse de lalginate chez les algues (figure 4)
Le fructose-6-phosphate (voir 1.b.) est converti en alginate lors de cette deuxime tape.
Les tapes de biosynthse dbutent par la conversion en mannose-6-phosphate par la phosphomannose manno-mutase isomrase. La phosphodans la
(PMM)
intervient
deuxime tape en catalysant la conversion du mannose-6-phosphate en mannose-1-phosphate en prsence de glucose 1-6-di-phosphate. Puis une troisime enzyme, la GDPmannose pyrophosphorylase (GMP) catalyse la formation de GDP-mannose par fixation d'un GTP sur le mannose-1-phosphate. Le GDPmannose dshydrognase (GMD), dernire enzyme cytoplasmique connue de la chane de Figure 4 : Voie de synthse de l'alginate chez les algues brunes (Jouanneau, 2010) biosynthse, catalyse la double oxydation du GDP-mannose en GDP-mannuronate avec la rduction de 2 NAD+.
Par la suite, lacide mannuronique va tre converti en mannuronane par action de la mannuronane synthase qui va entraner la libration dune molcule de GMP et dun phosphate inorganique.
Pour former de lalginate, une enzyme trs importante entre en jeu : la mannuronane C5-pimrase qui permet la transformation du mannuronane en alginate. Cette pimrase 9
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permet la conversion dune conformation M du mannuronate en conformation G , c'est-dire en guluronate (figure 5).
Figure 5 : mcanisme d'action de la C5-pimrase (Jouanneau, 2010).
III.2.c. Description botanique des principales familles dalgues productrices dalginate (Bruneton, 1999 et Paris, 1976).
Lalginate de sodium, substance mucilagineuse issue des algues brunes, est un polysaccharide naturel. Les principaux organismes constitus dalginate sont les algues brunes. En effet ces dernires en sont constitues pour plus de 40 % de leur poids sec et le produit constitue le polysaccharide le plus abondant de ces organismes. Lacide alginique est un constituant quasiment constant chez les Phaeophyceae. Cette classe regroupe les algues benthiques ou plagiques dont les plastes renferment de la chlorophylle a et c, du -carotne et des xanthophylles spcifiques (fucoxanthine), dont la matrice intercellulaire est essentiellement constitue dalginates et de fucanes et dans les vacuoles cellulaires desquelles laminarianes et mannitol accompagnent des drivs du phloroglucinol. Les principales algues dont est extrait lalginate sont celles qui appartiennent aux familles des Laminaires et des Lessoniaceae (figure 6).
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Lalginate contenu dans les algues est un mlange dalginate de calcium, sodium et potassium. Laminaires, macrocystis et fucus sont les principaux genres actuellement utiliss pour lobtention, par lindustrie, de lacide alginique et des alginates. Dautres Phaeophyceae sont galement utilisables pour la production dacide alginique : elles appartiennent aux genres Ascophyllum, Ecklonia, Nereocystis, Durvillea.
Figure 6 : classification phylogntique des principales espces d'algues productrices dalginate (Jouanneau, 2010)
Laminaires, Laminaria spp., Laminariaceae
Les principales espces utilises sont Laminaria digatata et Laminaria hyperborea. Les laminaires sont des algues de grande taille, de couleur brun olivtre. Le stipe (figure 7) adhre aux roches par des crampons fixateurs et le thalle peut atteindre 2 3 mtres de long. Chez les deux espces cites ci-dessus, il est large la base, puis divis en lanires plus ou moins larges. Le stipe des laminaires gonfle fortement dans leau et son diamtre peut atteindre 10 11
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fois celui du stipe sec. Ce sont les cellules de la zone moyenne qui gonflent en shydratant, mais le stipe conserve sa forme et une certaine rigidit en raison des cellules de lassise externe parois paisses. La rcolte de ces algues se fait sur les ctes de la mer du Nord, de la Manche et de lAtlantique nord. Elles sont rcoltes une vingtaine de mtres de profondeur. En Bretagne, plusieurs milliers de tonnes de ces algues sont rcoltes annuellement. Les laminaires sches renferment
encore environ 12% deau et 15% de matires minrales : chlorure, sulfates, iodures. Liode est particulirement abondant chez ces algues et peut atteindre 0,5% du poids sec. Figure 7 : Laminaria digitata http://manger-la-mer.org/. La plante sche renferme moins de 1% de lipides, 5% de protides et 65% au moins de glucides.
Ceux-ci sont reprsents par : du mannitol en quantit importante (12 15%) des glucides condenss solubles (15 40%) : o o fucodane (cf. fucus) ; laminarane. La teneur en laminarane varie beaucoup au cours de
la vgtation. Presque nulle au dbut du printemps, elle augmente en t, est maximale en septembre (jusqu 35% du poids sec). Elle peut tre extraite par un acide dilu et prcipite par neutralisation. de lalgine : 15 40% du poids sec. Les laminaires sont parmi les plus
importantes matires premires pour la prparation de lalginate.
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Fucus, Fucaceae
Les deux principales espces utilises sont Fucus serratus L. et Fucus vesiculosus L. (figure 8).
Figure 8 : Fucus vesiculosus et Fucus serratus

http://www.biopix.com/ http://abacus.bates.edu/
Ces algues prennes abondent sur les ctes des mers tempres et froides de lhmisphre Nord. En Manche, elles colonisent lespace de balancement des mares. Les frondes forment des lames foliaces de 20 centimtres 1 mtre de long, dun brun plus ou moins olivtre ; linaires la base, elles sont ramifies dichotomiquement et parcourues par une nervure mdiane. Chez F. serratus, la marge est dcoupe en dents de scie ; lextrmit des frondes existent des conceptacles anthridies et archgones, renfls et visqueux. Chez F. vesiculosus, il y a tout le long des nervures des vsicules arifres, ovodes ou circulaires. Lors de la rcolte, on ramasse le gomon de rive rejet par les flots et on arrache le gomon de rive ou de fond mare basse, aux grandes mares dautomne. Le tout est ensuite sch au soleil. La drogue sche se prsente alors comme des lames noirtres de consistance corne avec des efflorescences blanchtres odeur de mare et saveur mucilagineuse. Le thalle sch de ces deux espces est par ailleurs inscrit la 10me dition de la Pharmacope franaise. A ltat sec, ces algues renferment encore 10 12% deau mais galement 15% de matires minrales, 1 2% de lipides, 4 5% de protides et environ 65% de glucides. 13
LES ALGINATES
De plus ces algues sont constitues : de cellulose en petite quantit ; dalgine qui reprsente 18 28% du poids sec ; de fucodane : ce glucide de rserve, soluble dans leau, est constitu
par des units de L-fucose lies en 1-2 sous forme -glucosidique et portant des groupes esters sulfuriques en C4 ; de laminariane (cf. laminaires).
Par ailleurs, les fucus ont une teneur apprciable en vitamine C et provitamine A.
Macrocystis, Lessoniaceae
La principale espce utilise dans cette famille est Macrocystis pyrifera (figure 9). Elle appartient aux algues gantes (50 100 m) de locan Pacifique. Elles sont plus particulirement prsentes sur les ctes californiennes, o 120.000 tonnes sont rcoltes chaque anne. Cette algue prsente une lame divise en folioles unilatrales base renfle en une vsicule creuse qui assure la flottaison en surface. La division de la lame se poursuit dans le stipe, donnant celui-ci un aspect ramifi.
Figure 9 : Macrocystis pyrifera www.picsdigger.com
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IV. Proprits physico-chimiques

IV.1. Dfinition de lacide alginique selon la Pharmacope Europenne, 6me dition. 2006.
Lacide alginique est un mlange dacides polyuroniques [(C6H8O6)n] constitus par des rsidus de lacide D-mannuronique et de lacide L-guluronnique. Il est obtenu principalement partir dalgues appartenant la famille des Phophyces. Une petite proportion des groupes carboxyles de lacide alginique peut tre salifie. Lacide alginique contient au minimum 19,0% et au maximum 25,0% de groupes carboxyles (COOH), la teneur tant calcule par rapport la substance dessche. .
IV.2. Caractres organoleptiques issus de la Pharmacope Europenne, 6me dition
Lacide alginique est une poudre cristalline ou amorphe, blanche ou brun-jaune ple, trs peu soluble dans leau et pratiquement insoluble dans lalcool et dans les solvants organiques. Il gonfle dans leau mais ne sy dissout pas. Il se dissout dans les solutions dhydroxydes alcalins. Ses sels monovalents sont quant eux parfaitement hydrosolubles.
IV.3. Identification La 6me dition de la Pharmacope europenne prvoit 3 tests didentification : deux tests de glification et un test de coloration : - les tests de glification montrent que lalginate mlang dans de leau et du carbonate de sodium prend en masse en prsence de chlorure de calcium mais ne se glifie pas en prsence de sulfate de magnsium. - le test de coloration montre que lalginate en milieu aqueux, alcoolique et acide en prsence de 1,3-dihydroxynaphtalne et chaud donne une couleur rouge-bleue intense extractible par lther isopropylique.
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IV.4. Structure
Lacide alginique est un polymre linaire constitu de deux acides uroniques, lacide D-mannuronique (M) et lacide L-guluronique (G) (figure 10).
Figure 10 : monomres de mannuronate M et de guluronate G (Jouanneau, 2010)
Ce polymre est constitu de plusieurs units dont le nombre varie de 100 3000. La liaison entre les monomres est de type -(1-4). Ces acides sont prsents dans le polymre sous forme de blocs homognes poly-M ou poly-G spars par des rgions o ils peuvent alterner (G-M-G-M) (figure 11).
Figure 11 : polymre d'alginate constitu des monomres M et G lis en 1-4. Lalternance des monomres forme diffrents types de blocs : MM, MG, GG (Jouanneau, 2010).
A ltat natif, lalginate existe sous forme de sels mixtes (sodium, magnsium, calcium,...) dont une partie doit tre lie aux fucanes. Les proportions relatives des deux acides varient selon lorigine botanique de lalginate (tableau 2). La longueur des blocs, leurs proportions et leurs squences sont galement dtermines par lidentit botanique de lchantillon considr et par de nombreux autres facteurs : date de rcolte, partie de la plante utilise (stipe, fronde, rceptacle,).
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Tableau 2 : proportion variable des diffrents blocs MG, MM et GG en fonction des diffrentes espces d'algues (http://www.fmcbiopolymer.com/).
La proportion, la distribution et la longueur des blocs dtermine les proprits physicochimiques des molcules dalginate.
IV.5. Proprits physico-chimiques des alginates en solution-formation des gels dalginate (Stecquert, 2002).
Les proprits physico-chimiques des solutions et des gels dalginate en milieux aqueux dpendent de leur structure, cest--dire de la proportion de rsidus mannuroniques par rapport aux rsidus guluroniques (rapport not M/G) ainsi que du nombre et de la longueur des blocs MM, GG et MG. La solubilit des alginates en solution aqueuse dpend du degr dionisation des groupements carboxyliques ports par les units monomres. Ainsi, les alginates monovalents sont parfaitement solubles dans leau si on leur associe des cations alcalins monovalents car les groupements carboxyliques prsents dans les molcules dalginate sont ioniss. Par contre, lacide alginique est insoluble dans les solutions aqueuses. Il prcipite quand le pH est infrieur 3,5. On peut parler de pKa de lacide alginique. Lacide mannuronique a un pKa de 3,38 et lacide guluronique un pKa de 3,65. Le pKa apparent de lacide alginique varie de 3,7 4,2 en fonction de sa composition.
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LES ALGINATES
Les solutions aqueuses dalginate sont trs visqueuses. En effet, lalginate est un polylectrolyte qui contient des fragments poly(-L-guluronate) rigides. La relative rigidit de lalginate se traduit par un rayon de giration1 lev en solution. La prsence de groupements chargs sur la chane et le rayon de giration lev expliquent la viscosit relativement leve de lalginate. Cette proprit des alginates est utilise dans lindustrie : ils servent dpaississant, surtout dans lindustrie agro-alimentaire.
Les alginates de sodium se dissolvent dans leau en formant des solutions collodales visqueuses comportement pseudolastique et ce pour de faibles concentrations. Laddition progressive de cations divalents (Ca2+ par exemple) provoque la formation dun gel lastique, non thermorversible : les segments guluroniques conformation plisse retiennent les ions calcium par coordination, en cooprant avec une chane parallle.
Les ions calcium sassocient prfrentiellement aux fragments poly-guluronate plutt quaux fragments poly-mannuronate (figure 12). En effet, les blocs poly-guluronate, en raison
Figure 12 : liaisons covalentes des ions calcium avec les rsidus poly-G des polymres d'alginate (Stequert, 2009).
de leur conformation spatiale, permettent une chlation plus nergtique des ions. Ces derniers sont retenus dans une cage et interagissent avec les fonctions carboxylates et les atomes doxygne des fonctions hydroxyles. Les ions calcium sont beaucoup mieux retenus que par de simples liaisons ioniques. Cet enchanement rgulier de type egg box (figure 13) se reproduit priodiquement : il se forme un rseau tridimensionnel zones organises relies par les segments poly-M ou poly-(M-G).
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distance moyenne entre une extrmit de la chane et le centre de masse de la structure
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Figure 13 : rtention du calcium par un rseau tridimensionnel de segments poly-M ou polyG dfinissant une structure de type "egg-box" (www.cargilltexturizing.com/).
La structure du polymre est donc llment dterminant du comportement rhologique des gels dacide alginique : la proportion des blocs poly-G et leur longueur conditionnent la formation et la force des gels obtenus en prsence de calcium. On peut dailleurs remarquer que, in vivo, les tissus les plus anciens dans lvoution et les plus rsistants sont aussi les plus riches en acide L-guluronique.
Dans le cas de la glification avec les ions calcium, il existe trois tats physiques diffrents selon la concentration de cet lment. A trs faible concentration, il y a formation dagrgats (microgel) qui provoquent une diminution de la viscosit de la solution dalginate. Puis partir dune certaine concentration, les macromolcules se rarrangent pour former un rseau tridimensionnel (gel continu) (figure 14). Si la concentration en calcium augmente encore, on observe un phnomne de synrse 2 (gel continu avec dmixtion) d une diminution du taux de gonflement des chanes dalginate avec expulsion deau hors du rseau.
Par ailleurs certaines tudes ont montr que la glification de lalginate dans une solution ne contenant que des ions calcium conduit la formation dun gel non homogne. En effet, la diffusion des ions calcium provoque une glification de billes dalginate de lextrieur vers lintrieur. Lalginate a alors tendance migrer vers la zone de glification. De ce fait, il stablit un gradient de concentration en alginate lintrieur du gel. Cest un phnomne que lon souhaite viter, car il complique singulirement le calcul du coefficient de diffusion.
sparation d'un liquide de son gel.
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LES ALGINATES
Figure 14 : effet de l'ajout de calcium dans une solution d'alginate : en haut gauche les polymre polyM et polyG ne sont pas relis. Avec lajout dune concentration faible en calcium, on observe un assemblage des chanes. En haut droite cette figure montre que plus on ajoute de calcium, plus le rseau tridimensionnel est li et donc rigide (Jouanneau, 2010)
Pour obtenir un gel homogne, il faut ajouter du chlorure de sodium la solution de chlorure de calcium qui sert glifier lalginate, ainsi qu la solution dalginate. Ainsi lalginate na plus tendance se dplacer vers la zone de glification, car la prsence dions sodium conduit un quilibre des charges.
IV.6. Les gels dalginate et leurs proprits (Mjahed, 2009).

La glification de lalginate peut seffectuer par diffusion ou dialyse ou par processus interne. Dans le premier cas, les ions calcium diffusent dans la solution ou au travers des membranes de dialyse, mthode qui est applique pour la formation de gels de grandes dimensions. La diffusion est surtout utilise pour lobtention de billes, de fibres et de films ou lorsque le gel est employ pour immobiliser des cellules ou pour amliorer les proprits organoleptiques daliments. La seconde mthode, la glification interne, est trs employe dans lindustrie alimentaire. Pour cela, des ions calcium inactivs par chlation ainsi quun agent retardateur sont mlangs la solution dalginate. Lagent retardateur libre des protons qui permettent de librer des ions calcium dans la solution, do lappellation de glification interne.
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LES ALGINATES
Les paramtres physico-chimiques importants des gels sont : la rigidit, la densit du rseau, les phnomnes de gonflement/dgonflement , la nature chimique de lion divalent, le rapport mannuronate/guluronate dans lalginate, sa masse molculaire et sa concentration. En ce qui concerne lion divalent, il peut tre class dans lordre dcroissant suivant laffinit ci-aprs : Pb = Cd > Ba > Ca = Sr >> Mg. Par ailleurs laffinit pour ces mtaux varie selon la constitution de lalginate : laffinit est suprieure pour les alginates riches en guluronate. Les polymres blocs GG contractent une liaison forte avec le calcium, suprieure celle des autres blocs. La prsence de tel blocs influence les proprits rhologiques des gels et la vitesse de diffusion des soluts en leur sein. Ceci pourrait sexpliquer par le fait que les longs blocs GGG associs de courts segments lastiques gnrent la formation dun rseau ouvert, rigide et statique, alors que les gels faible taux de guluronate se caractrisent par de longs segments lastiques et des structure dynamiques (figure 15).
Laugmentation de la concentration de lalginate, surtout sil est de masse molculaire leve, induit une plus grande rigidit du gel. Enfin les conditions de glification influent sur les proprits mcaniques : il existe une relation entre la temprature et la rapidit de la glification : une temprature basse est responsable dune diminution de la diffusion du calcium do une glification plus lente, une structure plus ordonne et donc une plus grande cohsion.
Figure 15 : rseaux de gels forms partir dalginate possdant des blocs dacide guluronique de longueurs diffrentes : gauche, taux de M lev ; droite, taux de G lev conduisant un rseau mieux organis et plus rigide.( http://www.genialab.de/inventory/jpeg/alginate_network.jpg )
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IV.7. Stabilit et dgradation des gels Les gels dalginate de calcium ne sont pas solubles dans leau. Toutefois cette dissolution peut sobtenir si lon dplace les ions calcium par un chlatant ou par de fortes concentrations de sodium ou magnsium. En effet le dplacement du calcium diminue le rticulation du gel et accrot son instabilit. Il est galement possible de traiter les gels par des tampons phosphate 0,1M ou citrate 0,1M.
A linverse cette dissolution peut tre empche par la prsence en solution dions calcium libre dans un rapport adquat. Les gels peuvent aussi tre dgrads par hydrolyse acide.
V. Extraction de lalginate (http://www.fao.org/)

