584 Pdfsam El Mundo Celula

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Figura18.1 El flujo de informacin las en clulas, El diagrama caracterizalas clulas citoolasma eucariotas,aunque la replicacin del DNA, Ia ( (,*,,-,4)-divisin celular,la transcripcin y la traduccin \\ DNA /I son procesosque tambin sucedenen las clulas \\---,// procariotas. (a) La informacin gentica Ncleos Replicacin del codificada en las molculasde DNA se DNA (sntesis Citoplasma transmite a las sucesivas generaciones celulares de DNA) por la replicacin del DNA y por la divisin celular (en las clulaseucariotaspor medio de Ia mitosis).EI DNA primero seduplicay despus sedivide equitativamente entre las dos clulas hijas. De estaforma se aseguraque cada clula Divisin hija tenga la misma informacin genticaque la clula de la que procede.(b) En cadaclula,la informacin genticacodificada en el DNA se (sntesis Traduccin * expresamediante el procesode la transcripcin (e Protenas) (sntesisde RNA) y Ia traduccin (sntesisde protena). La transcripcin implica el uso de ,,,o,"-,** segmentosespecficos DNA como moldes del para la sntesis RNA mensajero otras de y molculasde RNA. La traduccin esel proceso se en gentica (a) Flujode informacin entre (b) Flulode informacin gentica el interior por el cual los aminocidos ensambln en dictadapor Ia secuencia generaciones de celulares de una clula:expresin la informacin una secuencia de qentca nucletidosdel RNA mensajero.
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-- Ncleos
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Abrimosestecaptulodescribiendo descubrimiento tir de una fuentemsagradable, esperma salmn. el el de El del DNA, la molculacuyopapelinformativo,subyace el en esperma pescado puedeparecer de una fuentede material centrode este grupo de seis captulos. poco usual,hastaque caigamos la cuentade que el nen cleosuponems del 90o/o la masade una clulaesperde mticatipicay de que,adems, DNA supone mayora el la Naturaleza qumica del material dela masa lasclulas de espermticas. esta Por razn, Miesgentico cherinicialmente crey,que el DNA estaba implicadoen la transmisin la informacinhereditaria. embargo, de Sin CuandoMendelpostulpor primeravezlaexistencia los pronto rechaz idea,debidoa que sustcnicas esta de primigenes, conoca identidadde la molcula no la tivas de medida sugirieronde forma incorrectaque los que lespermita almacenar transmitir la informacinheredada. y vuloscontenan muchomsDNA quelos espermatozoiPero unos aos ms tarde,estamolculafue descubierta, des.Dedujoque el espermatozoideel vulo debancony sin querer, fohannFriedrichMiescher, mdicosuizo. por tribuir aproximadamente cantidades un con En iguales Ia ina 1869,cuandoMiescherestudiaba formacinhereditaria setransmitea la descendencia, que clulas divisin.inen form sobreel descubrimiento una sustancia ahora y por esto,le parecique el DNA no podratransmitir la de que conocemos como DNA, justo unos aosantesde que el informacinhereditaria. AunqueMiescherseequivoccon bilogo celularWalter Flemmingobservase primera respecto papeldel DNA, a principiosde 1880un botal por vezlos cromosomas microscopio. al nico llamado Eduard Zacharias inform de cue la extraccin del DNA de lasclulas causaba desapiricinde la la tincin de los cromosomas. Puesto lasevidencias que emEl descubdmiento DNApor Miescher del condujo a pezaban sugerirel papelde los cromosomas la transa en propuestas contradictorias qumica sobrela naturaleza misin deIa informacin hereditaria,Zacharias otros iny de los genes vestigadores infirieron queel DNA erael materialgentico. Miescher estaba interesado estudiar qumicadel nen la Estavisin prevaleci hastaprincipios de 1900,cuando cleo,ya que la mayoriade los cientficossuponaque era unos experimentos tincin interpretados de incorrectadondesesituaba materialgentico el celular. susexpe- mentecondujeron la conclusin En a falsade quela cantidad rimentosiniciales, Miescheraislncleos glbulosblande de DNA cambiabadramticamente el interior celular. en cosde la sangre obtenidos partir de pus procedente a Puestoque se esperaba las clulas de que mantuvieranuna quirrgicas. vendas Unavez extrados ncleos los con lcantidad constante la sustancia guarda instrucde que sus cali,descubri una sustancia inusual,a la que denomin ciones hereditarias, estas observaciones errneas conduje<nuclena> de la que ahorasabemos es,en gran mey que ron a rechazar idea de que el DNA transmita Ia inforla dida,DNA. Miescher continuestudiando DNA a parel macin gentica.
558 Captulo Base 18 estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo DNA, v el
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El resultado es que entre 19i0 y I940,1a mayora de los cientficos pensaban que los genesestabanformados por protenas, ms que por DNA. Los bloques qumicos que construyentanto las protenascomo los cidosnucleicosse identificaron a principios de la dcadade 1900,percibindose a las protenas como estructurasms complejasy por tanto ms probables para almacenarla informacin gentica. Se defendaque las protenas estabanconstruidaspor 20 aminocidos diferentes que se podan ensamblar en un enorme nmero de combinaciones, generando, de ese y modo, la diversidad de la secuencia la complejidad esperada en una molcula que almacenay transmite la informacin gentica.Por el contrario, el DNA se perciba de forma general como un polmero que consistaen Ia misma secuenciade cuatro bases(es decir, el tetranucletido -ATCG-) repetido una y otra vez, faltndole adems,la variabilidad esperadaen una molcula gentica.De este que sirviera meramente como simple polmero seesperaba que estaban, camen un soporte estructural para los genes, bio, formados por protenas. Esta visin prevaleci hasta que dos lneas de evidencia resolvieron el asunto a favor del DNA como material gentico,como describiremosa continuacin.
que es Avery demostr el DNA emateralSentico delasbacterias que esa los esperaba bilogos estaban Unagransorpresa
tudiando las molculasproteicaspara determinar cmo la
informacin genticase almacenay setransmite. Los antelos cedentes proporcion en 1928 el mdico britnico Frederick Griffith, que estabaestudiando una cepapatgena de una bacteria, llamada (neumococo) que causa una neumona fatal en animales. Griffith descubri que esta bactepneumoniae)existeen dos formas ria (llamada Streptococus cepaR.Cuando creceen un medio de denominadascepaSy agar slido, Ia cepaS produce coloniaslisasy brillantes decadaclula, bido al moco, cubierta polisacridaque secreta para fabricar mientras que la cepaR carecede la capacidad la cubierta mucosay por tanto produce coloniasque muestran un lmite rugoso. Cuando seinyectaen ratones,la cepaS bacteriana(pero una neumona fatal.La capacino la cepa R) desencadena dad para causarla enfermedad est directamente relacionada con la presenciadel polisacrido en la cubierta de la cepa S, que protege a la bacteria del ataque del sistemainmune del ratn. Uno de los descubrimientosms intrigantes de Griffith fue el que la neumona tambin se poda inducit inyectando a los animales una mezcla de bacterias vivas de Ia cepaR con bacteriasmuertas de la cepaS (Figura 18.2).Este descubrimiento fue sorprendenteporque ni los organismosvivos de la cepaR ni los organismos muertos de la cepaS causabanneumona si se inyectabansolos. Cuando Griffith rcaliz la autopsia de los animales a los que haba inyectado la mezcla de cepa R viva con cepa S muerta estabanrepletos de bacteriasvivas de la cepaS. Puestoque a los animales no se les haba inyectado ninguna bacteria viva de la cepaS, concluy que las bacteriasde la cepaR no
El ratnmuere vivasS (lisas) (a) Bacterias
sano El ratnse mantiene vivas R (b) Bacterias (rugosas)
sano El ratnse mantiene por S (c) Bacterias muertas calentamiento
El ratnmuere (d) BacteriasR vivas mezcladas con

hrioriac Q nnr
genticadel neumococo. Lascolonias de Figura18.2 El experimento Griffithsobrela transformacin Las colonias en pneumoniae) son patgenas ratones. S (lisas)de Ia bacterianeumococo(Streptococus R (rugosas)no. (a) La inyeccin de bacteriasS vivas en un ratn produce el desarrollo de neumona y la muerte. (b) La inyeccin de bacteriasR vivas mantiene al ratn sano.(c) Las bacteriasS muertas por calentamiento no tienen ningn efecto cuando seinyectan solas.(d) Cuando se inyecta una mezcla de bacteriasde la cepaR vivas y bacteriasde 1acepaS muertas por calentamiento,el resultado es neumona y muerte. (e) El descubrimiento de que la cepaS de bacteriaspatgenasvivas se recobrabaa partir de la sangredel ratn del apartado d,le sugiri a Griffith que algn factor qumico procedentede las clulasS muertas por calentamiento,era capazde causarun cambio El heredable(transformacin) de las bacteriasR no patgenasen bacteriasS patgenas. factor qumico se identific posteriormente como el DNA.
calentamrento
(e) BacteriasS vas en la sangrede un ratnmuerto
gentico 559 qumica material del Naturaleza
produccindevirus. Cul la naturaleza qumicadel maes terial inyectado? 1952,Nfred Hersheyy Martha Chase En disearon experimentopara dirimir estacuestin. un Slo existen posibilidades queel virus T2 est dos ya formadosolamentepor dosclases molculas: de DNA y protenas. Para distinguir entre estas dos alternativas, Hersheyy Chasese aprovecharon hechode que las protenasdel virus T2, del como la mayorade lasprotenas, contienenazufre(en los aminocidos metioninay cistena) pero no fsforo, mientrasqueel DNA viral contiene fsforo(en su esqueleto azicar fosfato) pero no aztfre. Hersheyy Chaseprepararon adems lotesde partculas fagoT2 (a los quesededos del nominan fagosintactos)con distintostipos de marcajeradioactivo.En uno de los lotessemarcaronlasprotenas del fagocon "^S^; el otro lote el DNA del fagosemarcaba .tt con el istopo"P. Usando esta de forma los istopos radiactivos, Hershey y Chase localizaronel destinotanto de las protenascomo del DNA, duranteel proceso infeccin(Figura18.3a). de Empezaronel experimentomezclandoel fago radiactivo con clulas bacterianas intactas, permitiendoas que las partculasdel fagoseadhiriesen la superficiede las clua lasbacterianas inyectasen materialgentico las clue su a punto Hersey Chase las.En este y descubrieron lascuque (o proteicas vacas <fantasmas> fagos) podan biertas de se retirar deforma efectiva la superficie lasbacterias, de de agitandola suspensin unabatidoraconvencional recucon y perandolasclulas bacterianas centrifugacin. por Midieron, entonces, radiactividaden el lquido sobrenadante la y en el precipitado bacterias fondo del tubo. de del (650lo) Los datosrevelaronque la mayoria de132P quedabaen lasclulas bacterianas, mientrasquela mayoradel (Figura18.3b). se al "S 1800/o liberaba mediocircundante que Puesto el 32P marcaba DNA viral y el 3sS el marcaba las protenasvirales,Herseyy Chaseconcluyeronque era el DNA del fagoT2, y no las protenas, que habasido inlo yectado las clulas a y bacterianas,por tanto,debera funcionarcomo materialgentico. Estas conclusiones fueron por respaldadas la siguiente observacin: cuando bactelas y que HersheyChase demostraron el DNA el materal es rias radiactivas infectadas resuspendan un medio lse en gentco losvirus de quido fresco seincubaban y durantemstiempo,el 32P se transferaa algunade las partculasde los fagosde la desLosbacterifagos,fagos paraabreviar, virusqueino son pero fectan bacterias. sidoobjeto estudio a Han de cientfico descendencia, el "S, no. Comoresultado los experimentos hemos de que y primeros de 1930 muchos nuestros descride conocimientos de to, a principiosde Ia dcada 1950,la de mayora losbigentica molecularproceden experimentos implican que de de logosaceptaban ideade quelos genes la estaban formados a estos virus.El Anexo 18Adescribe anatoma el ciclo la y por DNA, perono por protena. Desafortunadamente,vide replicacinde algunosfagosy destaca ventajas para el sus sionarioOswaldAver mximo responsable dar un giro estudios genticos. de sobrela funcin de DNA, nunca reciUno de los fagos,que infectana la bacteriaEscherichia a la visin existente bi subien merecido reconocimiento. Comitdel Premio El coll,estudiados a fondo esel bacterifagoTl2. ms Durante la infeccin,estevirus seune a la superficiede la clula Nobeldebatisobreel trabajodeAver perodecidiqueno y modesta sin y bacteriana, le inyectasu material.Pocodespus, clula habahechosuficiente. la Quizsla nataraleza pretensiones Averyfue la causante estafalta de recode bacterianaempieza producir miles de nuevascopiasdel de a nocimiento. Despus la muertedeAveryen 1955, biode virus.Esteescenario que el materialinyectadoen la sugiere el qumico Erwin Chargaff escribi en su tributo: <Era un porta la informacin gentica guala clulabacteriana que
patgenas,se haban convertido de alguna forma en bacterias de la cepaS, patgenas, debido probablemente,a alguna sustancia presente en las bacterias de la cepa S (muertas por calentamiento) con las que se haban inyectado las de la cepa R. l denomin a este fenmeno transformacin gentica y se refiri a la sustancia activa (aunque todava desconocida)de las bacteriasde la cepa S como <el principio transformante>. Los descubrimientos de Griffith dispusieron el escenario de 14 aos de trabajo de Oswald Avery y de sus colegas en el Instituto Rockefeller de Nueva York. Estos investigadores continuaron con los trabajos sobre la transformacin bacteriana hasta su conclusin ms lgica, preguntndose qu componente de la cepa S muerta por calentamiento era el responsable de la actividad transformante. Fraccionaron extractos de la cepa Sbacteriana exentos de clulasy descubrieronque slo la fraccin de los cidos nucleicos era capaz de causar la transformacin. Adems, la actividad se eliminaba de manera especficapor tratamiento con desoxirribonucleasa, una enzima que degrada el DNA. sta y otras evidencias les convencieron de que Ia sustancia transformante del neumococo era el DNA, una conclusin publicada por Aver Colin Macleod y Maclvn McCartv en 1944. ita es la primera afirmacin rigurosamente documentada,d, respectode que el DNA pudiera portar informacin gentica.Pero, a pesar del rigor de los experimentos, la asignacin del papel gentico al DNA no obtuvo una aceptacin inmediata. El escepticismo sedeba en parte a la conviccin persistente y extendida ampliamente de que al DNA le faltaba Ia complejidad necesariacomo para desempeartal papel.Adems,muchos cientficosse cuestionabansi la informacin genticaen las bacteriasestararelacionadacon la herencia en otros organismos. Sin embargo, la mayora de las dudas que quedaban se acallaron ocho aos despus cuando sedemostr que el DNA era tambin el material gentico de un virus, el bacterifasoT2.
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y el Capitulo Base 18 estructuralla informacin de celular: cromosomas ncleo DNA,
Protena marcaoa con'"5
F, -tr ft?:Jl3'H:"('"ntasmas)
Bacteria
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de la radiactividad est en el lquido
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raolacltvtoao en la descendencia de los fagos
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con Mezclade bacterias
radiactivamente; los fagos infectan las a bacterianas clulas Protena marcaoa con "'H
para Agitacin un agitador en de separarlos fagos del exterior de la clulabacteriana su contendo
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medidade la Centrifugacin: radiactividad el precipitado en v en el louido
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La mayora la de est radioactividad en el precipitado (pellet) (a) El experimento Hershey-Chase de
ry4)
Partculas fago del radiactivas
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@
80% elimina B0% el La homogenizacin con 35S de las clulasmarcadas 357" del La mayora 32P(65%) en se mantiene las clulas intactas 012345678 (min) de en Tiempo agitacin el homogenizador
O n o+u
,20
(d
(b) Datosexperimentales apartadoa, paso3 del 35S (para Figura18.3 Expeilmento Hershey{hase:el DNAcomo matedalgenticodel fago T2. (a) O Seutilizan fagosT2 marcadosbien con de 32P (para marcar DNA) para infectar bacterias. Los fagosseadsorbena la superficiecelulare inyectansu DNA. @ La marcar protenas)bien con se mientras que la mayoria de32P mantiene.@ La de en agitacinde las clulasinfectadas un agitador elimina la mayora de 3sS las clulas, que quedanen el lquido centrifugacinhaceque las clulasformen un precipitado;cualquier partcula libre del fago,incluyendo los fantasmas y sobrenadante. Cuando las clulasde todos los precipitadosseincuban, el DNA del fago dirige en ellasla sntesis finalmente la liberacin de @ en nuevaspartculasdel fago.Algunos de estosfagoscontienen32P su DNA (ya que el antiguo DNA marcado del fago,seha empaquetadoen en algunade las nuevaspartculas),pero ninguna contiene35S las protenasde su cubierta. (b) El grfico muestra el grado en que se retiran tanto como como el 32P las clulasintactasen el paso 3, en funcin del tiempo de agitacin.Unos pocosminutos de agitacinson suficientes de el35S de del3zP las clulas. del mientras que en esemismo tiempo semantiene la mayora (650/o) para retirar la mayora (80o/o) 3sS,
gentlco 5 6 1 qumica material del Naturaleza
A ne x o F.COS:SISTEMA MoDELo PARA ESTUDIAR GENES

Desdesu inicio a mediadosdel sigloxx, la gentica empleuna ampliavariedadde organismos como materialde experimentacin. Inicialmente,centr su atencinsobre y animales plantas,como los guisantes Mendely lasmoscas de de la fruta popularizadas investigadores por posteriores. Sin embargo, alrededorde 1940, comenzaron probarse y a bacterias virus, proporcionandoa los bilogossistemas experimentales que revolucionaron literalmentela cienciade Ia gentica llevndolaal nivel molecular. Los bacterifagos sido especialmente han importantes.Los bacterifagos fagospara acortar,son virus que infectana o bacterianas. fcil obtenergrandes clulas Es cantidades de partculasde fagosen un corto periodo de tiempo,1oque facilita enormemente muestreode mutantes-fagos con el variaciones heredables- que de estaforma hacenposibleque los genetistas identifiquengenes particular.Algunosde los en fagosestudiados mayor profundidadson el bacterifagoT2, en el T4 y el T6 (los denominados T-pares)que infectana la bacteriaE. col.Lostres fagosT-parestienen estructuras que son bastante similares, elaboradas. fagoT4 semuestraen El la Figura 18A.1.La cabeza fagoesuna cpsula deI proteicaque tiene forma de icosaedro hueco(un objeto de 20 caras)relleno de DNA. La cabeza une a :una se colaproteica, que consiste en w ncleo Ia colahueco de rodeadopor una yaina contrctllde la colay quetermina eura placabasalhexagonal la que se a lunet seis de la cola. fibras La Figura 18A.2representa principalesacontecimientos los en el ciclo de replicacindel fagoT4. Los esquemas son a no la escala; bacteriaesproporcionalmente msgrande,como indica la micrografiaelectrnica. procesoempieza El con la adsorcinde una partculade fagoa la paredde una clula bacteriana. Cuandoel fagocolisionacon la clula,seaplasta de modo que su placabasalseanclaa un receptorproteico especfico la pared(Figura l8L.2a, O ).fo siguiente que de es la vaina de la cola,secontraedirigiendo a la cola centralhuecaa travsde la paredbacteriana. porcin centralde la cola La forma una agujaa travsde la que el DNA del bacterifago se inyectaen la bacteria(@ ). Una vezque esteDNA ha alcazado Ia clulabacteriana, informacin gentica fagose la del transcribe setraduce( @ ). Estoda lugara unaspocas y protenas claveque alteranla maquinariametablicade la clulahusped beneficiodel fago,que consiste en normalmente en su rpidamultiplicacin.Puestoque el fagoconsiste simplemente una molculade DNA rodeadopor una en cubiertaproteica(su cpsida),la mayorade la actividad metablicade la clulainfectadaestcanalizada haciala replicacindel DNA del fagoy haciaIa sntesis lasprotelnas de de la cpsida. DNA del fagoy lasprotenasde la cpsida El se autoensamblan cientosde nuevas partculasdel fago (@ ). en En aproximadamente mediahora, la clulainfectadaselisa (se abrengrietas),Iiberandoal medio lasnuevas partculasdel fago. ( @ ). ehora cadanuevofagoinfectaotra clulabacteriana, haciendoposiblela obtencinde enormespoblaciones fago del -tantas como 10" partculasdel fagopor mililitro de cultivo de bacterias infectadas-. Paradeterminarel nmero de partculasde fagoen una muestra,un volumen medido semezclacon bacterias creciendo en medio lquido parapermitir la adsorcinde los fagosa la bacteria. Lamezclaseextiendeen un medio nutritivo slido (que contieneagar)en una placade Petri.En la incubacin,la bacteriasemultiplica paraproducir un <csped> clulas de sobrela superficiedel medio nutritivo. As,en cualquierlugar que una partculavrica hayainfectadouna clulabacteriana, una manchaclaraaparecer el csped en debido a que las clulas bacterianas muerto por Ia poblacindel fagoen han multiplicacin.Estas manchas clarassedenominanplacas. El nmero de placasque aparecen el csped en bacteriano representan nmero de partculasde fagoen la mezcla el original de bacterias-fagos, siempreque el nmero inicial de fagossealo suficientemente pequeocomo para asegurar que cadauno va a dar lugar a una placaseparada. Figura 18A.3 La muestralasplacas formadaspor el bacterifagoT4en el csped de clulas E. coli. de El cursode los acontecimientos mostradosen la Figura 18A.2a denomina crecimiento se lticoy escaracterstico un de fagovirulento.El crecimientoltico tiene como resultadoIa lisis y de la clulahusped la produccinde una progeniede muchas partculasde fago.En comparaci an fago temperado n, paedeo
F65 nm-
Cabeza
225 nm
Ncleode la cola Vainade la cola
Placabasal Fibrasde la cola
Figum 18A.1 Estructura fagoT4. La imagen del identifica los componentes estructurales principales este de fago,no todosson (MET). visibles la micrografta en
562
Capitulo Base 18 estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo DNA, Vel
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I Adsorcin.de la parucura rago oe e n l ac l u l a husped
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(b) Bacteria partculas fagounidas con de
Figura184.2 El ciclo litico de vida de un fago T-pat (a) El ciclo de replicacin de un fago T-par, empiezacuando una partcula del fago @ seadsorbeen la superficiede una clulabacterianae @ inyecta su DNA en Ia clula.(Q El DNA del fago sereplica en Ia clula huspedy codifica la produccin de las protenasdel fago.@ Estoscomponentes se.ensamblan nuevas particulasde fago. en (! Normalmente, clulahusped lisa, la se Iiberando las partculasde fago de la descendencia que pueden infectar a ms bacterias.Esteprocesode replicacin es tpico del crecimiento ltico de muchos fagos.(b) Micrograffa electrnicade una bacteriacon partculasde fago pegadas su a superficie (MET).
o gB'niiu,.
effi
Replicacin del DNAdelfago y sntesis las de protenas fago del
a,f?w-t@ v
eqB^ .-b e
roscomponenres I delfago *
EnsamblajeI oer
Figura 184.3 Placas fagoen un csped bacterias. Sehan de de formadoplacas fagosobre csped E. coliinfectadas el de un de con fagoT4.Cada placa procede la reproduccin unanica de de partcula fagodeIa mezcla de original.
Liberacin de nuevaspantcutas del fago con lisis cerurar
(a) Replicacin fago del
bien producir crecimientoltico, como haceun fagovirulento, o integrarsu DNA en el cromosomabacterianosin causar ningrin dao inmediato a la clulahusped. ejemplode fago Un temperadoespecialmente estudiado, el bacterifago bien es }, (lambda),quejunto con los fagosT-pares, infectaa las clulas de E. coli.En el estado integradoo estado lisognico, DNA de el un fagotemperadosedenominaprofago.Elprofagosereplica junto con el DNA bacteriano, menudo a travsde muchas a (Figura18A.4). generaciones clulas de husped Duranteeste tiempo,los genes fago,aunquepotencialmente del letales, para el husped, estninactivoso reprimidos. embargo, Sin bajo ciertascondiciones, DNA del profagoseescinde el del y cromosomabacteriano entra otravezen el ciclo ltico, produciendoprogeniede partculas fagoy lisandoIa clula de husped.
qumica material gentico 563 Naturaleza del
Anexo
lJna raznpor la que los fagosson tan atractivos paralos (que genetistas porque el pequeotamaode susgenomas es facil de puedeserde DNA o de RNA) hacerelativamente ,1, El identificary estudiarsusgenes. genomadel bacterifago es una molculade DNA sencillaque contienemenosde 60 genes, de comparadocon los variosmiles de genes una bacteriacomo en E. coli.Otros fagosson todavamspequeos; algunoscasos, Debido a sus contienenmenosde una docenade genes. genomas su sencillos, rpida multiplicaciny el enorme nmero de progenieque sepuedeproducir en un pequeo estnentrelos volumen de medio de cultivo,los bacterifagos <organismos> Adems, tambin tienen otros mejor conocidos. prcticos. de Puestoque los fagosson capaces beneficios estn algunas empresas biotecnologa de destruirbacterias, en investigando el desarrollode fagosmodificadosque podran en bacterianas humanos, sertiles paratratar infecciones se en casos los que lasbcterias han en especialmente aquellos a hechoresistentes los antibiticos.
rt.tugo unea la se. cetuta nuespeo el e inyecta DNA
Fago temperato
Cromosoma bacteriano (DNA)
Clulabacteriana El DNA del fago se integra dentrodel bacteriano, cromosoma en convirtindose profago
La bacteria se proouce connormalidad
lisognico un profago de dentro un de 18A.4 Estado Figura por bacteliano.El DNA inyectado un fagotemperado cromosoma El bacteriano, DNA integraren el DNA de un cromosoma sepuede junto conel profago, replica se denominado delfagointegrado, que cadavez la bacteria reproduce. se DNA bacteriano
hombre tranquilo; habrahonrado ms al mundo, si el mundo le hubierahonradomsa l>. qulos trabajos Hershey-Chase recibieron una de Por ms clidaque los trabajospreviosde Avery sobre acogida de aunquelos dos condula transformacin lasbacterias, jeron a lasmismas parece La conclusiones? principalrazn el habersidosimplemente pasodel tiempoy el cmulode despus la publide circunstanciales adicionales evidencias ms imporla evidencia cacinde Averyde 1944. Quizs tante fue que el DNA tiene una estructuralo suficienteEsta mente variablecomo para ser el materialgentico. proceda estudios de de sobre composicin bala evidencia despus. del ses DNA, comoveremos revelan A = T y queC = G Lasreglasde Chatgaff QUe A pesarde la reaccinde indiferenciacon la que inicialmente se recibi el trabajo de Aver steejerci una inEntre ellosestafluenciatrascendental otros cientficos. en que interesado la composicin en ba Erwin Chargaff, estaba del debases DNA. Entre 1944yl9\2,Chargaffutrlizabam564
todos cromatogrficospara separary cuantificar las cantidadesrelativas de las cuatro basesen el DNA -adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T)-. De estosanlisis surgieron varios descubrimientos importantes, Primero demostr que el DNA aislado a partir de diferentes tipos cedadas, tenan el mismo porcentaje de lulares de especies cada una de las cuatro bases(Tabla 18.1),y que esteporcentajeno vara con el individuo, el tejido, la edad y el estado nutricional o el medioambiente. Esto es exactamente de lo que podra esperarse la sustanciaqumica que almacenainformacin gentica,ya que de las clulasde una especie dada se esperaque tengan una informacin gentica similar. Sin embargo, Chargaff descubri que la composiEsto se obsercin de basesdel DNA, vara entre especies. Ia ltima columna de la Tabla 18.1, que va, examinando muestra las cantidadesrelativasde las basesA y T con respecto a las cantidades relativas de G y C en los DNAs de varios organismos.La comparacin de estosdatos le revel a Chargaff que las preparaciones de DNA de especiesrelatienen una composicin de bases cionadas estrechamente diferentes tienden similar, mientras que aqullasde especies
y el DNA, 18 estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo Captulo Base
Tabla 18.1 Gomposicinbases DNA varios de del de orgenes