V.1. alginate de sodium
Selon lalgue utilise et les produits dsirs, plusieurs techniques sont possibles. Pour rcuprer lalginate de sodium, il existe deux techniques.
Les premires tapes (figure 16) consistent broyer lalgue sche puis la mettre en suspension dans une solution chaude de carbonate de sodium pendant environ deux heures. Au cours de cette tape lalginate se dissout sous forme dalginate de sodium. Les rsidus des algues sont ensuite retirs. La solution tant trs visqueuse, il est ncessaire de la diluer pour pouvoir la filtrer.
Aprs filtration on obtient une solution dalginate de sodium. Les tapes ci-dessus sont communes aux deux techniques. Les tapes suivantes diffrent et consistent faire prcipiter lalginate de la solution filtre.
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LES ALGINATES
Figure 16 : premires tapes de l'extraction de l'alginate chez les algues brunes : obtention d'une solution d'alginate de sodium
V.1.a. 1re technique : passage par lacide alginique (figure 17)
La premire technique consiste ensuite ajouter un acide. On obtient alors de lacide alginique sous forme de gel, insoluble dans leau. Il faut alors extraire le gel de la phase aqueuse. Pour cette dernire extraction, la filtration ntant pas possible, la flottation est utilise. La flottation est une technique de sparation base sur des diffrences d'affinit pour leau des matriaux sparer. Lors des premires tapes, un excs de solution de carbonate de sodium est utilis. Ce carbonate est donc toujours prsent dans lextrait et forme lajout de lacide du dioxyde de carbone gazeux qui schappe sous forme de fine bulles. Ces bulles se fixent sur les morceaux dacide alginique qui remontent alors la surface o ils peuvent tre rcuprs en continu. Le racteur contient alors une masse dacide alginique sous forme de gele qui ne reprsente que 1 2 % dacide alginique pour 98-99% deau. Ce pourcentage doit tre rduit. Lutilisation dune presse vis est satisfaisante. Certains processus placent le gel dans des paniers dans un cylindre de centrifugation et un filtre. La centrifugation peut amener lacide alginique 7-8% et cela est suffisant si lalcool doit tre utilis dans ltape suivante. Lacide 23
LES ALGINATES
est plac dans un mixer et une quantit suffisante dthanol ou disopropanol est additionne jusqu lobtention dun mlange eau-alcool 50-50. A ce moment du carbonate de sodium solide est ajout graduellement jusqu ce que la pte rsultante atteigne le pH dsir. La pte dalginate de sodium peut tre extrude sous forme de boulettes sches au four et pulvrises.
Figure 17 : extraction de l'alginate de sodium partir de la solution obtenue lors de la premire tape : technique de l'acide alginique
V.1.b. 2me technique : passage par lalginate de calcium (figure 18)
Quand un sel soluble de calcium tel que du chlorure est ajout lextrait filtr, lalginate de calcium solide se forme. Si la solution calcique et lextrait filtr sont mlangs soigneusement, lalginate de calcium peut tre form sous forme de fibres alors quun mauvais mlange donne une masse glatineuse. Le matriel fibreux peut tre rapidement spar sur un crible mtallique et lav leau pour enlever lexcs de calcium. Il est ensuite agit en milieu acide dilu, converti en acide alginique qui conserve sa forme de fibres. Cette forme peut tre aisment presse sur un filtre.
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Cette compression doit tre applique trs graduellement sinon le rsultat attendu ne sera pas atteint. Le produit issu de cette opration est relativement solide et contient seulement 20 25 % dacide alginique. Cependant il est suffisamment sec pour former une pte quand du carbonate de sodium est mlang avec lui dans un agitateur adquat jusqu ce que le pH dsir soit atteint, pour le convertir en alginate sodique. La pate est extrude en boulettes, sche au four et pulvrise.
Le dsavantage de cette mthode, compar la prcdente, est quune tape supplmentaire est ajoute au processus, mais lavantage est que lobtention de lalginate fibreux et de lacide est plus simple et que lalcool nest pas ncessaire. En effet lalcool est cher et comme il est gnralement rcupr et recycl, et que le recyclage natteint jamais 100%, son usage augmente les cots.
Figure 18 : extraction de l'alginate de sodium partir de la solution obtenue lors de la premire tape : technique de l'alginate de calcium
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V.2. autres alginates
Lalginate de sodium est la forme la plus utilise. De petites quantits dacide alginique et de sels de calcium, dammonium et de potassium et lester de propylne-glycol sont aussi produits. Lalginate de calcium et lacide alginique sont obtenus durant la prparation de lalginate sodique ; chacun peut tre rcupr au moment appropri et, aprs lavage, tre sch et pulvris la taille voulue. Les autres sont obtenus par neutralisation de lacide humide avec la base approprie, gnralement de lammoniaque ou du carbonate de potassium, une quantit suffisante deau ou dalcool tant ncessaire pour conserver le produit consistance souhaite. Lalginate de propylne-glycol a des proprits et des usages diffrents des autres sels. Il a t brevet pour la premire fois en 1947 et a fait lobjet de nombreux autres brevets quant sa mthode de prparation. Il est obtenu en partant dacide alginique humide quon fait partiellement ragir avec du carbonate de sodium et qui est trait par de loxyde de propylne liquide sous pression pendant 2 heures a 80 C, le produit tant ensuite sch et pulvris.
V.3. Autres paramtres importants de la production
Il sagit de la couleur du produit fini, de lapprovisionnement en eau et de llimination des dchets. V.3.a. Couleur
Si les algues originales sont trs colores, par exemple Ascophyllum, lextrait alcalin sera aussi trs color et le processus conduira finalement un produit sombre qui se vend peu cher parce que ses usages sont limits des applications techniques. Les algues plus lgrement colores telles que Macrocystis, donnent un produit peu color utilisable pour lalimentation et dautres applications. 26
LES ALGINATES
La couleur peut tre contrle par blanchiment au moyen dhypochlorite de sodium ajout lextrait alcalin filtr ou mme la pte ltape finale. Nanmoins il convient dtre attentif, car un blanchiment excessif peut abaisser la viscosit de lalginate, ce qui rduit sa valeur.
Une autre mthode est de tremper les algues dans une solution de formol avant lextraction alcaline. Le formol aide fixer les composants colors la cellulose des parois cellulaires, si bien que les colorants restent dans les rsidus quand lextrait alcalin est filtr.
V.3.b. Approvisionnement en eau
De grandes quantits deau sont ncessaires, spcialement lors de la dilution de lextrait pais et visqueux en vue dobtenir une solution de viscosit adapte la filtration. Une usine dalginate ne peut fonctionner quavec un abondant et constant approvisionnement en eau.
V.3.c. Elimination des dchets
Les eaux rsiduaires de la filtration sont alcalines et contiennent du calcium issu de ltape de prcipitation et de lacide issu de la conversion acide. Dans certains pays, les eaux sont rejetes la mer. Quand le respect de lenvironnement est plus grand ou quand les ressources en eau sont limites, le recyclage nest pas trop difficile et son cot peut tre abaiss par la diminution des quantits deau ncessaires.
Il convient de trouver le moyen de se dbarrasser des rsidus solides (algues et rsidus de filtration). Ils peuvent tre utiliss pour absorber les mtaux lourds dans les rsidus liquides industriels, et des essais pour produire de lthanol par fermentation de la cellulose ont t raliss, mais ils apparaissent moins intressants en terme conomique.
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LES ALGINATES
VI. Les diffrents emplois de lalginate

De par ses diverses proprits collodales, cest- dire la rtention deau, la glification et la stabilisation des mulsions, les alginates sont employs dans de nombreux domaines.
Ces proprits sont utilises dans de nombreuses industries et notamment dans le textile : lalginate donne la rhologie souhaite pour les ptes et teintures. Limprimerie les emploie dans les encres pour en amliorer la viscosit mais galement dans les livres o ils possdent des proprits anti-graisse, augmentent la rsistance lhuile, la prise dencre et limprimabilit.
Lalginate trouve un emploi jusque dans le domaine de la soudure. La fabrication des baguettes souder y a recours dans ltape de schage et de cuisson pour apporter un effet lubrifiant et liant.
Lindustrie alimentaire est un gros consommateur dalginates pour des emplois varis. Les additifs alimentaires sont les suivants : lacide alginique E400, lalginate de sodium E401, lalginate de potassium E402, lalginate dammonium E403, lalginate de calcium E404 et lalginate de propylneglycol E405.
Ils sont retrouvs dans les laits glifis en vue de la prparation de desserts lacts, dans les geles alimentaires pour leurs proprits glifiantes. Les glaces et les yaourts contiennent galement de lalginate pour amliorer la texture et la saveur : ces produits deviennent alors plus onctueux. Dans les crmes glaces et les sorbets, cet additif empche la formation de cristaux. Par ailleurs un rle secondaire dans cet industrie est leffet stabilisant des alginates. Ce phnomne est notamment trouv dans les jus de fruits. Les aliments reconstitus sont galement utilisateurs dalginates pour leur grande capacit de glification, leur stabilit la chaleur et leur maniabilit qui permettent de former le produit final facilement (exemples : poissons pans, jambons, cordons bleus). Dans la bire, lalginate permet de maintenir un taux de mousse suffisant.
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LES ALGINATES
Le
milieu
mdical
fait
aussi
partie
des
consommateurs dalginates. Des inserts oculaires ont t mis au point base dalginate. Ils sont constitus dun rservoir central charg en pilocarpine dans une matrice dacide alginique : ce sont les Ocusert (figure 19). Ces implants permettent le traitement du glaucome. Dautres applications dans le domaine du remplissage vasculaire utilisent lalginate comme modificateur de la viscosit des prparations. Figure 19 : insert oculaire contenant de l'alginate : Ocusert
Les chirurgiens-dentistes se servent de lalginate pour effectuer des moulages dentaires en vue de la prise dempreintes. Lavantage de ce produit est quil est hypoallergnique. Cette mme proprit est applique pour les moulages des parties du corps au cinma afin crer des effets spciaux (figure 20). Figure 20 : moulage du visage ralis avec de l'alginate Les proprits adoucissantes, filmognes, hydratantes font des alginates de bons composs pour les produits de beaut. En effet, ils ont la capacit former des prparations qui stalent bien sur la peau et sont agrables au toucher.
La cuisine moderne appele cuisine molculaire, sest inspire des diffrentes applications dj connues des alginates afin de les appliquer dans son domaine. Cest ainsi que les cuisiniers lutilisent aujourdhui pour former des billes remplies de diffrents produits gustatifs (figure 21). Figure 21 : billes d'alginate contenant un colorant vert ainsi qu'un arme pour la cuisine molculaire
Les applications en pharmacie et dans lingnierie tissulaire seront dtailles dans les parties suivantes.
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PARTIE II : LALGINATE : UN PRINCIPE ACTIF
LALGINATE : UN PRINCIPE ACTIF
A/ LES PANSEMENTS CUTANES

I. Les plaies (http://www.univ-rouen.fr/servlet/com)
Il existe plusieurs types de plaies : les plaies aigues et les plaies chroniques. Les plaies aigues sont des plaies traumatiques qui gurissent souvent spontanment. En revanche les plaies chroniques ne gurissent souvent pas spontanment et ncessitent de long soins.
Les pansements lalginate sont principalement utiliss au cours des plaies chroniques afin de traiter des plaies telles que, par exemple, les ulcres de jambe, les escarres, que nous allons dvelopper.
I.1. Lulcre de jambe I.1.a. Dfinition
Il se dfinit comme une plaie cutane chronique, situe sous le genou et nayant pas de tendance spontane la cicatrisation. Si la cicatrisation excde les 6 semaines, il sagit dune plaie chronique. I.1.b. Etiologies
La complication dune maladie vasculaire constitue plus de 90% des causes dulcre de jambe. Cependant dautres tiologies sont galement possibles telles que les vascularites, certaines dermatoses neutrophiliques, certaines infections cutanes profondes (quelles soient dorigine bactrienne, parasitaire ou mycosique) ou encore des carcinomes cutans primitifs ulcrs et certaines hmopathies.
Dans les 90% de causes vasculaires : 65% sont dorigine veineuse ; 5% dorigine artrielle ; 20% dorigine mixte artrio-veineuse mais toujours avec une prdominance soit veineuse dans 5% des cas, soit artrielle dans 15% des cas.
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I.1.c. Physiopathologie Ulcre veineux ou prdominance veineuse.
Il rsulte de lvolution dune insuffisance veineuse chronique qui elle-mme, peut tre secondaire aux varices qui entranent une reflux ou une insuffisance valvulaire profonde primitive. Il en rsulte une hypertension veineuse responsable dune altration des cellules endothliales, dune augmentation de la permabilit capillaire ainsi quun dme. Ces troubles de la microcirculation conduisent une hypoxie tissulaire qui induit lulcre (figure 22).
Figure 22 : ulcre veineux au niveau de la jambe.
Ulcre artriel ou prdominance artrielle
Ils sont souvent la consquence dune macroangiopathie oblitrante chronique des membres infrieurs. Les lsions cutanes observes (figure 23) rsultent dune fragilisation de la peau qui est la consquence directe de lischmie par dfaut de perfusion artrielle du membre.
Dans cette catgorie, on peut associer langiodermite ncrotique qui rsulte dune microangiopathie non inflammatoire associe une artriosclrose athromateuse ou qui survient au cours dun diabte mal quilibr. Cependant ce type dulcre est beaucoup plus rare, que les prcdents. 31
Figure 23 : ulcre de jambe prdominance artrielle sur le dos du pied
I.1.d. Aspect clinique Ulcre veineux ou prdominance veineuse
Il est caractris par une grande taille et des bords irrguliers ou encore dcrit en carte de gographie . Il est notamment diffrenci de lulcre artriel par sa localisation qui est principalement la rgion sus-mallolaire interne et la face interne de la jambe. Il peut cependant dborder largement de ces deux zones. De plus, lulcre veineux est peu profond et peu douloureux.
Enfin le fond de lulcre peut prsenter deux aspects diffrents : propre et bourgeonnant plutt caractris par un bon pronostic alors qu linverse sil est recouvert dun enduit jauntre, voire purulent, il est de mauvais pronostic.
En priphrie, on peut observer les signes de linsuffisance chronique tels que des lsions dermo-pidermiques galement appeles eczma variqueux (figure 24), des lsions de capillarite ou dermite ocre et enfin des lsions dhypodermite. Associs ces troubles trophiques, un dme veineux et des varices peuvent tre prsents.
Figure 24 : eczma variqueux 32
Il est plus frquemment situ au niveau des faces antrieure ou latrales de la jambe ou au niveau de la face dorsale du pied et des orteils. De plus lulcre artriel est douloureux et profond, avec une douleur exacerbe par le dcubitus. Il est caractris par une taille plus limite mais il peut tre multiple et surtout lemporte-pice, contrairement lulcre veineux.
La lsion pri-ulcreuse est froide, dcolore, lisse et dpile. Enfin des signes de linsuffisance artrielle peuvent tre aperus, tels que la claudication intermittente ou labolition de pouls.
I.1.e. Traitements Ulcre veineux ou prdominance veineuse
Le premier traitement est celui de la plaie en elle-mme. Il faut la nettoyer et la recouvrir de diffrents produits tels que des tulles neutres, des plaques dhydrocollodes ou dhydrocellulaires ou des alginates de calcium qui seront dtaills plus loin. Il est galement important de lutter contre ldme en portant une contention lastique mais galement en pratiquant une marche quotidienne et en surlevant de 10cm les pieds du lit.
Par ailleurs il est possible davoir recours la chirurgie pour le traitement des varices. Un stripping-crossectomie associ ou non une phlbectomie est ralis, mais on peut galement avoir recours une crossectomie en cas de contre indication lanesthsie gnrale. En complment de la chirurgie il est souvent ralis une sclrothrapie qui peut toutefois tre galement utilis en cas de contre-indication la chirurgie.
Au niveau mdicamenteux les veinotoniques ont peu dintrt ce stade. Enfin il est ncessaire dassocier des mesures hygino-dittiques, afin dviter le surpoids qui est un facteur de risque important mais lhygine locale est galement primordiale afin de permettre une cicatrisation la plus rapide possible.
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Le traitement de la plaie est identique celui des ulcres veineux, cependant la ralisation est limite par la douleur. En revanche la contention lastique est contre-indique pour lulcre artriel car elle favorise lischmie.
La chirurgie consiste dans ce cas raliser soit un pontage, soit une angioplastie. Il existe un traitement mdicamenteux qui est constitu de vasodilatateurs et danalogues de la prostacycline. I.1.f. Complications
Les complications sont quasi-identique pour les deux types dulcres : elles sont reprsentes majoritairement par : la surinfection microbienne, les lsions osto-articulaires, leczma de contact, lhmorragie, la cancrisation. Il faut galement prendre en compte le retentissement psychologique.
I.2. Lescarre I.2.a. Dfinition
L'escarre est une plaie conscutive une hypoxie tissulaire provoque par une pression excessive et prolonge (figure 25).
Figure 25 : schma de l'crasement des capillaires impliquant une hypoxie tissulaire responsable de la formation de l'escarre. (http://www.escarre.fr) 34
On distingue trois types descarres selon les conditions de survenue. L'escarre accidentelle est lie un trouble temporaire de la mobilit ou de la conscience, d une opration chirurgicale, une pathologie aigu, ... On l'oppose l'escarre neurologique, lie une pathologie neurologique avec troubles permanents de la mobilit ou de la sensibilit, et l'escarre multifactorielle des patients polypathologiques. I.2.b. Physiopathologie
La pression excessive qui crase les vaisseaux sanguins cutans et sous-cutans provoque une hypoxie tissulaire. Lescarre apparat quand la fermeture des vaisseaux se prolonge. La pression dcrite prcdemment est spcifique chacun et dpend galement des diffrentes parties du corps sur laquelle elle sexerce. On dfinit des zones risques telles que le sacrum et les talons qui reprsentent chacun 40% des escarres. Les autres localisations frquentes sont les ischions et le trochanter. Cette hypoxie est favorise par des vaisseaux sanguins en "mauvais tat", notamment cause d'un diabte, une hypertension, ou un tabagisme ancien, ou simplement du fait de leur vieillissement, ou une faiblesse de la teneur en oxygne du sang (anmie, infection pulmonaire, nicotine, ...). La faible teneur en oxygne ainsi apporte aux tissus provoque la mort de la peau et des muscles. La dgradation dbute de lintrieur des tissus pour atteindre ensuite lextrieur et former une plaie visible. Cest pourquoi sa gravit est souvent importante ds son apparition. De plus lvolution est trs rapide : en quelques heures seulement la plaie peut passer du stade drythme au stade dulcre par ouverture de la plaie (figure 26).
Figure 26 : Escarre talonnire au stade d'ulcre bourgeonnant
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I.2.c. Les facteurs de risques
Ces facteurs de risques sont trs importants dans la prise en charge du patient et permettent en partie lvaluation de la survenue dune escarre. Ils peuvent tre de deux types : extrinsques et intrinsques. Les facteurs extrinsques sont plutt de nature mcanique et sont la pression, la friction, le cisaillement (figure 27) et la macration cutane, alors que les facteurs intrinsques sont plutt dordre clinique et prennent en compte limmobilit du patient, les carences nutritionnelles, lincontinence, lhypoxie cellulaire, les troubles neurologiques (tels que la paraplgie, les neuropathies priphriques), les troubles psychologiques et enfin lge.
Figure 27 : schma du cisaillement, facteur de risque de survenue de l'escarre (http://www.escarre.fr) En plus des facteurs de risque il existe des facteurs de gravit qui compliquent la prise en charge de la plaie et allongent la dure de traitement. Ce sont principalement linfection, une ostite associe, et un dcollement priphrique et fistulaire. I.2.d. Classification
Il existe deux classifications : anatomiques et colorielle. Les classifications anatomiques sont au nombre de huit et sont rparties en trois groupes diffrents : les anatomiques proprement dites, les anatomo-cliniques et les cliniques. Ces dernires sont assez compliques. Cest pourquoi la classification colorielle, beaucoup plus simple demploi, est frquemment utilise. Elle se base sur la couleur de la plaie : rouge pour le bourgeonnement, jaune pour lexsudat ou la fibrine, noir pour la ncrose. La classification la plus utilise reste tout de mme la NPUAP (National Pressure Ulcer Advisory Panel) qui dtermine quatre stades de lescarre. 36
II. La cicatrisation (Hienne, 2008)

II.1. Dfinition
La cicatrisation est lensemble des phnomnes dynamiques physiologiques aboutissant la rparation dune plaie. Elle est trs variable dune plaie une autre et sa dure est dpendante de nombreux facteurs mais en particulier du type de plaie. On en distingue deux catgories : les plaies dites aigues causes par un agent traumatique et les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas spontanment. Ces dernires sont entre autres constitues par les plaies dcrites ci-dessus. II.2. Physiologie de la cicatrisation
La cicatrisation apparat la suite dune plaie. Elle permet de rparer les tissus lss. Cette cicatrisation se droule en quatre tapes : la phase de dtersion encore appele exsudation. Elle est caractrise par une action de nettoyage. La cicatrisation dbute toujours par lapparition de signes inflammatoires prcoces : rougeur, chaleur, douleur, dme. A la suite de cette premire tape une vasoconstriction des extrmits va permettre de stimuler la coagulation via lactivation de la thrombokinase. Aprs plusieurs minutes, un exsudat va se former. Ce liquide va permettre la dfense contre les infections mais galement la dtersion de la plaie. Laugmentation de la permabilit capillaire va favoriser le passage du plasma, des leucocytes, des macrophages et des anticorps qui vont avoir une action de phagocytose et de protolyse qui prpare la plaie la phase suivante. Cette phase dure entre deux et six jours. Paralllement, alors que la dtersion se poursuit, il y a une augmentation du nombre des mitoses au niveau de la plaie et les fibroblastes commencent se multiplier sous linfluence des macrophages. La phase de rparation tissulaire encore appele phase de granulation. Cette phase va permettre la cicatrisation dermique par comblement de la perte de substance par un tissu noform. La prolifration des fibroblastes voqus ci-dessus se poursuit. Ces cellules vont permettre la production de mucopolysaccharides qui serviront de matrice aux fibres de collagne afin dobtenir la construction dun rseau de collagne et dlastine. Le collagne va tre synthtis partir du pro-collagne. Les fibres isoles ainsi obtenues vont former les
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fibres dfinitives insolubles sous laction de la vitamine C, de loxygne et du fer. Ce rseau de fibre va ensuite tre intgr la matrice. Paralllement des no-capillaires vont se former, assurant ainsi la nutrition du tissu (figure 28). Ils se forment jusque sur la surface de la lsion provoquant une couleur rouge vif de la plaie.
Figure 28 : plaie en phase de granulation prsentant un aspect rouge vif en raison de la formation de no-capillaires assurant la nutrition du tissu.
A la surface de la plaie va se former une couche de scrtion fibrineuse dans laquelle vont venir sinclure des bourgeons vasculaires et des cellules conjonctives. Cette nouvelle couche va produire son tour une deuxime couche et ainsi de suite. On observe un bourgeonnement progressif qui tend combler la perte de substance. Pour cette raison, il arrive que cette phase soit galement nomme phase de bourgeonnement ; elle dbute entre le 4me et le 5me jour et peut durer jusqu trois semaines. La phase dpidmisation (figure 29) encore appele phase dpithlialisation ou de maturation. Cette phase dbute par la transformation des fibroblastes en myofibroblastes dous dune capacit de contraction. Cette proprit va permettre aux kratinocytes voisins de migrer du bord de la plaie vers le centre. Une fois la plaie recouverte entirement la migration va tre stoppe et une nouvelle phase de diffrenciation cellulaire va dbuter afin de reconstituer un pithlium
pluristratifi. Paralllement les kratinocytes vont Figure 29 : plaie en phase d'pidermisation reconstruire une membrane basale qui va permettre de solidariser le derme et lpiderme.
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Cette phase peut durer plusieurs mois mais est raccourcie quelques jours quand la plaie est suture. La phase de consolidation encore appele phase de remodelage. Lors de la phase prcdente la plaie se referme et est constitue dun tissu cicatriciel qui ne possde pas les mme proprits que le tissu dorigine. Afin de sapprocher au plus prs de la structure originelle du tissu, la cicatrise volue progressivement par remodelage constant. Ce remodelage peut prendre plusieurs mois. II.3. La cicatrisation dirige
Elle consiste orienter la cicatrisation vers une gurison la plus rapide possible. Cest la mthode la plus simple pour traiter une perte de substance superficielle. Il s'agit d'une technique simple et peu coteuse faisant appel uniquement des pansements rpts, le but tant dobtenir le bourgeon de granulation dcrit ci-dessus le plus rapidement possible.
Pour le traitement de lescarre par exemple on utilise la technique de la cicatrisation dirige en milieu humide. Cette technique repose sur deux principes fondamentaux : maintenir un environnement chaud et humide et un exsudat au contact de la plaie. Lexsudat ainsi maintenu va permettre la dtersion de la plaie grce la prsence de leucocytes mais va galement permettre la reconstruction tissulaire grce aux facteurs de croissance prsents dans ce mme liquide. Le maintien en milieu chaud et humide permet quant lui dacclrer les phnomnes tout en conservant la flore naturelle de la plaie qui permet une bonne cicatrisation. De plus cette flore est cyclique et alterne bactrie gram + et gram -. Il est donc ncessaire de maintenir ces cycles, do la ncessit de ne pas utiliser dantibiotiques locaux pour le traitement des escarres par exemple.
III. Les pansements

III.1. Le pansement "idal"
Il existe deux pansements : le primaire et le secondaire. Le primaire est celui qui va tre au contact de la plaie et qui par consquent doit possder les proprits adquates aux
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diffrents types de plaies. Le secondaire va recouvrir le primaire si ce dernier nest pas adhsif.
Le pansement idal nexiste pas. Cependant le cahier des charges thorique de ce dernier est le suivant, il doit : - maintenir la plaie en milieu humide et chaud, - tre modifi selon les stades de cicatrisation, - tre permable aux changes gazeux mais non aux bactries, - absorber lexcs dexsudat produit par la plaie, - ne pas coller la plaie mais adhrer la peau saine sans se dcoller ou sabmer rapidement, le tout en tant facilement applicable et confortable, - ne pas tre toxique et tre hypoallergnique, - protger des chocs, - tre transparent afin de pouvoir visualiser la plaie sans retirer le pansement, - tre le moins coteux possible et rduire le temps de traitement.
III.2. Les diffrents types de pansements Les Hydrocollodes. Ce sont comme leur nom lindique des pansements contenant des particules dhydrocollode c'est--dire formant un gel au contact deau. Grce cette proprit de glification ils contrlent la production dexsudat. Ils possdent de nombreuses autres qualits du pansement idal dcrit ci-dessus. Pour cette raison ils peuvent tre utiliss tous les stades de la cicatrisation. Cependant leur utilisation est plus fortement conseille pour les plaies peu ou modrment exsudatives. On peut par consquent les utiliser dans les escarres, les ulcres de jambes, Les Hydrocellulaires. Comme les prcdents, ils sont destins la cicatrisation en milieu humide mais en tant pour leur part totalement synthtiques. La construction de ces pansements en trois couches leur permet dabsorber les exsudats tout en conservant une certaine humidit et en protgeant des bactries. Pour ces raisons ils sont plus utiliss dans le traitement des plaies exsudatives et particulirement des escarres ou des ulcres.
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Les Hydrofibres. Ces pansements peuvent absorber jusqu 30 fois leur poids de liquide quils retiennent ce liquide par glification. Ce fort pouvoir absorbant indique leur utilisation tous les stades de la cicatrisation pour des plaies trs exsudatives. Un des avantages de ces pansement est leur utilisation sur des plaies infectes. Les Hydrogels. A la diffrence des prcdents, les hydrogels nabsorbent pas mais relarguent progressivement de leau sur la plaie afin de la rhydrater, permettant une bonne dtersion. Ces pansements sont donc indiqus dans la dtersion des plaies sches. Les irrigo-absorbants. Ils irriguent la plaie en relarguant progressivement une solution de Ringer qui permet le ramollissement des tissus dterger. Dautres part ils absorbent les exsudats. Par cette double proprit, ils favorisent la dtersion et la formation du tissu de granulation. Les alginates (figure 30). Ils seront dtaills plus loin.
Figure 30 : compresse d'alginate et pansement Algostril
Les pansements au charbon. Ladjonction de charbon activ dans les pansements leur confre une proprit dadsorption des bactries et des odeurs. Pour une activit bactricide plus importante il est parfois associ au charbon des sels dargent. En raison de cette proprit , ces pansements sont utiliss pendant la phase de dtersion sur des plaies infectes et nausabondes. Les pansements base dacide hyaluronique. Lacide hyaluronique est un lment naturel de la peau qui a un fort pouvoir hygroscopique, rgule les phnomne inflammatoires, stimule langiogense et la prolifration cellulaire et protge contre les infections. Or dans une plaie, lacide hyaluronique est absent. Ces pansements permettent donc un apport exogne de cet acide afin damliorer la cicatrisation. Pour ces raisons, ils sont utilisables pour de 41
nombreuses plaies, mais dans la pratique on les prfre pour la prise en charge des plaies bourgeonnantes. Les pansements largent. Comme indiqu pour les pansements au charbon, largent est un puissant antibactrien large spectre. Pour augmenter son efficacit il est parfois associ une autre substance bactriostatique, un sulfamide. Cette association permet donc de traiter des plaies infectes ou risque. Les films. Ils sont constitus de polyurthane semi-permable. Par consquent ces pansements sont souples, transparents et ne collent pas la plaie mais aux bords sains. Ces films sont impermables leau et aux bactries et retiennent donc lexsudat afin de maintenir la plaie dans un milieu humide favorable. Cependant ils restent permable aux gaz. Ces pansements sont donc principalement utiliss pour les plaies sches en phase dpidermisation mais galement en prvention des escarres aux endroits risque. On les retrouve galement en pansement secondaire. Les tulles. Ce sont des pansements imprgns dune substance grasse non adhrente (de type vaseline, paraffine,) qui permet le maintien dun taux dhumidit qui reste nanmoins faible. En effet les corps gras laissent passer trs lentement lexsudat. Les tulles sont donc principalement utiliss pour la phase de bourgeonnement des plaies sches. Les interfaces. Leur composition est varie (polyester, actate de cellulose imprgne dune mulsion ;). Elles ne collent pas la peau et ne sont pas grasses malgr leur aspect mais maintiennent un milieu humide au niveau de la plaie. Les interfaces sont donc employs pour le traitement de la phase de bourgeonnement ou dpidermisation des plaies peu exsudatives. La matrice effet antiprotase. Elle renferme du collagne et de la cellulose. Ces deux composs interviennent en rgulant lenvironnement de la plaie. Au contact de lexsudat, la matrice se glifie en inhibant les protases qui dgradent la matrice extracellulaire ncessaire la rgnration du nouveau tissu et en relarguant des facteurs de croissance favorables au bourgeonnement de la plaie. Ces pansements sont donc utiliss pour les plaies dont on souhaite acclrer la cicatrisation sous rserve que la plaie ne prsente pas de tissu ncrotique.
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III.3. Le choix du pansement
Deux critres sont majeurs dans le choix dun pansement : le stade de la cicatrisation et limportance des exsudats.
Les critres mineurs sont quant eux ltat de la peau en priphrie de la plaie, la localisation de la plaie, sa profondeur, la douleur, les odeurs,
Le stade de cicatrisation est dfini par le personnel soignant laide dune classification colorimtrique base sur la mme mthode que celle utilise pour les escarres. Ce code couleur est international et dfini comme :
Noir les tissus de ncrose, Jaune les tissus fibrineux et Rouge les tissus de granulation.
Afin de ne pas confondre le rouge de la granulation et de lpidermisation, et le jaune des tissus de ncrose et dune plaie purulente, les quipes soignantes ajoutent respectivement les couleurs rose et vert. Une couleur dominante est ainsi observe et le traitement peut alors tre adapt au stade de la cicatrisation.
La cicatrisation en milieu humide est une technique aujourdhui largement approuve. Il est donc ncessaire dadapter le pansement afin de rguler lexsudat produit. Pour une plaie trs exsudative, il sera ncessaire dabsorber une partie de ce liquide, en revanche pour une plaie sche, il sera ncessaire de maintenir lexsudat produit. Il faut maintenir un taux dhumidit idal et constant.
En consquence pour chaque type de plaies il existe une indication de pansements comme lindique le tableau 3.
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Tableau 3 : tableau dcisionnel pour le choix du pansement en fonction de l'chelle colorielle de la plaie et de l'importance de l'exsudat
IV. Les pansements lalginate (http://brothier.com/)
IV.1. Composition et formes
Le principe actif de ces pansements est lalginate de calcium. Il peut tre seul comme pour les compresses Algostril (Brothier), Sorbalgon (Hartmann) ou Melgisorb (Mlnlycke), ou bien associ avec un deuxime principe actif : le carboxymthylcellulose (CMC), un hydrocollode fort pouvoir absorbant. Cette association est notamment retrouve dans les compresses Urgosorb (Urgo), Askinasorb (B. Braun Mdical) et Seasorb soft (Coloplast) (tableau 4).
Ces pansements sont disponibles sous deux formes : des compresses allant dune taille de 5 x 5 cm 10 x 20 cm et des mches allant de 2 x 32 cm 3 x 44 cm. Les compresses sont plus utilises pour des plaies assez tendues et peu profondes, alors que les mches sont plus appropries des petites plaies profondes (Vidal, 2010).
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Tableau 4 : diffrents pansements base d'alginate rembourss par la scurit sociale
IV.2. Proprits
Au contact de la lsion, lalginate change ses ions Ca+ avec les ions Na+ des liquides biologiques, activant ainsi les cellules impliques dans la cicatrisation. De plus les fibres dalginate se glifient, crant un environnement humide favorable au processus cicatriciel. Il possde donc un fort pouvoir dabsorption, suprieur celui des hydrocollodes et des hydrocellulaires. Lalginate possde donc une proprit cicatrisante. Par ailleurs, cette substance naturelle a lavantage de possder une proprit dhmostase. Son efficacit rsulte dune activation locale de la coagulation par les ions calcium. Les fibres dalginate constituent galement une matrice permettant de structurer et de renforcer le rseau du caillot sanguin. Lalginate diminue le risque infectieux au niveau local en fixant les bactries de la lsion sur son rseau de fibres glifies. Enfin, lalginate ninduit pas la prolifration des germes responsables du syndrome de choc toxique. IV.3. Indications De par leur pouvoir absorbant, ces pansements vont pouvoir tre utiliss pour des plaies trs exsudatives comme les ulcres de jambes, les escarres, les plaies traumatiques, De plus ils sont davantage utiliss dans les plaies aux stades de dtersion.
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Ce pouvoir absorbant peut, linverse, tre utilis pour des plaies sches. En effet, si le pansement est hydrat laide de chlorure de sodium 0,9% avant lapplication, celui-ci va permettre de maintenir un certain taux dhumidit au niveau de la plaie. Il a t vu ci-dessus que lalginate possdait des proprits hmostatique et antiinfectieuses. Il est donc possible dutiliser ces compresses sur des plaies hmorragiques et infectes.
IV.4. Mode dutilisation
La plaie est nettoye laide dune solution de srum physiologique puis sche. Le pansement lalginate est ensuite appliqu sur la plaie. Il est ncessaire de choisir une compresse de taille suffisante afin de la recouvrir entirement et en prenant en compte la rtractation de la compresse lors de labsorption de lexsudat. Les compresses peuvent tre utilises sches lorsque la production dexsudat est importante ou humidifies avec du chlorure de calcium 0,9% lorsque la plaie est peu exsudative. Le tout est ensuite recouvert dun pansement secondaire, lexception des plaies infectes o lenfermement de la plaie est contre-indiqu. Afin de le retirer plus facilement il est possible dhumidifier le pansement.
Le renouvellement du pansement est variable, il dpend de trois facteurs : la quantit dexsudat produit, la prsence dune infection, et la propret de la plaie. Pour une plaie trs exsudative le pansement sera renouvel tous les jours comme pour une plaie infecte ou recouverte de dbris fibrino-ncrotiques. En revanche pour les plaies moins exsudatives, non infectes et propres (sans dbris), le renouvellement peut se faire tous les deux jours seulement.
IV.5. Contre-indication, prcaution demploi
En raison de leur fort pouvoir absorbant, il est dconseill de les appliquer sur des plaies sches, ncroses ou sur des brlures. Dans le cas des plaies sches, une alternative consiste les humidifier avec du chlorure de sodium 0,9%.
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Si la plaie prsente des signes de surinfection, le pansement primaire dalginate ne doit pas tre recouvert par un pansement secondaire occlusif qui favoriserait la prolifration bactrienne.
Lors du retrait des mches notamment, il arrive que des fibres restent dans la plaie, pouvant alors provoquer un tat inflammatoire ou infectieux au niveau de la plaie. Il est donc ncessaire dtre vigilant lors du retrait et de vrifier labsence de fibres dans la plaie.
Enfin il existe une interaction avec la chlorhexidine et les produits alcalins. Ces derniers entranent la solubilisation du pansement. Par consquent si la plaie a t en contact avec ces produits, il faut la rincer abondamment laide dune solution physiologique avant dappliquer le pansement.
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B/ LES PANSEMENTS HEMOSTATIQUES

Aprs un brve prsentation de lhmostase, nous envisagerons les pathologies et les traitements.
I. Physiologie de lhmostase
Toute lsion de la paroi endothliale entrane lactivation des processus hmostatiques qui conduisent la formation du thrombus. Trois tapes interviennent dans ce phnomne : - Lhmostase primaire qui fait intervenir les plaquettes qui nous serons dtailles plus loin- et conduit la formation du thrombus blanc, - La coagulation qui gnre la fibrine, - La fibrinolyse qui limite lextension du thrombus et permet sa rsorption. Nous allons nous intresser, dans les paragraphes suivants, uniquement lhmostase primaire, lieu daction des pansements hmostatiques.(Tortora, 2001) I.1. Le systme plaquettaire
Les plaquettes galement appeles thrombocytes sont des lments figurs du sang, discodes et anucls. Elles sont issus de lclatement des mgacaryocytes et sont donc constitus de cytoplasme, de granulations et dune membrane phospholipidique. Cette dernire contient des glycoprotines de type GP Ib-IX, GP IIb-IIIa. Les plaquettes sont actives (figure 31) par diffrentes protines telles que les prostaglandines, le facteur 3 plaquettaire (F3P) ou le platelet activating factor (PAF). Cette activation joue un rle majeur dans le processus dhmostase primaire mais peut linverse devenir dltre lorsque ces lments sauto-activent en situation dagression longue et rpte comme notamment dans le cadre de la pose de valve cardiaque. Les thrombocytes sont donc en quilibre entre trois tats permettant ainsi lhmostase primaire que nous expliquerons dans le paragraphe suivant : En circulation libre, En adhsion la surface endothliale lse, Agrg.
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Figure 31 : structure dun thrombocyte au repos et son activation la suite d'une brche vasculaire.
I.2. Le rle des plaquettes dans lhmostase primaire (figure 32) I.2.a. Ladhsion plaquettaire
Cette tape est une modification des proprits physiques de la membrane plaquettaire pour faciliter sa fixation sur lendothlium. Ce phnomne fait intervenir plusieurs facteurs dont : Le facteur von Willebrand (vWF), scrt principalement par
lendothlium mais galement par les granules plaquettaires, Le fibrinogne, La -thromboglobuline (-TG), Le calcium.
La lsion de lendothlium entrane la mise en contact du sang avec les fibres de collagne et la couche sous endothliale qui est fortement thrombogne. Le vWF scrt va alors se fixer aux fibres de collagne de la matrice sous-endothliale. Cette fixation va entraner une modification de la conformation de ce facteur qui va alors pouvoir adhrer aux plaquettes via les glycoprotines GP Ib-IX.
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Les plaquettes adhrent donc la lsion via le facteur von Willebrand et dmarrent ainsi larrt du saignement in situ. Cette adhsion va permettre lactivation des plaquettes, tapes suivante de lhmostase.
I.2.b. Lactivation plaquettaire
Lactivation est caractrise par un changement de morphologie des plaquettes. Elles changent tout dabord de forme et deviennent sphriques avec la formation de pseudopodes qui tmoignent de la rorganisation des protines contractiles. De plus on peut observer un regroupement de granules qui va permettre une scrtion rapide des substances biologiquement actives. Enfin au cours de la scrtion on note une augmentation significative du nombre des glycoprotines GP IIb-IIIa impliques dans lhmostase. Cette activation a pour but de prparer les plaquettes lagrgation.
I.2.c. Lagrgation plaquettaire
Il sagit de la facult des plaquettes sagrger entre elles sous leffet dun stimulus. Ce processus est induit par diffrents facteurs intrinsques et extrinsques. Les facteurs intrinsques dpendent du mtabolisme intra-plaquettaire : on peut citer pour exemple la concentration en calcium ionis. Quant aux facteurs extrinsques, ils peuvent tre soit biologiques (concentration de protines par exemple), soit mcaniques. Ces facteurs agissent en favorisant la liaison entre les GP IIb-IIIa, le vWF et le fibrinogne. Cependant cette liaison nest possible quen prsence de calcium. Il en dcoule alors une agrgation plaquettaire qui est ltape principale de lhmostase primaire (lvyToledano, 1995, Szefner, 2008, Gaussem, 2007).
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Figure 32 : l'hmostase : aspects molculaires de l'adhsion, de l'activation et de l'agrgation plaquettaire
II. La pathologie : lpistaxis

Lpistaxis est une pathologie lorsquelle est bnigne, qui fait intervenir lhmostase primaire et dont le traitement principal repose sur lutilisation de pansements hmostatiques (http://saignementdenez.com).
II.1. Dfinition
Lpistaxis encore appel saignement de nez est un coulement de sang extrioris par le nez. Il sagit dun symptme et non une maladie et il survient de manire inattendue. Dans la majorit des cas, il s'agit d'un vnement sans gravit qui peut tre rsolu par le patient luimme. Dans certains cas (persistance, abondance et/ou rptition du saignement), l'pistaxis ncessite une prise en charge adapte par un mdecin.
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II.2. Physiopathologie
La localisation du saignement de nez est la muqueuse nasale. Cette dernire est fragile et richement vascularise, notamment au niveau de la tache vasculaire (figure 33) situe de chaque ct de la cloison nasale environ 1cm de l'entre du nez. Toute agression de la muqueuse entrane un risque de rupture des vaisseaux sanguins et donc un saignement de nez.
Figure 33 : fosses nasales prsentant une tache vasculaire conduisant un pistaxis
II.3. Etiologies
Pour les pistaxis sans gravit, les causes peuvent tre multiples. Cependant, pour les pistaxis plus graves, il existe souvent une pathologie sous-jacente explorer.
Les causes multiples voques ci-dessus sont : Les traumatismes tels quune fracture du nez, Le grattage, Le mouchage nergique, Laltitude, La chaleur, La scheresse, Les anomalies vasculaires, 52
II.4. Traitements
Si la cause des saignements est une pathologie sous-jacente, il est ncessaire de la traiter pathologie avant de traiter lpistaxis en lui-mme.
Cependant, le traitement de lpistaxis repose sur trois types approches : Le traitement anti-agrgant plaquettaire mdicamenteux, La compression mdicale, Les pansements hmostatiques base de mches.
Ces traitements sont dvelopps dans la partie suivante.
III. Les mdicaments hmostatiques

III.1. gnralits
Il existe deux grands types de mdicaments hmostatiques : Les mdicaments utiliss par voie systmique, Les mdicaments utiliss par voie topique.
Les mdicaments administrs par voie gnrale sont des antiplaquettaires utiliss lors dhmorragies. Cinq classes (que nous ne dtaillerons pas) les composent (Lecompte, 1995) : Les inhibiteurs de la cyclo-oxygnase (COX) plaquettaire. Ils ont reprsents
par les anti-inflammatoires non strodiens (AINS) dont laspirine et le flurbiprofne sont les plus utiliss. Les inducteurs de laugmentation de lAMP cyclique intraplaquettaire. Deux
molcules sont actuellement commercialises en France : le dipyridamole et liloprost. Les antagonistes des rcepteurs lADP ou thinopyridines sont la ticlopidine
et le clopidogrel. Les antagonistes des rcepteurs GP IIb-IIIa dont les molcules aujourdhui
employes sont labciximab, leptifibatide et le tirofiban.
Nous allons nous intresser plus particulirement aux mdicaments par voie topique ou hmostatiques locaux.
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III.2. Les hmostatiques locaux
Ces produits sont utiliss en vue dacclrer lhmostase au niveau des plaies et des tguments. Ils sont notamment utiliss pour traiter les petites hmorragies simples lorsque la compression nest pas possible ou pas suffisante.
Il en existe deux types : Les non-absorbables qui sont : ladrnaline, leau oxygne, certains
sels de fer, des prparations drives du sang avec thrombine, fibrinogne ou fibrine et lhmocoagulase. Les absorbables : ce sont la glatine, la cellulose oxyde rgnre, le
collagne microfibrillaire hmostatique et lalginate de calcium.
Ce sont ces derniers que nous allons dvelopper.
IV. Les hmostatiques locaux base dalginate