Nmerode cada tipo de nucletido* Origen del DNA
Timo bovino Hgado bovino Rin bovino Cerebro bovino Hgado humano Langosta Erizo de mar
l1Ar A. +,i-^
Proporcin nucletidos** de
A
)9, L
A/T
28,4 28,4 28,2 28,1
?o?
c/C
0,95 r,07 1,08 1,03 0,98 1,00 1.,02 1,00 1,00 1,00 1,09
(A+r)/(G+c)
1,31 1,30 1,30 r,28 1,53 1,41 1,85 1,19 7,s0 1,00 1,79 2,73
2t,1 22,6
)) 1
22,r 2t,0 ,no 2t,6 19,9 20,7 17,3 22,8 2,7 25,0 17,l 12,8
1,00 0,99 1,00 1,00 1,00 1,00 1,02 1,01 I,00 1,00 0,9s
28,1 28,3 28,0 30,3

)q?
19,5 20,5 t7,7 22,7 2,7 25,1 t8,7 14,0
32,8
)77
32,1 27,1 47,3

)19 t) q
Cangrejo marino (moho) Aspergillus Saccharmycescerevisiae (levadura) o Clo r idiu m (bacteria) st

1A O
25,0
36,3
r,02
r,09
{ Los valores de estas cuatro columnas son el nmeo aproximado de cada tipo de nucletido encontrado por cada 100 nucletidos de DNA ** Las proporciones de AiT y de G/C no son todas exactamente 1,00 debido al error experimental.
a exhibir composiciones bases de bastantedistintas.Una vez ms, esto es lo que se esperarade una molcula que almacena informacin gentica, Sin embargo,la observacinms sorprendentede Chargaff fue su descubrimiento de que para todas las muestras de DNA examinadas, nmero de adeninasera igual al nel mero de timinas (A : T), y el nmero de guaninasigual al nmero de citosinas (G : C): esto significaba que el nmero de purinas era igual al nmero de pirimidinas (A + G : C + T). El significado de estasequivalencias, conocidas como las reglas de Chargaff, era un enigma y as se mantuvo hastaque en 1953Watson y Crick establecieron el modelo de la doble hlice de DNA.
y que Watson Cilck descubrieron el DNAes unadoblehlice En 1952, Watson Francis y Crick formaban partedel James pequeo grupo de cientficos estaban que convencidos de que el DNA era el materialgentico de que el conociy mientode su estructura tridimensional proporcionara les pistasvaliosas sobrecmo funcionaba. Tiabajandoen la Universidad Cambridge, Inglaterra, aproximaron de en se al rompecabezas construyendo modelos alambre esen de tructuras posibles. Duranteaos, pensaba el DNA era se que un polmerolargocon un esqueleto azcares de repetidos (desoxiribosas)unidades fosfatoy una basenitrogey de nadaunida a cadaazucar. Paraconstruirsu modeloWatson y Crick sebasaron quea pH fisiolgico bases G, C en las A, y T existenen unasformasparticulares que permitenla formacindepuentes hidrgeno de especficos entreparejas.Sinembargo, evidencia la experimental importanms te,vino del patrnde difraccin rayos del DNA obtede X nido por RosalindFranklin,que estaba trabajandoen el King'sCollege Londres. imagen Franklinindicaba de La de queel DNA erauna estructura y helicoidal, basndose la en informacin proporcionadapor estaimagen,Watsony Crick propusieron finalmenteun modelode DNA queconsistaen dos hebrasentrelazadas, doble hlice. una En la doblehlicedeWatson Crick,ilustrada la Fiy en gura 18.4,losesqueleto azicarfosfato lasdoshebras s de de estn el exterior la hlice, lasbases en de y miran hacia inel terior,haciael centrode la hlice, formandolos escalones de una escalera circulara la que separece estructura. la La hliceesdextrgira, estosignificaquela hlicesecurva<ha(fjese queestoescierto,incia arribo y haciala derecha en poneel diagrama revs). clusosi se al Contiene diezpares por denucletidos vueltay avanza0,34 por cada de nm par nucletidos. Consecuentemente vueltacompleta la cada de
Laestructura DNA del 565
La estructura del DNA

A medida que la comunidad cientfica aceptabagradualmente las conclusionesde que el DNA almacenabala informacin gentica,comienza a surgir un nuevo grupo de preguntas relacionadascon la manera en la que el DNA realizasu funcin gentica. Uno de los primeros temas que surge es la cuestin sobre cmo se replica el DNA de una forma tan precisaque las copias duplicadasde la informacin genticase pueden pasar de una clula a otra durante la divisin celular,y de los padres a la descendencia. Contestar a esta pregunta requiere el conocimiento de la estructura tridimensional del DNA, que fue proporcionada en 1953 cuando Watson y Crick formularon su modelo de la doble hlice del DNA. Hemos descrito la estructura de la doble hliceen el Captulo 3 y su descubrimientoen elAnexo 3A, pero volvemos a ello ahora, para revisarlo y ver algunos detallesen profundidad.
5' Extremo I
Extremo 3' I
t5'
O: P-O-CHz
oo
Adenina Timina
oHrC-O-P:O
I O: P-O-CHz
o
N-H """."..
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3,4 nm
I
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Purina
oCitosina
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I /w
I HrC-O- P:O
o-
s',o
I Extremo 5'
(b) Orientacin de antiparalela las hebras (a) Doblehlice
de de muestralas cadenas azicar fosfatodel esqueleto DNA, Ios paresde 18.4 La doblehlicede DNA. (a) Estaimagenesquemtica Figura basescomplementarias,elsurcomayorymenoryotrasdimensionesimportantes.A:Adenina,G:Guanina,T:Timina,P:FosfatoyS : Azicar (deoxiribosa). Una de las hebrasde la molculade DNA estorientadaen direccin5' + 3' mientrasque su hebra (b) estorientadaen la direccinopuesta5' + 3' . Estediagramatambin muestralos puentesde hidrgenoque conectanlos complementaria paresde bases y GC. AI
hliceaade3,4 nm a la longitud de la molcula, EI dimetro de Ia hlice es de 2 nm. Estadistancia es demasiadopequea para dos purinas y demasiadogrande para dos pirimidinas, pero se ajusta bien para una purina y una pirimidina, de acuerdo con las reglasde Chargaff.En otras palabras,se necesitael par purina-pirimidina por consideLas raciones estricas. dos hebras se sostienenpor puentes Adems,los hidrgeno entre las basesde hebras opuestas. de puentesde hidrgeno que mantienen juntas las dos hebras de la doble hlice slo ajustan cuando seforman entre la base y adenina (A) en una de las cqdenas timina (T) en la otre, o (G) en una cadena citosina (C) en la y guanina entre la base que la secuencia basesen una cadena de otra.Esto significa
de determina la secuencia basesde la cadenaopuesta;adems, se dice que las dos cadenasde la doble hlice de DNA son complementarias. Esemodelo explica por qu Chargaff haba observadoque las molculasde DNA contienen canA tidadesigualesde las bases y T que de las basesG y C. La implicacin ms profunda del modelo de Watson y Crick esque sugiereun mecanismopor el que las clulasreplican su informacin gentica:simplemente, las dos hebras de la doble hlice de DNA se separanantes de la divisin, de manera que cadahebra funciona como un molde que dirige la sntesisde una nueva hebra de DNA, usando las rela glasdel emparejamientode bases. otras palabras, base En A en la hebra molde definira la insercin de Ia baseT en la
566
y el DNA, 18 de celular: cromosomas ncleo Capitulo Base estructuralla informacin
hebradenuevaformacin, base especifica insercin la G la la A, de la baseC, la baseT concreta insercin la base y de la Iabase implicara insercin la base En el siguienC de G. para trataremos evidencias las experimentales el te captulo, propuesto describiremos bases mecanismo y las molecularesde la replicacindel DNA en detalle. En la Figura18.4seilustranvariasde lascaractersticas msimportantes la doblehlice DNA. Porejemplo,la de de forma en la que giran lasdos hebrascreaun surcomayory Estos surcos desempean papelimporun vn surco menon tanteen lasinteracciones DNA convariasde molculas. del importante la orientacin es antiparaleOtra caracterstica la de las dos hebrasde DNA, que se ilustra en la Figura muestra que,a medidaque nos des18.4b. Estediagrama plazamos lo largo de una de las hebrasen una direccin a dada, nucletidos los sucesivos estn unidospor enlaces fosque unen el carbono5' de un nucletido carfodister al nucletido; unacadena este de bono 3' delsiguiente de tipo sedicequetieneuna orientacin -+ 3'. Perosi semueve 5' a lo largode la otra hebraen la mismadireccin, orden el delos enlaces exhibe una orientacin --.> En otraspa3' 5'. labras, enlaces los fosfodister lasdoshebras orientan de se Las de en direcciones opuestas. diferentes orientaciones las que dos hebras son una caracterstica tieneimplicaciones importantes tanto parala replicacin como parala transen 19 cripcindel DNA comoveremos los Captulos y 2I. La hlicedextrgirade Watsony Crick es una versin idealizada Io que sedenominaB-DNA (Figura18.5a). de Perolasdobles hlices B-DNA queseforman de manede que a menudosedesvan flexibles ra natural sonmolculas que de este ideal, con formasy dimensiones exactas dependen de Ia secuencia local de nucletidos. Adems, aunque el B-DNA esindudablemente forma principaldel DNA la en lasclulas, tambinpuedenexistirotrasformas,quizs dispuestas pequeos en segmentos intercalados molen formasalterculasmayoritariamente B-DNA. De estas de nativas, msimportantes A-DNA y Z-DNA. La forlas son ma A-DNA tiene una configuracin hlicedextrgira en que queesmscortay msgruesa la formaB-DNA.La forma A-DNA sepuedecrearde maneraartificialdeshidraque tandoel B-DNA,perosedesconoce exista condicioen nescelulares normales. Como muestrala Figura 18.5bIa formaZ del DNA esuna doblehlicelevgira. nombre Su que derivadel patrnen zig-zag sigue esqueleto azsu de y que Ia forma B del car fosfato, es ms largay delgada DNA. La forma Z del DNA surgecon mayor facilidad en aquellas regiones DNA quecontieneno bien purinasaldel (siternandocon pirimidinaso bien citosinas metiladas yaseCatuacinqueseproduce el DNA cromosmico; en ptulo 23). Aunquela significacin biolgicadelaformaZdel DNA no se conocecon exactitud, algunas evidencias sugieren que pequeos tramosdel DNA pasan maneratransitode ra ala configuracin como partedel proceso Z mediante el cual seactivala expresin ciertosgenes. de
Surco mayof
Surco menor
(a) DNA B
(b) DNA Z
Figura18.5 Folmas altelnativas DNA. (a) En la forma B del de DNA, el esqueletode azicar fosfato forma una doble hlice suavementedextrgira. (b) En el DNA Z, el esqueletoforma una hliceen zigzag,Ievgta. utiliza el color para destacar Se el esoueleto DNA. del
El DNApuede transformarse formasrelajadas en y superenfolladas En muchas situaciones DNA de doblehlice el puedegirar sobres mismo paraformar DNA superenrollado. Aunque que ahorasesabe esuna propiedaddel DNA extendida ampliamente, superenrollamiento identificpor primera el se que contenan i"t el DNA de ciertosvirus pequeos "n DNA circularque sedisponen buclescemolculas de en rrados. molculas DNA circulartambinsehan enLas de contrado bacterias, en mitocondrias cloroplastos. y Aunque el superenrollamiento estrestringidoal DNA circular, no en esmuchomsfcilde estudiar estas molculas. Una molcula DNA puedeir haciaatrso haciadede lanteentreel estado superenrollamientoel estado de y de no superenrollamiento, estadorelajado. o Paraentender podra desarrollar siguiente estaidea bsica, el ejercicio. que Empiece un trozode cuerda consista doshebras con en quegirenjuntasformandouna hlicedextrgira; esel ste a equivalente una molculade DNA linealrelajada. Unir los extremos la cuerda cambianada;la cuerdaahoraes de no circularperotodava esten el estado relajado. Perosi antesde sellarlos extremos, le da a la cuerdauna l'uelta exse tra en Ia direccin la cuallashebras en estn entrelazadas, po la cuerda entraen un superenrollamiento sitivo.EncamLaestructura DNA del 567
bio, si antes de sellar los extremos,a la cuerda se le da una vuelta extra en la direccin opuesta,la cuerda entra en un De superenrollamiento negativo. manera similar, una molcula de DNA relajadase puede convertir en una molcula de DNA con un superenrollamiento positivo girndola en la misma direccin en la que estenrollada y en una molcula de DNA con un superenrollamiento negativo girndola en la direccin opuesta (Figura 18.6a).Las molculas de DNA circular que se encuentran en la naturaleza, in-
iento rollam Superen negativo (a)
DNA relalado
rollam iento Superen posrtrvo
y de Figura 18.6 Convetsin DNArelajado supetenrollado. (a) Diagrama de una molcula de DNA circular relajado y su por el giro en la misma conversinhacia formas superenrolladas direccin en la que la doble hlice estenrollada (superenrollamiento positivo). (b) Micrograffas electrnicasde molculas de DNA circular de un bacterifagodenominado PM2, con una molcula relajadaa la izquierda, y una molcula con superenrollamiento negativo a la derecha(METs).
cluyendo el de bacterias,virus y orgnulos eucariotas estn de manera invariable superenrrolladasnegativamente.(La Figura i8.6b muestra una molcula de DNA circular de un fago relajada y una molcula similar con superenrollamiento negativo.) El superenrollamiento se produce tambin en molculas de DNA lineal, cuando las regiones de la molcula estn ancladasa alguna estructura celular de manera que no pueda rotar libremente. En un momento dado, porciones significativas del DNA lineal del ncleo de las clulas eucariotas pueden estar superenrolladas, y cuando el DNA se empaqueta en los cromosomas en el momento de la divisin celular,el superenrollamientomasivo ayuda a hacer al DNA ms compacto. El superenrollamientoinfluye tanto en la organizacin espacialcomo en el estadode energadel DNA y afectaa la capacidadde una molcula de DNA para interactuar con otras molculas.El superenrollamientopositivo implica un enrollamiento muy apretado de la doble hlicey por tanto Por el consereducenlas oportunidadespara interaccionar. trario, el superenrollamiento negativo estasociadocon el desenrollamientode la doble hlice,que aumenta el acceso de sushebras a las protenasimplicadas en Ia replicacin o en la transcripcin del DNA. La interconversin entre la forma relajada y Ia forma superenrolladadel DNA estcatalizadapor enzimasdenominadas topoisomerasas, que seclasifican en tipo I o en tipo /L Ambos tipos catalizanla relajacin del DNA superenrollado, pero las enzimas de tipo I Io hacen introduciendo cortestransitorios en una sola hebra del DNA mientras que las enzimasde tipo II introducen rupturas transitoriasen la doble hebra de DNA. En la Figura 18.7 se ilustra Ia forma en la que estos cortes temporales afectan al superenrollamiento del DNA. Las topoisomerasasde tipo I inducen Ia relajacin cortando una hebra de la doble hlice, permitindole al DNA rotar y a la hebra no cortada pasara travs del agujero antesde que la hebra rota sevuelva a sellar.Por de el contrario, las topoisomerasas tipo II inducen la relajacin cortando las dos hebras de DNA y pasando un segmento de Ia doble hlice no cortada a travs de la ruptura A antesde que seasellada. diferenciade la reaccinde la enzima tipo I, la accin de las topoisomerasasde tipo II requiere energa derivada de la hidrlisis de AIP. de Las topoisomerasas tipo I y de tipo II seutilizan para eliminar superenrollamientosdel DNA. Adems, los procariotas tienen una topoisomerasade tipo II denominada DNA girasa que puede inducir tanto la relajacin como el superenrollamiento del DNA. Como aprenderemosen el Captulo 19, la DNA girasaes una de las enzimas implicadas en la replicacin del DNA. Puede relajar el superenrollamiento positivo que resulta del desenrollamiento parcial de una doble hlice, o puede introducir activamentevueltas negativasque promuevan la separacin de las hebras,facilitando ademsel accesoa otras protenasimplicadas en la replicacin del DNA. La DNA girasa requiere AIP para
s68
y el DNA, Captulo Base 18 estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo
ffi
K v
\\/ ^ DNA
Corteen una solahebra
..........................................*
Se sueldael corte
5ffi W
K \
El DNA rotay la hebra intactapasa a travsdel orificio

\Aijs
Toposomerasa ll
La doblehliceintacta pasaa travsdel orificio que posteriormente sel{a se
,rv
d o b l eh e b r a
por Figura18.7 Reacciones catalizadas la topoisomerasay ll, (Arriba) La topoisomerasa elimina los superenrollamientos I I porque rompe d e m a n e r a t r a n s i t o r i a u n a h e b r a d e l a d o b l e h l i c e d e D N A v p a s a l a h e b r a n o c o r t a d a a t r a \ s d e l a r u p ta jr a .L a t o p o i s o m e r a s a l l (Ab u o) elimina superenrollamientos porque corta de maneratransitorialas dos hebrasde la doble hlicede DNA y pasauna regin no cortadade la doble hlicede DNA a travsdel orificio. La DNA girasaesuna topoisomerasa que utiliza estemecanismopara eliminar II superenrollamientos positivosy para introducir superenrollamientos negativos.
generar el superenrollamiento, pero no para relajar una molcula ya suDerenrollada.
Lasdoshebras unadoble de hlice DNA pueden de se por y volver pol separar desnaturalizacin a unirse renaturalizacin Debido quelasdoshebras la doble a de hlice DNA se de
mantienen unidas por enlacesno covalentes relativamente dbiles,las dos hebraspueden separarse con facilidad bajo condicionesadecuadas. Como veremosen los prximos captulos,la separacinde las hebrasesparte integral tanto de la replicacin del DNA como de la sntesisde RNA. La separacin de las hebrastambin se puede inducir de manera experimental teniendo como resultado la desnaturalizacin del DNA; el proceso inverso, que restableceuna doble hlice a partir de hebras separadas DNA, se denode mina renaturalizacin del DNA. Una forma de desnaturalizarDNA en el laboratorio es aumentando la temperatura. Si esto se hace lentamente,el DNA retiene su estadode doble hebra, o nativo, hasta que se alcanzauna temperatura crtica, en esepunto la doble hebra se desnatsralizarpidamente, o se <funde), en sus hebras componentes.El procesode fusin esfcil de monito-
rizar debido a que el DNA de doble cadenay el DNA de cadena sencilla difieren en sus propiedadesde absorcin de Iuz. Todo el DNA absorbela luz ultravioleta, con un mximo de absorcin de alrededor de 260 nm. Cuando la temperatura de una solucin de DNA se aumenta lentamente, Ia absorbancaa260nm semantiene constantehastacue la doble hlicecomienza a fundirse en sushebrascomponentes.A medida que las hebras se separan,la absorbanciade Ia solucin aumenta rpidamente debido a la elevadaabsorcin intrnsecadel DNA de cadenasencilla(Figura 18.8). Se denomina temperatura de fusin del DNA (T^) la temperatura a la cual se alcanzala mitad del cambio de absorbancia. El valor de la temperatura de fusin refleja Ia fuerzacon la que semantiene unida la doble hlicede DNA. Por ejemplo, lapareja de basesGC, que se mantienen unidas por tres puentesde hidrgeno, son ms resistentes la a separacinque la pareja de basesAT, que slo tienen dos puentesde hidrgeno (vaseFigura 18.4b).Adems,latemperatura de fusin aumenta en proporcin directa al nmero relativo de paresde bases GC en el DNA (Figura 18.9). Asimismo, las molculas de DNA en las que las dos hebras estnemparejadascorrectamenteen cada posicin se fundirn a temperaturasms elevadas que el DNA en el que las dos hebras no seanperfectamentecomplementarias.
Laestructura DNA del
569
Cadenas de DNA
c (o
14
hasta Enfriar 20'C Actode nucleacin cremallera)
E
c
@ N
o
.F O 1A
(
6.^ 4) |,1
.F
( .t ..
-o <
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O C
I,J
DNA nattvo
DNA renatuvado
'
_o o
_o 1n
a c (g
1.1
40 5 0 6 0 7 0 B 0 9 0 1 0 0 0 ('C) Temperatura
70 B0 90 100
30 60 (minutos) Tiempo
('C) Temperatura 18.8 Peil de desnaturalizacin tmica del DNA. A medida Figura que la temperaturade una solucinde DNA de doble cadena (nativo) seaumenta,sealcanza punto en el cual la energa del un rpidamente. La que el DNA sedesnaturalice calor causa va de sencillas acompaada un aumento en conversin cadenas de de caracterstico la absorbancia la I,z a 260 nm. La temperatura a Ia cual seproduceel punto medio de esteaumento sedenomina ei temperaturade fusin T^.Para la muestrarepresentada, valor de T, esde aproximadamente87'C
y renaturalizacin DNA, Si una del Figura 18.10 Desnaturalizacin solucinde DNA nativo (de dobie cadena)secalientalentamente cuidadosamente, DNA <sefunde> el contoladas bajo condiciones con rango de temperaturas, un aumentode la en un estrecho a260 nm. Cuando sedeja enfriar la solucin,las absorbancia se siguiendouna cinticaque hebrasde DNA separadas reasocian complementarias inicial. Lascadenas dependede la concentracin en colisionanaleatoriamemente el acto de nucleacinque es de seguidopor un rpido <cierreen cremallera,de las parejas La requierecantidades nucletidosadyacentes. reasociacin de variabies tiempo que dependende la concentracin DNA en de de la soluciny de la longitud de las cadenas DNA.
se El DNA desnaturalizado puede renaturalizardispara permitir el restableciminuyendola temperatura (Fientrelasdoshebras de mientodelospuentes hidrgeno los de gura 18.10).La capacidad renatunalizar cidos cientfide nucleicos tieneuna granvariedad aplicaciones formala base Ia hibridade cas. queesmsimportante, Lo una familiade procedimiencin de los cidosnucleicos,
tos para identificar cidos nucleicos, basada en la capacidad de las cadenas sencillas de unirse, o hibridar, con secuencias
z o 80 (
.C @
100
M. phlei
Serratia
E. coli Neumococo Timode ternera
o
O
60 40
+
c 'C l O) c c) (d
Levaoura
20 o
C
Esperma de salmn
T4 Bacterifago
La de bases complementarias. hibridacin de los cidosnucleicos se puede aplicar a interaccionesentre DNA-DNA, DNA-RNA e incluso RNA-RNA. Por ejemplo, en la hibridacin DNA-DNA, el DNA que se examina se desnaturalizay se incuba con un fragmento radiactivo de DNA de cadena sencilla, denominado sonda, cuya secuenciaes complede mentaria a la secuencia basesque se trata de detectar. de Las secuencias cido nucleico no necesitanser perfectamente complementarias para poder hibridar. Camy biando la temperatura,la concentracinde sales el pH utilizado durante la hibridacin se permite que tenga lugar el que emparejamientoentre secuencias presentannumerosas En condiciones,esposible demal emparejadas. estas bases tectar secuenciasde DNA relacionadas entre s pero no idnticas.Este abordaje es til para identificar familias de genesrelacionadosen un tipo de organismo dado y entre diferentestipos de organismos.
E O
0L 60
B0
90
100
La organizacn del DNA

en genomas
Hasta ahora, hemos considerado varias propiedades del DNA, tanto fsicascomo qumicas.Pero,como bilogos celulares,estamosinteresadosde forma prioritaria en su importancia para la clula. Adems, queremos saber cunto
de 18.9 Latemperatura fusindepende la composicin de de Figura basesdel DNA, La temperatura de fusin del DNA aumenta linealmente con su contenido de G * C, como seilustra por la relacin entre 7- y el contenido de G + C para muestrasde DNA de varios orqanismos.
570
y el de celular: cromosomas ncleo DNA, Gapitulo Base 18 estructural la informacin
a-
y DNA tienenlasclulas, cmo y dndesealmacena, cmo que Empezareutilizan la informacin gentica contienen. ya por mos por preguntarnos la cantidadde DNA presente, que estodeterminarla mxima cantidadde informacin que una clulapuedeposeer. El genomade un organismoo de un virus comprende DNA (o para algunosvirus, RNA) que contieneuna coel de pia completade toda la informacin gentica eseorgaParamuchosvirus y procariotas, genoma el nismo o virus. nmeropequeode moreside una nicamolculao en en eucariotas tielculasde DNA lineal o circular.Lasclulas nen un genomanuclear,un genomamitocondrial y en el tambin un genomacloroplstico. casode plantasy algas, son Losgenomas mitocondriasy cloroplastos molculas de de sencillas DNA, normalmentecircular,que separecena conEl los de las bacterias. genomanucleargeneralmente en de sisteen multiplesmolculas DNA dispersas un juego (Como estudiaremos mayor con haploidede cromosomas. cromosomas detalle el Captulo20,un juegohaploidede en de consiste un representante cadatipo de cromosomas, en mientras que un juego diploidconsisteen dos copiasde una copiade la madrey otra del cadatipo de cromosoma, padre.Cadaespermatozoide cadavulo tienen un juego y mientrasque la mayorade los haploidede cromosomas, eucariotas diploides.) son otrostiposde clulas aumenta con la Eltamaodelgenomanormalmente del compledad organismo como el El tamaodel genomanormalmentese expresa nucleotdicas emparejadas pares o nmero total de bases (pb). Por ejemplo, molculade DNA circular la de bases que constituye el genoma de una clula de E. coli tiene pb. que nmerostiendena serbas4.639.22I Puesto estos Mb Kb tante largos,lasabreviaturas (Kilobases), (Mega(Gigabases) utilizan para referirse miles, y a se bases) Gb De de respectivamente. milloneso billonesde pares bases, el de estamanera, tamaodel genoma E. colisepuedeexpresar I simplemente como4,6Mb. En la Figura18. I sereen de observados vasumeel rangode tamaos genomas la rios gruposde organismos. Estos datosrevelan existencia de de una gamade casiocho rdenes magnituden el taque unospocosmilesdepares maodel genoma, va desde parael virus mssimplea msde cienbillonesde de bases pares bases paraciertas plantas anfibios. trminos y En de a de longitudtotal de DNA, estocorresponde un rangode como el menosde 2 tmde DNA para un virus pequeo, 34 SV40, aproximadamente metrosde DNA (msde 30 a plantas, comoIa flor silvestre tal Trimetros!)paraciertas llium. el Hablandoen trminosgenerales, tamaodel genoma Los aumentacon la complejidaddel organismo. virus concidosnucleicos como para codificarsotienen suficientes las o docenas protenas, de lamente unaspocas unaspocas y puedencodificarunospocosmilesde protenas bacterias
o E 'o
1 0 0G b
E o c
1 0G b '1 Gb
o o) o o a c) a -o 0)
! a o
100tvtb
o c)
1 0M b
I o E .l g (s E
c a) o) a)
!
lMb
1 0 0K b
( E .(
o c
1 0K b
1Kb Fgura 18.11 Relacinentre el tamao del genomay el tipo de otganismo. Para cadagrupo de los organismosque se muestran, la barra representael rango aproximado del tamao del genoma, medido como el nmero de paresde nucletidos por genoma haploide.Seusael mismo color (morado) para los grupos que incluyen miembros del reino animal.
tienen bastante cantidadde DNA (al las clulaseucariotas de menosen teora)como para codificarcientos milesde protenas. Peroun examenmsexhaustivo los datosrede La sorprendentes. msnotablede ellas, velacaractersticas presenta es que el tamao del genomade los eucariotas que grandes variaciones no secorrelacionan ninguna con conocida cuantoa la complejidad orgaen del diferencia nismo. Por ejemplo,algunosanfibiosy plantas,tienen geque nomasgigantescos sondecenas inclusocientosdeveo que de anfibios ces mayores los de otrasespecies mamferos, o plantas. Por ejemplo,Trillium,esun miembrodela familia delos evidentes como para prelirios que no tiene necesidades excepcionales informacin gentica. de sentarcantidades el el Sin embargo, tamaode su genomaesmsde 20 veces y el la plantadel guisante 30 veces de los humanos. Adede con una nica clulatieneun genomaque ms,una ameba humano.No tenemos tiene200veces tamaodel genoma el por qu lasplantasde la familia de los lirios y las ni ideade poseen destaca hechode tanto DNA. Supresencia el amebas portan grandes quela mayorade los genomas eucariticos un cantidades DNA de funcin desconocida. fenmeno de fi.nal, tael sobreel quetrataremosen breve.Como anlisis mao del genomaes menosimportante que el nmero e identidad de los genesfuncionalesy de las secuencias de DNA que controlansu expresin.
Laorgnizacin DNA genomas 577 del en
de mediante electrofo Separacin losfiagmentos restliccin de tesisen gel. Incubar una muestrade DNA con una enziproduceuna coleccin fragde ma de restriccinespecfica que heredables se Puestoque las similitudesy diferencias mentos de restriccin de tamaos diferentes. Para derivan de su DNA, podeobservanentre los organismos determinar el nmero y longitudesde talesfragmentosy que de mos esperar el estudiode lasmolculas DNA proposterioparaaislarfragmentos individualesparaestudios Las biolgicos. pistasparamulduzcaimportantesavances de unos fragmentos res,debemos capaces separar ser de gnica titud de misterios--desde el control de la expresin otros.La tcnicade eleccinpara estepropsito esla elecen la clulahastala evolucinde nuevasespecies- debeel troforesis en gel, esencialmente mismo mtodo ',fiilizaen de del ran encontrarse la secuencia nucletidos DNA ge(vaseFigwa7.22). protenas polipptidos y do paraseparar de de nmico.Sin embargo,lamayora lasmolculas DNA De hecho,el procedimientopara el DNA es incluso ms paraserestudiadas grandes intactas. heDe sondemasiado simple que para protenas,debido a que las molculasde principiosdelos aos70,el DNA erala molcucho,hasta inherente(debido a sus DNA tienen una carganegativa la biolgica ms difcil de analizarbioqumicamente.El gruposfosfato)y por tanto no necesita tratadacon un ser intimidatorio, DNA eucariticoparecaserespecialmente para hacerque semuecargado negativamente detergente eucariticos, dado el tamaode la mayorade los genomas fragmentos DNA, norvanhacia nodo. pequeos el Los de ningn mtodoparacortarel DNA en siy no seconoca malmentese separanen geles poliacrilamida,mienftas de para La reproducibles. tios especficos obtenerfragmentos quelosfragmentos msgrandes separan geles se en mspoposibilidadde seralgunavez,capaz identificar,aislar, de serososhechosdel polisacridoagarosa. pareeucariticos especficos, cuenciar manipulargenes o ilustrala separacin fragmentos de La Figura18.12 de el en ca improbable.Sin embargo, menosde una dcada, restriccinde diferentes tamaospor electroforesis gel. en biolgicas DNA seha convertidoen una de las molculas Lasmuestras DNA seincubanprimero con la enzimade de con las que esmssencillotrabajar. en deseada; la figuraseutilizantresenzimas de por el des- restriccin Estegranpasoadelante ha hechoposible se Las se entonces restriccin diferentes. muestras colocan en cubrimiento de las enzimasde restriccin, que son enzi(upociseparados que mas,aisladas partir debacterias, cortanlasmolculas un extremodel gel en compartimentos a y (El de DNA extraoen sitiosespecficos. Anexo 18Bdes- llos>).Posteriormente,con el nodosituadoen el extrelas se mo opuesto dondeseencuentran muestras, le aplia cribe el papelbiolgico de las enzimasde restricciny alDebido ala carga negativa ca al gel un potencialelctrico. gunosdetalles acerca los sitiosenlos quecortan;aqulnos de los analticas.) de centraremos su uso comoherramientas en de susgruposfosfatos, fragmentos DNA migrarnha(es La accinde corte de una enzimade restriccingenera ciael nodo. fragmentos pequeos deci aquLos ms de de un grupo especfico fragmentos DNA denominados llos con el pesomolecular msbajo) semovernen el gel de con relativa facilidady por tanto migrarn rpidamente, fragmentos restriccinCadaenzimade restriccinrompe DNA de doblecadena lugares dondeensloen aquellos quelos fragmentos msgrandes movern se mientras ms especfica la que reconoce, a deno- lentamente. corrientese mantienehastaque los fragcuentrauna secuencia La minada sitio de restriccin, que tiene normalmenteentre en final son mentosestn bien separados el gel.EI resultado cuatro y seisnucletidosde longitud (aunquepuedenser de bauna seriede fragmentos DNA que sehan separado que ste el sitio de restriccin es ochoo ms).Porejemplo, en de sndose diferencias tamao. reconocela enzimade restriccinde E. coll,denominada Losfragmentos DNA en el gelsevisualizan tiende o msampliamente utilizada: EcoRI, Una do o utilizandoDNA marcadoradiactivamente. tcel nica de tincin comn implica empapar gel en el colo5'G'A A T-T-c 3' que seune al DNA y fluoresce rantebromurodeetidio, en 3, C-T-T-A-A-G 5' Si naranjacuandoseexponealal:uzultravioleta. los fragmentosde DNA son radiactivos, localizacin puede su se paradetecpor una tcnica determinar autorradiografta, Lasflechas indican dndecorta EcoRIal DNA. Estaenradiactivas revistiendo muestracon pella tar molculas zimade restriccin,como muchasotras,haceun corte esla produceun Cuandoserevela pelcula, culafotogrfica. calonadoen la doble hebrade la molculade DNA. como est autorradiogramaqve msoscuroall dondela radiacsepuedever en la Figura188.lb (Anexo18B). Despus locon de La frecuencia con la que los sitios de restriccinapare- tividad ha interaccionado la pelcula. calizarde estaforma los fragmentosindividualesde DNA, cen en el DNA estal que una enzimade restriccindada, que unospocos sepuedenextraer gelparaserestudiados posteriodel con romperel DNA en fragmentos van,desde de cientosde paresdebases longitud, a unospocosmilesde ridad. paresde bases. fragmentos estos Los de tamaos son,con Mapade restriccn.Cmodetermina el investigadorel mucho, ms fcilesde manipular posteriormenteque las orden en el que un conjunto de fragmentosde restriccin molculas DNA, enormemente de largas, partir delascuaa sedisponeen una molculade DNA?Una aproximacinal lessehan generado. cortanlas molculas DNA de Lasenzimas restdccin de por sitios especficos
572 y el 18 DNA, Capitulo Base estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo
ffifi
Ctodo
UU
Mezclade DNA de diferentes tamaos
-:
Fragmentos ms largos
__-____>
Gel Placas de vidrio Anodo (a) (b)
ii
tttt l t
Fragmentos ms cortos
Gel migrado (c)
Fitwa L8.L2 Electrofolesisen gel del DNA, (a) Los tres tubos de ensayocontienen mezclasde fragmentos de DNA producidos por la incubacin de muestrasde DNA con diferentesenzimasde restriccin. Parafraccionar una preparacin de DNA que contiene fragmentos de varios tamaos,sedepositauna pequeamuestrade Ia preparacinen la parte superiordel gel.Entonces, aplicaun potencialelctricode se varios cientos de voltios a travs del gel, de forma que el nodo (electrodo positivo) esten la parte inferior del gel y el ctodo (electrodo negativo)en la parte superior.(b) Los fragmentosde DNA de la muestradepositada migran haciael nodo,desplazndose rpidamente ms Ios fragmentos cortos que los largos.(c) Despus un tiempo suficiente de para que seseparen fragmentos, retira el gel y setie con un los se colorante como el bromuro de etidio que se une a los fragmentos de DNA y les hace fluorescentes bajo la luz ultravioleta. Como alternativa, puedeusarse autorradiografiaparalocahzar bandasde DNA en el gel si el DNA seha marcadoradiactivamente. la las
estudio implica tratar al DNA con dos o ms enzimas de restriccin, solaso combinadas,seguido de una electroforesisen gel para determinar el tamao de los fragmentosde restriccin resultantes. Figura 18.13muestra cmo funLa cionara para una molcula sencillade DNA tratada con las enzimasde restriccin EcoRIyHaeIII. En esteejemplo,cada enzima de restriccin de forma individual corta el DNA en dos fragmentos,indicando que el DNA slo contiene un sitio de restriccin para cada enzima. Basndonossolamente en esta informacin, se pueden proponer dos posibles mapas de restriccin (vanselosmapasA y B en la parte de abajo de Ia Figura 18.13).Para determinar cul de los dos mapas es el correcto se debe realizar un experimento en el que la molcula de DNA de partida se debe cortar simultneomente con EcoRI y HaeIIl. El tamao de los fragmentos producidos por la digestinsimultneacon las dos enzimas revelaque el mapa A debe ser el correcto. En la prctica, los mapas de restriccin implican datos que son considerablemente ms complejos que en nuestro sencillo ejemplo. En esas situaciones,losfragmentos de DNA producidos por cadaenzima de restriccinpuedenseraislados ffsicamente-cortando el gel,por ejemplo, en porciones y extrayendo el DNA de cada porcin-. Los fragmentos aisladosse cortan de manera individual con la segunda enzimade restriccin, permitiendo as el anlisispor separado de los sitios de corte en cada fragmento. El Problema 18.4 aporta un ejemplo de cmo se emplea este abordaje para construir un mapa de restriccin, que representela localizacin de todos los sitios de restriccin en el DNA original.
parasecuenciar Existenprocedimientos rpidos DNA Casial mismotiempoquesedesarrollaron tcnicas las para preparar fragmentos restriccin idearon mtodos de se dos -es decir,paradeterparasecuenciar DNA rpidamente minar el ordenlinealde lasbases el DNA-. Uno de los en mtodosfue concebidopor Allan Maxany Walter Gilbert, y el otro por Frederick Sanger colaboradores. mtodo y El de Maxam-Gilbert, denominado mtodo el qumico,estaba basado el uso de compuestos en qumicos(no proteicos) que cortan el DNA de manerapreferente bases en especfimientrasque el procedimiento Sanger, cas, de denominado el mtodode terminacin cadena, de utiliza dideoxinucletidos(nucletidos losquelesfaltaun grupohidroxiloen 3') a que interfierencon la sntesis enzimticanormal DNA. del Nos centraremos el mtodode Sanger en debidoa queesel mtodoqueseha adaptado parasu usoen mquinas autoque seempleanactualmente la mayorade las mticas en tareas secuenciacin DNA. de de En este procedimiento, emplea fragmentode DNA se un de cadena sencillacomo molde para guiar la sntesis de nuevas hebras DNA complementario. sntesis DNA de La de se realizaen presencia deoxinucletidos de dATR dCTR dTTP y dGTPque sonlos sustratos normales proporque cionanlasbases C, T y G a lascadenas DNA en creciA, de miento.Tambinseincluyen,aunqueen menor concentracin, los cuatro dideoxinucletidos marcadoscon un colorante(ddlLIR ddCTR ddTTR ddcTP) a los quelesfalta el grupo hidroxilo unido al carbono 3' de los deoxinuLaorganizacinDNA genomas del en
),/ J
Anexo Lns TNZIMAS DE RESTRICCIN EN DETALLE

(una Lasenzimas restriccinson un tipo de endonucleasa de en el enzimaque corta internamente DNA) que seencuentran a Estas enzimas ardan a lasbacterias muchasbacterias. de protegerse contrala invasinpor molculas DNA extraas, particularmente por el DNA de bacterifagos. hecho,el De procededel descubrimiento nombre de enzimade <restriccin> del enzimasrestringenla capacidad DNA forneo de que estas para apoderarse la maquinariade transcripciny de de traduccinde la clulabacteriana. la Paraprotegersu propio DNA de serdegradado, clula que aadegruposmetilo (-CH3) a tiene enzimas bacteriana que nucletidosespecficos de otra forma, seranreconocidos los por suspropiasenzimas restriccin.Una vezmetilados, de por de ya nucletidos no son reconocidos lasenzimas por restriccin,de maneraque el DNA bacterianono esatacado de de suspropiasenzimas restriccin.Sedice de lasenzimas restriccinque forman parte del sistemade metilacin/restriccin de la clula: el DNA efirao serompe por la accinde las enzimas restriccin,mientrasque el de se genomabacterianopreviamente protegepor metilacin. Lasenzimas restriccinrecibensu nombre a partir de la de bacteriade la que seobtienen.Cadanombre enzimticoderiva de la combinacinde la primera letra del gnerode la bacteria La bacteriana. cepade la con lasdos primerasletrasde la especie bacteriatambinsepuedeincar, y si sehan aisladodos o ms las se enzimasapartr de la misma especie, enzimas numeran (usandonmerosromanos)por orden de descubrimiento. a Adems, primera enzimade restriccinaislada partir de la Ia como EcoRI, mientrasque Ia terce.ra cepaR de E. colisedesigna se a aegyptius denomina enzimaaislada partir de Hemophilus HaeIIl. del Lasenzimasde restriccinson especficas DNA de y Cadaenzimade doble cadena digierenlas dos cadenas. especfica DNA que de una secuencia restriccinreconoce normalmentetiene una longitud de cuatro o seis(pero puede ser ocho o ms) paresde nucletidos.Por ejemplo,la enzima GGCC y Ia de HaelIl reconoce secuencia tetranucletidos rompe la doble hlicede DNA como semuestraen la Figura 18B.la.Los sitios de restriccinde otras enzimasde restriccin seresumenen Ia Tabla188.1.Algunasenzimasde restriccin como HaelIl, cortan las dos hebrasen el mismo punto, romos. Otras generando fragmentosde restriccinde extremos enzimasde restriccindigierenlas dos hebrasde manera generando sencillao colascortasde cadena escalonada, EcoRIesun ejemplode estetipo en salientes, ambosextremos. la reconoce secuencia GAAITC y corta la molcula de enzimas; dejandouna colaAATT en de DNA de maneracompensada, (Figural88.1b).Losfragmentos de ambosfragmentos por restriccingenerados enzimascon estepatrn de ruptura
,,l-Gdddls, l " l c c e eu 1
s ' lG G G C C1 5 ' C
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g ' I G GI I C C Cs ' G l
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que por (a) Digestin enzimas producen extremos romos
s.lonRrr].' EcoRl .,lcrrnnelu'

t 3.
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u,[ol lnF1rTls. s'lCrrAA I lels' u.[e cl lercccclg,