IV.1. Mcanisme daction
Comme nous lavons vu prcdemment dans la physiologie de lhmostase, le calcium est un lment indispensable pour lagrgation plaquettaire. Il permet linitiation du phnomne dhmostase et ncessite dtre prsent une concentration suffisante pour lagrgation plaquettaire. Ainsi les hmostatiques permettent dinduire une concentration de calcium suffisant au niveau de la plaie en changeant les ions calcium prsents dans les fibres de lhmostatique avec les ions sodium prsents dans le sang. Cet change va permettre par ailleurs de former un gel hydrophile. Les fibres dalginate ainsi glifies vont rester emprisonnes dans la blessure et dans la crote qui va se former. Ces dernires vont tre limines avec la crote.
Ces produits induisent lagrgation plaquettaire, permettant ainsi de raccourcir le temps de formation du caillot sanguin et le temps de coagulation. Les fibres dalginate constituent galement une matrice qui permet de renforcer le caillot et donc damliorer larrt du saignement.
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IV.2. Composition et formes
Ces pansements sont composs de fibres dalginate pur. Les pansements hmostatiques sont commercialiss sous deux formes : compresses (figure 30) et mches (figure 34). Les compresses sont utilises pour les grandes plaies alors que les mches sont utilises pour les petites hmorragies et les petites plaies profondes. Il existe une forme poudre mais son utilisation est beaucoup moins frquente. (http://brothier.com/)
Figure 34 : mche d'alginate (Coalgan)
IV.3. Indications
Lindication principale est lhmostase lors de procdures chirurgicales lorsque la compression, la ligature ou les autres procds sont inefficaces ou impraticables.
Les diffrents hmostatiques locaux base dalginate commercialiss en France sont : Stop-Hmo : Stop-Hemo est disponible sous 3 formes adaptes aux diffrents types de plaies : o Stop-Hemo poudre pour les raflures, les zones de plis, les rythmes fessiers, les plaies du cuir chevelu, les coupures de rasoir, les varicelles suintantes ; o Stop-Hemo pansements pour les coupures, les ampoules ouvertes, les petites plaies ; o Stop-Hemo compresses pour les brlures superficielles et suintantes, les saignements de nez, les plaies avec saignements.
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Coalgan : est utiliss dans les saignements cutans et muqueux (nez, points de ponction, extraction dentaire, coupure,).
IV.4. Interactions- prcautions demploi
Ces produits sont trs bien tolrs et possdent peu deffets indsirables et dinteractions. Seule leur utilisation en association avec des solutions alcalines est contreindique car il en rsulte des incompatibilits physico-chimiques comme nous le verrons avec les pansements. Ils ne doivent pas tre laisss en place plus de 24 heures.
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C/ LES PANSEMENTS GASTRIQUES

I. Systme digestif
I.1. Physiologie de la scrtion gastrique.
La muqueuse gastrique est constitue de plusieurs types glandulaires (figure 35) : - Des glandes cardiales trs peu nombreuses et dont le rle est quasiment identique celui des glandes pyloriques ; - Des glandes fungiques qui ont une fonction principale scrtrice des sucs gastriques. Ce sont des glandes tubuleuses droites constitues par : * Les cellules du collet contenant des grains mucigne et par consquent produisant le mucus. * Les cellules principales scrtrices des enzymes digestives dont principalement le pepsinogne prcurseur de la pepsine. * Les cellules bordantes, galement appel paritales, scrtrices dacide chlorhydrique et de facteur intrinsque. * les cellules argentaffines, beaucoup moins nombreuses que les prcdentes et appartenant au systme neuro-endocrine diffus.
Figure 35 : coupe de la muqueuse stomachale et dtail des diffrentes cellules qui la composent. 57
- Des glandes pyloriques, glandes tubuleuses contournes de type muqueux constitues par des cellules muqueuses qui produisent une scrtion mucode et par quelques cellules argentaffines gastrine. Elles scrtent le mucus qui protge la paroi de lestomac contre diverses agressions, notamment : *des agressions mcaniques en jouant le rle de lubrifiant lors du passage des aliments ; *lauto-digestion en inhibant la pepsine ; *lattaque acide en neutralisant lHCl (Guyton, 1989) I.2. Scrtion acide chlorhydrique.
Cette solution lectrolytique est scrte par les cellules bordantes, une concentration de 160 mmol.L-1et elle possde un pH de 0,8. La biosynthse seffectue partir de dioxyde de carbone qui peut provenir de deux origines distinctes : soit endocellulaire, soit par pntration dans la cellule partir du sang. Ce gaz va ragir avec leau amene par diffusion passive pour former de lacide carbonique grce une enzyme : lanhydrase carbonique. Ce dernier acide va se dissocier en ion hydrognocarbonate et proton. Le premier de ces ions va diffuser dans le sang alors que le proton va tre transport vers la lumire de la cellule. A chaque ion hydrogne produit un ion chlore issu du sang rentre dans la cellule par transport passif pour former une molcule dHCl. Cette scrtion dacide chlorhydrique est trs importante pour lactivation du pepsinogne. En effet, la pepsine est une enzyme produite par les cellules principales. Cependant ces dernires scrtent cette enzyme sous sa forme prcurseur, c'est--dire sous forme de pepsinogne. Une fois ce prcurseur en contact avec de la pepsine produite prcdemment et de lacide chlorhydrique, il se clive pour donne la molcule active. Cependant la pepsine est une enzyme protolytique qui, pour tre active, doit se situer dans un milieu trs acide.
La rgulation de ces scrtions gastriques se fait par deux mcanismes (figure 36): - La rgulation nerveuse : via les fibres parasympathiques et les rflexes du plexus myentrique. - La rgulation hormonale : via la gastrine, lactylcholine, lhistamine, les prostaglandines 58
Cest sur ces diffrentes voie de rgulation que vont agir les mdicaments des pathologies digestives que nous allons voir dans le paragraphe suivant.
Figure 36 : schma des diffrents paramtres de la scrtion acide gastrique et certaines interfrences mdicamenteuses favorisant la production acide ou s'y opposant (La Revue du praticien, 2001).
Le facteur intrinsque est issu des cellules paritales. Il est ncessaire au transport et labsorption de la vitamine B12, elle-mme indispensable la formation des rythrocytes (Sherwood, 2000)
II. Pathologies
II.1. Le reflux gastro-sophagien (RGO) II.1.a. Dfinition
Le RGO est le reflux de lestomac dans le bas de lsophage lorsque le sphincter infrieur de lsophage et le systme anti-reflux au niveau du cardia reste ouvert.
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Il peut tre physiologique ou pathologique. Il est physiologique en priode postprandiale et lorsque il ny a aucun signe clinique. En revanche il devient pathologique lorsquil survient plus frquemment et quil est associ des signes cliniques. II.1.b. Physiopathologie
Le systme anti-reflux tant dfaillant, le contenu de lestomac, trs acide car contenant de lacide chlorhydrique, remonte dans lsophage (figure 37) et provoque lirritation avec lsions de la muqueuse.
Figure 37 : schma de la remonte acide dans l'sophage au cours du RGO
A court terme, on observe une irritation, puis, moyen terme, cette irritation va voluer vers une sophagite associe ou non une hmorragie digestive et une stnose peptique, c'est--dire un rtrcissement sophagien. A long terme le RGO peut avoir des consquences plus graves et conduire une altration de la structure cellulaire de la muqueuse, voire une cancrisation.
La dfaillance du systme anti-reflux est la plupart du temps provoque par une hernie hiatale, cest--dire la protusion dune partie de lestomac dans le thorax travers le diaphragme.
II.1.c. Clinique
Lirritation provoque par lacidit entrane une sensation de brlure pigastrique irradiation rtrosternale ascendante ou pyrosis, communment appele brlure destomac. Le RGO peut galement tre accompagn de rgurgitations acides. Ces signes sont favoriss par le dcubitus ou antflexion du tronc : on le dcrit souvent comme le signe du lacet. 60
On peut observer dautres signes digestifs tels que des flatulences, des ballonnements, des ructations et une digestion lente.
Le RGO est souvent associ des signes extra-digestifs qui peuvent se manifester isolment. On trouve des signes respiratoires avec une toux inexplique et souvent nocturne ou une dyspne asthmatique, mais galement des signes cardiaques avec des douleurs pseudoangineuses ou une douleur rtrosternale. Ces diffrents signes peuvent amener lindividu prsentant ces troubles penser un infarctus du myocarde. Des manifestations stomatologiques tels que gingivite ou carries rcidivantes peuvent tre un signe de RGO.
II.1.d. Traitement Mesures hygino-dittiques
Comme pour toute pathologie, le premier traitement consiste respecter certaines rgles hygino-dittiques. Il faut viter la consommation daliments qui augmentent la scrtion dacide tels que le th, le caf, le chocolat, les aliments gras, Il est galement possible de fractionner les repas. Enfin il est conseill de ne pas sallonger immdiatement aprs le repas et de surlever la tte du lit. Labsence de fermeture totale du sphincter infrieur de lsophage est augmente par la consommation dalcool et de tabac qui entrane son relchement et qui, par consquent, aggrave le problme ; il est donc recommand darrter la consommation de ces substances. Enfin une rduction pondrale est envisageable si il y a surpoids. Traitement pharmacologique
Le traitement de premire intention est variable selon la frquence des symptmes et une ventuelle pathologie ulcreuse. Chez les sujets jeunes, sans signes cliniques majeurs et rpts, le traitement de rfrence sera un anti-acide ou un pansement gastrique la demande. Il peut parfois tre prescrit des antihistaminiques faible posologie.
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Pour des symptmes plus frquents, des inhibiteurs de la pompes protons (IPP) seront demble proposs faible dose pendant un mois. Si les symptmes reviennent larrt du traitement, celui-ci pourra tre reconduit. Dans les cas plus svres, voire invalidants, les IPP seront prescrits forte posologie et pour une dure indtermine qui peut se poursuivre plusieurs annes. Dans ce cas, lindication chirurgicale sera discute. La chirurgie est notamment applique chez des personnes ges ou prsentant des facteurs de risques.
II.2. la maladie ulcreuse : lulcre gastrique II.2.a. Dfinition
Lulcre gastrique ou gastroduodnal est une plaie de la muqueuse de lestomac. Les tissus sous-muqueux sont atteints et deviennent sclreux, rigides. Les saignements apparaissent lorsque les vaisseaux sanguins sont touchs. II.2.b. Physiopathologie
La premire cause de lulcre gastrique est une bactrie : Helicobacter pylorii qui produit une enzyme : lurase. Cette enzyme dgrade lure pour la transformer en anhydride carbonique et ammoniac. Ce dernier produit joue deux rles essentiels : il protge la bactrie des scrtions dHCl et il dtruit la couche protectrice de mucus ainsi que les cellules situes en dessous. Cela provoque donc la perte de substance de la muqueuse stomacale (figures 38 et 39) et par consquent une diminution de la rsistance la digestion. En effet, contrairement lulcre duodnal, la scrtion chlorhydrique est normale, voire basse, ce qui ne permet pas de limputer dans cette pathologie. De plus le reflux du contenu duodnal dans lestomac provoque galement un ulcre. Les acides biliaires contenus dans le chyme reflu sont trs acides et diminuent la rsistance gastrique de par leur effet dtersifs.
Figure 38 : physiopathologie de l'ulcration 62
Figure 39 : ulcre gastrique vu par endoscopie
De plus la prise danti-inflammatoire non strodien, de certaines boissons telles que le caf ou le th, ou encore le tabac, aggrave ce phnomne en perturbant les mcanismes de dfense de la muqueuse gastrique.
II.2.c. Clinique
La douleur est le signe le plus typique de la maladie ulcreuse. Elle est de type crampes pigastriques ou faim douloureuse. Cette douleur est post-prandiale tardive et rythme par les repas. Elle est en gnral calme par la prise daliments ou danti-acides avec un intervalle libre de 1 4 heures. Ce phnomne peut aussi bien tre diurne que nocturne et il est favoris par le stress et la prise danti-inflammatoire.
Dautres manifestations plus rares peuvent apparatre telles que des brlures pigastriques, un syndrome dyspeptique, des vomissements, une hmorragie digestive ou encore une perforation. Il arrive que lulcre soit totalement asymptomatique mais ce cas est beaucoup plus rare. II.2.d. Complications
Quatre complications sont possibles : Des hmorragies, Une stnose du pylore, Une pritonite, Un cancer de lestomac.
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II.2.e. Traitement (figure 40)
Les mesures hygino-dittiques vues pour le RGO sont galement valables pour la maladie ulcreuse. Par consquent nous ne les redtaillerons pas ici.
Helicobacter pylori tant la premire cause dulcre gastrique, le traitement de premier intention va consister radiquer cette bactrie laide dun traitement antibiotique. Cependant, en raison de la faible diffusion de ces produits dans la muqueuse gastrique ainsi que leurs altrations par lacidit, seuls amoxicilline, clarithromycine et mtronidazole sont utilisables.
Les protocoles les plus efficaces associent deux antibiotiques avec un IPP double dose matin et soir pendant 7 jours. Lassociation utilise en premire intention en France comporte : amoxicilline 1g matin et soir, clarithromycine 500mg matin et soir et IPP double dose.
Lradication doit tre contrle 8 12 semaines aprs le dbut du traitement par le test lure C13 (mesure de lactivit urasique de la bactrie). En cas dchec de lradication, le traitement sera modifi pour contenir amoxicilline, mtronidazole et IPP pendant 14 jours (Vatier, 2007).
III. Les mdicaments des pathologies digestives

Trois grandes classes de mdicaments sont utiliss dans les troubles de la digestion : Les antiscrtoires dans lesquels on distingue : o Les antagonistes des rcepteurs histaminiques H2 o Les anticholinergiques o Les inhibiteurs de la pompe ATPase H+/K+ o Les analogues de la somatostatine Les anti-acides Les protecteurs dans lesquels on retrouve certains anti-acides ainsi que les prostaglandines.
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Figure 40 : arbre dcisionnel de la prise en charge d'un ulcre gastrique
III.1. Les antiscrtoires III.1.a. Les antiH2
Ils inhibent la scrtion acide en bloquant de faon slective les rcepteurs membranaires H2 de lhistamine des cellules paritales. Ils possdent par consquents deux proprits pharmacologiques importantes : ils rduisent le scrtion peptique basale et augmentent le pH intragastrique. En France quatre molcules sont actuellement disponibles : Cimtidine (Tagamet, Stomdine), 65
Ranitidine (Azantac, Raniplex), Nizatidine (Nizaxid), Famotidine (Pepdine, Pepcidac).
Les effets secondaires les plus frquemment retrouvs avec les antiH2 sont les suivants : diarrhe, cphales, fatigue, myalgies, constipation et somnolence.
La cimtidine est un puissant inhibiteur enzymatique des cytochromes P450 ; elle interfre donc avec le mtabolisme oxydatif hpatique de nombreux mdicaments. Cependant cette interactions nengendre des manifestations cliniques importantes quavec quelques associations : warfarine, thophylline, phnytone. A linverse certains mdicaments inducteurs enzymatiques comme le phnobarbital augmentent le mtabolisme hpatique de la cimtidine. III.1.b. Anticholinergiques
Latropine a longtemps t lantiscrtoire le plus utilis en thrapeutique bien que son effet ait t controvers. Un driv synthtique daction plus slective alors t mis au point : la pirenzpine, antimuscarinique slectif des mcanismes nerveux de la rgulation de la scrtion acide. Cette molcule est plus affine pour les rcepteurs M2 de la muscarine que les rccepteurs M1 ,M2 tant les rcepteurs prsents sur la cellule paritale. Par consquent la pirenzpine possde la proprits dinhiber le dbit acide basal mais galement dinhiber la scrtion peptique et bicarbonate.
Les effets secondaires qui peuvent tre observs sont ds aux effets muscariniques extra-gastriques, cest--dire scheresse de la bouche, troubles de laccommodation, photophobie, tachycardie, constipation, rtention urinaire, glaucome.
III.1.c. Les inhibiteurs de la pompe protons (IPP)
Les IPP sont des inhibiteurs de lenzyme ATPase H+/K+ localise au ple apical de la cellule paritale qui permet la scrtion dions H+ du milieu intracellulaire vers la lumire gastrique o, associs aux ions Cl-, ils forment lacide chlorhydrique. Ils se diffrencient des
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autres antiscrtoires par leur mcanisme daction original, leur puissance et leur longue dure daction. En France cinq molcules sont actuellement disponibles : Omprazole (Mopral, Zoltum), Lansoprazole (Ogast, Lanzor), Pantoprazole. (Eupantol, Inipomp) Esomprazole (Inexium) Rabprazole (Pariet)
Les effets secondaires qui peuvent apparatre sont rares et bnins de type : nauses, vomissements, diarrhe, cphales, rash,
Lomprazole est galement un inhibiteur enzymatique mais son interaction avec les cytochromes P450 est moindre que celle de la cimtidine. Il existe donc une interfrence avec le diazepam, la phnytone et la warfarine en rduisant leur limination. Le lansoprazole possde galement un petit effet sur le systme microsomal doxydation hpatique, il sera donc ncessaire dtre vigilant lors de ladministration concomitante de lIPP et de mdicaments mtaboliss par ce systme. III.1.d. La somatostatine (SMT)
Les proprits de la SMT sont variables : elle inhibe la scrtion acide en inhibant directement la libration de gastrine. Cette molcule bloque galement la scrtion enzymatique pancratique et diminue le flux sanguin portal.
III.2. Les antiacides
Les prparations anti-acides contiennent diffrents sels minraux : Aluminium qui exerce un effet tampon, provoque une rduction de la
scrtion de pepsine et protge les glycoprotines du mucus de lrosion. Magnsium Calcium Sodium Ces trois mtaux possdent principalement une action de neutralisation du pH.
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III.3. Les protecteurs de la muqueuse
Deux grandes classes de produits composent les protecteurs de la muqueuse : Les prostaglandines, Les substances induisant la libration de prostaglandines ; il sagit notamment des sels daluminium.
Les prostaglandines (PG) utilises pour ce type de pathologie sont les PG E2. Elles agissent sur la cellule paritale afin dinhiber la scrtion acide, mais sont galement actrices de la dfense et de la rparation de la muqueuse. Une seule molcule est actuellement commercialise : le misoprostol (Cytotec).
Leffet secondaire le plus frquent est une diarrhe svre qui peut entraner larrt du mdicament. Les interactions mdicamenteuses concernent les anti-inflammatoires. Le misoprostol diminue leur biodisponibilit.
IV. Les pansements gastriques

IV.1. Gnralits-prsentation
Les pansements gastriques sont utiliss dans le RGO pour leur pouvoir couvrant de la muqueuse intestinale. Au contact du liquide gastrique ils forment un gel visqueux qui protge la muqueuse de lacidit et limite le reflux. Plusieurs classes de principes actifs sont utilises : Les argiles et apparents (Actapulgite, Bedelix, Smecta), La polyvinyl-polypyrrolidone (Bolinan, Poly-Karaya), Les silicones (Pepsane, Polysilane Upsa, siligaz), Les alginates : cest cette dernire classe que nous allons plus particulirement dvelopper.
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IV.2. Les pansements gastriques base dalginate
Les spcialits base dalginate sont au nombre de deux et sont toujours associes un anti-acide : lhydroxyde daluminium. Ce sont :
Le Gaviscon (figure 41) : compos dacide alginique, dalginate de sodium, dhydroxyde daluminium collodal sch et de bicarbonate de sodium,
Le Topaal : compos dacide alginique, dhydroxyde daluminium collodal, dhydrocarbonate de magnsium et de silice hydrate.(Dorosz, 2009)
Figure 41 : pansement gastrique en suspension buvable
IV.2.a. Mcanisme daction- Effet de lalginate
Au contact du liquide gastrique lalginate forme un gel lger qui lui permet donc de flotter la surface du contenu gastrique au niveau de la jonction gastro-oesophagienne. Par consquent, en cas de reflux, seul le gel et non le liquide acide refluera dans lsophage et il va donc tapisser celui-ci, empchant ainsi le contact entre le liquide gastrique et la muqueuse sophagienne. Par ailleurs, sa viscosit et sa cohrence forment une barrire physique qui empche le reflux et diminue donc le nombre de rgurgitations. Enfin lalginate agit sur le pH du liquide gastrique : son pH alcalin se substitue au pH acide du liquide gastrique. Les alginates sont des polysaccharides non absorbables et sont donc limins par voie digestive.
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IV.2.b. Indications
Les deux produits sont utiliss dans le traitement du reflux gastro-sophagien. En revanche le Topaal est indiqu galement dans le traitement des troubles gastrique lis lacidit dans les hernies hiatales, le pyrosis, les sophagites. IV.2.c. Effets indsirables
Lhydroxyde daluminium peut provoquer une dpltion phosphore, notamment lors des traitements prolongs. De plus, pour le Gaviscon contenant du bicarbonate de sodium, il est possible de voir apparatre une constipation (mais dont le risque de survenue est considrablement diminu grce la prsence dalginate), mais surtout une hypercalcmie avec risque de nphrolithiase et dinsuffisance rnale. IV.2.d. Prcautions demploi interactions mdicamenteuses
Les pansements gastriques, de par leur pouvoir couvrant, diminuent labsorption dautres mdicaments absorbs par voie orale et administrs simultanment. Par consquent, il est conseill de dcaler la prise des mdicaments de deux heures par rapport celle des pansements gastriques. Cet espacement des prises peut tre allong et il atteint notamment quatre heures entre la prise de fluoroquinolone et le pansement.
En raison de la prsence dhydroxyde daluminium, on peut observer une diminution de labsorption de certains mdicaments tels que le furosmide, lindomtacine, les ttracyclines, la digoxine, lisoniazide et les anticholinergiques.
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LES ALGINATES EN PHARMACIE GALENIQUE
A/ LES ALGINATES : DES EXCIPIENTS

I. Les excipients
I.1. Dfinition
Un excipient est dfini comme tout composant, autre que le(s) principe(s) actif(s), qui est prsent dans un mdicament ou utilis pour sa fabrication . La fonction dun excipient est de servir de vecteur au(x) principe(s) actif(s), ou dentrer dans la composition du vecteur, contribuant ainsi certaines proprits du produit telles que la stabilit, le profil biopharmaceutique, laspect et lacceptabilit pour le patient, la facilit de fabrication. La formulation dun mdicament comprend gnralement plusieurs excipients. Un excipient n'est donc pas dfini par une composition chimique particulire mais par son utilisation, qui dcoule des proprits physico-chimiques qui le rendent apte remplir son rle d'excipient. Deux autres termes sont utiliss suivant que les prparations sont liquides ou solides. Dans le premier cas on parle de vhicule, alors que pour les prparations solides on parle de base (Goris, 1949).
I.2. Rles des excipients
Les excipients ont pour but de : Faciliter ladministration des principes actifs dun point de vue technique
comme par exemple les excipients pour pommades, mais galement dun point de vue de lacceptabilit par le malade comme les dulcorants ou les aromatisants,, Augmenter lefficacit du principe actif : on peut citer dans cette partie les
excipients libration prolonge qui permettent une longue dure daction du principe actif, Assurer la conservation et la stabilit du principe actif le plus longtemps
possible : ce sont notamment les conservateurs.
I.3. Proprits des excipients
Une des proprits principales des excipients est linertie. Cette proprit est primordiale et sapplique tous les excipients. Ils doivent tre inertes vis--vis : 71
Du principe actif : lexcipient ne doit pas interfrer sur son action afin de ne
pas augmenter ou diminuer son activit qui pourrait conduire une absence defficacit du mdicament ou une toxicit. Cest pourquoi les excipients ne peuvent pas tre modifis sans une tude pralable, Du matriau de conditionnement primaire, cest--dire celui en contact avec le
mdicament. Il est important que les excipients ne dissolvent pas ou ne soit pas retenu par le conditionnement, De lorganisme : lexcipient ne doit pas avoir une activit par lui-mme, seul le
principe actif doit en avoir une. Cette neutralit est teste laide des essais dinnocuit. Cependant linertie totale ne peut tre obtenue. Le choix de lexcipient se fait donc par un quilibre entre bnfice et risque. De plus ces problmes peuvent tre lis aux impurets de lexcipient et non lexcipient lui-mme (LeHir, 2009).
II. Les alginates : des excipients

Plusieurs formes dalginates sont utiliss pour un usage dexcipient dans la confection des mdicaments : lacide alginique, lalginate de sodium et lalginate de propylneglycol (Rowe, 2003).
II.1. Acide alginique (figure 42) II.1.a. Chimie
En tant quexcipient utilis en galnique, plusieurs synonymes peuvent tre utiliss mais le symbole E400 lest le plus souvent. Le nombre CAS qui dfinit chaque produit chimique est le 9005-32-7.pour lacide alginique. II.1.b. Catgories dexcipients- les utilisations dans la formulation des mdicament Figure 42 : reprsentation de l'acide Figure 42 : alginique
Lacide alginique possde diffrentes proprits et peut tre class dans diffrentes catgories dexcipients : Ils peut servir comme : Agent stabilisant, 72
Agent de suspension, Agent de viscosit, Liant pour comprims et Agent de dsintgration pour comprims.
De ces proprits, il dcoule des applications dans la formulation galnique des produits. Lacide alginique est notamment utilis dans la formulation des mdicaments destins la voie orale et les topiques. Il est utilis comme agent de suspension et comme paississant dans les pommades, crmes et gel alors quil est plus utilis comme stabilisant pour les mulsions huile dans eau.
II.1.c. Proprits spcifiques de lacide alginique
Six proprits caractrisent cet excipient : - Son acidit avec un pH=1,5-3,5 , - Sa ractivit croise : laddition dun sel de calcium provoque une raction croise avec lacide provoquant une augmentation de son poids molculaire, - Sa densit de 1.061g/cm3, - Son taux dhumidit de 7.01%, - Sa solubilit : il est soluble dans les hydroxydes mais insoluble dans les solvants organiques, - Sa viscosit qui varie en fonction de la concentration, de la temprature,
II.1.d. Conditions de conservation et de stabilit
Lacide alginique doit tre conserv dans un endroit ferm sec et frais et temprature ambiante car elle est hydrolyse haute temprature, induisant une perte de poids molculaire ainsi que de viscosit. Une contamination microbienne peut entraner une dpolymrisation conduisant une diminution de la viscosit. Il est donc ncessaire de conserver ce produit en prsence dun antimicrobien. La strilisation est possible mais, quelque soit la mthode utilise, on observe une diminution de la viscosit.
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II.1.e. Incompatibilits
Lacide alginique est incompatible avec les oxydants forts et forme des sels insolubles avec de nombreux mtaux. II.1.f. Donnes de scurit-toxicit
Cette substance est dcrite comme non toxique ; cependant une consommation excessive par voie orale peut devenir dangereuse. De plus une inhalation importante peut conduire des problmes respiratoires. La dose ltale 50 chez le rat en intra-pritonal (IP) est de : 1,6g/kg. II.1.g. Prcautions demploi Lacide alginique peut tre irritant pour les yeux et le systme respiratoire. Il est donc recommand de le manipuler avec des gants, des lunettes, un masque et dans un endroit ventil.
II.2. Alginate de propylneglycol (figure 43) II.2.a. Chimie
En tant quexcipient utilis en pharmacie galnique, plusieurs synonymes peuvent tre utiliss mais le symbole E405 sera utilis le plus souvent. Le nombre CAS qui dfinit chaque produit chimique est le suivant pour lalginate de propylneglycol : 9005-37-2. Figure 43 : Figure 43 : reprsentation de l'alginate de propylneglycol
II.2.b. Catgories dexcipients- utilisations dans la formulation des mdicament
Lalginate de propylneglycol possde diffrentes proprits et peut tre class dans diffrentes catgorie dexcipients : Il peut servir comme : Agent stabilisant, Agent de suspension, 74
Agent de viscosit, Agent mulsifiant.
De ces proprits, il dcoule des applications dans la formulation des produits. lalginate de propylneglycol est notamment utilis dans la formulation des mdicaments destins la voie orale et les topiques. II.2.c. Proprits spcifiques de lalginate de propylneglycol
Deux proprits caractrisent cet excipient : Sa solubilit : il est soluble dans acides organiques et leau o il forme
une solution collodale. du pH. II.2.d. Incompatibilits Sa viscosit qui varie en fonction de la concentration, de la temprature,
Il nexiste pas dincompatibilits avec lalginate de propylneglycol. II.2.e. Conditions de conservation et de stabilit
Lalginate de propylneglycol doit tre conserv dans un endroit ferm hermtiquement, sec et frais car elle perd de sa solubilit en prsence de chaleur pendant une longue dure. Une contamination microbienne peut entraner une dpolymrisation de lacide alginique, conduisant une diminution de la viscosit. Il est donc ncessaire de conserver ce produit en prsence dun antimicrobien ou de le striliser. La strilisation est possible mais quelque soit la mthode utilise, on observe une diminution de la viscosit. En solution cet excipient doit tre conserv pH acide, compris entre 3 et 6 pour ne pas tre saponifi rapidement. II.2.f. Donnes de scurit-toxicit
Cette substance est dcrite comme non toxique ; cependant une consommation excessive par voie orale peut devenir dangereuse. De plus une inhalation importante peut conduire des problmes respiratoires.
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La dose ltale 50 chez le rat par voie orale est de : 7,2g/kg ; chez le hamster par voie orale : 7,0g/kg ; chez le lapin par voie orale : 7,6g/kg ; chez la souris par voie orale : 7,8g/kg II.2.g. Prcautions demploi
Lalginate de propylneglycol peut tre irritant pour les yeux et le systme respiratoire. Il est donc recommand de le manipuler avec des gants, des lunettes, un masque et dans un endroit ventil.
II.3. Alginate de sodium (figure 44) II.3.a. Chimie
En tant quexcipient utilis en galnique, plusieurs synonymes
peuvent tre utiliss mais le symbole Figure 44 : reprsentation 44 l'alginate de sodium Figure de : E401 sera plus souvent utilis. Le nombre CAS qui dfinit chaque produit chimique est le suivant pour lalginate de sodium : 9005-38-3.
II.3.b. Catgories dexcipients- utilisations dans la formulation des mdicaments.
Lalginate de sodium possde diffrentes proprits et peut tre class dans diffrentes catgorie dexcipients. Il peut servir comme : Agent stabilisant, Agent de suspension, Agent de viscosit, Liant pour comprims et Agent de dsintgration pour comprims et capsules.
De ces proprits, il dcoule des applications dans la formulation galnique des produits. Lalginate de sodium est notamment utilis dans la formulation des mdicaments destins la voie orale ou les topiques.
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II.3.c. Proprits spcifiques de lalginate de sodium
Trois proprits caractrisent cet excipient : Son acidit avec un pH=7.2 ; Sa solubilit : il est pratiquement insoluble dans lthanol, lther, le
chloroforme, les solvants organiques et les solutions acides aqueuses dont le pH est infrieur 3. En prsence deau, il forme une solution collodale. Sa viscosit qui varie en fonction de la concentration, de la temprature,
de la prsence dions mtallique,
II.3.d. Incompatibilits
Cet excipient est incompatible avec les drives acridine, le cristal violet, lactate et le nitrate phnylmercurique, les sels de calcium, les mtaux lourds et lthanol.
II.3.e. Conditions de conservation et de stabilit
Lalginate de sodium doit tre conserv dans un endroit ferm hermtiquement, sec et frais car ce produit est hygroscopique. De plus il ne doit pas tre conserv dans un contenant en mtal. Cette substance doit tre conserv dans un endroit frais car elle perd de sa viscosit en prsence de chaleur. Une contamination microbienne peut entrainer une dpolymrisation de lalginate de sodium conduisant une diminution de la viscosit. Il est donc ncessaire de conserver ce produit en prsence dun antimicrobien ou de le striliser. Les prparations pour voie externe peuvent tre conserv avec du chlorocrsol, du chloroxylnol ou du paraben. II.3.f. Donnes scurit-toxicit
Cette substance est dcrite comme non toxique cependant une consommation excessive par voie orale peut devenir dangereuse. De plus une inhalation trop importante peut conduire des problmes respiratoires.
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La dose ltale 50 chez le rat par voie orale est de : plus de 5 g/kg ; chez le rat par voie intraveineuse (IV) : 1 g/kg ; chez le lapin par voie IV : 0,1 g/kg ; chez la souris par voie IV : 0,2 g/kg ; chez le chat par voie IP : 0,25 g/kg. II.3.g. Prcautions demploi
Lalginate de sodium peut tre irritant pour les yeux et le systme respiratoire. Il est donc recommand de le manipuler avec des gants, des lunettes, un masque et dans un endroit ventil.
III. Mdicaments contenant lalginate et ses drivs comme excipient (Vidal,

2010) III.1. Liste des mdicaments contenant la substance acide alginique comme excipient :

ACTICARBINE cp enr APAROXAL 100 mg cp sc ARKOGELULES FUCUS gl AVLOCARDYL 40 mg cp sc BIAFINE muls p appl cut BIAFINEACT muls p appl cut CANTABILINE 400 mg cp CARTEOL LP 1% collyre LP en unidose CARTEOL LP 1% collyre sol LP CARTEOL LP 2% collyre LP en unidose CARTEOL LP 2% collyre sol LP COMBANTRIN 125 mg cp FASIGYNE 500 mg cp enr FLUOXETINE CRISTERS 20 mg cp dispers sc
HEPADIAL 50 mg cp enr LAMIDERM 0,67 % muls p appl cut LARIAM 250 mg cp sc LUMIRELAX 500 mg cp MESTACINE 100mg cp pellic sc PREVISCAN 20 mg cp quadrisc PROPRANOLOL EG 40mg cp PROPRANOLOL RATIOPHARM 40 mg cp quadrisc
RILMENIDINE MYLAN 1 mg cp RILMENIDINE QUALIMED 1 mg cp RILMENIDINE RATIOPHARM 1 mg cp TERCIAN 100mg cp pellic sc TERCIAN 25mg cp pellic sc VERRULYSE-METHIONINE cp enr VOGALENE 15 mg gl
FLUOXETINE ZYDUS 20mg cp dispers sc HALDOL 1 mg cp
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III.2. Liste des mdicaments contenant lalginate de sodium comme excipient :
ALOPLASTINE pte p appl loc ARTHRODONT 1% pte gingiv BIAFINE muls p appl cut BIAFINEACT muls p appl cut ISOPTINE 240mg cp pellic sc LP LAMIDERM 0,67 % muls p appl cut NIQUITIN MENTHE FRAICHE 2mg cp sucer NIQUITIN MENTHE FRAICHE 4mg cp sucer NIQUITIN SANS SUCRE 2mg cp sucer NIQUITIN SANS SUCRE 4mg cp sucer NIQUITINMINIS 1,5 mg SANS SUCRE cp sucer NIQUITINMINIS 4 mg SANS SUCRE cp sucer PSEUDOPHAGE gl p sol buv TARKA LP cp pellic LP TROLAMINE BIOGARAN 0,67 % muls p appl cut VERAPAMIL EG LP 240 mg cp pellic sc LP VERAPAMIL MYLAN L.P. 120 mg cp enr LP VERAPAMIL MYLAN L.P. 240 mg cp pellic sc LP VERAPAMIL RATIOPHARM 240mg cp pellic sc LP VERAPAMIL SANDOZ LP 240 mg cp pellic sc LP VITATHION gl efferv
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B/ LALGINATE : UN PROCEDE DENCAPSULATION

I. La micro-encapsulation (figure 45)
I.1. Dfinition-Historique
Cest le pigeage dun compos ou dun systme au sein dun matriau dispers en vue de son immobilisation, sa protection, le contrle de son transfert, sa structure et sa fonctionnalisation. En dveloppant cette technique
lhomme na fait que reproduire la nature.
Cette technique donn naissance de nombreux produits ces dernires annes ; cependant son utilisation dans lindustrie est connue depuis longtemps. La possibilit des structures encapsuler est grande et peut aller de molcules trs simples trs complexes telles que des mdicaments. Figure Figure 45 : 45 : microcapsules dalginate observes au microscope lectronique balayage
La diversit des formes de capsules est trs grande. Pour un puriste, une microcapsule est une membrane contenant un liquide. Dans la ralit, cela peut aller de la forme la plus simple : une molcule creuse dans laquelle sinsre un principe actif, jusqu des formes complexes de type liposomes, En rsum lencapsulation comprend un ensemble de structures solides obtenues par schage, agglomration ou enrobage de particules solides. I.2. Rle de lencapsulation
La microencapsulation est une technique qui pour objectif les 5 proprits suivantes : - Immobiliser ou isoler : le but est de limiter le contact entre certaines parties dun systme. Cet objectif est notamment retrouv dans les mdicaments o il est souhaitable que les deux ractifs nentrent en contact quau moment de la rupture de la capsule. - Protger : certains composs sont trs fragiles et sont rapidement dgrads au contact du milieu environnant ; la micro-encapsulation leur permet donc dtre protgs de cet environnement nfaste. Pour exemple il est possible de citer certains mdicaments qui sont 80
dtruits par le pH acide de lestomac. Cette technique leur permet donc de traverser cet organe sans tre dnaturs et dagir au niveau intestinal. - Contrler la libration. Dans de nombreux cas un profil de libration particulier est recherch. En effet certains mdicaments doivent suivre une cintique bien dfinie pour leur libration. - Structurer : la microencapsulation est une technique de galnique qui permet dtre trs homogne dans la rpartition du principe actif et dviter les effets de dilution qui peuvent exister. En effet, le mlange dun litre de liquide avec une tonne de poudres et rarement homogne, lencapsulation permet de solutionner ce problme. - Fonctionnaliser : un systme peut acqurir des fonctions nouvelles avec ce type de structure. Par exemple lactivit dun biocatalyseur peut tre rgule en modifiant la permabilit de la membrane qui lentoure. I.3. Mcanismes de libration des substances encapsules dans des microcapsules
Plusieurs mcanismes sont possibles mais dpendent de la faon dont le principe actif doit tre libr, ainsi que des capacits du principe actif. Les diffrentes pratiques sont : - La pression externe : le contenu de la capsule est libr par rupture de la membrane suite lcrasement de cette dernire, - La pression intrieure : ceci nest possible que si le principe actif produit des composants gazeux qui augmente la pression lintrieur de la capsule jusqu lclatement, - Labrasion : la capsule est progressivement use jusqu la libration de la substance la contenant, - La chaleur : le contenu est libr suite la fusion de lenveloppe de la microcapsule, - La combustion-dcomposition : les substances extinctrices dincendie librent leurs contenus suite la combustion ou la dcomposition de lenveloppe, - La lumire : la capsule sensible aux UV se dcompose au contact de la lumire, librant ainsi le contenu. - Les solvants : certaines microcapsules sont destines tre dissoutes dans un solvant spcifique, - Le pH : la libration du principe actif par dissolution de la membrane au contact dune substance pH donn permet de librer le produit dans un site spcifique,
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- La dgradation enzymatique : cela permet de librer la substance un endroit donn cest--dire o les enzymes sont prsentes et digrent la membrane, - La permabilit : la membrane tant permable, le contenu est libr progressivement par diffusion, dissolution ou vaporation. La membrane peut galement tre semi-permable pour le substrat qui va diffuser travers la membrane (Vandame, 2007).
II. Lalginate : support pour la microencapsulation

De nombreux polymres dorigine biologique sont utiliss pour la microencapsulation : les polysaccharides, les protines et lipides. Cinq critres spcifiques aux biopolymres peuvent tre recherchs pour la conception de microcapsules : Permabilit aux gaz, Caractristiques chimiques et fonctionnelles, Emulsifiant naturel, Nombreuses possibilits de modification et de rticulation chimiques.
Selon lutilisation souhaite, chaque biopolymre, possdant des indications diffrentes, va possder une indication prcise. Les principaux matriaux dorigine biologique utiliss pour la microencapsulation sont prsents dans le tableau 5.
Tableau 5 : principaux matriaux, les procds utilisables et quelques exemples d'application de la microencapsulation Matriaux dencapsulation Glatine Procds utilisables Coacervation simple, ou complexe Coacervation complexe, Glification de gouttes Coacervation complexe Glification de gouttes Nbulisation Lit dair fluidis Nbulisation Extrusion Exemples de domaines dapplication Arme, Parfum, Pharmacie, Papeterie Mdecine, Arme, Cosmtique, Parfum, Pharmacie (libration entrique) Pharmacie (libration gastrique) Alimentaire
Alginate de sodium
Chitosane
Amidon
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II.1. Techniques dencapsulation partir dalginates
Lalginate de sodium est utilis pour divers domaines et le procd de microencapsulation adapt pour lalginate de sodium est de deux types : la coacervation complexe, la glification de gouttes
II.1.a. La coacervation complexe : procd physico-chimique
Cette technique se dfinit comme la sparation dun systme collodal en deux phases liquides. La phase la plus concentre est la phase coacerve, lautre phase tant la solution dquilibre. La coacervation se produit par interaction direct entre biopolymres. Les interactions sont de nature hydrogne, hydrophobe ou encore lectrostatique. Le polymre est compress la surface du collode ou de la gouttelette et le dpt de coacervat la surface provient de labaissement de pH (figure 46).
Figure 46 : reprsentation schmatique du processus de coacervation complexe. (a) Dispersion du produit encapsuler dans une solution du matriau denrobage ; (b) sparation du coacervat de la solution; (c) coating du matriel par des microgouttes du coacervat
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II.1.b. Glification de gouttes : procd mcanique.
Il est galement appel procd dextrusion. La solution de biopolymres tombe goutte goutte dans un bain contenant le milieu squestrant, conduisant la glification des gouttes ou la formation dune membrane autour de ces gouttes sphriques (figure 47). La co-extrusion est base sur le mme principe mais permet dentourer le matriel liquide encapsuler dans une membrane de biopolymre (Hernandez, 2002).
Figure 47 : procd de glification de gouttes dalginate et structure atomique dune bille dalginate
II.2. Applications : exemple de molcules encapsules avec lalginate
Diffrentes protines ont t encapsules : lalbumine de srum bovin (BSA), lhmoglobine et lurase dHelicobacter pylori. Des liposomes ont galement t encapsuls dans lalginate (Monshipouri, 1999).
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PARTIE IV : LALGINATE DANS LINGENIERIE TISSULAIRE
LALGINATE DANS LINGENIERIE TISSULAIRE
A/ INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
Ce projet a pour objectif final la cration dun substitut vasculaire. Pour ce faire, lingnierie vasculaire aura recours la construction par la technique des feuillets cellulaires ou cell-sheet par lintermdiaire dun biomatriau qui sera dans notre cas lalginate. Cette partie contient la bibliographie du projet, le matriel et mthode ncessaire pour comprendre la partie suivante, cest--dire les rsultats.
Les maladies cardiovasculaires, et plus particulirement lathrosclrose, reprsentent la premire cause de mortalit dans les pays dvelopps. Lathrosclrose est caractrise par lobstruction de la lumire des vaisseaux sanguins. Le traitement de dernier recours reste le remplacement chirurgical du vaisseau ls. Lingnierie vasculaire tente donc dans ce but de mettre au point des substituts vasculaires idaux : non toxiques, non thrombogniques et prsentant des proprits proches de celles des vaisseaux natifs. Nous allons donc dcrire la structure des vaisseaux sanguins puis dfinir un biomatriau et enfin nous verrons lingnierie tissulaire.
I. Les vaisseaux sanguins