I C Gl s '
Nor|
o'ICGCCGG I
por que (b) Digestin enzimas producen extremos cohesivos por de FigwatSB.L Digestin DNA lasenzmas restriccin. (a) del que de son de Haellly SrnI ejemplos enzimas restriccin cortan fragmentos del lasdoshebras DNA en el mismositio,generando y que de romos.(b) EcoRI No/I sonejemplos enzimas con extremos generando fragmentos escalonada, con cortanel DNA de manera puede gentico utilizarestos cohesivos. <ingeniero> Un extremos pegajosos unir fragmentos DNA de orlgenes para de extremos en diferentes comoexplicaremos el Capltulo20.
escalonada siempredejan extremospegajosos(tambin Estostrminos derivandel hecho llamadosextremos cohesiuos). sencilladel extremode cadauno de de que la cola de cadena con cualquier esos fragmentospuedeemparejarsusbases extremode cualquierotro fragmentogeneradopor la misma que los fragmentossepeguenunos a otros enzma, causando por puentesde hidrgeno.Lasenzimasque generan tales ya fragmentosson particularmenteprcticas que sepueden emplearde maneraexperimentalpara crearmolculasde DNA como veremosen el Captulo 20. recombinante, de Los sitiosde restriccinparala mayorade lasenzimas lo se restriccinsonpalndromos, que significaque la secuencia leeigual en cualquierdireccin.(La palabrainglesaradaresun palindrmicade un palndromo,por ejemplo.)La naturaleza sitio de restriccinsedebea su doble simetrade rotacin,lo que significaque rotando la secuencia doble cadena180"en de que el plano del papel,seproduceuna secuencia selee igual que antesde Ia rotacin.Los sitiosde restriccinpalindrmicos
cletidosnormales.Cuando un dideoxinucletidose inen corporaa una cadena DNA en crecimiento, lugar de de annormal,la sntesis DNA sedetiene de un deoxinucletido
574
del tesdetiempodebidoa la ausencia grupo hidroxilo en 3', que haceimposiblela formacin del enlace con el siguiente nucletido.De estaforma, seproducirn seriesde frag-
y el DNA, 18 estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo Gaptulo Base
y que Tabla 188,1 Enzimas restriccin usocomn secuencias reconocen de de

Enzima
'4val
Organismoorigen de
Anabenavariabilis
Secuencia reconocimiento* de
5' C-Pi-C-G-Pu-G 3' C-Pu-C-C-Pi-C J 5,G-G-A-T-C-C3' 3' C-C-T-A-G-G J 5' CrA-A-T-T-C 3' C-T-T-A-A-G
3' 5'
BamHl
Bacillusamylolquefaciens
5'
EcoRI
Escherichia coli
3' 5'
Haelll
Hemophilus aegyptius
5'c-c-c3'
3,C-C-G-G f 5'
Hindlll
Hemophilus influenzae
5,A-A-G-C-T-T 3'T-T-C-G-A-A
I J
3' s',
Psd
Prot i denciastuartii | 64
5, C-T-G-C-A-G 3',G-A-C-G-T-C t J s'G--4-A-T-C-G 3,(H-T-A-G-C5' t J 5'c-A-G.{-T-C3', 3' G-T-C-G-A-C I J 5' C-T-C-G-A-C 3'C-A-G-C-T-G
3' s', 3',
Pvul
Proteus vulgaris
Pvull
Proteus tulgaris
5' 3' 5'
Sall
Streptomyces albusG
* Lasflechas los sitiosde reconocimiento, en indican los puntos n los que lasenzimasde restriccindigierenlas dos hebrasde la molculade DNA. Pi : Pirimidina (C o T), Pu : Puira (G o A).
tienenIa misma secuencia bases lasdos hebrascuandose de en lee cadahebraen direccin5' ---> . 3' La frecuencia Ia que un sitio de restriccin con en particular, aparece una molcula DNA, sepuedepredecir en de de maneraestadstica. ejemplo, una molcula DNA Por en de (A, que contienecantidades igualesde las cuatro bases T, G y predecirque,aproximadamente, produceun C) podemos se sitio de reconocimientocon cuatro paresde nucletidoscada 256 (esdecir,4a), probable paraun mientrasqueIa frecuencia sitio de seis nucletidos una de cada4.096nares es de (es nucletidos decir,46). Adems, enzimaide restriccin las
que tienden a digerir el DNA en segmentos normalmente varanen longitud de varios cientosa variosmiles de paresde nucletidos, esencialmente segmentos tamaode genes. del Estossegmentos denominanfragffientos restriccinPuesto se de que cadaenzimade restriccin rompeen una secuencia de nucletidosinicay especfica, siemprecortarL molcula una dadade DNA de una manerapredecible, generando un conjunto de fragmentosde restriccinreproducibles. Esta propiedadhacede las enzimasde restriccinherramientas muy poderosas paragenerar piezas DNA de tamaos de manejables parasu posteriorestudio.
mentosde DNA incompletos proporcionacuyos tamaos rn informacinrelativaa la secuencia lineal delasbases en CIDNA.
La Figura18.14ilustracmo funcionaesteprocedimiento.En el paso@, sepreparauna mezclade reaccin que incluyelos dideoxinucletidos ddlffR ddCTR ddTTP
LaorganizacinDNA genomas 575 del en
DNA sin
Eco Rl Haelll EcoRl+ Haelll
cortar
.\
Tamao los de (Kb) fragmentos 7,0

qq
4,5 3,0
tq t,c
o
Mapas de restriccin posibles EcoRl
2 , 5K b
5 , 5K b FcoRl Hael I
7 , 0K b
Mapa B
tt
4 , 5 K b 5 , 5K b
7 , 0K b
Figura 18.13 Mapasde restriccin. En esteejemplohipottico,se de determinala localizacin los sitiosde restriccinde EcoRIy HaeIll en un fragmentode DNA de 7,0 Kb de longitud. EI tratamientode EcoRIcorta el DNA en dos fragmentosque miden 2,5 Kb y 4,5 Kb lo que indica que seha cortadoel DNA en un solo punto localizadoa 2,5 Kb de uno de los extremos. tratamiento El con HaelII corta el DNA en dos fragmentos que miden 1,5 Kb y 5,5 Kb lo que indica que seha cortadoel DNA en un solo punto Iocalizado 1,5Kb de uno de los extremos. puedenproponer a Se basndose slo en esta dos mapasde restriccinposibles informacin. Si el mapa A fuesecorrecto,la digestinsimultnea del DNA con EcoRIy HaeIII deberadar tres fragmentos de 3,0 Kb, 2,5 Kb y 1,5Kb. Si el mapa B fuesecorrecto,la digestinsimultnea del DNA con EcoRIy HaeIII deberagenerar tres fragmentos de revelanque el 4,5 Kb, 1,5Kb y 1,0Kb. Los datosexperimentales mapa A debeserel correcto.
frecuentemente y al azar,un dideoxinucletido coloreado se inserta en vez de su equivalente normal. Cadavez que seinde corpora un dideoxinucletido sedetienela sntesis DNA para esa hebra en particular. Por lo tanto, se genera una mezcla de hebras de longitudes variadas. Cada una de las hebras,contieneuna basecoloreadaen el extremo donde se ha detenido la sntesisantesde tiempo como consecuencia de la incorporacin de un dideoxinucletido (paso @). la en Posteriormente, muestra sesometea electroforesis un gel de poliacrilamida, que permitir que los fragmentos de DNA recin sintetizadosse separen unos de otros, ya que los fragmentos ms cortos migrarn en el gel ms rpidamente que los fragmentos ms largos (paso @ ). A medida que se desplazanen el gel, una cmara especialdetecta los colores de los diferentes fragmentos segn van pasando.El paso @ muestra cmo esainformacin permide te determinar la secuencia basesdel DNA. En esteejemplo en particular, el fragmento de DNA ms corto es azul y el siguiente fragmento ms corto es verde. Como el azul y el verde son los colores de ddCTP y de ddGTP, respectivamente,las dos primeras basesaadidasal cebadordeben automhaber sido C seguidade G. En los secuenciadores en ticos,esainformacin serecogepara cientosde bases fila y si se introduce en un ordenador permite determinar rpidamente la secuenciacompleta del fragmento de DNA inicial.
los de secuenciado genomas numerosos Sehan ofganismos

El significado de la tcnica que acabamosde describir apenas se puede estimar.Ahora, la secuenciacinde DNA es algo frecuentey automatizado que se aplica de manera rutinaria no slo para genesindividuales sino tambin para genomas enteros.Aunque las mquinas que secuencian de DNA sIo determinan la secuencia fragmentoscortos de DNA, de unas 500 a 800 basesde largo, uno a uno, los prode gramas de ordenador buscan secuencias solapamiento entre esosfragmentos y de esemodo es posible ensamblar datos de cientos o miles de fragmentos de DNA en grandes longitudesde millones de bases. tramos que puedenalcanzar Muchos de los xitos iniciales en la secuenciacindel genoma estn relacionadoscon bacterias,ya que stasposeen genomas relativamente pequeos, normalmente de Ahora estn disponibles las unos pocos millones de bases. secuencias completasdel DNA de ms de 100 bacteriasdiferentes, incluyendo aquellasque causanvariasenfermedades en los humanos. De hecho, los aparatosde secuenciacin son tan eficacesque recientemente,un instituto de investigacininform de que haba sido capazde secuenciar el genoma de 15 bacteriasdiferentesien un mes! Pero la secuenciacin DNA tambin se ha aplicado con xito de en genomasms grandes,incluyendo los organismos ms importantes para la investigacin biolgica (Tabla 18.2). Por ejemplo, Ios cientficos han completado la secuencia
y ddGTR cada uno marcado con un marcador fluorescente de distinto color. Ej., ddATP : rojo, ddCTP : azttl,
ddTTP : naranja y ddGTP : verde.Estosdideoxinucletidos coloreadosse mezclan con los deoxinucletidos,sustratos naturalespara la sntesisde DNA y a la molcula de que seva a secuenciar junto a un y DNA de cadenasencilla cebador(primer) corto de DNA de cadenasencillacomplementario al extremo 3' de la hebra de DNA que se va a secuenciar.Cuando se aadela DNA polimerasa,stacataliza la unin de los nucletidos,uno a uno, al extremo 3' del cebador,produciendo una hebra de DNA en crecimiento complementaria al molde de DNA cuya secuenciase est determinando. La mayora de los nucletidos que se insertan son deoxinucletidos normales debido a que son los sustratospreferidos por la DNA polimerasa.Sin embargo,
s76
y el 18 DNA, Captulo Base estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo
Secuencia desconocida M o l d ed e D N A 3 ' - 4 A C A G C T T C A G T , . . , . . . . , . . . . . . . . 5 ' Cebador(primer) F_TTGTI Incubacin DNA de cadenasencilla de (hebra de secuencia desconocida de arriba) una mezclade reaccin en que contiene cebador,la DNA un polimerasa, deoxinucletidos y dideoxinucletidos marcados con colorante
f DNA polimerasa + dATP,dCTP,dTTP, dGTP + ddATP', ddCTPO, ddTTP' ddGTP'
Productos la reaccin de
que se formancada coloreada vez que la sntesis DNA de se termina formaprematura de por la incorporacln un de dedeoxinucletido marcado con cotoranle
o l_lie trccnne
F;-rreis64ao
ls':TTofcoAAGrcA. ll-iie iccAAGrc. l s '- r r e i c c A A G r .
Figura 18.14 Secuenciacin DNA. del La tcnica de terminacin de Ia cadena que seilustra aqu, que emplea dideoxinucletidos marcadoscon un colorante, seha adaptado para su uso en mquinas secuenciadoras automticasde alta velocidad.Auncue esteejemplo resumesolamente los resultadosobtenidos para las primeras ocho bases Ia secuencia DNA, los de de experimentosde estetipo determinan generalmentesecuencias fragmentos de de DNA de 500-800bases longitud. de Los cuatro pasosprincipales implicados en el procedimientosedescriben con mayor detalle en el texto.
fficcn'
E;-iie il66o E_rroil6o
Los fragmentosse separan

r al^irf^racic on nol
La cmara detecta
losf ragmentos coloreados a medidaque se desplazan en el gel, permitendo as representar secuenca la oe Dases
/\A A/\AAA
genmica de Ia levadura Saccharomices (12,1 micereyisiae llones de bases),de la lombriz Caenorhabditiselegans (97 millones de bases),de la planta de Ia mostaza Arabidopsis thaliana (125 millones de bases)y de la mosca de la fruta ( Drosophila melanogaster180 millones de bases). Para nosotros, como sereshumanos, el logro ms importante de la secuenciacindel DNA es,por supuesto,el genoma humano. Cmo ha sido de impresionante esedesafo?Para contestara esacuestin necesitamossaber que el genoma nuclear humano contiene alrededorde 3,2 billones de basesque es aproximadamente 1.000vecesms que el DNA que est presente en una clula de E. coli. Una manera de entender la magnitud de semejantedesafio es apuntar que a principios de los 90, cuando los esfuerzos para secuenciargenomasempezarona ir en serio,el laboratorio de FrederickBlattner necesitcasiseisaosDaradeterminar la LaorganizacinDNA genomas 577 del en
genomas Tabla 18.2 Ejemplos algunos de secuenciados 0rEansmo

Bacteria Mycophsma genitalium Haemophilus inlluenza Streptococcusp neumoniae Escherichia coli Levadura (5. cerevisiae) Lombriz redonda (C. elegans) P l a n t ad e fa m o s t a z a( A . t h a l i a n a ) Mosca de la fruta (D. melanogaster) Ratn (Mas musculus) Humano (H. sapiens)
Tamao Nmero estimado delgenoma degenes
0,6Mb 1,8Mb 2,2llb 4,6Mb 12,1 b M 97 Mb 12sMb 180Mb 2.s00Mb 3.200 Mb
470 r.740 2.240 4.405 6.200 19.700 25.500 13.600 30.000 30.000
mayoriadelasfuncionescelulares, ahoralos cientficos miran msalldel genomaparaestudiarel proteoma -la estructuray propiedades cadaprotenaproducidapor el de genoma-. La complejidaddel proteomade un organismo mayorquela desu genoma. ejemesconsiderablemente Por que los aproximadamente plo, sepiensa 30.000 genes que sehan encontradoen las clulashumanas,son capaces de producirentre200.000 yms de un milln deprotenas. La puedenproducir tantasprorazn por la cual las clulas partir de un nmeromspequeo genes tratenas a de se reflejael hechode que taren el Captulo23.Esencialmente, un gen individual sepuedeleer de mltiples formas para producir versiones diferentes su producto proteico,y de quelasprotenas resultantes estnsujetas modificaciones a paradesciflal ha El campode la bioinformtica emergido bioqumicasquepuedenalterarde manerasignificativa sus genomas ploteomas y y propiedades estructuralesfuncionales. producidas Identificarel enormenmerode protenas el Sin duda,secuenciar genomahumano ha sido una de las por el genoma sidomsfcilpor la espectrometra maha de que la no hazaas ha coronado biologamoderna, slodesas altavelocidad, tcnicaextremadamente de una sensible bido a su magnitudy dificultad sino tambin a su impacto y para separar potencial nuestros conocimientos sobre evolucin, que utiliza camposmagnticos elctricos la sobre o de basndose diferenen y fisiologa enfermedad humana.E incluso, desenmaraar protenas fragmentos protenas, y ciasde masa carga. Una aplicacin la espectrometra de de Ahoravienela parIa secuencia bases la parte<fcil>. de era los es derivados protenas de sede secuencia masas identificar pptidos te difcil queesdarleforma al significado esta previamente electroforesis gel y digeridas por en tramos paradas de 3 billonesdeA.,, G.,,C.. y T.,. Por ejemplo, qu posteriormente proteasas con especficas, comola tripsina. del DNA corresponden genes, a cundoy en qutejidosse los con de genes, clase protenas qu esos de codificanesos Comparando datosresultantes lasmasas los ppexpresan tidos que se produciran,segnel pronsticode las seprotenas otrasy cmo genes cmo interactan y esas con de en de cuencias DNA presentes lasbases datosgenmicos, funcionan? protenas producidas genes repor identificar de La perspectiva analizar enormetorrentede datos sepueden de ese hacen viableel estucientedescubrimiento. Otrastcnicas a la identificacinde una nuevadisciplina,denocondujo y funcionales el enoren minadabioinformtica, que anala cienciade los ordena- dio de interacciones propiedades me nmero de protenas que se encuentran en un dorescon Ia biologlaen un intento de darlesentidoa todo Por es inmovilizar milesdeproque esto. ejemplo, programas Por Ios informticos analizan proteoma. ejemplo, posible (u que telnas diferentes otrasmolculas seunena protenas por tramosquepodrancodificarsecuencias amide el DNA comominsculas manchas un trozo de vien especficas) que nocidos, utilizanparaestimar nmerodegenes cose el que un porta.Lasmicrocolecciones prodrio mspequeo Estos anIisis sugieren presencia unos la de dificanprotenas. teicasrestltantes(o ochips, de protenas)sepuedenusar genes que codificaran protenas el genoma 30.000 en huparaestudiar propiedades proteicas varias tales comoIa camano,aproximadamente la mitad, no seconoca exisde su pacidad cada mancha individualparaunirsea otrasmode del Lo tenciaantesde la secuenciacin genoma. ms fascilculasaadidas la solucincircundante. a nante de estaestimacin,es que esto significa que los Adems lasprotenas lasque codifica,otra caractede a que humanostienensolamente dobledelos genes tienen el genoma rsticaimportantedel humanoesla maneraen la por ordenadortamlaslombriceso las moscas! analisis El quela secuencia bases de difiereentrepersonas. secuenLa que bin ha revelado solamente 1 o el 2o/o el delgenoma hucia del genoma humanopublicada en realidad moes un mano codificaprotenasnormalmente. Mientras que el de reguladores DNA restante contieneelementos importantes saicoobtenidoa partir del DNA aislado 10individuosdiEn ferentes. la prctic el 99,7o/o lasbases su genoma a, de de as como algunosgenesque codificanpara productosdel perfectamenteesta publicada con seajustarn a secuencia o parece la en RNA envezdeprotenas, mayora consistir DNA la secuencia bases DNA de su vecinode la puerta de de del (Leapor ejemplo, discu<basura> funcin aparente. sin las puedevariar de restante lasbases de y siones sobreel DNA repetidoen la siguiente seccin sobre al lado.Peroel 0,37o que a caractersticas nos hacen losintronesen el Captulo21.)Mientrasquela significacin una persona otra, creando Estas variaciones la secuencia baen de DNA no estclara,algunas evidencias sugieren individuosnicos. de todo este que su presencia puedeaumentarla capacidad genoma sesentre individuos se denominanpolimorfismos de un del nico nucletido,o SNPs(quesepronuncia<snips>). Aunde evolucionar lo largo del tiempo. a queel 0,30lo suena mucho,el 0,30lo no a multiplicadopor 3,2 quela funcin de la mayoradelos genes proPuesto es billonesde bases genoma del humanoproduce total de un y protenasson las responsables la ducir protenas estas de
578 y el Capitulo Base 18 estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo DNA,
de completa genoma E. coli.Aesta del de vesecuencia bases del locidad,la secuenciacin genomahumano completole habrasupuesto un nicolaboratoriounos6.000aoslEn a los elProyecto consecuencia, 1990, cientficos en acordaron Humano,un esfuerzo cooperacin insobre Genoma el de que implicabaa cientosde cientficos comque ternacional partieron susdatosen un intento de determinarla secuencia completadel genomahumano.A finalesde los 90, una abordtambin el compaacomercial, CeleraGenomics, Comoresultado estos de esfuerzos, abrilde2003, en asunto. se determinla secuencia completadel genomahumano, aproximadamente aosantesde lo previsto. dos
10 Los cientficosya aproximadamente millones de SNPs. Ia han creado una base datosquecontiene mayoradelos de pequeas genticas se variaciones mscomunes; estas SNPs creeque son importantesya que puedeninfluir probablemente en cmo seva a ver ustedafectadopor una enfera medaden particularo en cmo respondera un tratamientoconcreto. en El impactode estecuerpode datosgenticos crecirelaevidente descubrimientos con miento seva haciendo hugentica muchas de enfermedades cionados la base con manas-desde el cncerde mamay el de colon hastala y de diabetes la enfermedad Alzheimer- sobrelas que se Esrpidamente. informandoa un ritmo queaumenta est prometenrevolucionar prcticamla tos descubrimientos paraidentificargenes ende dicafutura,ya quela capacidad fermedades investigarsu funcin haceposibleconcebir e que enmdicas aliviene inclusoprevengan intervenciones fermedades. Perola capacidad identificar genespotencialmente de ticas, perjudiciales tambin aumentalas preocupaciones probablemente portamos unas debidoa quetodosnosotros que riesgos. pocasdocenas genes nos exponena algunos de informacinsele d un mal Existe posibilidad quea esa la de gentica individuos a discriminacin uso-por ejemplo,la por de o gruposde personas partede lascompaas segugubernamentales-. Adems, ros,empleadores agencias o el del humanoaumenta el conocimiento detalle genoma en (vase de potencial utilizartcnicas DNA recombinante de genes la gente, slopara no de Captulo20) paraalterarlos que no funen corregirenfermedades tejidoscorporales Ios sino cionancorrectamente tambinparacambiar genes y para y de delosespermatozoides loslrrlos, por extensin gentica generaciones futuras. de alterarla composicin y cmodeberan regularse son capacidades Cmousaresas que a cuestiones afectan claramente la comunidadcientfien caperotambina todala sociedad su conjunto. Lassecuencias repetidas DNAexplicanparcalmente del eucartcos elgran tamaode los genomas por creadas los estudios sede Adems las dificultades de hudel DNA, el enormetamaodel genoma cuenciacin plantea msimportante: lasgranmano una cuestin Son de de en descantidades DNA que seencuentran lasclulas y superiores simplemente los humanos de otroseucariotas ms de un reflejodelasnecesidades los milesdeveces de geo en bacterianas nesde los que estnpresentes las clulas hay otros factorestambin en juego?Al final de la dcada paracontestar a de 1960 produjoun granpasoadelante se de del estacuestin. cuandolos estudios renaturalizacin DNA llevadosa cabopor Roy Britten y David Kohne conrepetidas del de dujeronal descubrimiento las secuencias DNA. En los experimentos Britten y Kohne,el DNA secorde y sencillas fragmentos sedisocien hebras t en pequeos
por calentamiento. baj entonces temperatura la para Se permitir que los fragmentosde cadena sencillaserenatuLa dependede la ralizasen. velocidadde renaturalizacin de concentracinde cadatipo de secuencia DNA individe dual; cuantoms alta seala concentracin una secuencia de DNA dada,mayor esla probabilidadde que colisiocon ne al azar con una hebra complementaria la que se las puedareasociar. sepuedencomparar propiedaCmo de de des de renaturalizacin las diferentesclases DNA? vamosa considerar DNA derivadode el Como ejemplo, y una clula bacteriana de una clulatpicademamferoque msde DNA. Si estadiferencia el conen contienemil veces diferencias ordendemil veces del tenidode DNA refleja en de entonces DNA el cuantoa lassecuencias DNA presentes, renaturalizar 1.000 veces msdeprise bacteriano debera en saque el DNA de mamfero.El fundamentosubyacente prediccin quecualquier es secuencia esta de el quesebasa debera estarpresente una concenen DNA en particular, msbaja en Ia muestrade DNA de matracin mil veces msde tipos de secuenmfero debidoa que hay mil veces que cadasecuencia particular presentes, manera de en cias pequea Ia poblacin de una total representa fraccinms de secuencias. sus De hecho, cuandoBritteny Kohnerealizaron estula de del dioscomparando velocidad renaturalizacin DNA los con respecto bacterias, resultados a no de mamferos los En fueronexactamente esperados. Ia Figura18.15 rese parala renaturalizacin DNA del sumenlos datosobtenidos se de una terneray el de E. coli;la renaturalizacin repreinicial de DNA senta comouna funcin dela concentracin Esteparmetrode multiplicadopor el tiempo transcurrido. de se la concentracin DNA por el tiempo,o Cor, emplea en lugarde solamente tiempo,porquepermitela comparael a cin directade los datosobtenidos partir de reacciones de a concentraciones DNA. Cuandose realizadas diferentes los de que representan grficos estaforma,los datosrevelan
o n
.N
DNA de E coll
E -u c 0)
DNAde ternera
<40 z o60
c) -('
oon
OUW
o_
100 3 o
1o-2 0.1
10
1o2
103
104
C6r(concentracin DNA x tiempo) de
y de de Figura 18.15 Renatunlizacin DNA temeta de E coli. El que ms que DNA de ternera sereasocia rapidamente el DNA repetidas. bacteriano consiste secuencias en LaorganizacinDNA genomas 579 del en
que de el DNA de la ternera constade dos clases secuencias se renaturalizan a velocidades claramente diferentes. Un tipo de secuenciaque supone aproximadamente el 40o/odeI DNA de ternera se renaturalizams rpidamente (es decir, a valores ms bajos de Cor)que el DNA bacteriano.La explicacin ms sencilla de esteresultado inesperadoes que el DNA de ternera contiene secuenciasde DNA repetidas que estn presentesen mltiples copias. La existenciade copiasmltiples aumenta la concentracinrelativa de tales generando ms colisiones y una velocidad de secuencias, reasociacinms rpida de lo que sera esperablesi la sepresenteen una nica copia. cuencia estuviese El 600/orestante del DNA de ternera se renaturaliza alrededor de mil vecesms despacioque el DNA de E. coli, que es el comportamiento esperadopara secuencias que estn presentesen copia nica. Esta fraccin se denomina repeDNA no repetido para distinguirlo de las secuencias tidas que serenaturalizanms rpidamente.Las secuencias en de DNA no repetido estnpresentes una sola copia por genoma.Lamayoriade los genesque codifican para protenas consistenen DNA no repetido, aunque esto no significa que todo el DNA no repetido codifique para protenas. prcticamentetodo el DNA es En las clulasbacterianas no repetido, mientras que en las eucariticaspresentan grandes variaciones en las proporciones relativas de seEsto proporciona una excuenciasrepetidasy no repetidas. plicacin, al menos en parte, del misterio de la cantidad aparentemente excesiva de DNA en especies como Trillium; esteorganismo contiene una proporcin relativamentealta de Usando las tcnicasde sede secuencias DNA repetidas. cuenciacin descritasanteriormente, los investigadoreshan de determinado la secuencia basesde varios tipos de DNAs repetidos y los han clasificadoen dos categoras:DNA re(Tabla18.3). petido entndemy DNArepetido disperso DNArepetido tndem, Una de las categoras en ms importantes de DNA repetido se denomina DNA repetido en tndem ya que las mltiples copiassecolocan una al lado de la
otra en una fila -es decir, en tndem-. El DNA repetido en tndem supone el 10-15o/o genoma tpico de mamdel feros y consiste en secuenciasde DNA de muchos tipos diferentes que varan tanto en la longitud de la unidad bsica que serepite como en el nmero de vecesque estaunidad La se repite de forma sucesiva. longitud de la unidad repetida puede medir cualquier valor ente 1 y 2.000 pb ms o la menos. Sin embargo,la mayor parte de las veces, unidad repetidaesms corta de 10 pb; consecuentemente, subesta categoriase denomina DNA repetido de secuencia simple.El siguientees un ejemplo (se muestra solamenteuna hebra) de una secuenciasimple de DNA repetido, formado a partir de una unidad de cinco bases, GTTAC: . . . GTTACGTTACGTTACGTTACGTTAC. . . El nmero de repeticionessecuenciales la unidad de de GTTAC puede ser tan elevado como varios cientos de midel Ies,en sitios seleccionados genoma. El DNA repetido en tndem del tipo de secuencias simples se denomin originalmente DNA satIiteporque, en muchos casos, estacomposicin de bases caracterstica hace que aparezcaen una banda satliteque se separadel resto del DNA genmico durante los procedimientos de centrifugacin diseadospara separar molculas por densidad. Esta diferencia en densidad surge como consecuenciade que la adenina y la guanina difieren ligeramente en el peso molecular, de la misma forma en que difieren Ia citosina y la timina; por lo tanto,las densidades los DNAs con dide ferente composicin de bases diferirn. En los procedimientos que revelanbandas satlites, DNA genmico se el corta en pequeos fragmentos y, por tanto, Ios segmentos de DNA de diferentesdensidadesson libres para migrar a diferentesposicionesdurante la centrifugacin. simCulesla funcin del DNA repetido de secuencia ple (DNA satlite)?Puesto que esassecuenciasnormalmente no se transcriben, se ha propuesto que podran ser responsables proporcionar propiedadesfsicasespecfide casa ciertasregionesdel cromosoma. En Ia mayora de los
de repetidas el DNA en eucaritico Tabla 18.3 Categoas secuencias