I.1. Structure gnrale
La paroi vasculaire (figure 48) comprend trois tuniques concentriques et solidement runies : une tunique interne ou intima, une tunique moyenne ou mdia et une tunique externe ou adventice. I.1.a. Intima
Lintima tunique la plus interne et la plus fine, est constitue dune couche monocellulaire de cellules endothliales ou endothlium, qui reposent sur une lame basale, et dune couche sous-endothliale de tissu conjonctif fibro-lastique qui contient du collagne, des fibres lastiques, des fibres musculaires lisses et des fibroblastes qui produisent des protoglycannes et des glycosaminoglycannes. Lendothlium est linterface entre le sang et la paroi vasculaire et joue donc le rle dune barrire de permabilit slective. De plus lendothlium a une proprit antithrombotique par deux mcanismes : la charge ngative de 85
la paroi vasculaire qui empche ladhsion des cellules vasculaires et la production de molcules antithrombotiques (activateur tissulaire du plasminogne, prostacycline, monoxyde dazote,) par les cellules endothliales (CE). Enfin lendothlium contrle en partie le tonus vasculaire par la synthse de molcules vasoactives.
Figure 48 : structure de la paroi d'une artre
I.1.b. Mdia
La mdia, tunique moyenne et avasculaire, est la plus paisse. Elle est essentiellement constitue de cellules musculaires lisses (CML), mais aussi de matrice conjonctive cest-dire dlastine, de collagne et de mucopolysaccharides. Elle est spare de lintima par la limitante lastique interne (LEI) qui est constitue dune lame dlastine.
Nous allons nous intresser plus particulirement la mdia. Lorganisation des fibres lastiques et des CML varie selon la fonction du vaisseau. Dans les artres lastiques, la mdia est forme par des lames de fibres lastiques concentriques entre lesquelles se trouvent des CML. Les CML et les lames lastiques forment des units lamellaires concentriques dont le nombre est proportionnel au diamtre du vaisseau. Depuis 1985, on parle de feuillet 86
musculo-lastique : cest un groupe de cellules enveloppes dans une matrice constitue dune lame basale et de fibrilles de collagne, le tout tant envelopp dans un tapis de fibres lastiques. Dans les artres musculaires, cette structure lamellaire nexiste pas, on trouve uniquement quelques lamelles lastiques entre des couches de CML. Dans ces 2 types dartres, les CML sont disposes de faon concentrique. De plus la constitution de la mdia permet de classifier les diffrentes artres en trois groupes. On distingue : compliance, Les artres de transition entre les artres lastiques et musculaires, Les artres musculaires qui sont loin du cur, de petit ou moyen calibre ; elles Les artres lastiques qui sont de gros calibre et proches du cur, comme
laorte ; elles possdent une mdia riche en fibre lastiques qui assure des proprits de
sont les plus nombreuses, et possdent une mdia pauvre en fibre lastiques. La couche de cellules musculaires lisses assure des proprits vasomotrices. I.1.c. Adventice
Ladventice est la tunique externe ; elle est constitue de tissu conjonctif peu organis. Elle est riche en collagne et en fibres lastiques et contient des fibroblastes et des adipocytes. Ladventice est irrigue par des vasa vasorum et innerve par des nervi vasorum. Elle comprend aussi une enveloppe qui permet lancrage de lartre aux structures voisines. Elle repose sur la limitante lastique externe (LEE), compose dune lame dlastine, qui la spare de la mdia. I.2. Les cellules musculaires lisses (CML) I.2.a. Structure
Les CML (figures 49 et 50) ou liomyocytes sont en forme de fuseau et ont une taille trs variable, de 20 500m. Cette cellule possde un noyau unique allong ou elliptique au centre de la cellule, et le cytoplasme forme une zone bien dfinie qui 87 Figure 49 : Figure 49 : structure d'une cellule musculaire lisse
coiffe les 2 ples du noyau qui contient les organites de la cellule. Le reste de la cellule contient le sarcoplasme et des myofilaments. Les myofilaments sont de deux types : des myofilaments fins dactine et des myofilaments pais de myosine qui sont groups en faisceaux irrguliers orients selon le grand axe de la cellule. Ces derniers sont associs des molcules de tropomyosine. Les myofilaments dactine et de myosine sont attaches des zones denses du sarcoplasme constitues dalpha-actinine. Des filaments intermdiaires constitus de desmine et de vimentine sont aussi attachs ces zones denses. Dans la membrane plasmique on trouve des jonctions communicantes. Entre deux de ces jonctions le sarcolemme possde des plaques dadhrence en alternance avec des zones riches en cavoles. Chaque CML est entoure dune lame basale externe.
Figure 50 : observation dun tapis de cellules musculaires lisses en microscopie lectronique contraste de phase
I.2.b. Proprits
Les cellules musculaires lisses matures sont incapables de migrer. Elles possdent une faible capacit de prolifration et scrtent une faible quantit de matrice extra-cellulaire. Cependant, loppos des cellules matures, les cellules musculaires qui interviennent lors dun remodelage ou lors de la formation du systme vasculaire subissent un changement phnotypique qui leur confre un avantage volutif typique. Ce changement caractristique est une proprit essentielle de leur programme de diffrenciation, montrant une certaine plasticit (figure 51). On peut ainsi observer un large spectre de phnotypes en rponse diffrents stimuli physiologiques ou pathologiques.
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Cette htrognit dtats phnotypiques ne possde pas de marqueurs distincts. Ces derniers apparaissent de faon progressive grce des mcanismes dinduction pour former un appareil contractile efficace. Il est donc important de dfinir les diffrentes protines qui caractrisent un tat dfini. Il existe par consquent des marqueurs diffrents pour les CML matures et une ligne cellulaire utilise pour la culture cellulaire.
Phnotype contractile
CML Diffrencie
Changement rapide de phnotype
Phnotype de synthse
CML Ddiffrencie
In vivo
In vitro
Figure 51 : reprsentation de CML de phnotype diffrenci (contractile) et ddiffrenci (de Figure 51 : synthse).
En rsum, lidentification des CML seffectue sur plusieurs critres : les marqueurs spcifiques que nous dtaillons par la suite, leur morphologie et leurs caractristiques fonctionnelles. I.2.c. Marqueurs de diffrenciation
Les marqueurs qui caractrisent les CML sont nombreux et de deux types : les protines de lappareil contractile et les filaments intermdiaires. Les protines de lappareil contractile
Les protines de lappareil contractile sont elles-mmes constitues de deux types de filaments : les filaments fins et les filaments lourds.
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Les filaments fins sont les suivants : L-actine de muscle lisse, protine de 42kDa, est le premier marqueur de
diffrenciation identifi. Il existe 5 autres isoformes de lactine (Vandekerckhove et al., 1978) mais, dans les CML vasculaires diffrencies et matures, la forme la plus abondante est lactine avec plus de 40% des protines totales et plus de 70 % de lactine totale. De plus pour une bonne contraction la cellule doit ncessairement contenir un fort pourcentage d -actine. La caldesmone est un marqueur exprim dans les cellules matures et immatures
mais galement dans des tissus non musculaires (Ueki et al.,1987). Du fait de son absence de spcificit, il nest pas utilis dans la caractrisation des CML. Son fonctionnement se ralise via une liaison avec lactine et la calmoduline. La calponine est fortement lie lactine mais son mcanisme daction rel
nest pas clairement tabli. Il a seulement t prouv que cette protine de 28 34 kDa agissait de manire calcium-dpendante (Winder et al., 1992). La smootheline est un marqueur tardif de diffrenciation des CML (Van der
Loop et al.., 1996). Cette protine de 100 kDa est une protine structurale associe aux filaments dactine. Son expression est rapidement rprime lors de la mise en culture, il est donc impossible de caractriser les CML par ce marqueur. La SM22 est une protine de 22 kDa comme lindique son nom. Elle est
mal identifie. Elle est prsente principalement chez les CML mais on peut aussi la trouver dans les fibroblastes et les myofibroblastes (Chiavegato et al., 1999)
Les filaments lourds quant eux sont constitus exclusivement par de la myosine et ses deux types de chanes : la chane lourde et la chane lgre. La chane lgre sous sa forme phosphoryle induit un changement de conformation de la myosine dans un tat capable de se lier lactine.La chane lourde est exprime sous deux formes dans la CML : SM-1 et SM-2. La forme deux est un marqueur de diffrenciation avanc des CML (Babij et al.,1992). Son rle principal de contraction est assur par sa fonction ATPasique. Les filaments intermdiaires
Ils sont reprsents par la desmine et la vimentine. La proportion de ces deux types de filaments varie entre les CML dun mme vaisseau (Gabbiani et al., 1981). Leur rle consiste en un maintien de la morphologie cellulaire et de la cohsion intercellulaire, mais galement dans la rsistance au stress mcanique. 90
II. Les biomatriaux

II.1. Dfinition
La confrence de consensus de Chester de la Socit Europenne des biomatriaux a dfini les biomatriaux en 1986 de la manire suivante : matriaux non vivants utiliss dans un dispositif mdical destins interagir avec les systmes biologiques . Cependant cette dfinition t modifie en 1991 pour prsenter les biomatriaux comme des matriaux utiliss pour interagir avec les systmes biologiques dans le but dvaluer, traiter, augmenter ou remplacer tout tissu, organe ou fonction de lorganisme .
Pour quun biomatriau soit idal , il doit possder de nombreuses proprits telles que la biocompatibilit, la biofonctionnalit, la biodgradabilit, linertie, la non-
immunognicit et la strilisabilit. En effet ces matriaux doivent avoir la capacit dtre utiliss dans des applications spcifiques dinteraction chez un tre vivant (humain) avec une rponse approprie de lhte et de maintenir cette capacit dans le temps.
II.2. Alginate
La structure de ce produit, ainsi que ces proprits physico-chimiques ont dj t dvelopp dans la partie des alginates. Nous ne les redtaillerons donc pas ici.
II.3. Les films multicouche de polylectrolytes
Dans les annes 1990 Decher et al.. dcouvrent les films multicouche de polylectrolytes. Cette technique alors innovante permet la formation de minces films de polymres hydrophiles. Cette construction est ralise par le dpt de couches successives de chanes de polylectrolytes sur une surface charge (figure 52). Lpaisseur du dpt est variable mais sa mesure varie du nanomtre plusieurs dizaines de nanomtres. Les couches successives rsultent dune adsorption alterne de polycations et de polyanions et constituent un film trs hydrat.
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Figure 52 : principe de la construction d'un film multicouche de polylectrolytes Figure 52:
Ce type de structure possde une bonne cohsion grce aux forces lectrostatiques qui interagissent entre les diffrents lectrolytes de charges opposes mais galement par lintermdiaire des interactions hydrophobes qui permettent une certaine stabilit du complexe (Kotov et al.., 1999). De nombreux polylectrolytes sont envisageables : poly-Dlysine, polythylnimine, poly-L-glutamine, polylysine,, mais dans notre travail nous avons choisi dutiliser comme polycation le PAH ou Chlorhydrate de poly(allylamine) et comme polyanion le PSS poly(4-styrne sulfonate de sodium) (figure 53). Dans ce type de film, la masse et lpaisseur croissent de faon linaire avec le nombre de couches (Lavalle et al., 2002). Dans les films linaires, les diffrentes couches pntrent peu les unes dans les autres : on obtient alors un film stable, homogne et adhrent grce aux diverses interactions entre les polylectrolytes eux-mmes et avec le substrat.
PAH
PSS Figure 53 : structure chimique des polylectrolytes utiliss. PAH: poly (allylamine hydrochloride); PSS : poly (sodium 4-styrne sulfonate)
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Un des avantages des multicouches de polylectrolytes est la possibilit de modifier leurs proprits en ajustant certains paramtres comme la nature des polylectrolytes, la force ionique, le pH ou encore la temprature. Les proprits modulables sont entre autres, lpaisseur, la rugosit, la permabilit, les proprits mcaniques ou encore la charge de surface.
Depuis quelques annes, ces films sont trs tudis du fait de leurs nombreuses applications. Ils trouvent actuellement une application dans des domaines varis tels que loptique avec le traitement des verres antireflets, des procds de sparation et de nanofiltration, la production de microcapsules et nanoparticules,, mais surtout pour ce qui nous concerne la bioingnierie que nous dvelopperons dans le paragraphe suivant.
III. Ingnierie tissulaire

III.1. Dfinition
Lingnierie tissulaire (IT) a pour but de remplacer, maintenir ou amliorer la fonction de tissus humains, grce des substituts tissulaires incluant des lments vivants. Il s'agit donc d'laborer des tissus artificiels, en faisant appel aux cultures de cellules (cellules diffrencies, ou cellules souches), des biomatriaux, des facteurs de croissance dans le but daboutir un biomatriau hybride. Cette technique utilise gnralement les scaffolds , cest--dire des matrices qui servent de support la reconstruction tissulaire.
Figure 54 : concept dingnierie tissulaire ; lingnierie tissulaire est base sur le triptyque cellules/biomatriaux/facteurs biologiques dans le but de gnrer un tissu hybride 93
III.2. Rle de lingnierie tissulaire dans lathrosclrose
Lathrosclrose est une pathologie qui conduit lobstruction de la lumire des vaisseaux. A lheure actuelle le traitement de dernier recours reste le remplacement chirurgical du ou des vaisseau lss. Deux techniques sont possibles : la greffe autologue et la greffe de vaisseaux synthtiques. La greffe autologue peut se raliser partir de veine saphne ou dartre mammaire interne en raison de leurs caractristiques structurales ou fonctionnelles proches de celles des vaisseaux lss. La limite de cette premire technique est le manque de greffons disponibles. En effet, 70% de ces greffons ne peuvent par tre utiliss du fait de leur mauvais tat ou de leur utilisation pour une intervention prcdente. Quant la greffe de vaisseaux synthtiques, elle utilise des prothses base de polyttrafluorothylne expans (PTFE) (figure 55), de polyurthane ou enfin de polythylne trphtalate (Dacron). Cette technique possde lavantage de ne pas recourir une intervention chirurgicale pour lobtention du greffon Cependant les prothses synthtiques de petit calibre c'est--dire infrieur 6 millimtres, posent des problmes de restnose du fait de leur surface interne thrombognique et de leurs faibles proprits mcaniques. Par consquent, il existe un manque cruel de greffons de petit calibre possdant des proprits mcaniques similaires aux vaisseaux naturels et non thrombogniques. Figure 55 : vaisseaux synthtiques Figure 55 : en PTFE
Lapproche globale de lingnierie tissulaire des vaisseaux est base sur les scaffolds . Deux types de scaffolds ont t dcrits : de polymres synthtiques type acide polyglycolique (Iwasaki et al., 2008 ; Hoerstrup et al., 2001), poly-L-lysine, polyurthane (Kim et al., 1998) et des matrices biologiques. Ces dernires sont reprsentes par trois grandes classes : les vaisseaux sanguins dcellulariss allo- ou xnogniques, des conduits non vasculaires dcellulariss et des matrices extracellulaire prfabriques comme des gels de collagne ou des matrices gnres in vitro par des fibroblastes ensemencs dans un bioracteur. Par ailleurs les scaffolds ne doivent pas tre cytotoxiques, ni thrombogniques et immunognes (Yow et al., 2006).
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Ces diffrents scaffolds vont tre ensemencs avec des CE et CML en condition dynamique dans un bioracteur mis au point par Niklason et al. en 1999.
En 1986, Weinberg et al. ont t les premiers dvelopper cette technique. Le scaffold utilis tait un gel de collagne dans lequel taient insrs des fibroblastes. Une fois le cylindre ralis, les autres types cellulaires (CE et CML) sont ajouts au systme afin dobtenir un vaisseau de petit calibre.
En se basant sur cette technique, Lheureux et al. ont dvelopp en 1998 une nouvelle approche de lingnierie tissulaire vasculaire appele cell sheet qui consiste produire les diffrents feuillets du vaisseau afin de les assembler.
III.2.a. Construction par feuillet cellulaire
La construction des feuillets est dlicate puisquelle doit permettre leur dtachement de la culture cellulaire tout en conservant les interactions cellules-cellules. La difficult de cette technique consiste obtenir des cellules ayant une forte cohsion entre elles mais pas avec le substrat. Cependant, si les cellules nadhrent pas suffisamment avec le substrat elles ne pousseront pas correctement et ne synthtiseront pas leur matrice. Lintrt de ce systme est par consquent de rcuprer les cellules dans leur ensemble et dans la matrice extracellulaire quelles viennent de synthtiser. Cette technique fait ses preuves dans les domaines articulaire, ligamentaire, cardiaque,. Mais Lheureux et al. sont les premiers avoir dvelopp cette technique en 1998 dans le cadre de lingnierie vasculaire. Leur but est de dvelopper un greffon vasculaire en utilisant du matriel biologique qui servira crer des scaffolds . Les cellules utilises sont les CE et des CML de cordon ombilical humain ; quant aux fibroblastes ils sont issus dun prlvement de peau humaine. Ces diffrents types cellulaires sont cultivs pendant 5 semaines et aboutissent des feuillets cellulaires cellules confluentes et avec production de matrice extracellulaire (MEC). Les feuillets sont alors enrouls autour dun mandrin afin de former la media et ladventice. Ce systme est ensuite cultiv 8 semaines dans un bioracteur adquat. Au bout de ce temps le mandrin est retir et le rouleau obtenu est endothlialis avec des CE. Le greffon ainsi obtenu possde de bonnes proprits mcaniques et de suturabilit. 95
Ce systme a t test in vivo mais un taux de russite de 50% seulement t obtenu. La raison de ce faible taux est une infiltration sanguine entre les diffrents feuillets. La suite des travaux des ces auteurs, leur a permis damliorer leur produit et de dvelopper Lifetime, un greffon constitu dun feuillet de CE et dun de fibroblaste. Ce substitut implant chez le singe dmontr son efficacit avec un taux de permabilit 8 mois de 86% (Lheureux et al., 2006). Le problme majeur de cette technique est le travail fastidieux et trs long ncessaire pour la ralisation dun seul greffon.
Afin de crer ces diffrents feuillets plusieurs matrices peuvent tre utilises telles que le collagne, diffrents polymres, Nous avons choisi dutiliser un polymre particulier, lalginate, qui a dj montr un intrt particulier dans le cadre de lingnierie tissulaire. III.2.b. Applications de lalginate dans lingnierie tissulaire
Les gels dalginate trouvent de nombreuses applications dans lingnierie tissulaire. En effet, lalginate est une substance non toxique, inerte et non immunogne qui prsente donc les caractristiques requises pour constituer un bon scaffold pour lingnierie tissulaire (Hara et al.., 2001).
Plusieurs quipes ont dmontr lintrt de ce type de biomatriau. Lalginate t utilis comme vecteur de dlivrance mais aussi comme support de microencapsulation. En effet des billes dalginate servent de rservoir. Elles constituent un support trs bien tudi aujourdhui puisquon sait contrler leur production et leur reproductibilit au niveau des dimensions. Lalginate en tant que matrice de support de lencapsulation cellulaire est un outil considrable utilis dans lexprimentation animale et les essais cliniques (Leinfelder et al., 2003). De plus ces billes sont biodgradables grce une diffusion lente des ions calcium (qui permettent la cohsion du gel) en dehors du gel. In vivo, les molcules dalginate sont excrtes par voie urinaire (Novikov et al., 2002).
Lalginate est galement utilis dans la culture cellulaire dhpatocytes, de cellules nerveuses mais principalement de chondrocytes. Diffrentes tudes ont montr que ladhsion et la morphologie cellulaires des chondrocytes varient en fonction des proprits mcaniques des gels qui les supportent (Genes et al., 2004). 96
Enfin, afin damliorer les proprits biologiques des gels, il est possible de le mlanger avec dautres biomatriaux. Cette association notamment t ralise dans le domaine de los par association avec de lhydroxyapatite. Ce mlange produit un composite ostoconducteur qui active la prolifration des cellules osseuses et permet de maintenir un phnotype osseux plus longtemps (Tampieri et al., 2005).
Au vu de ces diffrentes applications, lalginate semble possder de nombreuses qualits du biomatriau recherch et il semble donc intressant dy recourir pour la cration de cell sheet. De plus, il est possible de le fonctionnaliser afin damliorer ladhsion et la prolifration cellulaire et de parvenir le plus rapidement possible un feuillet cellulaire. Or les films multicouche de polylectrolytes ont dj beaucoup t tudis et leurs applications dans lingnierie tissulaire sont nombreuses (Kerdjoudj et al., 2010). III.2.c. Applications des films multicouche de polylectrolytes dans lingnierie tissulaire
Plusieurs quipes se sont attaches dmontrer que le verre recouvert avec des films multicouche de polylectrolytes permet une bonne adhsion cellulaire et un bon comportement des cellules vasculaires matures (CML et CE) (Berthlmy et al.., 2008).
De plus certaines ont valu le comportement des HUVEC sur diffrents types de films, dmontrant ainsi que les films se terminant par une charge positive, cest--dire un polycation, permettent une meilleure adhsion des diffrents types cellulaires mais galement que le film PAH-(PSS-PAH)3 prservait mieux la forme et lallongement du cytosquelette. Ce type de film semble donc idal puisquil ne modifie en rien lexpression de certaine molcule dadhsion comme ICAM-1 (intracellular cell adhesion molecules-1) (Boura et al.., 2006).
Dautre types de coating par des films ont t raliss. Des essais damlioration de ladhsion des cellules endothliales dans des substituts synthtiques de type PTFEe ou dacron ont t raliss (Moby et al.., 2007)
Aujourdhui la recherche semploie galement coater des greffons naturels cryoprservs avec ce type de film. Des rsultats prliminaires ont montr que ces films
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permettaient la formation dune monocouche endothliale avec des CE adhrentes par rapport aux greffons non traits (Kerdjoudj et al.., 2006 et 2008).
Dans le cadre de nos recherches, nous allons tenter de dvelopper un gel dalginate qui dans un premier temps servira de matrice pour crer un feuillet de CML (figure 56). Afin damliorer le biomatriau choisi, il va tre fonctionnalis par des films multicouche de polylectrolytes.
Figure 56 : ingnierie vasculaire : construction par feuillet cellulaire. Les cellules sont cultives sur un biomatriau fonctionnalis afin de former un feuillet cellulaire. Puis le feuillet est dtach de son support pour tre enroul autour dun mandrin. Ce tube va ensuite tre cultiv dans un bioracteur. La lumire pourra alors tre endothlialise afin de former un vaisseau autologue
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B/ MATERIEL ET METHODES
I. Prparation du biomatriau
I.1. Prparation des lames de verre
Avant de dposer le film multicouche de polylectrolytes sur les lames de verre il faut faire ressortir la polarit ngative due la silice. Pour cela on procde deux lavages de 15 min dans un bain de SDS (Sigma, France) 0,01 M dilu dans de leau distille filtre 100C, puis dans un bain de HCl (Sigma, France) 0,12M 100C. Aprs chaque bain trois rinages sont effectus avec de leau distille filtre. Les lames sont conserves jusqu leur utilisation dans de leau distille filtre 4C. I.2. Matriel
Les polylectrolytes utiliss sont : - Le polycation : chlorhydrate de polyallylamine (PAH) (Sigma Aldrich, France, PM=70kDa) - Le polyanion : poly (4-styrne sulfonate de sodium) (PSS) (Sigma Aldrich, France, PM=70kDa).
Les polylectrolytes sont dissous une concentration de 1 mg/mL dans une solution de chlorure de calcium (CaCl2) (Sigma, France) 7,4 mg/ml. Cette solution est galement utilise pour les lavages. Les films sont dposs par une technique de spray. Pour cela des flacons vaporisateurs air-boy (Carl Roth, France) (figure 57) sont utilises. La lame est dpose sur un support ralis par le laboratoire de Strasbourg par lquipe de Mr Voegel. Deux types dalginate de sodium sont utiliss : viscosit faible (ALV : Alginate Low Viscosity) et moyenne viscosit (AMV : Alginate Medium Viscosity) (Sigma, France). Ces deux polymres sont Figure : flacon Figure 57 57 : pulvrisateur "airboy"
dissout dans de leau miliQ une concentration de 1%, soit 1g pour 100 mL. 99
I.3. Protocole
Les flacons air-boy sont remplies au maximum avec les solutions ralises. Un maximum dair y est introduit afin dobtenir un spray bien diffus et en fines gouttelettes. Les solutions sont pulvrises les unes la suite des autres, sur la lame de verre une distance de 5 cm.
Les temps de pulvrisation varient selon la solution : 30 secondes pour les couches dalginate ; 5 secondes pour les couches de chlorure de calcium ; 15 secondes pour les solutions de polylectrolytes. La lame de verre est ensuite retire du support pour tre place dans une bote de ptri. Les cellules sont alors ensemences sur ce support une densit de 1 000 000 cellules. Elles sont dposes sur le biomatriau, puis on ajoute par dessus la quantit de milieu ncessaire afin de ne recouvrir que la lame. Au bout de 4 heures dincubation 37C , du milieu de culture est ajout pour atteindre 10 mL. Les cellules sont laisses en culture jusqu confluence. I.4. Enroulement du gel
Lenroulement se ralise autour dune barre en tflon de diamtre 6 mm qui va servir de mandrin (figure 58). Le tflon est utilis en raison de sa non adhrence mais galement de sa possibilit dautoclavage.
Figure 58 : technique d'enroulement du feuillet cellulaire
La structure dalginate est dcolle de la lame de verre puis progressivement enroule autour du mandrin. Une fois lenroulement effectu, la barre de tflon est retire dlicatement et le rouleau est plac dans une bote de ptri dispose verticalement.
100
II. Mthode de caractrisation du biomatriau