I. DNA repetido en tndem, incluyendo el DNA repetido de secuenciasimple (DNA satlite) El 10-15o/o la mayora los genomas mamferos de este de de de son tipo Longitud de cadaunidad repetida: por Nmerode repeticiones genoma: Disposicin lasunidades de repetidas: Longitud total del DNA satliteen cadasitio: DNA satliteregular: DNA minisatlite: DNA microsat1ite: II. DNA repetido disperso E125al40o/o la mayorade los genomas mamferosson de estetipo de de
Longitud de cada unidad repetida: Disposicin de las unidades repetidas: Nmero de repeticiones por genoma:
5-10pb paraDNA repetido secuencia l-2.000pb; normalmente de simple 1 0 2l - s o Tndem pb 105-107 pb 102-los p lol-102 b
pb 102-104 por Dispersas todo el genoma <copias> idnticas no 101-106,
580
y el Captulo Base 18 estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo DNA,
cenlas del eucariotas, regiones cromosomadenominadas un trmeros que desempean papelimportante en la disdurante la divisin celular tribucin de los cromosomas (vaseCapitulo sonparticularmente ricasen repeticio19) queestas y secuencias le nesde secuencia simple, esposible propiedades esproporcionen centrmero estructurales al peciales. telmeros, que son secuencias DNA locade Los tambintienen de lizadas losextremos loscromosomas, en En captulo, repeticiones secuencia de simples. el siguiente protegen los cromoa cmo los telmeros aprenderemos dusomasde la degradacin susextremosvulnerables de (vaseFigtra 19.16). teLos rantecada ciclode replicacin entre250-1.500 copias Ia de lmeroshumanoscontienen TTAGGG, cualseha conservado lo extraordinasecuencia riamentea lo largo de cientosde millonesde aosde evoestudiados hastael momenlucin.Todoslos vertebrados idnticas,e incluso los repetidas to tienen secuencias poseen similares. Apaeucariotas unicelulares secuencias talessecuencias crticaspara Ia supervison rentemente, vencia estos de organismos. encontradoen un siLa longitud total del DNA satlite variarenormememente. DNAssatlites Los tio dadopuede a normalmente caenen el rangode longitudde 105 tp_icos a El se l0' pares bases. trminoDNA minisatlite refiere de pares bases londe ms de a de regiones cortas, unas102 10s por en gitud total,compuestas repeticiones tndemde en15 tre aproximadamente y 100pb. LosDNAs rnlcrosatlites, repetidas tienenentreI y 4 pb, son en los quelasunidades nuincluso mscortos(entre10y 100pb por sitio),aunque puedenexhibir la mismasemerosos sitiosen el genoma que en Las cortas repetidas seobservan cuencia. secuencias son extraordinariael DNA minisatlitey microsatlite mentetilesen el laboratorioparael estudiode lashuellas genticas DNA (DNA fingerprint). Esteprocedimiento de en descrito detalle el Anexol8C usaIa electroforesis en en gelde fragmentos restriccin DNA paracompararside del Es de tios distintosdel genoma doso msindividuos. una comoel estumanerade identificar individuostan precisa dio de la huellagentica convencional. Losinvestigadores mdicoshan hechoel descubrimienque genticas to sorprendente que variasenfermedades de al nerviosoimplicancambios el DNA mien afectan sistema De estas enfermedades crosatlite. manerams especfica, de son fcilesde encontrargraciasal nmero excesivo sedentro de un gen que, cuencias trinucletidosrepetidas de repeticiones, seranormal.Un ejemplode de no tenerestas repeestefenmenodenominadoamplificacin tripletes de de tidoslopodemos encontrarenla enfermedad Huntington, que neurolgica devastadora aparece mea una enfermedad y que invariablemente fatal.La versinnores diana edad mal del gendela enfermedad Huntington contiene tride el nucletidoCAGrepetidoen tndementre11y 34veces. Sin poseen los de ms embargo, genes los individuos afectados El delXfrde 100copias esa de unidadrepetidas. sndrome gil qu'e una causa es importantede retrasomental,yla dis-
a trofia miotnica,qu'eafecta los msculos,se encuentran que neurolgicas seoriginan como entrelasenfermedades de consecuencia la amplificacinde otro triplete de seEn enfermedades, secuencias repetidas. algunade estas la en cuenciarepetidaseencuentra una regindel genafectado que no setraduce;en otras,setraduceen un segmento polipeptdicoque consiste una serielarga del mismo en En la de aminocido. amboscasos, severidad la enfermedad con secorrelaciona el nmero de tripletesrepetidos. principal deserepetido disperso.La segunda categora DNA es cuencias DNA repetido, el DNArepetido disperso. de En agrupadas lugar de estardispuesto secuencias en formanrepetidas este de unidades tipo de DNA do un tndem,las por estnesparcidas todo el genoma.Una nica unidad o tiendea tenerunalongitudde cientos inclusodemilesde que y pares bases, sus<copias> dispersas, puedenestar de a similares perono idncientos a miles, o normalmente son suponeentreel ticasa lasotras.EI DNA repetidodisperso 25 y el 40o/o la mayorade los genomas mamferos. de de En humanosy otros primates,una gran porcin del consiste una familiade secuenen DNA repetidodisperso denominadas ciasrelacionadas asl familia Alr4denominada identificadas esta de debidoa que lasprimerassecuencias parala enzimade famiiiacontenan sitio de restriccin un restriccinAlul.Una nicaunidadAlu tieneuna longitud de alrededorde 300 pb y los cientosde miles de unidades humanosuponen msdel 10o/o Alu presentes el genoma en La de del genoma. unidad Alu essimilar,en secuencias baa de ses, un tipo especial RNA implicadoen la sntesis de protenas el retculoendoplasmtico rugoso(comocomen ponentede la partcula reconocimiento la seal, de de traAlu tada en el Captulo 22). Lassecuencias estntambin que protenas algunos presentes regiones codifican de geen que proa nes, dondesepiensa contribuyen Iavariabilidad por Aunquelasrazones lasque el geteicay a la evolucin. tantascopias secuencias de dispersas tales noma mantiene claras, aunquesabemos cmohan surcomoAlu no estn gido tantascopias. Lamayoriadelassecuencias dispersas repetidas miembros unaclase de especial segmentos de son de y DNA quesemueven proliferana lo largodel genoma dejandocopias dondeseparan. movimientos estos all Los de mvilesde DNA, denominados trasposones, elementos genticas las que secreeque contride creanalteraciones El a la adaptabilidad evolutivadel genoma. origeny buyen de los trasposones discutirms amse comportamiento pliamente el Captulo21. en sobrela organizacin DNA del Concluimosestaseccin la apuntandoque aplazaremos discusinsobrealgunosde ms obtenidosa partir de los descubrimientos interesantes moleculary dela secuenciacin DNA -a sadel la gentica del ber,la organizacin DNA que constituyegenes-hasta la de el Captulo21,dondetrataremos estructura los genes en detalle.
|: organizacinDNA genomas s8l del en
A ne x o
L,t nusLLA GENrrcn pe DNA (Di{A FTNGERpRTNT)

EI anlisis los patronesfragmentos restriccinque se de de producencuandosedigiereel DNA con las enzimas de restriccinseha aprovechado para diversos propsitos,que varandesde investigacin la organizacin los genomas la en de prcticas a aplicaciones talescomo el diagnstico de genticas la resolucinde crmenes enfermedades o con violencia.Lasaplicaciones prcticas anlisis los del de fragmentos restriccin,sebasanen el hechode que no hay de (salvogemelos dos personas idnticos)que tenganun juego exactode secuencias bases DNA. Aunquelas diferencias de de entrelassecuencias DNA de dos personas muy de son pequeas, alteranIa longitud de algunode los fragmentos de por DNA producidos lasenzimas restriccin. de Estas diferencias la longitud de los fragmentos, en que sedenominan + DNA enzimas de restriccin polimorfismo de longitud de fragmentosde restriccin (RFLP,del inglsrestrictionfragmentlength polymorphisms) sepuedenanalizar por electroforesis gel.El patrn de en fragmentos resultante sirvecomo nhuellagentica> que identificaa los individuos de los que seha obtenidoel DNA. En la prctica,la tcnicade la huellagentica DNA se del realza tai forma que slo seexaminaun pequeoy selecto de grupo de bandasde fragmentos restriccin.Parailustrar este de punto,la Figura18C.1 resume cmopodrautilizarse huella la gentica DNA paradeterminarsi los individuos son del portadores un genparticularcausante una enfermedad, de de aunquepuedeque todavano exhibansntomas esa de enfermedad. esteejemplo,imagineque los individuos I, II y En III sonmiembros una familiaen la queescomnel gen de
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Fragmentos de restriccin
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Preparacinde fragmentos de restriccin. El DNA se extraede los glbulos blancosprocedentes los de i n d i v i d u ols l l y l l l .S e a a d eu n a , enzimade restriccin lastres a muestras DNA oara oroducirlos de fragmentos restriccin de
!-
etectrotoresis gel. Lasmezclas en Iconlosfragmentos restriccin de de

caoa muestra seoaranoor se electroforesis. Cada muestra forma un patrnde bandas caracterstico (seran muchasms bandasque las que se muestran aqui).
Transferencia. Despus queel cie DNAdelgelse ha desnaturalizado

por calor.las cadenassencillas se por transferen absorcin un papel a especrai.
Lavaoo
+
Sondas radiactivas, aadeuna solucin Se de sondasradiactivas papelde transferencia. del La sondaes una molcula DNA de cadena de sencilla complementaria DNA de inters. al La sondaslose une a las bandasque contienen por el DNA complementario, emparejamiento oe oases, IAutorradiografa.Despusde que se aclare el exceso de sonda,se pone una hojade papelfotogrfico sobreel papelde transferencia. radioactividad La de la sondaligadalmpresiona pelcula la formando una que corresponde las bandasde DNA magen a especrficas. bandascontienen DNA que hibrida Las el con la sonoa,
gentica DNA anlisis RFLP. por Figura 18C.1 Huella de con
582
Capitulo Base 18 estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo DNA, Vel
de Se causante la enfermedad. sabeque el individuo I es pero que el individuo II no, portador del gen defectuoso, genticode su hijo, el y queremos determinarel estatus individuo III. del El pasoclaveen la huellagentica DNA sedenomina Hibridacin de Southern (del inglsSouthernBlotting, desarrollada 1975por E. M. Southern),pero normalmenteel en implica variospasos procedimientode la huellagentica el distintos.En el pasoO de Ia Figura 18C.1, DNA obtenidoa partir de los tresindividuos sedigierecon una enzimade se resultantes separan restriccin.En el paso@,los fragmentos en unos de otros medianteelectroforesis gel.Debido a que el un DNA de cadapersonarepresenta genomacompleto,cientos en si de milesde bandasaparecerlan esteestadio, todasse Aqu esdondehizo su aparicinel golpede hicieranvisibles. brillantezde Southern,con una tcnicaque nos permite distinguir lasbandasde inters.En el procesode hibridacin de Southernpaso@ sepresionacontra el gel terminado,un tipo o especial papel<detransferencio (de nitrocelulosa nylon), de permitiendoque el patrn de fragmentos DNA setransfiera de a al papel.En @, seaadeuna sondaraactiva la transferencia. una molcularadiactivade DNA (o de La sondaessimplemente es de RNA) de cadena sencillacuyasecuencia bases el al estecaso, DNA del complementaria DNA de inters----n gen causante la enfermedad-. La sondaseune a las de de del secuencias complementarias DNA por emparejamiento (el Iasbases mismo procesoque ocurre cuandoel DNA En se desnaturalizado renaturaliza). el paso@, lasbandasque se unen a la sondaradiactivasehacenvisiblespor indican que la versindel gen Los autorradiografia. resultados indiduo II. del hijo concuerda la del parentalsano, con Los autorradiogramas la Figura 18C.2ilustran el uso de de Aqu, el la huellagentica DNA en un casode asesinato. del en encontrada la anlisis los RFLPdeterminaque la sangre de procedede la vctima,implicando al acusado ropa del acusado del en el asesinato. Otra aplicacinprcticade la huellagentica DNA en el realegalesen la determinacinde la paternidado de la maternidad. del U. Ahora, en muchasaplicaciones 1uhuellagentica la cortas DNA, los cientficosanalizan longitud de secuencias (DNA minisatlite)conocidas como nmero variable repetidas de repeticionesen tnden o VNTRs (del ingls,variable parahuella Los number tandemrepeats). sitios\T{TR elegidos gentica DNA varande maneraimportante su longitud de que debido a la diferenciaen el nmero de veces entrepersonas, serepiteIa unidad bsicasecuencialmente. Como resultado,el patrn de VNTRs en el DNA de una personasepuedeutilizar para identificar nicamentea un en individuo. Por ejemplo,el DNA de tres sospechosos un caso podra tener,en cadauno de ellos,un nmero de asesinato diferentede copiasde la secuencia dinucletidosTG en un de del uno podratener 19 copias, otro,2L sitio concreto genoma; en copiasy el tercero32 copias.Lasdiferencias los patronesde de en los fragmentosde restriccinprocederan las diferencias
procedente Sangre del Sangre de Sangre la vctima acusado de la ropa del acusado \ I \ r---------"----l
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Figura18C.2 Huellagentica de un caso de asesinato, EI DNA se aisl a partir de muestrasde sangredel acusadoy se compararon por an:lisiscon RFLR con DNA del acusadoy con DNA de la vctima. El patrn de bandasdel DNA de la mancha de sangrese ajusta al de la vctima, demostrando que la sangrede la ropa del acusadoprocede de la vctima. (Cortesade Cellmark Diagnostics, Inc., Germantown, MD.)
entre dos sitios el nmero de unidadesde TG repetidas, que secortan,msque de la presencia de restriccin o de en ausencia un sitio de corte. como sucede los RFLPs criminales,seexaminaen tradicionales. los casos En el genomade forma rutinariaIa longitud de l3 sitios VNTR diferentes. posibilidad de que dos individuos La presentaran exactamente mismo perfil en el no relacionados de los 13 sitios esaproximadamente una en un milln de billones. de La utilidad de la huellagentica DNA seaumentapor la (PCR,del ingls,polymerase reaccin cadena la polimerasa en de chain reaction),una tcnicaparahacermriltiplescopiasde DNA que sedescribiren el Captulo 19.Empezando DNA con aisladoa partir de una nica clula,la reaccinde PCR seutiliza para sintetizarde forma selectiva millonesde copiasde una secuencia dadade DNA en unaspocashoras,produciendocon facilidadDNA suficientecomo para realizarel anilisisde la huellagentica los 13 sitiosVNTR. De estaforma, unaspocas de al clulas la piel, dejadas tocar un bolgrafoo lasllavesde un de cochepuedenproducir el suficienteDNA paraidentificar a un individuo.
LaorganizacinDNA genomas 583 del en
Empaquetamiento del DNA

La cantidadde DNA que puedeconteneruna clulaesimpresionante, incluso para organismos con genomas dide mensiones modestas. ejemplo,una clulatpica de E. Por coli mide alrededorde I mm de dimetroy 2 mm de longitud,pero puedecontener una molcula DNA (circude lar) con una longitud de unas 1.600mm -DNA suficiente para rodeara la clulamsde 400 veces!-. Lasclulas eucariotas afrontan un desafoincluso mayor.Una clula humana de tamaomedio contienesuficienteDNA como paraenvolver la clulamsde 15.000 a veces. algunamaDe neratodo este DNA debeestar empaquetado eficazmente en las clulas maneraque seaaccesible la maquinariacede a lular,tanto parala replicacindel DNA comoparala transcripcin de genesespecficos. Claramente, empaquetael miento del DNA es un problema que suponeun desaffo paratodaslasformasdevida.Observaremos primero cmo llevana cabolos procariotas tareade organizar DNA esta su y despus consideraremos cmoabordan mismoprobleel ma los eucariotas.
ptocariotas Los empaquetan encromosomas el DNA y en bacterianos plsmdos

Duranteun tiemposepensqueel genoma procariotas de como E. coli erauna molcula<desnuda> la quele faltaba a y cualquierelaboracin que tena slo cantidades triviales que de protenasasociada ella.Ahora sabemos la organia zacindel genomabacterianoesmsparecidaa la organizacinde los cromosomas eucariotasde lo que se haba previamente. pensado Adems, genetistas los bacterianos se referana la estructuraquecontienelo fundamentaldel genomabacteriano comocromosoma bacteriano.
Ctomosomas baeterianos. Generalmente. cromosoma el bacterianoesuna molculade DNA circular,que contiene algunaprotenaunida,localizada una reginespecial en de la cluladenominada nucleoide(Figura18.16). Aunqueel nucleoide estrodeadopor membrana, cromosoma no el bacterianoque resideen estareginforma una masade fibras con aspecto filamentoso, empaquetada forma que de mantieneunoslmitesdiferentes entreel nucleoide el resy to de la clula.El DNA del cromosomabacterianoest superenrollado negativamente yplegadoen una extensa serie debucles quepor trmino mediotienenuna longitud de pb. 20.000 Debidoa quelos dosextremos cada de bucleestn ancladosa los componentes que se enestructurales cuentran en el nucleoide,el superenrollamiento los de buclesindividuales se puede alterar sin influir en el superenrrollamiento buclesadyacentes. de Sepiensaque los buclessemantienenen su sitio por el RNA y lasmolculas proteicas. han obtenidoevidencias Se del papelestructuraldel RNA en el cromosoma bacteriano a partir de estudiosque demostrabanque el tratamiento con ribonucleasa, enzimaquedegrada RNA,liberaaluna el guno de los bucles,aunqueno relajael superenrollamiento. Por otro lado,los pequeos cortes DNA con una todel poisomerasa,relajan el superenrollamientopero no desorganizan bucles. DNA superenrollado forma los El que cadabucle seorganizaen paquetes cuentas de que contieproteicas nen pequeas molculas bsicas anlogas las a (de histonas lasclulas de eucariotas lasquesetrataren la prximaseccin). Las evidencias actuales sugierenque la molculade DNA estenvueltaalrededorde partlculasde protelnabInclusoa partir de Io que sabemos sica. hasta momento, el el cromosoma bacteriano consiste DNA superenrollado en protenas unido a pequeas bsicas plegado dominios y en conbucles.
Nucleoide
'*r':.s*
y"m 0,25 tzs,;
-1,,'-.'
Figura18,16 El nucleoidebactefiano. La micrograffa electrnica de la izquierda muestra una clula bacteriana con un marcado nucleoide, que esla regin donde reside el cromosoma bacteriano. Cuando se rompen las clulasbacterianasselibera el DNA cromosmico de la clula.La micrografia de la derechamuestra que el DNA liberado forma una serie de bucles que se mantienen unidos al armazn estructural del nucleoide (METs).
584
y el Capitulo Base 18 estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo DNA,
bacterianos, Adems de su cromosoma, una cPlsmidos lula bacterianapuede contener uno o ms plsmidos. Los plsmidos son pequeas molculas de DNA circular que porta genestanto para su propia replicacin, como para una o ms funciones celulares(normalmente funciones no esenciales).Lamayora de los plsmidos estnsuperenrollados' dndoles una forma compacta, condensada.Aunque los plsmidos se replican de forma autnoma, la replicacin est normalmente en suficiente sincrona con la replicaun cin del cromosoma bacterianocomo Paraasegurar nplsmidos, ms o menos comparable,de una gemero de En neracin a la siguiente. las clulasde E. coli,sereconocen F plsmidos.Los factores (fertilidad) estnimde tres clases plicados en los procesosde conjugacin,un procesosexual del que trataremos en el Captulo 20. Los factoresR (resistencia)portan genesque confieren a las bacteriasresistencia a las drogas. Por ltimo, los factorescol (colicingeno) compuestosque permiten a las bacteriassecretarcolicinas, matan a otras bacteriasa las que le falta el factor col. Adems, aigunas cepasde E. coli contienen plsmidos crpticos, que no tienen funcin conocida.
H 1. Estasproporciones son extraordinariamente constantes de entre las diferentesclases clulaseucariotas,independientemente del tipo celular o de su estadofisiolgico.Adems de las histonas,la cromatina tambin contiene un grupo de diprotenasno histonasque desempeanuna gran varievercas dad de papelesenzimticos, estructurales,y reguladores.
bsica la estructula de son Losnucleosomas la unidad dela cromatina