II.1. Microscopie confocale a balayage laser
Le microscope utilis au laboratoire est un Leica TCS SP2-AOBS (Leica microsystems, Allemagne).
La microscopie confocale balayage laser permet de visualiser des tissus en trois dimensions et marqus par des molcules fluorescentes.
Le microscope confocal est bas sur le principe de la fluorescence, la lampe lumire blanche tant remplace par un laser. Le laser est focalis sur la prparation et seule la zone de focalisation est suffisamment excite pour mettre de la fluorescence, le reste de la prparation restant sombre. En balayant avec le laser tout le plan de focalisation, on obtient une image trs nette.
Le laser excite les fluorochromes en des points prcis de lchantillon. Le signal mis en chaque point est rcupr sur un photomultiplicateur. Un diaphragme, qui arrte tout signal ne provenant pas du plan focal, est plac devant le photomultiplicateur. Le signal reu y est amplifi puis numris. Limage est construite point par point par balayage du champ analys laide de miroirs de dflection de la source lumineuse.
Figure 59 : principe de fonctionnement du microscope confocal
101
II.2. Mesure de la viscosit des solutions dalginate II.2.a. Principe de fonctionnement
Le viscosimtre Low-shear 30 (Contraves, Suisse) est un rhomtre rotatif bas sur le principe de Couette. Il est constitu de deux cylindres coaxiaux : Un cylindre extrieur entran par un moteur vitesse de rotation rgule. Ce cylindre recueille la substance tudier. Un cylindre intrieur fixe reli un systme de mesure qui transforme la force mcanique en force lectromagntique.
La substance tudier joue le rle dinterface entre les deux cylindres. La mesure du couple ncessaire pour empcher la rotation du cylindre intrieur sous l'effet de la viscosit de la substance permet de remonter la valeur de la viscosit.
Figure 60 : viscosimtre Low shear 30 et principe de Couette
II.2.b. Protocole
La temprature de travail est extrmement importante pour la mesure de viscosit. Il est donc ncessaire de la connaitre avec prcision. Pour cela de leau distille ainsi quun thermomtre sont placs dans le cylindre interne jusqu quilibre de la temprature.
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Ensuite lappareil est mis en route vitesse de cisaillement nulle et le cylindre interne est sch pour rgler le zro. La viscosit de leau distille est une valeur connue aux diffrentes tempratures. Un contrle est donc effectu. Le viscosimtre cisaille de 128,5 s-1 0,01747s-1. Les diffrentes vitesses de cisaillement sont parcourues afin dobtenir les premires valeurs numriques partir desquelles on va en dduire la viscosit. Ces valeurs doivent tre comprises entre 10 et 90 afin dtre le plus prcis possible.
Ces valeurs obtenues sont alors transformes en viscosit en mPa.s grce aux abaques.
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C/ RESULTATS
I. Mise au point de larchitecture base du gel dalginate et de films multicouches de polylectrolytes
Le travail effectu lors de cette premire phase a consist en la dtermination des bonnes conditions exprimentales afin dlaborer une membrane dtachable base de gel dalginate. I.1. Formation dun gel dalginate la surface dune lame de verre
Le but ici est dobtenir une membrane dalginate homogne. Deux techniques de dpt ont pu tre testes: - La premire a consist dposer manuellement, laide dune pipette, une solution dalginate sur une lame de verre. Le gel dalginate est ensuite obtenu par trempage de cette dernire dans une solution de chlorure de calcium (CaCl2) pour permettre la glification de lalginate. - La deuxime mthode est base sur la technique du spray ou pulvrisation, o lalginate est pulvris laide des bouteilles Air-Boy , directement sur la lame de verre. Lorientation verticale de cette dernire permet un drainage naturel de la solution dalginate. De la mme manire, la solution de CaCl2 est pulvrise sur la lame de verre afin dobtenir un gel dalginate.
Il est important de signaler que lalginate tant un polymre ngatif, il est impratif davoir une surface positive pour permettre ladhsion du gel. Pour cela, nous avons adsorb une couche de PAH, un polylectrolyte charg positivement, la surface de la lame de verre charge ngativement la base.
Daprs les rsultats obtenus, nous avons observ que le dpt par lapproche du spray permet dobtenir un gel fin et dapparence homogne et plan. Au contraire, lorsque le gel est dpos suivant la premire mthode, celui-ci prsente des irrgularits sa surface facilement visualisables lil nu. Le gel est galement beaucoup plus pais. 104
Par consquent, toutes nos constructions ont t ralises par la mthode de spray .
I.2. Elaboration dune membrane de gel dalginate dtachable I.2.a. Gels simples Nous avons choisi de comparer deux types dalginate : - Lalginate de basse viscosit ou alginate low viscosity (ALV). - Lalginate de moyenne viscosit ou alginate medium viscosity (AMV). Nous avons observ que le gel dalginate obtenu par une solution dALV est trs fin, facilement cassable et ne se dcolle pas aisment de la lame de verre. LAMV permet dobtenir une membrane de gel dalginate qui se dtache convenablement du support condition que le gel soit suffisamment pais (figure 61).
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Figure 61 : dpt dun gel dalginate de viscosit moyenne color au bleu de trypan sur lame de verre (A). Le gel est ensuite dcoll progressivement de son support (B, C, D) puis enroul autour dun mandrin de verre (E). I.1.a. Gels stratifis Notre but est dobtenir une membrane dalginate qui soit fine et facilement dtachable. Pour cela, nous avons opt pour une architecture stratifie o deux gels dalginate seront superposs. Les superpositions testes sont les suivantes : - AMV sur AMV, - AMV sur ALV. Nous avons montr la superposition de deux gels dalginate nest possible que lorsquune couche de PAH est adsorbe la surface du premier gel. La superposition AMV sur AMV conduit au dcollement des deux couches du support. Cependant, la superposition AMV sur ALV a permis le dtachement dune membrane dalginate compos dAMV. En effet, le gel dALV reste coll la lame de verre. Cette
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deuxime architecture semble donc plus satisfaisante car on obtient une seule membrane moins paisse et plus facilement enroulable. I.3. Elaboration de larchitecture stratifie base de gel dalginate et de films multicouches de polylectrolytes
Nous avons ralis larchitecture suivante (figure 62) : 1 : FMPE (films multicouche de polylectrolytes) 2 : ALV 3 : FMPE 4 : AMV 5 : FMPE
Figure 62 : architecture finale dveloppe : sur la lame de verre sont dposs 2 bicouches et demi de polylectrolytes. Un gel dalginate de basse viscosit est ensuite dpos. Puis 1 bicouche et demi des mmes polylectrolytes est ensuite dpos. La deuxime couche dalginate de viscosit moyenne est ensuite dpose puis recouverte dun film multicouche de polylectrolytes composs de 5 bicouches et demi. I.3.a. Visualisation de larchitecture en microscopie optique : topographie
Nous avons constat grce au microscope optique contraste de phase (figure 63 A) que le gel prsente une porosit importante sa surface. Lorsque la glification est ralise par pulvrisation de la solution de CaCl2 directement au-dessus, la surface du gel est rgulire et caractrise par des stries distantes de quelque micromtres (figure 64).
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Figure 63 : aspect de la surface du gel observ au microscope contraste de phase (objectif x40) (A) et au microscope confocal (B) aprs avoir recouvert le gel dalginate dun film de PAH marqu la FITC (objectif x40).
La microscopie confocale a galement permis de confirmer la topographie poreuse du gel dalginate lorsque la glification est ralise par pulvrisation de la solution de CaCl2 directement sur le gel (figure63 B).
Figure 64 : observation au microscope contraste de phase (objectif x40) des stries ralises dans le gel dalginate la suite de la modification de la technique de pulvrisation
I.3.b. Epaisseur de larchitecture stratifie
Pour estimer lpaisseur de notre architecture, nous avons utilis le PAH marqu la FITC. Larchitecture visualise est la suivante : PAH (FITC) AMV / ALV PAH (FITC) 108
Le rsultat a montr que lorsque le temps de pulvrisation est de 30 secondes, que ce soit dans le cas de lALV ou de lAMV, nous obtenons une paisseur totale denviron 50m (figure 65).
PAH(FITC) Epaisseur dune couche dAMV
PAH(FITC)
Figure 65 : mesure de lpaisseur de gel dalginate de viscosit moyenne (AMV), selon le repre xzy. Sur la lame de verre, une couche de PAH marqu la FITC est dpose puis le gel dalginate est pulvris sur cette couche. Enfin une couche de PAH marqu la FITC recouvre ensuite le gel. Microscope confocal balayage laser, ouverture numrique = 0,8(SP2, AOBS, Leica Allemagne); barre chelle = 75 m,objectif x40.
I.4. Enroulement du gel dalginate
La finalit de cette construction est dobtenir un tube (cellularis) de forme proche de celle du vaisseau sanguin. Pour cela, lalginate est dabord dtach du support puis enroul autour dun mandrin en tflon (figure 66). Le gel dalginate une fois enroul peut donc tre retir du mandrin et mis dans une solution de CaCl2 o il reste enroul.
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Figure 66 : enroulement du biomatriau final non cellularis. Le gel est dabord dcoll de la lame de verre (A) puis enroul autour dun mandrin en tflon (B, C). Une fois enroul (D) le tube est retir du mandrin en tflon (E). Le tube reste en forme une fois le mandrin retir (F).
I.5. Quelques tests mcaniques prliminaires sur le rouleau du gel dalginate
Des essais mcaniques purement qualitatifs ont t raliss sur le biomatriau dvelopp afin de valider dans un premier temps sa rsistance diffrentes tensions : la pression, la torsion et ltirement.
Le tube dalginate a t soumis un flux de CaCl2 (pression) appliqu laide dune seringue : ce dernier ne sest pas rompu et apparat tanche (figure 67 A,B). Les mouvements de torsions appliqus au gel ne provoquent pas sa dformation mais ce dernier revient son tat initial la fin de la torsion (figure 67 C). Ce nest que lorsque le tube dalginate est soumis un trs fort tirement sur ses extrmits, que la rupture sopre au niveau des ligatures et non au centre, ce qui prouve sa relative solidit (figure 67 D).
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Figure 67 : ralisation de tests mcaniques succincts : les tests de pression envoient de leau dans le rouleau laide dune seringue fixe en bout du tube afin dobserver la dformabilit du tube (A, B). Le deuxime test consiste tirer sur les deux bouts du tube afin dobserver sa rsistance ltirement (C). Enfin des tests de torsion ont t raliss : le tube est tordu de 180C puis le gel revient sa forme initiale (D). Aprs les diffrents tests effectus, le biomatriau est droul pour observer son tat : le gel a un aspect froiss mais sa taille est relativement inchange (E, F).
II. Suite du travail

La premire tape de la suite consistera tudier la viabilit cellulaire sur ce biomatriau. Pour ce faire, des cellules musculaires lisses vont tre ensemences sur ce support et des test dAlamar Blue vont tre effectus. La culture cellulaire et le test de viabilit ont dj t mis au point et sont dcrits respectivement en annexes 2 et 3.
Sur ce mme support il sera essentiel de vrifier que les cellules ensemences sont bien adhrentes et ne se ddiffrencient pas. Un immunomarquage fluorescent sera effectu sur ces cellules (protocole dtaill en annexe 4) : - ladhsion cellulaire sera vrifie grce au cytosquelette, - les caractristiques phnotypiques seront vrifies grce aux marqueurs de diffrenciation que sont : l-actine, la myosine (MHC : myosine heavy chain), la calponine.
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Lalginate interagit avec le milieu de culture. Les ions sodium contenus dans le milieu schangent avec le calcium, provoquant ainsi une liqufaction du gel. Les diffrentes solutions proposes pour remdier cet inconvnient sont les suivantes : 1) Epaisseur du gel : daprs la littrature, plus le gel est pais, plus la
rticulation en profondeur est mdiocre et donc moins le gel est rigide et solide. 2) Ajout de calcium dans le milieu : lajout de calcium dans le milieu
permet de rduire le phnomne de relargage de calcium par le biomatriau et par consquent de rigidifier le support. 3) Modification du nombre de couches de polylectrolytes.
Laugmentation du nombre de couches de polylectrolytes trs rigide, la surface de ce biomatriau, pourrait augmenter la rsistance de ce gel.
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D/ DISCUSSION - PERSPECTIVES
I. Discussion
Lingnierie vasculaire tend reconstruire in vitro un greffon vasculaire autologue prsentant des caractristiques structurales et fonctionnelles se rapprochant de celles dun vaisseau natif. Deux approches en ingnierie tissulaire ont t dveloppes dans la littrature. La premire consiste associer un biomatriau polymrique biodgradable, dorigine synthtique ou naturelle, et des cellules. La deuxime approche est base sur llaboration de feuillets cellulaires qui vont tre assembls puis enrouls pour mimer les diffrentes tuniques dun vaisseau natif. La maturation de ce systme se ralisera sous flux pour mimer les conditions physiologiques de la circulation sanguine. Ces approches prsentent des limites dont la principale reste le temps ncessaire la ralisation de ce substitut (plus de 3 mois) incompatible avec le caractre durgence de cette situation.
Le travail que jai ralis sinscrit dans le domaine de lingnierie vasculaire. Le but tait le dveloppement dune membrane dalginate, facilement dtachable du substrat et enroulable autour dun mandrin. La fabrication de ce tube est ltape initiale vers la constitution in vitro dun substitut vasculaire cellularis. Ce travail peut tre considr comme une tude pilote du laboratoire. Cette tude consiste optimiser les conditions afin dobtenir une membrane dalginate, dtachable et enroulable sous forme de tube.
Lalginate est un polysaccharide qui a la proprit de former un gel au contact dun cation bivalent. Il prsente divers avantages, ce qui explique les nombreuses applications dans le domaine biomdical. Pour cela, lalginate constitue le biomatriau de choix (Hara et al., 2001). Dans ce travail, nous avons pu montrer quil tait possible dobtenir un gel dalginate homogne et de meilleure qualit grce la technique de pulvrisation, en comparaison la technique de dpt o le gel prsentait des irrgularits de surface. En effet, nous avons montr que la pulvrisation et le positionnement vertical du support permettaient un drainage naturel au cours de la construction. 113
Cependant le dtachement est difficile et induirait des dgts cellulaires. Nous avons cherch construire une structure qui allie les avantages de deux types de gel : ALV et AMV.
Nous avons galement pu voir que la stratgie de superposer deux gels dalginate de type alginate de faible viscosit et alginate de moyenne viscosit est la plus satisfaisante pour dtacher avec aisance la membrane dalginate de viscosit moyenne. En mesurant lpaisseur totale (100 m : 50 m par couche) de cette architecture stratifie par microscopie confocale, nous avons montr que lalginate de faible viscosit donne un gel trs fin et facilement cassable alors que la membrane dalginate une fois dcolle de son substrat a pu tre enroule autour dun mandrin en tflon. Le tube dalginate obtenu semble rpondre nos attentes car il parat stable. Nous avons appliqu ce tube des tests manuels servant de premire apprciation qualitative de sa rsistance. Nous avons constat que le gel dalginate rsiste convenablement un tirement et a une pression exerce par la perfusion dune solution de CaCl2. Dailleurs, le tube dalginate retrouve sa forme initiale la fin des tests, ce qui signifie une bonne "souplesse".
Concernant la topographie de surface du gel dalginate, nous avons constat quil tait possible de la contrler simplement en changeant la manire de pulvriser la solution de CaCl2. En effet, lorsque la solution de CaCl2 est pulvrise directement sur le gel, nous obtenons un gel avec une surface poreuse et des invaginations. Par contre, nous avons montr que lorsque la solution de CaCl2 est pulvrise au dessus du support, la surface du gel prsentait des stries distribues de faon homogne. Ces stries rgulires devraient jouer un rle trs important pour obtenir des cellules orientes dans la mme direction. Ce phnomne est une gageure car dimportance majeure en lingnierie tissulaire : cest le "patterning". En effet il faut dire que pour orienter les cellules, il faut exercer un champ magntique ou autre. Par notre procd, les CML sorientent naturellement, donc ce phnomne est trs intressant.
Le gel dalginate seul ne permet pas ou trs faiblement ladhsion cellulaire (Augst et
al., 2006). Pour y remdier, plusieurs tudes ont montr que la fonctionnalisation du gel
dalginate par des protines dadhsion telle que RGD a permis une nette amlioration de ladhsion cellulaire (Genes et al., 2004). Les films multicouches de polylectrolytes constituent une nouvelle alternative pour fonctionnaliser de manire simple des surfaces de biomatriaux (Moby et al., 2007). Dans notre laboratoire, plusieurs travaux ont montr le potentiel des films multicouches. Ladhsion 114
et la prolifration des cellules matures sont augmentes en prsence de ces films (Boura et al., 2006), et le temps de diffrenciation des cellules souches est rduit (Berthlmy et al., 2008). Dans ce travail, nous avons opt pour une fonctionnalisation de la surface du gel dalginate par des films multicouches de polylectrolytes de type (PAH-PSS)n (n reprsente le nombre de couches) afin doptimiser ladhsion cellulaire. Le gel dalginate tant charg ngativement, nous avons choisi de commencer la construction des films multicouches sur le gel par ladsorption de PAH.
Les premiers rsultats de cette mise au point ont permis de dvelopper un biomatriau possdant les proprits recherches : membrane dtachable, enroulable, rsistante et fonctionnalise pour amliorer la prolifration cellulaire. La faisabilit du concept a donc bien t prouve.
Larchitecture dalginate ainsi dveloppe se rvle un support dintrt et dont la mise au point doit tre approfondie. Enfin, nous avons montr que lalginate permettrait un dcollement des cellules et un enroulement du feuillet. Lavantage de ce type de support compar Lheureux et al. en 2006, est que les cellules sont dcroches avec le support qui est lui-mme enroul. Le support tant directement enroul, il vite de traumatiser les cellules lors du dcollement du tapis afin de les enrouler. Ce support biodgradable devra donc progressivement tre remplac par la matrice scrte par les CML.
Lenroulement du feuillet permet de faire plusieurs couches de cellules enroules les unes au dessus des autres. Cette structure multicouche de cellules, devrait aboutir une structure quivalente la mdia de structure rsistante et possdant plusieurs couches cellulaires concentriques.
II. Perspectives
Le but de ce travail tait de proposer un protocole susceptible de permettre la fabrication dun substitut vasculaire cellularis et autologue. Cependant, nos rsultats requirent des amliorations de sa mise en uvre.
115
A court terme, le support devra tre ensemenc pour obtenir un feuillet cellulaire le plus rapidement possible sur ce support stable. Ce feuillet cellulaire devra tre caractris : les cellules devront garder leur phnotype et produire leur matrice extracellulaire afin de stabiliser dfinitivement le gel obtenu. Cette production de matrice extracellulaire devra tre quantifie. Une fois le feuillet ralis, il devra tre enroul et le comportement des cellules enrobes dans la matrice sera alors tudi. Ltape suivante sera lendothlialisation de la lumire de ce substitut, technique mieux matrise au laboratoire.
Lorsque le protocole sera arrt, ltude sera renouvele avec des cellules souches du patient dans le but de fabriquer un substitut autologue et viter tout problme de rejet lors de limplantation. Lorigine des cellules souches peut tre varie : on pourra avoir recours aux progniteurs circulants (ou EPC : endothelial progenitor cells) qui ne ncessiteraient quun prlvement sanguin pour leur recueil mais ce procd risque dtre long. Dautres sources peuvent actuellement tre tudies en particulier les cellules souches issues de la gel de Wharton du cordon ombilical, qui sembleraient encore moins diffrencies que les prcdentes.
Lavantage davoir recours ces cellules souches serait de pouvoir constituer une banque de vaisseaux disponibles en cas durgence.
Ce substitut ainsi ralis devra avoir des proprits semblables celles des vaisseaux et il est donc essentiel de raliser des tests mcaniques. Les tests devront mesurer la rsistance la pression et ltirement afin de sassurer quune fois implant, le substitut rsiste une pression mme leve et aucun anvrysme ne se dveloppe. Enfin, le substitut, pour tre implant, doit tre sutur. Il faudra donc sassurer de la rsistance la suture de ce substitut. Il faudra aussi vrifier que les cellules de ce substitut ragissent de la mme faon que celles dune artre native (communication cellulaire, production et raction au NO, ).
A long terme, ltape finale sera limplantation in vivo chez lanimal. Le modle animal choisi sera dans un premier temps le lapin (dont on connait bien le comportement et lvaluation), puis le substitut sera test sur de plus gros animaux. Si ces essais sont concluants, des essais cliniques pourront tre entrepris au travers de PHRC, en vue dobtenir une AMM et le transfert de la technologie un industriel. 116
II. Conclusion
Lingnierie vasculaire tente de construire des substituts cllulariss. Plusieurs techniques sont actuellement ltude mais lapproche que nous souhaitons dvelopper au sein du laboratoire est la technique du "cell-sheet". Cette approche sappuie sur la cration de feuillets cellulaires qui seront enrouls en vue de reproduire au moins deux des trois tuniques des vaisseaux : media, intima. La premire tape de cette construction tait de mettre au point le biomatriau capable de produire un feuillet dtachable sur lequel les cellules pourront se dvelopper. Cest ce travail qui a t ralis. Etant une tude pilote, de nombreuses mises au point ont du tre effectues.
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CONCLUSION
Lacide alginique et ses drivs ont t dcouverts dans les annes 1860 par le Britannique Stanford. Depuis cette poque, lintrt pour cette molcule naturelle, puisquissue principalement des algues brunes, na cess daugmenter pour aboutir une industrialisation et une commercialisation mondiale.
Cette substance tout dabord t tudie afin den dcouvrir ses proprits physicochimiques. La principale, qui peut tre mise en avant, est sa capacit de glification. Ainsi dcrits, les alginates vont pouvoir trouver une application dans de nombreux domaines allant de lindustrie textile alimentaire en passant par limprimerie, la mdecine, la cosmtologie,
Lindustrie pharmaceutique sest intresse trs tt ces molcules afin de dvelopper de nouveaux mdicaments. Un mdicament possde toujours un ou plusieurs principes actifs ; les alginates et leur proprit de glification vont donc tre utilis cet effet. Ainsi, certains pansements ont pour composant majeur lalginate. Par pansements, il est sous-entendu : Les pansements cutans, Les pansements gastriques, Les pansements hmostatiques.
Lindication des alginates est donc le traitement des plaies, du reflux gastro-sophagien, des saignements,
Lautre aspect du mdicament est la pharmacie galnique. Les alginates trouvent ici encore des applications. De par leurs multiples proprits, ils vont tre utilises comme excipients des mdicaments dans les fonctions suivantes : stabilisant, agent de suspension, agent de viscosit, liant pour comprims, agent de dsintgration pour comprims, mulsifiant. Lalginate, en se glifiant, peut former des billes . Ces dernires peuvent contenir un principe actif qui va tre libr selon une cintique connue et dans des conditions connues : cest la microencapsulation, autre application de lalginate.
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Enfin lingnierie tissulaire sintresse de plus en plus aux alginates pour une utilisation en tant que biomatriau. Ses proprits physico-chimiques, son origine naturelle, sa biodgradabilit,, en font une substance idale pour la construction dun matriau biologique. Dans le cadre de lingnierie vasculaire, un biomatriau fonctionnalis base dalginate va donc tre dvelopp et sera le support de cultures cellulaires en vue de lobtention de cell-sheet qui seront ensuite assembls pour crer un substitut vasculaire, traitement de dernier recours de lathrosclrose.
Les alginates ont dj beaucoup t tudis et leurs utilisations sont nombreuses et varies. Cependant, au vu des qualits que peut prsenter cette substance, les industries sattachent encore dvelopper de nouvelles applications.
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ANNEXES
ANNEXE 1
Extrait de la confrence de 1892
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ANNEXE 2 Culture cellulaire