El DNA contenido dentro de un ncleo tpico medira un metro o ms de longitud si estuviera completamente extendido, mientras que el ncleo en s normalmente no mide ms de 5-10 mm de dimetro. El plegamiento de tan enorme longitud de DNA en un ncleo que escasiun milln de vecesms pequeo,supone un problema topolgico significativo. Uno de los primeros hallazgossobre el proceso de plegamiento surgi a finales de los aos 60, cuando los estudios de difraccin de rayosX llevadosa cabo por MauriceWilkins revel que las fibras de cromatina purificada tienen una subunidad estructural que se repite que no se Adems,Wilobservani en el DNA ni en las histonassolas. kins concluy que las histonasle imponen al DNA una organizacin estructural repetitiva. En I97 4 se proporcion una pista sobre cmo era la naturalezade esta estructura, cuando Ada Olins y Donald Olins publicaron micrografas electrnicasde las fibras de cromatina aisladasa partir de cidosemclulas,de manera que se evitaban los solventes pleados en 1osprimeros procedirnientosrealizadospara prepararcromatina y examinarlaal microscopio.Las fibras de cromatina vistas de estaforma parecenuna seriede minsculas partculas ancladasuna a otra mediante un filamento fino. Esta aparienciade <collar de cuentas>sugiri que las cuentas estabanhechasde protenas (presumiblemente histonas) y que el fino filamento que conecta las cuentascorresponde al DNA. Ahora nos referimos a cada cuenta junto a su DNA asociado,con el nombre de nucleo s o m a ( F i g u r a1 8 . 1 7 ) .
Partcula ncleodel nucleosoma del
el DNA cromatna en empaquetan Loseucariotas y cf0mosomas

Cuando pasamosde las clulasprocariotasa las eucariotas, empaquetar el DNA se vuelve ms complicado. Lo primemaro es que estnimplicadas cantidadessustancialmente yores de DNA. Cada cromosoma eucariotacontiene una nica molculade DNA lineal de tamao enorme.En lascde molcuias por ejemplo,sIottnade estas lulashumanas, puedetener l0 cm o ms de largo,aproximadamenDNA te unas cien vecesel tamao de la molcula de DNA encontrado en un cromosoma tpico bacteriano.En segundo lugar se introduce una mayor complejidad estructural mediante la asociacindel DNA eucaritico con mayor cantidad y nmero de protenas.Cuando se une a estasprotenas,el DNA seconvierte en fibras de cromatina que miden de 10 a 30 nm de dimetro' que normalmente estn dispersasen el ncleo. En el momento de la divisin celular (y estasfibras se condensany en otras situacionesespeciales), se pliegan en estructuras compactas,mucho mayores,en los donde sehacenreconocibles cromosomas individuales. La protena que tiene el papel ms importante en la estructura de la cromatina son las histonas, un grupo de protenas relativamente pequeas cuyo contenido elevado en aminocidoslisina y arginina lesaporta una fuerte cargapositiva. La unin de las histonas al DNA, que estcargado neademspor puentesinicos.En la gativamente, estabiliza se mayora de las clulas,la masa de histonas de la cromatina es aproximadamenteigual a la masade DNA. Lashistonas sedividen en cinco grupos principales, designadoscomo H1' IH2A,H2B, H3 y H4. La cromatina contiene aproximadamente igual nmero de molculas de histonas H2A,H2B,H3 yH4y cerca la mitad de esacantidad de molculas del tipo de
-o"o5til
Figura 18.17 Nucleosomas.Laspartculasdel ncleo del espaciadas a en parecen estructuras forma de cuentas nucleosoma intervalos regularesa lo largo de las fibras de cromatina. Un nucleosoma sedefine por incluir una partcula central o del ncleo y un tramo de DNA que la conectaa la siguientepartcula central
(MET). delDNA Emoaouetamiento 585
Basndonos solamente la microscopa en electrnica habrasido diffcil determinarsi los nucleosomas un son componentenormal de la cromatinao un artefactogenerado durantela preparacin la muestra. de Afortunadamente,DeanHewishy LeighBurgoyneinformaron, casial mismo tiempo y con evidencias independientes, la exisde tenciade una estructurarepetitivaen la cromatina;descubrieron que los ncleosde las clulas hgadode rata del contenan una nucleasa capaz cortar el DNA en fibrasde de cromatina. un grupo de experimentos En crucial, inestos vestigadores expusieron cromatina esta la y a nucleasa purificaron el DNA parcialmente para retirar las degradado protenas la cromatina. de Cuandoexaminaron DNA puel rificado,por electroforesis gel,encontraron patrn de en un fragmentos distintos,en el que el fragmentomspequeo de DNA medaalrededor 200pb de longitudy los fragde mentosrestantes eran exactamente mltiplos de 200 pb (Figura18.18).Ya la digestin DNA libre de proteque de naspor la nucleasa, generaba patrndefragmentos, no este que (1) las protenas la cromatinaestn concluyeron de agrupadas lo largo de la molculade DNA con un patrn a regularque serepite a intervalosde aproximadamente 200 pb,y (2) que el DNA Tocalizado entreestos gruposde protenasessusceptible ser digeridopor la nucleasa, de proporcionando que fragmentos tienenunalongitudmltiplo de 200pb. plantearon cuestin si losgruEstas observaciones la de pos de protenas los que sehabapostulado de que aparecana intervalos 200pb secorrespondan laspartde con culasesfricas observadas las micrograffas en electrnicas delasfibrasde cromatina. Contestar esta a cuestin requera una combinacin abordajes la cuestin de a comoeran
la digestin con nucleasay la microscopa electrnica.En estosestudios, la cromatina se expona brevemente ala nucleasade micrococcus, una enzima bacteriana que, como la nucleasa del hgado de rata, corta el DNA de la cromatina a intervalos de 200 pb. Entonces, la cromatina fragmentada se separabaen fraccionesde varios tamaos por centrifugacin y se examinabaa microscopa electrnica.Se encontr que la fraccin ms pequea contena partculas esfricassolamente,la siguiente fraccin contena grupos de dos partculas, la siguiente fraccin tena grupos de tres partculas,y as sucesivamente(Figura 18.19). Cuando se
..',,. ...! I
A
.o _o
C c
Cromatina
t_ Tratamiento nucleasa con

I I Cromatina parcialmente degradada
Eliminar protenas las de la cromatina
Tamao (enpares de bases)
'o
I
Figura18.19 Pruebade la existenciade nucleosomas. La cromatina que haba sido parcialmente degradadacon nucleasade micrococo sefraccion por centrifugacin en gradiente de densidad (grfico central). Los picos individuales se analizaron entoncespor microscopa electrnica (abajo) y por electroforesisen gel, tras eliminar las protenas de la cromatina (arriba). El pico de la derechaconsisteen partculas individuales de protena asociadas con 200 paresde baJes DNA, el pico centralconsiste grupos de en de dos partculas asociadas con 400 paresde basesde DNA y el pico de la izquierda consisteen grupos de tres partculas asociadas con 600 paresde basesde DNA. Esto indica que la unidad bsica repetida de la cromatina esuna partcula de protena asociadacon 200 paresde basesde DNA.
Fragmentos DNA de
por Anallzar electroforesis gel en
Figura18.18 Pruebade que las protenasse agrupana intervalosde 200 paresde basesa lo largo de la molculade DNAen las fibras de clomatina, En estoserperimentos se analizaron por electroforesis en gel fragmentos de DNA generadospor digestin con nucleasaa partir de cromatina de hgado de rata. El descubrimiento de que los fragmentos de DNA son multiplos de 200 pb sugiereque las histonas seagrupan a intervalos de 200 paresa lo largo del DNA confiriendo por ello un patrn regular de proteccin contra la digestin por nucleasa.
586
por y fracciones seanalizaba elecaislaba DNA de estas el de troforesisen gel,el DNA procedente la fraccinquecontena slo partculasmeda200 pb de largo,el DNA de la fraccin que contenalos grupos de dos partculasmeda se a00 pb de largo,etc.De estoshallazgos concluyque en observadas las milas partculasesfricas cadauna de a estabaasociada 200 pb de DNA. electrnicas crografas Estaunidad bsicarepetida,que contieneaproximadacon una partculaproteimente 200 pb de DNA asociado ca,esel nucleosoma. por est formado un octmero El ncleodel nucleosoma de histonas moleculardel Los primeros indicios sobrela organizacin y proceden trabajode Kornberg suscoladel nucleosoma paraensamblar quienes tcnicas desarrollaron boradores, purificadas DNAyprode a nucleosomaspartir demezclas que fibrasde crotena.Descubrieron sepodangenerar el por mezclando DNA matina compuestas nucleosomas cuandointentaronusar Sin conlascincohistonas. embargo, purificadas maneraindividual,descubrieron de lashistonas cuandosehaban quelos nucleosomas seensamblaban slo que suaves dejapurificado las histonasmediantetcnicas ban a la histonaH2A unida a la histonaH2B,y la histona H3-H4 complejos H3 unidaa la histonaH4. Cuandoestos ficon el DNA, sereconstituan yH2A-H2B semezclaban nornucleosomal de cromatinacon una estructura bras de mal.Portanto,Kornbergconcluyquelos complejos hisy H2A-H2B eran una parte integral del tonas H3-H4 nucleosoma. de con Parainvestigar mayorprofundidadla naturaleza histonas, Kornbergy su colega, entrelas las interacciones con trataronla cromatinaaislada un reactiThomas, Jean entre molculas covalentes vo qumico que forma enlaces del proteicas localizadas al ladode otra.Despus tratauna qumicamiento con estereactivo,las protenasancladas por en menteseaislarony analizaron electroforesis gel de proteicos, en poliacrilamida. a Con respecto los complejos de se talesgeles hizo patenteel tamaode ocho molculas connucleosomales que laspartculas histona, sugiriendo Unavezquesesupo de tienenun octmero ochohistonas. H2A-H2Bformaban quelashistonas H3-H4 y lashistonas cuatro histoy complejosunidos estrechamente que estas en aproximadamente cantidades nas estabanpresentes en equivalentes Ia cromatina,Kronbergy Thomaspropuparamanse de sieronquelos octmeros histonas creaban y H3-H4, H2A-}J2B dosdmeros tenerjuntosdosdmeros alredey que la doble hlicede DNA seenvolvaentonces (Figura18.20). resultante dor del octmero est Un temano tratadopor el modeloprecedente relaHl, queno forma de con cionado la importancia la histona individualesseaisparte del octmero. los nucleosomas Si de la lan digiriendorpidamente cromatinacon la nucleasa (junto a las presente la micrococcus, histonaHl todavaest
.Cuenta" de nucleosoma (B molculas histonas de
l',Xl#1033'i'"1"*o
con mayol Figura18.20 La estructuradel nucleosoma detalle, Cada nucleosomaconsisteen ocho molculasde histona (dos de cadauna de las histonas }{ZA,HZB, H3 y Ha) asociadas con 146 paresde nucletidos de DNA y un tramo de DNA espaciador de aproximadamente 50 paresde nucletidos de longitud. El del dimetro de las <cuentas> nucleosoma o partcula central es de alrededor de l0 nm. Secree que la histona Hl (no representada)se une al DNA espaciadory facilita el empaquetamiento de los nucleosomasen fibras de 30 nm.
y la otrascuatrohistonas a las200pb de DNA). Cuando difragmento de gestin llevaa cabodurantemstiempo,el se hastaque alcanza una longitud DNA sesiguedegradando finales 146 del de aproximadamente pb; durantelos pasos proceso digestin, liberala histonaH1. La partcula de se asociado un de de a quequedaconsta un octmero histonas DNA de 1a6pb sedenominapartculacentralo ncleodel la durante digestin de EI nucleosoma.DNA quesedegrada de200a 146pb de longitud sedenominaDNA espaciador, (Figura18.20). al bido a queune un nucleosoma siguiente que Hl de Puesto la histona seliberacomoconsecuencia la que lasmolse del degradacin DNA espaciador, piensa a regin. longiLa asociadasesta culasde histonaHl estn pero tud del DNA varaun tantoentreorganismos, el DNA siempremide cercade al asociado ncleo del nucleosoma alrededor comoparaenrollarse 146pb,lo queessuficiente 1,7 centralaproximadamente veces. de la partcula paraformatfibms de se Los nucleosomas empaquetan y cfomatna clomosomas es La formacin de nucleosomas slo el primer pasoen el Las del empaquetamiento DNA nuclear(Figura18.21). fibras dispuestas <collarde cuentas> en mide cromatinaaisladas la unos 10 nm de dimetro,pero,con frecuencia, croden intactas forman una fibra ligeramente matina de lasclulas denominada fibrade gruesa, unos30nm de espesor, ms de de nm. En preparaciones cromatinaaislacromatina de 30 da,lasformasde i0 y 30 nm de cromatinasepuedeninterde de Ia convertircambiando concentracin sales la solucin. no seforma en preparaciola Sin embargo, fibra de 30 nm
Emoaouetamiento delDNA 587
Doblehlice DNA de
I,.'
l,o.'
ill("'
nucleosoma
Hisronas==-Si "Cuenta"de
(a) Nucleosomas ("collarde cuentas")
(b) Fibrade cromatina 30 nm de
.-----lAN
Nucleosoma
I,,.'
"' l.oo
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(c) Dominios bucle en
J/nl Mla!^n"
Dominio en oucte
(d) Heterocromatina
J^,., m
Cromtidas
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"' l,ooo
(e) Cromosoma duplicado, altamente condensado, unaclula divisin de en Figuta18.21 Niveles empaquetamiento la cromatina, Estosdiagramas METs muestranun modelo actualde los estadios de de y progresivos de enrollamientoy plegamientode DNA, que culminan en el cromosomaaltamentecompactadode una clu1a divisin. (a) <Collarde en cuentas), una configuracinextendidade nucleosomas formado por 1aasociacin DNA con cuatro tipos de histonas.(b) La fibra de de cromatinade 30 nm, representada aqu como una agrupacinde nucleosomas estrechamente empaquetados. quinta histona,Hl, podra La localizarse el interior de la fibra. (c) Dominios en forma de bucle de fibras de 30 nm visiblesaqu a MET ya que un cromosomamittico en (d) seha desenrollado experimentalmente. Heterocromatina, cromatinaaltamenteplegadaque esvisible como puntos diferenciados incluso (e) en clulas interfase. Un cromosomareplicado(dos cromtidas en unidas) de una cluiaen divisin,con todo el DNA del cromosomaen forma de heterocromatina altamente comoactada.
s88
Captulo Base 18 estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo DNA, v el
de nesde crornatina lasquesehan retiradolasmolculas en H1, sugiriendoque la histonaHl facilita el empaquetaen miento de los nucleosomas fibrasde 30 nm. Sehan propuestovariosmodelosparaexplicarcmo los nucleosomas para individuales empaquetan formar una fibra de 30nm. se La mayoriade los primerosmodelosproponanque la cagirabasobres mismaparaformar aldenade nucleosomas estudios reSin gn tipo de estructuraenrollada. embargo, que la estructurade la fibra de 30 nm es cientessugieren el mucho menosuniforme de lo que sugiere modelode enparece que los nucleosomas de rollamiento.En vezde esto, queformaban de la fibra de30nm seempaquetaban manera irregular, forma de zigzag en tridimensional, una estructura que puedeinterdigitarse susfibrasvecinas. con de nivel de empaquetamiento la cromatina El siguiente esel plegamientode las fibras de 30 nm en dominios con y entre50.000 100.000 buclesquetienenaproximadamente por se pb de longitud.Estadisposicin bucles mantiene en peridicodel DNA a una red insoluble de el acoplamiento que protenas histnicas, forman tn andamiajeproteino mslargosdel DNA. Los doco al cualseunen los bucles se miniosconbucles vencon mayorclaridaden micrograde de fas electrnicas cromosomas clulasen divisin que aislados sehan tratadoparaeliminartodaslashistonas y la mayorade las protenasno histnicas(Figura 18.22). especialien tambinseobservan cromosomas Losbucles con zadosno asociados el procesode la divisin celular (vase discusin politnicos del la sobrelos cromosomas los de casos, bucles cromatinaconCaptulo23).En estos de tienen regiones<activas> DNA -es decir,DNA que se esttranscribiendo-. Eslgicoqueel DNA activoestempaquetado manerams compactaque el DNA inactivo de ima debidoa que assele facilitarael acceso lasprotenas gnica. plicadas la transcripcin en se en Inclusoen lasclulas lasquelos genes estntransde cantidades significativas crocribiendode maneraactiva, (Figura18.21d). El muy compactadas matinapueden estar grado de plegamientoen estas clulasvaria de forma confuertede tinua. Los segmentos cromatinacompactados queaparecen en comopuntososcuros lasmicrogramente fassedenominaheterocromatina,mientrasque la forma se de cromatinams difusay menosempaquetada deno(vaseFigura La heterocroma18.26a). mina eucromatina contieneDNA que es densamente tina ms empaquetada mientrasque Ia eucromatiinactivotranscripcionalmente, ms laxamentese asociacon DNA que na empaquetada La estsiendotranscrito activamente. mayoriade la croestnempaactivas metablicamente matina en lasclulas pero a mequetadas laxamente, forma de eucromatina, en dida que la clula se prepara para dividirse, toda esa generando grupo de un cromatinasevuelvemuy compacta, Debidoa queel distinguibles microscopio. al cromosomas cada DNA del cromosomaseha duplicadorecientemente, denode duplicadas cromosoma compone dosunidades se (Figura18.2 1e). minadas cromtidas
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que elecfnica muestra armazn el figwa L8.22 Micrografia proteico queda eliminar histonas loscromosomas que de tras las unido al armazn se humanos.El DNA cromosmico mantiene largos. flecha La seala regindonde una comounaseriedebucles de puede verse claramente bucledela molcula DNA (MET). un Usando el ndice de empaquetamiento del DNA sepuede cuantificar la medida en la que sepliega una molcula de DNA en la cromatina y en los cromosomas.Estendice determina la longitud total de una molcula de DNA extendida dividida por la longitud de la fibra de cromatina o del cromosoma en el que se ha empaquetado.El enrollamiento inicial del DNA alrededor de los ncleos de histona de los nucleosomas reduce Ia longitud por un factor de aproximadamente siete,y la formacin de la fibra de 30 nm tiene como resultado una condensacinde seisvecesms. El ndice de empaquetamientode la fibra de 30 nm es por tanto de aproximadamente 7 X 6 : 42.Unplegamiento y un enrollamiento posterior proporcionan el ndice de empaquetamiento total de la eucromatina tpica en aproximadamente T50.Paralaheterocromatinay para los cromosomas de las clulas en divisin, el ndice de empaquetamiento es todava superior. Por ejemplo, en el momento de la divisin celular, un cromosoma humano tpico mide alrededor de 45 mm de longitud pero contiene una molcula de DNA que podra medir casi 75 mm si se extendierapor completo. El ndice de empaquetamiento para un cromosoma de este tipo cae en el rango de 15.000a 20.000.
Emoaouetamiento delDNA
589
Loseucadotas tambin empaquetan desu DNA algo en y mitocondilascloroplastos No todoel DNAdeunaclula eucariota incluidoenel est
ncleo.Aunqueel DNA nuclearcontienela mayorpartede la informacin gentica la clula,las mitocondriasy los de cloroplastos tambin contienenalgo de DNA, junto a la para replicar,transcribir y traducir maquinaria necesaria por la informacincodificada ste. molculas DNA Las de queresiden lasmitocondrias en los cloroplastos en y estn (Fiy desprovistas histonas normalmente circulares de son gura 18.23). otraspalabras, parecen genoma las En se al de bacterias, comoseesperara probable del origenendosimbitico de estosorgnulos(tratado en el Cuadro de Texto 11A).Los genomas las mitocondrias los cloroplastos y de pequeos, tiendena serrelativamente comparables taen mao a un genomaviral. Adems, ambosorgnulos son polipptisemi-autnomos, capaces codificaralgunos de dos,pero dependen genomanuclearpara codificarla del mayora ellos. de Por ejemplo, genomade las mitocondrias el humanas consiste una molculade DNA circularque contiene en pares bases mide cerca 5 mm delongitud.Se y 16.569 de de ha secuenciado y completamente,seconocen 37 genes. sus por El RNA y los polipptidos codificados esteDNA son slounapequea fraccin(deaproximadamente el50lo) del para nmerode molculas RNA y protenas de necesarias la mitocondria. embargo, esuna contribucingeSin sta nticavital, entrecuyos productos incluyen molcuse las lasde RNA presentes los ribosomas en mitocondriales, topara daslasmolculas RNA de transferencia del necesarias proteicamitocondrial, 13 de las subunidades y la sntesis polipeptdicas sistema transporte electrones. del de de Esto
r-:-f.i:?n.*:
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Figura18.23 DNAmitocondrial. El DNA mitocondrial de la mayora de los organismoses cicular, como seve en esta micrografiaelectrnica. Estamolculafue fijada durante el proceso de replicacin. Las flechas indican los puntos en los que seestaba desarollando replicacincuando sefij la molculapara la MicroscopaEiectrnica(MET).
incluyesubunidades NADH deshidrogenasa, de citocromo (Figura18.24). y b, citocromoc oxidasa AIP sintasa El tamao del genomamitocondrialvaria consideraentreorganismos. blemente Generalmente, mitocondrias las de los mamferos tienenalrededor 16.500 de DNA, de pb queel DNA de lasmitocondrias la levadura mientras de es aproximadamente cinco vecesmayor y el DNA mitocondrial de plantas inclusomayorque eso. embargo, es Sin no est claroquelosgenomas mitocondriales grandes ms copara difiquennecesariamente un nmerode polipptidos
tRNAPhE
tRNAGI, lGenes de RNAribosmico IGenes de RNAde transferencia

TRNALCU
lComplejo I Genes de la NADHdeshidrogenasa nComplejo lll Genesdel Coenzima c Q-Citocromo r !Complejo lV Genes de Ia citocromo oxidasa c !Genes de la ATPsintasa E DNA no codificante
tRNA^'V
tRNA''E
TRNAGIY TRNAIVEI IRNA''P TRNAAIA tRNA^'P TRNACYS
TRNALCU tRNAS"' tRNAHI.
TRNATY'
TRNASE' TRNALEU TRNALYS
Figwa L8.24 El genomade la mitocondriahumana. La molcuia de DNA de doble cadenade la mitocondria humana escirculary contiene16.569 paresde bases. Estegenomacodificapara molculasde RNA ribosomal grandesy pequeas,para molculas de RNA de transferencia(RNAI) (cadauno identificado con una abreviatura de tres letras cue corresponde aminocido al que transporta), y subunidadesde varias de las protenas que componen los complejos del sistemade transporte de electrones mitocondriales. Los genesde los RNAt son muy cortos porque las molculas de RNA que codifican contienen slo alrededor de 75 nucletidos. Obsrvese que hay dos genesde RNAI para la leucina y dos para Ia serina; stoscodifican versionesligeramente diferentesde RNAI para esosaminocidos.El genoma mitocondrial esextremadamentecompacto y con poco DNA no codificante entre los senes.
s90
del la longitud. Por ejemplo, comparacin a equivalente esa que DNA mitocondrial de la levaduray humanos,sugiere presente la mitocondriade en la mayoradel DNA adicional no en consiste secuencias codificadoras. la levadura poseenmolculasde Normalmente,los cloroplastos bp 120.000 delongitud DNA circulardeaproximadamente Adems RNA ribosmico del unos 120genes. quecontiene en implicados la sny y detransferencia delospolipptidos tambincodidel genoma cloroplasto el tesis protenas, de de implicados maneftcaparaunnmerode polipptidos incluyen varios en ra especfica la fotosntesis.stas Iy de polipeptdicos losfotosistemas II y una componentes carboxide delasdossubunidades la ribulosa1,5-bifosfato la lasa, enzimaquefija carbonoen el ciclode Calvin. codificade mayora los polipptidos Curiosamente,la cloo mitocondriales por losgenomas dospor losgenomas que multimricas de son roplsticos componentes protenas por codificadas el genoma subunidades tambincontienen que de las En nuclear. otraspalabras, protenas los orgnulos de codificadas steson normalsubunidades contienen hbridos que contienenpoliproteicos mente complejos dentro del orgnuloy y pptidoscodificados sintetizados y nuclear quesesinpor polipptidos codificados el genoma cuestioEsto citoplsmicos. plantea por tefizan ribosomas sobrecmo entranen el orgnulolos polinesintrigantes el un en pptidos sintetizados el citoplasma, temasobre que en volveremos el Captulo22.
El ncleo
Hastael momento,en estecaptulohemostratado al DNA al comoa un de comoel materialgentico la clula, genoma de juegocompletode instrucciones DNA paralasclulas de comoIa manera y en una especie particular, al cromosoma Ahora el ffsicade empaquetar DNA dentro de las clulas. llegamosal ncleo, el lugar dentro de la clula eucariota y y los dondeselocalizan sereplican cromosomas dondese el Adems, ncleoes' transcribeel DNA que contienen. tanto el almacnde la mayorade la informacin gentica de de la clula,como el centrode control parala expresin esainformacin. y ms prominentes caEl ncleoesuno de los rasgos (Figura 18.25). Reeucariotas de ractersticos las clulas verdadesignifica<ncleo cuerdeque el trmino eukaryon de esencia una clulaeucariotaes su ro>. La verdadera que las de ncleorodeado membrana, compartimentaliza del actividades genoma-tanto la replicacincomo la transcripcin- del restodel metabolismocelular.En la sien primeronoscentraremos la envuelta guiente discusin, Despus, desque membranosa forma loslmitesdel ncleo. hacialos porosqueperforanla atencin nuestra viaremos enrrelta, haciala matriz estructuraldel interior del ncleo, haciala distribucin de Ia cromatinay finalmentehaciaIa proporciona una La del organizacin nucleolo. Figura18.26 nucleares. estructuras de general algunas estas de visin
(a) Ncleode una clulaanimal
5pm
(b) Ncleode una clulavegetal
5 m
estructural prominente en la mayora de las clulaseucariticas.(a) Ncleo (N) de Figura18,25 El ncleo, El ncleo esuna caracterstica productora de insulina del pncreasde rata; de ah la prominencia de los grnulos de secrecin(SG) en una clula animal. Esta esuna clula (P) refleja su el citoplasma. (b) Ncleo (N) de una ciula vegetal.sta esuna .1u1"de un ndulo de ruz de soja.La prominencia de plstidos almidn (METs). papel en el almacenamientode grnulos de
Elncleo
591
por El ncleoest rodeado unaenvuelta nuclear doble de memblana La existencia una membranaalrededor ncleosesude del giri por primera veza finalesdel siglorux.Antesde la llegadadel microscopio electrnico conoca pocosobrela se estructurade estelmite membranoso que la microscoya pa pticalo mostrabasolamente como un lmite borroso en la superficieexternadel ncleo.La microscopa electrnicadetransmisinrevelqueel ncleoestaba rodeado por -la una envueltanuclearcompuesta dosmembranas por membrananuclearinternay externa- separadas el espor pacio perinuclear que mide alrededorde 20-40nm de un extremoa otro (vase Figura 18.26b). Cadamembranatiene entre7 y 8 nm de espesor muestra mismaaparieny la cia trilaminar que muestranla mayorade las otras membranas celulares. membrana nuclear interna se apoya La sobreuna red de fibras de soportedenominadas lmina (de nuclear la quesetratarmstardeen este captulo). La membrananuclearexternacontina con el retculo endoplasmticoproporcionandocontinuidad entre el espacio perinucleary el lumen del RE.Al igual que las membranas del RErugoso, membranaerternaest frecuencia la con cu-
bierta de ribosomasimplicadosen la sntesis protenas. de En algunasclulas, filamentosintermediosdel citoeslos queleto celular se extiendendesdela mdmbrana externa haciael citoplasma, anclandoel ncleoa otros orgnuloso a la membranaplasmtica. Una de las caractersticas distintivasde la envuelta ms nuclear esla presencia aperturasespecializadas, de denominadaslos poros nucleares,que son especialmente fciles de observarcuandoseexaminala envueltanuclearpor criofractura(Figura18.27). Cadaporo esun canalcilndrico pequeoque seextiendea travsde ambasmembranas dela envuelta proporcionandoascontinuidadennuclear, tre el citosoly el nucleoplasma, espacio el interior del ncleo(aparte la regindel nucleolo). densidad pode La de ros (es decir, nmero por unidad de rea de envuelta nuclear)vara de forma importante con el tipo de clulay la actividad. ncleode mamferos Un tpico,tiene entre 3.000y 4.000poros,o entre I0 y 20 porospor micra cuadrada. En cadaporo, las membranas internay externade la erurreltanuclearsefusionan,formando un canalque est alineadocon una estructuraproteicaintrincada denomiMembrana nuclear externa Membrana ,.",",," nucrear Lminanuclear nuclear interna ] Nucleolo Cromatina Espacioperinuclear
Ribosomas
(a)
1.m
Figura18.26 Organizacin estructulal del ncleoy de la envuelta nuclear. (a) Micrografa electrnicadel ncleo de una clula heptica de ratn con las caractersticas estructuralesprominentes marcadas(MET). La envuelta nuclear consisteen unu dobl" membrana perforada por poros nucleares(NP). Las estructuras internas incluyen el nucleolo (nu), eucromatina (eu) y heterocromatuna (he). (b) Dibujo de un ncleo tpico. Las r caractersticas estructuralesincluidas aqu pero no visibles en la micrografia incluyen la lmina nuclea los ribosomas en la membrana nuclear externay la continuidad entre la membrana nuclear externay el RE rugoso.
Poros nucleares CrrosoL
RErugoso
(b)
592
(a) Porosnuclearesen la envuelta
O,25 L.m
Figuta L8.27 Porosnucleares. En estamicrografla de criofiactura de la envuelta nuclear de una clula epitelial del rin de rata se ven numerosos poros nucleares(NP). El plano de fractura revelacaras tanto de la membrana interna (A) como de la membrana externa (B). Los bordes que sealanlas flechasrepresentanel espacio perinuclear delimitado por las dos membranas (MET).
Membrana externa de la envuelta Transportador nuctear Fibra
Retculo endoplsmico Ribosomas CITOSOL
nadael compleio delporo nuclear (CPN). El dimetrodel complejode poro en su conjunto esde unos 120nm. Tiene una masaglobaldeunos 120miilonesde daltonsy conspolipepde de diferentes subunidades ta de docenas clases la tdicas.En las micrograftaselectrnicas, caracterlstica msllamativadel complejode poro esla disposicinoctoLas como las de la gonalde sussubunidades. micrografias, dismuestrananillos de ocho subunidades Figura 18.28a, puestas siguiendoun patrn octogonal.En otrasvistas,se tanto por el sobresalen observaque las ocho subunidades Fde como nucleoplsmico la envuelta. lado citoplsmico jeseen queseobservan grnuloscentrales algunos los en de Aunque complejosde poro nuclearde la Figura 18.28a. grnuloseran hubo un tiempo en el que sepensque estos repartculas trnsitoa travs losporos,lasevidencias de en cientessugierenque son parte integrantedel complejo de poro. Aparentemente pierden con facilidad durante el se paramicroscopa. procesamiento lasmuestras de La Figura 18.28bilustra los principalescomponentes del complejode poro nuclear.El examende estediagrama revelaque el complejode poro en su conjunto tieneforma nuclear.Dos anillos de ruedapuestade lado en la envuelta
de (b) Localizacin los poros nuclearesen la membrananuclear Figura18.28 Estructuradel poro nuclear. (a) La tincin negativa de una envuelta nuclear de un oocito revela el patrn octogonal de los complejos de los poros nucleares.La flecha sealaun grnulo central. Esta envuelta nuclear procede de un oocito del tritn Tarichagranulosa(MET). (b) Un poro nuclear se forma por la fusin de las membranas nuclearesinterna y externa y estcontorneado por una intrincada estructura proteica denominada complejo del poro nuclear. La estructura tiene aproximadamente forma de rueda y simetra octogonal. Dos anillos paralelos formados cada uno por ocho subunidades (morado oscuro) delimitan el borde de la rueda. Ocho radios (verde) conectan los dos anillos (dos de los radios se han omitido en el dibujo) y se extienden hacia el transportador central (rosa oscuro) en el eje de la rueda; el transportador podra ser una estructura similar a un diafragma que se abre y se cierra para permitir el paso de partculas de diferentes tamaos. Las protenas que se extienden desdeel ensamblajedel borde y los radios hacia el espacioperinuclear probablemente ayudan a fijar el complejo a la envuelta nuclear. Hay fibras que se extienden por encima y por debajo del complejo formando las del lado nucleoplsmico una cestade funcin desconocida, El complejo del poro nuclear podra consistir hasta de cien polipptidos diferentes.
Elncleo
593
paralelosperfilan el borde de la rueda, cada uno consta de las ocho subunidadesque sevean en las micrografaselectrnicas.Ocho radios (en verde) seextiendendesdelos anillos hacia el centro de la rueda (rosa oscuro), que forman el grnulo central que se observabaen las micrografas electrnicas.A estegrnulo sele denomina normalmente transportador ya que se piensa que mueve macromolculas a travs de la envuelta nuclear. Se cree que las protenas que se extienden desde el borde hacia el espacio perinuclear ayudan a anclar el complejo de poro a la enr,'uelta. Adems, las fibras se extienden desde los anillos hacia el citosol y hacia el nucleoplasma,las que estn del lado del nucleoplasma forman una cesta (a la que a vecesse denomina <jaulu o <red>).
y Lasmolculas entran salen ncleo tlavs del a de losporos nucleafes

La enr,rreltanuclear es tanto la solucin de un problema como la fuente de otro. Es una manera de localizar los cro-
mosomasen una parte de la clula,y esun ejemplo de la estrategia general eucariota de compartimentalizacin. Presumiblemente, para el ncleo es ventajoso poseer una barreapara mantener en el interior a los cromosomasy para dejar fuera a orgnulos como ribosomas,mitocondrias, lisosomasy microtbulos. Por ejemplo, la envuelta nuclear protege a los RNAs recin sintetizados de la actuacin de los orgnulos citoplasmticosy de las enzimasantesde que se haya procesadopor completo. Al mismo tiempo que protege a los cromosomasy a las molculas de RNA inmaduro de la exposicin al citoplasma, Ia enl'uelta nuclear crea en las clulaseucariotasproblemas formidables de transporte, desconocidospara los procariotas.Todaslas enzimasy otras protenasrequeridas parala replicaciny transcripcin del DNA en el ncleo, se deben importar desdeel citoplasma,y todas las molculas de RNA y los ribosomas parcialmente ensambladosque se proteica en el citoplasmasedeben necesitanpara la sntesis obtener del ncleo (Figura 18.29). En respuesta a estos problemas de transporte, se han desarrollado unos poros
y Transcripcin procesamiento RNA del DNA
Replicacin cromosmica
--L-\e 6/
^+
Protenas necesarias Protenas necesarias parala replicacin parala transcripcin cromosomrca Sntesisde protenas en crecimeto
CITOPLASMA
g
Protena terminada
Figura18.29 Transporte maclomolecular haciay desdeel ncleo. Dado que 1as clulas eucariticas almacenan informacin gentica el su en ncleo pero sintetizan protenas en el citoplasma,todas las protenas que senecesitanen el ncleo deben ser transportadashacia el interior desdeei citoplasma(flechas moradas), todaslas molculas RNA y subunidades y de ribosmicas necesarias para la sntesis protenas el de en citoplasma deben ser transportadashacia el exterior desdeel ncleo (flechasrojas). Las tres clases molculasde RNAr que serequieren de para la sntesisde protenas son el RNA ribosmico (RNAI), el RNA mensajero (RNAm) y el RNA de transferencia(RNAI).
594
y el Captulo Base 18 estructural la informacin de celuiar: cromosomas ncleo DNA,
median todo el transque, especializados prcticamente, porte al interior y al exteriordel ncleo. una idea de cuntotrfico viaja a travs Parahacernos el consideraremosflujo delassubude losporosnucleares, Los desde ncleoal citoplasma. riel ribosomales nidades en bosomasestnparcialmenteensamblados el ncleo es cada de como dosclases subunidades, una de lascuales se Estassubunidades un complejo de RNA y protenas. para y se haciael citoplasma cuando necesitan sinmueven tetizar protenas,se combinan en ribosomasfuncionales de que contienen una subunidad cadatipo. Una clulade mamferoen crecimientoactivopuedesintetizarfcilmenpor ribosomales minuto.Yasasubunidades te unas20.000 bemosque una clulade estetipo tiene de unos 3.000a ride 4.000porosnucleares, maneraque las subunidades a haciael citoplasma una velocise bosomales transportan por 5-6 dad de aproximadamente subunidades minuto y ms es, opuesta si acaso, por poro.El trficoen la direccin se replicando, nese los cromosomas estn Cuando denso. por molculas de histonas una velocidad 300.000 a cesitan haciael interiordebe del minuto.Lavelocidad movimiento de de seradems unas100molculas histonapor minuto los trficomacromolecular, de ypor porolAdems todo este partculas mspede porostambinmedianel transporte e queas, molculas iones. a molculas tnvs de lospotosnude Difusin simple pequeas pueden dipequeas cleares.La ideade quelasmolculas de a en fundir libremente ambossentidos travs los poros por recibiapoyoexperimental, primeravez,a nucleares partculas oro de en partir de estudios los que seinyectaron que de coloidalde variostamaosen el citoplasma clulas, Poco electrnico. al despus, examinaron microscopio se de se de despus la inyeccin, podaver a laspartculas oro haciael ncleo.La pasando travsde los poros nucleares a velocidadde entradade las partculasen el ncleoestincon relacionada el dimetrodela partcula-es versamente de es decir,cuantomsgrande la partcula oro, mslentade mayores 10nm menteentraen el ncleo-. Laspartculas por completo.Puestoque el dide dimetro se excluyen metro total de un complejodel poro nuclearesmayor que de de el delaspartculas oro, seconcluyquelos complejos a canales difusinacuosos trade poro contienenpequeos y vsde los que semuevenlibrementelaspartculas molculaspequeas. los canales, invesel Paradeterminar dimetrode estos de inyectaronprotenasradiactivas varios tamatigadores cunto y de os en el citoplasma las clulas observaron en a tiempo le cuesta dichasprotenasaparecer el ncleo.A de una protqnaglobularcon un pesomolecular 20'000le y entreel citoplasma slounosminutosequilibrarse cuesta daltons de perola mayora lasprotenas 60.000 de el ncleo, y stas en de o msno soncasicapaces penetrar el ncleo. de indicanquelos canales dide transporte otrasmedidas un tienenunos9 nm de dimetro, tamao fusinacuosos
paramolculas con quecreaunabarrerade permeabilidad mayor de 20.000. significativamente un pesomolecular generalmente asuman Hastahacepoco,los investigadores poro nucleartenauno solode esos que cadacomplejode que ahoraparece puedenser8 canacanales. embargo, Sin en 9 les,separados nm y localizados la periferiadel poro nuentrelos radios,y quizsun canaladicionalen el cenclear, que estos acuosos canales Se tro del transportador. piensa pequeas iones e al sonpermeables libre pasodemolculas sus(incluyendo protenas pequeas) debidoa que estas despus la nuclearrpidamente tanciasatraviesan envuelta los triAdems, nuclesidos en de serinyectadas lasclulas. para la sntesis DNA y RNA probade fosfato necesarios a de difundenlibremente travs los poros,como blemente para pequeas necesarias lasrulo hacenotrasmolculas que tasmetablicas funcionanen el ncleo. proteinas de RNA tlavsde los y a de actvo grandes Transporte implicadas el poros en Muchasde lasprotenas nucleates. y del replicacin transcripcin DNA son empaquetamiento, a de pequeas comoparapasar travs un lo suficientemente por tienen Las canalde 9 nm de ancho. histonas, ejemplo, difundir o pesos de moleculares 21.000 menosy deberan sin de pasivamentetravs los porosnucleares problemas. a protenas son nucleares muy grandes. algunas Sinembargo, de implicadas la sntesis DNA y de RNA,por en Lasenzimas que moleculares excon tienensubunidades pesos ejemplo, grande parapasar que a delos 100.000, esdemasiado ceden de de unaaperturade9 nm. Lasmolculas RNA mentravs el un tambinsuponen reto,ya que abandonan nsajero RNA-proprotenas, forma de complejos en cleounidasa grandes. que Las tena(nribonucleoprotenar) sonbastante sedeben exportarhacia tambin ribosomales subunidades en de despus habersidoensambladas el nel citoplasma partculas estas a de el cleo.Claramente, transporte todas es travsde los poros nucleares un reto significativo. que molculas y sugieren Un buen grupo de evidencias activamente traa son tan partculas grandes, transportadas por selectivo. Como vsde los porosnucleares, un proceso normales, el de activoa travs lasmembranas el transporte requiere activoa travsde los poros nucleares transporte de transe energa implica la unin especfica lassustancias que caso forman de portadas protenas membrana, eneste a molecular subpartedel complejode poro.El mecanismo que se yacente entiende mejor en el casode protenas se desde citosolhaciael ncleo.Thel transportanactivamente de poseen una o msseales localizacinnulesprotenas que de clear (SLN),que son secuencias aminocidos perpor y sea miten quela protena reconocida transportada el complejode poro nuclear.Una SLN tiene normalmente y una longitud de 8 a 30 aminocidos a menudocontiene (bsicos) positivacargados prolina,ascomoaminocidos mente, comolisinay arginina. SLN en el las El papel que desempean secuencias haciael ncleoseha estade direccionamiento protenas
Elncleo 595
blecidogracias experimentos dondepartculas oro a en de de ms de 9 nm de dimetro-demasiado grandes como paraatravesar canales difusinacuosos los poros los de de nuclearesse cubrieroncon polipptidos que contenan SLN y seinyectaban el citoplasmade ovocitosde ranas. en Despus este de tratamiento, partculas oro de hasta las de 26 nm de dimetrosetransportaban rpidamente travs a de los complejos poro nuclear de haciael ncleo. Adems, el dimetromiximo para el transporteactivoatravsde la
enrrelta nuclear parece ser 26 nm (frente a 9 nm para la difusin simple). steesslo uno de los numerososejemplos en los que se ha encontrado que una secuenciacorta de aminocidos dirige a una molcula o a una partcula a un sitio celular especfico. El procesopara transportar protenascitoplsmicashacia el ncleo a travs de los poros nuclearesse ilustra en la Figura 18.30a. el paso @, una protena citoplsmicaque En contiene una SLN es reconocida por un tipo de protena
NUCLEO
Carga liberada en el ncleo
o :Mr \-fi
6-DF) --7 lnan \ l_ GEF T>
NCLEO GTP GDP