Les cellules
Au cours de ces travaux, les cellules utilises sont des cellules musculaires lisses issues de laorte de lapin. Il sagit de la ligne U8A4. Ces cellules ont t fournies par le Dr Huguette LOUIS de lunit Inserm U961 dirige par le Dr. P. LACOLLEY. Lavantage dutiliser ce type de cellule est lhomognit de leur population, mais surtout la stabilit de ces cellules. De plus elles possdent une capacit illimite de division.
Le matriel
La culture de ces cellules seffectue dans des botes de 75 cm (Nunc, Deutcher France) en prsence de 10ml de milieu de culture et 37 C. Le milieu de culture est constitu de DMEM-F12 (Dulbeccos Modified Eagle Medium F-12 ; Invitrogen, France) supplment avec : 5% de SVF (Sigma, France) pour lapport de facteur de croissance ; 4 mg/ml dHEPES (Sigma, France) afin de tamponner le milieu ; 100 UI/mL de pnicilline (Invitrogen, France) ; 100 g/mL de streptomycine (Invitrogen, France) ; 2,5 g/mL de Fungizone (Invitrogen, France) . Deux types de tampons isotoniques sont utiliss pour la culture et notamment lors des diffrents lavages : LHBSS (Hanks balanced salt solution) est compos de KCl 0,4g/L, NaCl 8g/L, KH2PO4 0,047 g/L, D-glucose 1 g/L, rouge de phnol 0,011 g/L. Ce tampon est achet sous forme de poudre chez Sigma (France) et il est tamponn pH 7,2-7,4. Le PBS (Phosphate Buffer Saline) qui est compos de NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,4 mM. Ce tampon est galement pH 7,2-7,4. Ces deux tampons sont prpars dans de leau distill puis filtrs sur une membrane de porosit 0,22 m (Millipore, France) et conservs 4 C.
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Une solution de trypsine-EDTA est utilise pour dtacher les cellules de leur support au cours des diffrents passages. Le mlange trypsine-EDTA 0,25% (Sigma, France) contient 2,5g de trypsine porcine et 0,2 g dEDTA ttrasodique dans 100 mL de tampon HBSS.
La culture
Les cellules daorte sont laves avec du tampon HBSS deux reprises et tous les deux jours. Aprs ces lavages, elles sont remises en culture ltuve. Aprs quelques jours de culture, les cellules arrivent confluence. Il faut alors les dtacher du support pour raliser ainsi un passage en subculture. Ces cellules sont laves deux fois avec du HBSS. Ces lavages sont ncessaires llimination du milieu qui contient du srum et qui inhibe laction de la trypsine, mais galement pour permettre la libration des ions Ca2+ qui vont faciliter le dtachement des cellules. Une fois ces lavages raliss, les cellules sont incubes 3 min avec 5 mL de trypsineEDTA 37C. La trypsine va cliver les liaisons cellules-cellules et cellules-support, ce qui va tre vrifi par microscopie optique contraste de phase.
Ltape suivante consiste inhiber lactivit enzymatique de la trypsine en ajoutant du milieu (contenant du srum). Les cellules sont alors en suspension dans cette solution qui va tre centrifuge 250 g pendant 10 minutes. Le surnageant va tre limin et le culot contenant les cellules tre remis en suspension dans 5 mL de milieu de culture. Cette suspension cellulaire va permettre densemencer diffrents support de culture certaines concentrations aprs comptage cellulaire. Le comptage cellulaire seffectue avec du bleu trypan (Sigma, France) et une chambre de Thoma. La suspension cellulaire est dilue au quart avec du bleu trypan. La dilution est place dans la chambre de Thoma pour compter les cellules vivantes, c'est--dire non colores. Deux comptages sont effectus et la moyenne est ralise. Le nombre de cellules par mL de milieu est dfini par la formule suivante : N = m * 4* 104 avec m = moyenne du nombre de cellules dans chaque chambre 4 = facteur de dilution 104 = coefficient de la chambre de Thoma
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Conglation et dconglation des cellules
A chaque ensemencement il reste des cellules non utilises. Elles sont alors congeles. Les cellules sont laves puis trypsines. Le tout est centrifug 250 g pendant 10 minutes. Le surnageant est limin puis le culot est resuspendu dans du SVF. Les cellules sont congeles une densit de un million par cryotube, soit par mL en prsence de 10% de DMSO (dimthylsulfoxyde, Sigma, France) afin de les prserver de la cristallisation. Le DMSO tant toxique temprature ambiante, il est ncessaire de congeler rapidement. Le cryotube est plac dans une solution disopropanol, puis plac -80C. Lisopropanol permet la descente progressive en temprature. Aprs 24h -80C ; les cellules doivent tre places dans lazote liquide.
La dconglation des cellules, doit tre la plus rapide possible et les cellules sont dilues dans 30 ml dHBSS afin dinhiber au maximum leffet nfaste du DMSO. Les cellules sont ensuite centrifuges 250 g pendant 10 min, le surnageant est limin et le culot est resuspendu dans 5 mL de milieu. Les cellules peuvent enfin tre ensemences.
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ANNEXE 3 Viabilit cellulaire

Principe
La viabilit cellulaire est mesure par la dtermination du mtabolisme cellulaire au moyen du test de lAlamar Blue (Serotec, France) qui est un test de prolifration cellulaire. Il contient un indicateur color bleu qui se rduit en rose en fonction de lintensit de lactivit mitochondriale des cellules. Au cours de la respiration, les cellules produisent des composs rducteurs tels que FADH2, NADH, NADPH qui ont une activit cytochromique et qui rduisent lAlamar Blue prsent dans le milieu. En mesurant labsorbance 570 et 600 nm, il est possible den dduire le pourcentage de rduction refltant semi-quantitativement la viabilit cellulaire.
( Eox600 * A570 ) ( Eox570 * A600 )
% de rduction =
( Ered570 * Actrl600 ) ( Ered600 * Actrl570)
Cette formule fait intervenir les coefficient dextinction molaires de lAlamar Blue de la forme oxyde 570 nm (Eox570), 600 nm (Eox600), et de la forme rduite 570 nm (Ered570) et 600 nm (Ered600). Ce pourcentage prend galement en compte les absorbances 570 et 600 nm de lchantillon (respectivement A570 et A600) et du contrle ngatif (Actrl570 et Actrl 600).
Les coefficients dextinction molaires pour lAlamar Blue 10% sont les suivants : Eox570 = 80.586, Protocole Eox600 = 117.216, Ered570 = 155.677, Ered600 = 14.652
LAlamar Blue est dilu 10% dans du DMEM sans rouge de phnol : lintrt dutiliser ce milieu est de conserver les conditions de culture les plus proches des conditions standard. Les cellules sont laves trois fois avec le DMEM sans rouge de phnol afin dliminer totalement le rouge de phnol contenu dans le milieu de culture. Ensuite la solution prpare 124
est mise incuber dans les puits de culture ( le volume dpos est identique dans chaque puits de mme contenance). Les cellules sont mises incuber pendant 4 heures 37C.
Pour chaque test, il est ncessaire de raliser un contrle ngatif qui consiste incuber le mme volume dAlamar Blue 10% dans un puits sans cellules. Le milieu de chaque puits est alors transfre dans une plaque 96 puits. Le contenu de chaque puits est rparti en quatre volumes de 100L.
125
ANNEXE 4 Protocole dimmunomarquage

Le phnotype du muscle lisse est dtermin par lexpression de marqueurs fortement exprims par les cellules diffrencies tel que : -SMA (Smooth Muscle Actine) (Dako, France) ; SM-MHC (Smooth Muscle-Myosin Heavy Chain) (Dako, France) ; Calponine (Dako, France) .
On ralise un immuno-marquage indirect, c'est--dire que la molcule dintrt est reconnue spcifiquement par un anticorps primaire. Un deuxime anticorps est utilis afin de mettre en vidence la formation du complexe rcepteur-anticorps primaire. Lanticorps secondaire est alors coupl un fluorochrome.
Les cellules sont dabord fixes avec du PAF 1% dilu dans du PBS (paraformaldhyde, Sigma, France) pendant 10 minutes 37C. Elles cellules sont ensuite permabilises laide du Triton-X 0,5% (Sigma, France) dilu dans du PBS pendant 15 minutes. La permabilisation permet aux anticorps de se fixer sur la molcule dintrt qui est intracellulaire. Une fois permabilises les cellules sont incubes pendant 45 minutes dans la solution danticorps primaire. Cette dernire est une solution de lanticorps commerciale dilue au 1/50me dans du Triton-X 0,1%. Ensuite deux lavages au PBS sont raliss. Lanticorps secondaire pourra alors tre incub pendant 30 minutes labri de la lumire. A la diffrence de lanticorps primaire, le secondaire est dilu au 1/100me. Deux lavages successifs sont nouveau raliss, puis les lames sont conserves dans du PAF 1% 4C labri de la lumire.
Lorganisation des cellules et leur adhsion sont vrifies par le marquage du cytosquelette laide de la phallodine (Invitrogen, France). Celui-ci est marqu par un immunomarquage direct. La molcule dintrt est alors reconnue spcifiquement par un anticorps coupl directement au fluorochrome. Le protocole est ensuite quasiment identique au prcdent, seules deux tapes sont supprimes : lincubation de lanticorps primaire et les rinages qui suivent cette tape.
126
BIBLIOGRAPHIE
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135
N didentification : 3330 TITRE
LES ALGINATES ET LEURS APPLICATIONS EN PHARMACIE ET EN INGENIERIE

APPLICATION A LA CONSTRUCTION DUN BIOMATERIAU
Thse soutenue le 02 juillet 2010 Par Emilie VINCENT RESUME :
Les alginates, polymres saccharidiques extraits principalement des algues brunes de la classe de Phophyces, sont des substances trs peu connues du grand public mais qui trouvent des applications dans de nombreux domaines et de nombreuses industries. Leurs usages reposent sur leurs proprits de glification qui se traduisent par une chlation des cations divalents par les monosaccharides, et principalement par les acides guluroniques, le cation divalent le plus utilis tant le calcium. Dans notre travail, deux grands domaines dapplications ont t dtaills : la pharmacie et lingnierie tissulaire. Dans le domaine de la pharmacie, les alginates sont employs pour trois proprits diffrentes. Ils constituent dabord le principe actif de pansements cutans comme lAlgostril, de pansements hmostatiques comme le Coalgan, et de pansements gastriques comme le Gaviscon. Ils sont par ailleurs prsents dans de nombreux mdicaments en tant quexcipients, o ils agissent comme agent de viscosit, agent stabilisant, Enfin, des technologies comme la microencapsulation emploient lalginate en vue de modifier la cintique de libration du ou des principes actifs encapsuls. Lalginate tant biocompatible, atoxique et non immunogne, il constitue un bon composant en vue de la ralisation dun biomatriau. Cest dans ce cadre qua t effectue la partie exprimentale du prsent travail qui sinscrit dans la thmatique de lathrosclrose et de son traitement par substitution vasculaire. Dans ce contexte, mon but a t de mettre au point une matrice base dalginate destine la construction dun feuillet cellulaire, premire tape de la construction in vitro dun substitut vasculaire biosynthtique.
MOTS CLES : ALGINATES, APPLICATIONS PHARMACEUTIQUES DES ALGINATES, INGENIERIE VASCULAIRE, SUBSTITUT VASCULAIRE, BIOMATERIAU. Directeur de thse Intitul du laboratoire Groupe dingnierie cellulaire et tissulaire UMR CNRS 7561 Facult de mdecine Physiologie Facult de pharmacie Thmes 1 Sciences fondamentales 3 Mdicament 5 - Biologie Nature Exprimentale Bibliographique Thme
Professeur Pierre LABRUDE
2 Hygine/Environnement 4 Alimentation Nutrition 6 Pratique professionnelle

Scdpha T 2010 Vincent Emilie

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UNIVERSITE HENRI POINCARE - NANCY 1

FACULTE DE PHARMACIE LES ALGINATES ET LEURS APPLICATIONS EN PHARMACIE ET EN INGENIERIE

le Diplme d'Etat de Docteur en Pharmacie

Responsable du Collge dEnseignement : Pharmaceutique Hospitalier

Bibliothque Universitaire Sant - Lionnois (Pharmacie - Odontologie)

SERMENT DES APOTHICAIRES

les hommes maccordent leur estime si je suis fidle mes promesses.

Que je sois couvert dopprobre et mpris de mes confrres si jy

A ma sur Coralie qui a toujours t prsente,

A mes beaux-parents qui sont devenus au fil du temps ma deuxime famille,

A mes beaux-frres Alex, Christophe et Gilles,

Sans oublier bien sr Valentine !!

Et tout le reste de la famille quil ne mest pas possible de citer.

VI. Les diffrents emplois de lalginate ................................................................................... 28

PARTIE II : L'ALGINATE UN PRINCIPE ACTIF

PARTIE III : LES ALGINATES EN PHARMACIE GALENIQUE

II.1.c. II.1.d. II.1.e. II.1.f. II.1.g.

Glification de gouttes : procd mcanique. .................................................... 84

II.2. Applications : exemple de molcules encapsules avec lalginate ............................... 84

PARTIE IV : L'ALGINATE DANS L'INGENIERIE TISSULAIRE

TABLE DES FIGURES

PARTIE I : LES ALGINATES

PARTIE II : L'ALGINATE UN PRINCIPE ACTIF

PARTIE III : LES ALGINATES EN PHARMACIE GALENIQUE

PARTIE IV : L'ALGINATE DANS L'INGENIERIE TISSULAIRE

TABLE DES TABLEAUX

PARTIE I : LES ALGINATES

PARTIE II : L'ALGINATE UN PRINCIPE ACTIF

PARTIE III : LES ALGINATES EN PHARMACIE GALENIQUE

PARTIE I : LES ALGINATES

Phase disperse Milieu / Phase Gaz Liquide Solide

Aucun Gaz (Tous les gaz sont miscibles)

Arosol liquide Exemples : brouillard, brume, nuage

Arosol solide Exemples : fume, particules ariennes

Mousse Milieu continu Liquide Exemples : crme fouette, mousse au chocolat

mulsion Exemples : lait, mayonnaise, savon liquide

Sol Exemples : peinture, encre

Mousse solide Solide Exemples : arogel, polystyrne expans,

Gel Exemples : glatine, gele, fromage, alginate

Sol solide Exemple : verre

III. Les diffrentes sources dalginates

III.1.b. Voie de synthse de lalginate chez les bactries

La biosynthse de lalginate chez Pseudomonas aeruginosa se ralise en deux tapes successives :

La premire tape utilise la voie de Enter-Doudoroff, voie secondaire du

III.2. Les algues III.2.a. Intrt

III.2.b. Voie de synthse de lalginate chez les algues (figure 4)

Figure 5 : mcanisme d'action de la C5-pimrase (Jouanneau, 2010).

Laminaires, Laminaria spp., Laminariaceae

importantes matires premires pour la prparation de lalginate.

Figure 8 : Fucus vesiculosus et Fucus serratus

Figure 9 : Macrocystis pyrifera www.picsdigger.com

IV. Proprits physico-chimiques

IV.2. Caractres organoleptiques issus de la Pharmacope Europenne, 6me dition

Figure 10 : monomres de mannuronate M et de guluronate G (Jouanneau, 2010)

distance moyenne entre une extrmit de la chane et le centre de masse de la structure

sparation d'un liquide de son gel.

IV.6. Les gels dalginate et leurs proprits (Mjahed, 2009).

V. Extraction de lalginate (http://www.fao.org/)

V.1.a. 1re technique : passage par lacide alginique (figure 17)

V.1.b. 2me technique : passage par lalginate de calcium (figure 18)

V.2. autres alginates