GTP GDP
v\
\r\-/
NLS,,h
protenas
a transportar "carOa,,
Cargaliberada en el citosol (b) Ciclode exportacin
(a) Ciclode importacin
Figura 18'30 Transporte travsdel complejo poronucleat (a) Ciclo de importacin. Lasprotenasfabricadas el citosoly destinadas a de en de nuclear(SLN) que las marca como (carga) a transportara travsdel Parasu uso en el ncleo contienenuna secuencia locaiizacin complejode poro nuclear. Una protenaa transportarque contienela secuencia O SLN seune a importina y @ el cmplejoprotenaa transportar-importinasetransportaa travsdel complejode poro nuclear. Ran-GTPnuclearseune a la importina deseniadenando @ la liberacinde ia protenaa transportaren el ncleo.@ El complejo Ran-GTP-importinasetransportade vueltahaciael citosol,donde q la hidrlisis de GTP a GDP seacompaapor la liberacinde importina. (b) Ciclo de exportacin.La principal cargadeexportacin nucleares RN4.," lugar de protenas,pero los RNAs se transportan generalmentehacia el exterior del ncleo mediante protenas que contienen una sealde exportacinnuclear (SEN).Durante el ciclo de exportacin, Ran-GTPseune a la exportinaen el ncleo,lo que @ promueveIa O unin de la exportina a su arga,en estecasoe1complejo RNA-protena. @ El complejo exportina-carga-RNA-GTP se exporta a travs de los poros nucleareshacia el citosol, donde @, la exportina y su cargaseliberan de Ran, acompaadopor la hidrlisis de Gip a GDp. @ La exportina r,'uelve entoncesa-lncleo, donde puede repetir el ciclo de exportacin. Los cicios de imporiacin y exportacin seimpulsan por un gradiente de concentracin de Ran-GTP que semantiene por la presenciade un factor intercambiador de no.letidor de gunina (nf del ingls, Guanine-nucleotideExchangeFactor) en el ncleo y una protena activadora de GTPasa(GAP del ingls,GTpasectivating Protein) en el citosol.
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Capitulo Base 18 estructural Ia'informacin DNA, de celular: cromosomas ncleo v el
receptoradenominadaimportina, que se une a la SLN y rnediael movimiento de la protenaque contienela SLN hacia el poro nuclear,sirviendo las fibras citoplasmticas del poro, quizsde algunaforma, como carriles. el paso En @, el complejoproteicoSlN-importina setransportaal ncleopor el transportador centrodel complejodeporo del nuclear(CPN).Despus llegaral ncleo,lamolcula de de importina seasocia la protena con Ranque seune a GTP. Estainteraccinentreimportina y Ranprovocaquela protenaquecontiene SLNsea la liberadapara usoen el nsu se cleo (paso@).EI complejoRan-GTP-importina transporta de vuelta a travs de un poro nuclear hacia el citoplasma lpaso@) dondela importina seliberaparasu reutilizacin,acompaada la hidrlisis de Ran unido a de pasode hidrlide GTP (paso@). Lasevidencias queeste paralaimportacinnuclear sisde GTR produce energa la que que el seobtienena partir de experimentos muestran transporte nuclear puedeinhibir exponiendo lascluse a pero lasa anlogos GTPno hidrolizables, no a anlogos de de ATP no hidrolizables. Parala exportacin materialal exteriordel ncleo, de operanmecanismos comparables. principal diferencia La es que el transporte haciael exteriordel ncleoseusaprincipalmente paralasmolculas RNA quesesintetizan el de en ncleoperoque funcionanen el citoplasma, mientrasque la importacinnuclearestdedicada gran parte,a imen portar protenas que se sintetizanen el citoplasma pero funcionanen el ncleo. AunqueIa carga principala transportar en la exportacinnuclear esRNA en lugar de que protenas, exportacin RNA est Ia por de mediada proteprotenas adaptacin nasqueseunena RNA.Estas de contienensecuencias aminocidos de denominadas seales de nuclear(SEN), quedirigena la protena, por y exportacin extensin RNA que lleva unido, para exportarloa travs al delosporosnucleares. secuencias sereconocen Las por SEN protenas receptoras transporte del nucleardenominadas que contienenseexportinas,que se unen a molculas cuencias haciael exterior, traSENy mediansutransporte a por que vsde porosnucleares, un mecanismo recuerda al modo en que las importinastransportan molculas citoplasmticas ncleo(Figura18.30b). al La diferencia la direccin en entreel transporte mediado por importinasy por exportinas, guiadopor la interest accinentre Ran-GTPy estas dos clases molculas, de por acompaado un gradiente concentracin Rande de GTP a travsde la envueltanuclear.La concentracin de Ran-GTPsemantieneelevada el interior del ncleograen ciasa un factor intercambiador nucletidos guanina, de de (GEF),[del inglsGuanine-nucleotide Exchange Factor] quepromueve unin de GTP a Rana cambiode GDP.Por la el contrario, el citosol contieneuna protenaactivadora de (GAP) [del inglsGTPase GTPasa activatingprotein] que promueve hidrlisisde GTPpor Ran,disminuyendo la adems la concentracin Ran-GTPfuera del ncleo.Las de concentraciones relativamente elevadas Ran-GTPen el de
primero, la Ran-GTPnuclear ncleo tienen dos efectos: promueye liberacin la carga, Ia que contieneSLN,de la de paso@); segundo, importina(Figura18.30a; Ran-GTP nuclearpromueve unin de la cargaque contieneSEN a la la paso @). El resultado exportina(Figura 18.30b; neto es que la direccindel transportepara cualquiermolculaa por transportar determina el tipo de secuencia destise de no (SLN o SEN) que dicta si las importinas liberarn la molculatransportadaen el ncleoy la unirn en el citoplasma, lasexportinas o unirn la molcula transportaren a el ncleoy la liberarnen el citoplasma. y La matliznuclear la lminanuclear son esttucturas de soportedel ncleo Entre el 80y el 90olo la masanuclearestconstituidapor de fibrasde cromatina, quesepodraesperar retirarla as que que cromatina causara el ncleosecolapsara una masa en relativamente desestructurada. embargo, principiosde Sin a que los 70,los investigadores descubrieron despus que de ms del 95o/o la cromatinasehubieraretiradopor una de combinacinde tratamientoscon nucleasa detergente y permaneca red fibrosa que una insoluble retena compor pletola forma del ncleo. pensaba esta denomique Se red nada,la matriz nuclear (o nucleoesqueleto), ayudaba a la y mantener formadel ncleo proporcionaba esqueleun para las fibras de cromatina.Sin embargo, to organizador por la existencia la matriz nuclearno ha sidoaceptada tode dos los bilogoscelulares. fibras son slo visiblesen Las (Figura18.31), micrografas ciertas llevandoa los escpticosa cuestionarse sonartefactos si introducidos duranteel procesamiento Ia muestra. de En los ltimos aos,evidencias adicionales reforhan zadola idea de la existencia una matrzestructuralque de las del organiza actividades ncleo.Por ejemplo,sesugiere una conexinestrecha entre la matriz y las fibras de cromatinadebidoal descubrimiento quelaspreparaciones de de matriz nuclearaisladas, siemprecontienenpequeas cantidades DNA y RNA unidasestrechamente. tcde Las nicasde hibridacinde cidos nucleicos revelado han que el DNA unido ntimamentees rico en secuencias se que transcriben forma activaen RNA.Adems, de cuandoseincubanlasclulas timidina-H3, precursor con un radiactivo parala sntesis DNA, seobservaque el DNA radiactivo de recin sintetizadoestasociado, forma preferente, la de a matriz nuclear. Estas observaciones sugieren que la matriz nuclearpuedeestarimplicadaen el anclajede las fibrasde cromatinaa localizaciones donde el DNA o el RNA estn siendosintetizados, organizando este de modo al DNA para que serepliquey setranscribade forma ordenada quizs y incluso proporcionandocarrilesque gueny propulsenal RNA mensajero recinformado hacialos poros nucleares para transportarlos citoplasma. al MientrasqueIa naturaleza exactay significacin la funcional de la matriz nuclearsemantienensin esclarecer. el
Elncleo 597
Citoplasma
Fibrasde la matrz nuclear
Lminanuclear
(a) Uninde las fibrasde la matriz nuclear la lminanuclear a
1pm
(b) Vistlsuperficial la lmina -i-de nuclear
Figuta18.31 [a matz nuclea]y la lminanuclear. (a) Estamicrograffa electrnicade una parte del ncleo de una clula de mamfero muestra una red ramificada de filamentos de la matriz nuclear atravesandoel ncleo. Estosfrlamentos parecenestarpegadosa Ia lmina nuclear,la densacapa de filamentos que limita el lado del nucleoplasmticode la enrrelta nuclear. (b) Vista superficial de la lmina nuclear de un oocito de rana (METs).
ncleocontiene otra estructura fibrosacuyopapelha sido definido con mayor claridad.Estaestructuradenominada la lmina nuclear,esuna red de fibras densa fina que liy mita la superficieinterna de la membrananuclearinterna y que ayudaa sostener la envuelta a nuclear. lmina nuLa cleartieneun espesor entre10y 40 nm y estconstruide da con filamentos intermediosfabricados protenas con denominadas lminas (tratadas en mayor detalle en el Captulo15) . Al menosalgunos estos parecen de filamentos estarunidosa protenas la membrana de nuclearinterna. Ademsde proporcionarsoporteestructural para la envuelta nuclear,Ia lmina nuclear puedetambin proporcionarlugares anclaje de paralacromatina, temaal que un nosreferiremos la siguiente en seccin. Lasfibrasde cromatina estndispersas azal no al en el ncleo Apartedel momentode la divisincelular, fibrasde crolas matina de una clulatiendena estarmuy extendidas disy persas el ncleo. en Adems, podrasuponerque lasfise bras de cromatinaque corresponden cadacromosoma a individual sedistribuyenal azary estnmuy entrelazadas dentrodel ncleo. de este Quizs, forma sorprendente, pareceno serel caso. vezde eso, cromatina cada En la de cromosomaaparentemente tiene su propia localizacin. Esta ideasepropusopor primeravezen 1885, pero lasevidenciasde que escierto en una gran variedadde clulasesperabana lastcnicas la biologa de molecular moderna. Recientemente, utilizandosondas cidos de nucleicos se oue hibridan con el DNA de cromosomas especficos, varios grupos de investigacin han demostradoque las fibras de
598
cromatinacorrespondientes cromosomas a los individuales ocupan compartimentosdiferenciados dentro del ncleo,referidoscomo <territorioscromosmicos> (Figura 18.32). embargo, posiciones estos Sin las de territoriosno parecen fijas.Varande clulaa cluladel mismo orgaser nismoy parecen cambiarduranteel ciclo devida de una cquizs lula,reflejando cambios Ia actividad los genes en de de los diferentes cromosomas. La envuelta nuclear ayuda a organizarla cromatina uniendo ciertossegmentos sitiosespecficos la supera de
Figura18,32 Teritorios ctomosmicos. Las clulasde pulmn de ratn se tien con colorantesfluorescentes ligados a sondasde cidos nucleicos que hibridan especficamente con el DNA del cromosoma12 (rojo), cromosoma14 (verde)o cromosoma15 (azul). Estavista de un solo ncleo observadoa microscopa ptica muestra que el DNA de cada cromosoma selocaliza en una regin especfica ncleo (cada cromosoma estpresenteen dos del copias).
ficie interna de la envuelta, asociados estrechamente a los poros nucleares. Los segmentosde cromatina que se unen forma estn muy compactados -es decir, son hetede esta rocromatina-. En las micrografias electrnicas,estematerial aparececomo una capa oscura irregular alrededor de la periferia nuclear, como se ve en la Figura 18,26a.La mayoriaparece ser del tipo denominado heterocromatina constitutiva, que apareceen una forma altamente condensada, prcticamente todo el tiempo, en todas las clulas del organismo. El DNA de la heterocromatina constitutiva consiste en DNA repetido de secuenciasimple (recuerdeque stas cortas que se repiten en tndem y que no se son secuencias transcriben). El centrmero y el telmero son dos regiones importantes del cromosoma compuestas por heterocromatina constitutiva. En muchos casos,los telmeros del cromosoma -5ssusnsis de DNA altamente repetidaslocalizadasen los extremos de los cromosomas- se unen a la envuelta nuclear en momentos diferentes a los de la divisin celular. A diferencia a la heterocromatina constitutiva, la heterocromatina facultativa vara con las actividades concretas realizadaspor la clula. Incluso, difiere de tejido a tejido, e incluso puede variar a vecesen una clula dada. La heterocromatina facultativa parece representar las regiones del en cromosoma que se han inactivado especficamente un tipo celular concreto.Normalmente la cantidad de heterocromatina facultativa es baja en las clulas embrionarias pero puede ser importante en clulas muy diferenciadas.La formacin de heterocromatina facultativa puede ser adems una manera fundamental de inactivar bloques enteros de informacin genticadurante el desarrollo.
Fibrillas
Grnulos
F--
"'r-----18.33 Elnucleolo.El nucleolo unaestructura es Figura y Es de Las prominente. unamasa fibrillas grnulos. intranuclear son fibrillassonDNA y RNAI;los grnulos subunidades Aqul semuestra nucleolo el de de formacin. ribosomales reciente que una unaespermatogonia, clula da lugara losespermatozoides (MET).
en El nucleolo estimplicado la fomacinde los ribosomas
riormente exportadasa travsde los poros nucleareshasta el citoplasma.Debido a su papel en la sntesisde RNA, los nucleolos se marcan radiactivamente con intensidad cuandel Un componenteestructuralrelevante ncleoeucariota do las clulas se exponen a precursores de RNA radiactivos esel nucleolo,la fbricade ribosomasde la clula.Lasctpicascontienenuno o dos nucleolos, (Figura 18.34). lulas eucariticas La primera evidencia que asociaba al nucleolo con la en pero la presencia ms no es infrecuente; ciertasside formacin de los ribosomasfue aportadaa principios de los cientoso inclusomilespuedenestarpresentes. tuaciones, aos 60 por Robert Perr que emple un microhaz de luz Normalmente,el nucleolo es una estructuraesfricaque grandes ultravioleta para destruir el nucleolo de clulas vivas. Tales pero seobservan mide variasmicrasde dimetro, en variaciones forma y tamao.Debidoa su grantamao clulas perdieron su capacidad para sintetizar rRNA, sugiriendo que el nucleolo est implicado en la produccin de relativo,los nucleolosseven fcilmenteal microscopioppor tico y seobservaron primeravezhacemsde 200aos. ribosomas.Surgieron evidenciasadicionalesa partir de esdel estructurales nucleolo tudios realizados por Donald Brown y |ohn Gurdon en la los Sin embargo, componentes rana de uas africana, Xenopuslaevis. Atravs de cruces geno se identificaron con claridad hastaIa llegadadel mielec- nticos es posible producir embriones de Xenopus a cuyas electrnico los aos50.En micrografas en croscopio clulas les faltan los nucleolos. Brown y Gurdon descubriecomoun ortrnicasde cortesfinos,cadanucleoloaparece en gnulo sin membranaque consiste fibrillas y grnulos ron que tales embriones, denominados mutantesanucleolados, no podan sintetizar rRNA y por tanto moran du(Figura18.33). fibrillascontienen DNA que estsienLas (rRNA), el componente rante el desarrollo temprano, implicando otra vez al do transcrito en RNA ribosmico nucleolo en la formacin de ribosomas. RNA de los ribosomas.Los grnulosson molculasde Si el rRNA se sintetiza en el nucleolo, entonces las secon rRNA empaquetados protenas(importadasdesdeel cuencias de DNA que codifican para este RNA deben resiparaformar subunidades ribosomales. Como citoplasma) ribosomales poste- dir tambin en el nucleolo. Esta prediccin se ha verificado son las hemosvistoantes. subunidades Elncleo 599
Nucleolos
r4
r
# rr' +
.$;.
: qI
--1olrr-
Figura18.34 El nucleolo un lugarde sntesisde RNA, Para es demostrar el papel 9el nucleolo en la slntesisdel RNA, sele inyect a una rata citidina-'H, un precursor de RNA marcado radiactivamente.Cinco hoias ms tarde, se retir el tejido heptico y se someti a una autorradiografia. Los puntos_negros sobre los ncleosde estaautorradiograffa indican que el'H seconcentraen el nucleolo (MET).
mostrandoque los nucleolos aislados contienenuna regin organizadoradel nucleolo (NOR del inglsnucleolus organizer region), tramo de DNA que lleva copiasmlun para rRNA. Estosgenes tiplesde los genes mltiplespara rRNA aparecen todos los genomas incluso son un en e ejemplosignificativode DNA repetidoque porta informacin gentica. nmerodecopias los genes rRNA vaEl de de forma significativaentre especies, clulasanimara de las les,a menudo,contienencientosde copiaspero las clulas normalmente milesde copias. codeplantas contienen Las piasmltiplesseagrupan uno o msNOR, quepueden en residiren msde un cromosoma; cadaNOR, lascopias en mltiplesdel gen se disponenen tndem.Un nico nucleolopuedecontenergenes rRNA derivados msde de de un NOR. Por ejemplo,el genomahumano tiene cinco NORspor cromosoma haploide, diezpor ncleodiploio de,cadauno localizado cerca extremode un cromosodel ma diferente. Peroenvezde dieznucleolos separados, nel cleo humano tpico tiene un nico nucleolograndeque contienebuclesde cromatinaderivadosde diez cromosomasseparados.
El tamaodel nucleoloestrelacionado con su nivel de que En lasclulas tienenuna elevada de snactividad. tasa y tesis protenas por tanto necesidad muchosribosode de y mas,los nucleolostiendena sergrandes cuentancon endel tre un 20y un25o/o volumentotaldel ncleo. clulas En menosactivas, nucleolos muchomspequeos. los son La principal diferencia la cantidadde componente es granular presente. Las clulasque producen muchos ribosomas procesan empaquetan transcriben, y grandes cantidades de rRNA y tienenniveles msaltosde subunidades ribosomay lesparcialmente completas estables disponibles el nuen cleolo,a lo que debe su destacado componentegranular. por El nucleolo desaparece durante mitosis, Io menos la y en lasclulas plantas de superiores de animales. mediA da que la clulaseaproximaa la divisin, la cromatinase condensa cromosomas en compactos, hechova acomeste paadopor la reduccin posteriordesaparicin nuy del cleolo.Esto se ajustaperfectamente nuestrosconocia y mientos actuales sobre la composicin funcin del nucleolo: bucles cromatinadel nucleoloextendidos los de dejande sertranscritos medidaque seenrollan sepliea y gany cualquier protenaribosomalo rRNA remanente se dispersa sedegrada. medidaquela mitosistermina,la o A las NOR forman bucles cromatinasedesenrolla, regiones otra vez,y la sntesis rRNA contina. lasclulas de En humanas, la nicaocasin la quelasl0 regiones es en NOR de los ncleos diploides son evidentes; medidaqueIa sntea sisde rRNA empieza otravez, hacen visibles se diezpequeos nucleolos, cercadel extremode cadauno de los diez A nucleolos hacen grancromosomas. medidaqueestos se des, fusionan se rpidamente el nicogrannucleolo en que queno estn proceso lasclulas humanas seobserva en en de divisin. Aunquesu funcin principal estclaramente relacionada con la produccinde ribosomas, nucleolocontiene el algunas molculas cuyapresencia sugiere papelenotrasacun talescomo la exportacin tividadesadicionales, desdeel ncleo,la modificacinqumica de pequeos RNAs,e incluso el control de Ia divisin celular.Los microscopistas tambin han identificadovarios tipos de cuerpos nucleares pequeos que,como el nucleolo,son estructuras rodeano por daspor membrana compuestas pequeas fibrasy/o grnulos con configuraciones peculiares. han caracterizado Se variostiposde cuerpos nucleares, uno contiene grucada un po diferentede protenas residentes. Aunquelos detalles no que seconocen bien,sepiensa los cuerpos nucleares desempeandiversos papeles relacionados el procesamiento con y manejode molculas RNA producidas el ncleo. de en
600
y el 18 Capitulo Base estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo DNA,
El descubrimiento DNA seremontaa del Ios primeros estudiosde Miescher,pero no fue hastamediadosdel siglo xx cuando los experimentos bacteriasde tipo en neumococoy experimentosen el bacterifago T12 revelaroncon claridadque el DNA era el material gentico. estetraA por bajo le siguiel esclarecimiento Watsony Crick de la estructuraen doblehlice del DNA, uno de los puntos de referencia la biologa del siglo xx. Los de puentes hidrgenoquemantienenunide daslas dos hebrasde la doble hliceslo ajustan cuandola base seempareja A con T,y la base seempareja C. Debidoa G con juntaspor quelasdoshebras mantienen se puentesno covalentes relativamentedbiles, doshebras puedenseparar las se fcilmentedurantela replicacin DNAy del la sntesis RNA. de Los bilogos moleculares han desarrollado diversas herramientaspoderoparaestudiar DNA. Por ejemplo, sas el las enzimas restriccinaisladas partir de a de bacterias, puedenusar para cortar el se DNA en fragmentos reproducibles, sulo ficientemente cortos como para ser fcilmentemanipulables el laboratorio.En en estecaptulo,describimos cmo el uso de lasenzimas restriccin de hace mssencillo el estudio la estructura lasmolde de culasde DNA muy largas. Ms tarde,en el 20,veremos cmolasenzimas Captulo de restriccin tambinIa clave parahacer son DNA recombinante. EI DNA (o RNA para algunosvirus) que constituye juego completode la un gentica un organismo informacin de se denominasu genoma. Parala mayorade virusy procariotas, genoma el consiste en una molculade DNA sencillao en un nmero pequeode ellas.Los eucariotas tienen un senomanucleardividido entre
mltiples cromosomas, cadauno de ellos tiene una molcula de DNA muy larga. Loseucariotas tambintienenun genoma mitocondrial,y en el caso lasplantas de un genoma cloroplstico. bilogos Los moleherraculareshan desarrolladodiversas paraestudiarlos genomientaspoderosas mas. Por ejemplo, las enzimas de restriccin aisladas lasbacterias, puede se den usarpara cortar el DNA en fragmenque son lo suficientetos reproducibles mente cortos como para ser fcilmente manipulables el laboratorio.Lastcnien automtica DNA de casde secuenciacin determihan permitido a los cientficos nar la secuencia bases de completa los de genomas numerosos de organismos desde Iasbacterias loshumanos. a Unade lascaractersticas ms llamativasde los genomasnucleares los eucariotas, de especialmentedelos organismos multicelulares, es la enormefraccinde DNA que no codifica para RNA ni para sntesis protede nas.La mayorade DNA no codificante repetidas. conoSe consiste secuencias en poco sobrelasfunciones ce relativamente pero algunade estas del DNA repetido, sepuededesempear papelesun cuencias y tructural en el cromosoma, otraspueden proporcionarfuentesdevariabilidadevoIutiva parael genoma. La enormelongitud de las molculas en de DNA presente lasclulas(e incluso conen losvirus) necesita un embalaje de como siderable). Tantoen losprocariotas eucariotas, el en el ncleode las ciulas pero DNA forma complejos protenas, con esteempaquetamiento ms elaborado es La estructuen eucariotas. unidadbsica eucariota el nucleoes ral del cromosoma que soma, consiste una pequea en longitud de DNA enrollado alrededorde una partcula proteica construidaa partir de
ocho molculasde histonas. Hileras de (<cuentas un collar>)se nucleosomas en juntasparaformar una fibra empaquetan de cromatinade 30 nm, que puedeseguir curvndose plegndose. y Cuanto mayor seael empaquetamiento DNA, menos del probablees que steseaactivotranscripcionalmente la clula. lasclulas en En que no estnen divisin y que estntranscribiendoDNA de maneraactiva,Ia mayora de la cromatinaesten una forma relatiy vamenteextendida, bastantedifusa denominada eucromatina.Sin embargo, otras porcionesde Ia cromatina estnen un estado altamente condenSado denominado heterocromatina. Durante Ia divisin celular, todala cromatinasecompacta formando cromosomas diferenciados visibles el microscopio con ptico. Los cromosomas eucariotas localise zan en el ncleo.La envueltanuclear de doblemembrana perforada poros est por nucleares medianel transporte que bidireccionalde materiales entre el nucleoplasma el citosol. y Dentrode cada poro se encuentra proteicaelabouna estructura rada,denominada complejo poro nudel clear.Losionesy pequeas molculas con un tamaohasta9 nm de dimetro,difunden pasivamente travs de canales a acuosos el complejodel poro; lasparen tculasmayores transportanactivamense te a su travs; porosnucleares los controIanadems movimientohaciael interior el de lasprotenas que seusanen el ncleoy el movimiento haciael exteriordel RNAy delassubunidades ribosomales. piensa Se que una red estructuralde fibras, denominada matriz nuclearestimplicadaen Ia localizacin otras actividades de nucleares, talescomo la replicacindel DNA y Ia produccindel RNA mensajero, zoa nasdiferenciadas ncleo. del
Problemas
problemas Los demayor dificultad marcados un .. estn con 18.1 El material gentico. Marque cadauna de las siguientes aseveraciones relativas la nattralezaqumicadel material a gentico con una A si la afirmacinserealizalgunas dcadas antes 7944,conuna I si pertenece nterin 1944-1952, de aI con una P si seajustams al periodoposterior 1952, con una N si a o nuncafueun conceptoampliamente aceptado. (a) El DNA de doble hebracontienecantidades igualesde las bases y T, e iguales A cantidades lasbases y C, pero Ia de G significacinde estas equivalencias un misterio. es (b) El materialgenticode organismos superiores es probablemente protenaen su mayora. (c) EI DNA esel materialgentico tanto de lasbacterias como de susfagos.
Problemas 601
(d) EI DNA esqumicamente demasiado simplecomo para ser Ia de considerado informacin gentica cualquierclula. (e) La nuclenaesun componenteimportante del citoplasma. (0 El DNA puedeserel materialgentico lasclulas de pero todavaesun asuntopendientesu bacterianas, superiores. significado organismos en (g) Lascepas de lisas(S) de neumococoson capaces convertira (R) en S lascepas rugosas no patgenas) cepas patgenas, pero todavano sabemos componentede lasclulas qu S causa transformacin. esa (h) rJnavezadsorbidoen una clulahusped, bacterifago el inyectasusprotenasa la bacteria. cada 18.2 Conocimientosprevios.Prcticamente por experimentorealzado los bilogosseciment en previos. procedentes experimentos de conocimientos (a) Qusignificadotuvo para Averyy cols.,el descubrimiento (realizadoert 1932por |. L. Alloway) de que la misma clase R S de transformacinde clulas en clulas que Grifth con observ ratones, podatambindemostrar en se en clulas neumococoaisladas cultivo? de explicacin (b) Qu y la significparaHershey Chase siguiente (realizada 1951por R. M. Herriott)?nUn virus puede en agujahipodrmicallenade funcionarcomo una pequea principiostransformantes; virus,como tal, no entranunca el y Ia con en lasclulas; solamente colacontacta el husped quizs,realiza un agujeroen la enzimticamente pequeo y el membranaexterna entonces cidonucleicodelacabeza delvirus fluyehaciael interior de la clulo. (c) Qu paraWatson Crick los datosde sus y significaron de de tan colegas Cambridge la manera particularen la que permitala A, sedisponan G, C y T a pH fisiolgico formcinde puentes hidrgeno de especficos? (d) Cmo descubrimientos Hershey Chase y ayudan los de a explicarun informe preliminar (de T. F.Andersony partculas virales en R. M. Herriot) en el que,al suspender antesde aadirlosa un cultivo bacteriano, el aguadestilada por y Tl2 bacterifago seabreviolentamente, smosis, pierdesu capacidad reproducirse? de 18.3 Estructura del DNA. Examinecon detenimientoIa doble hebrade la molculade DNA que semuestray fjeseen que presenta doblesimetra rotacin: una de 3, A-G-C-G-C-T-A-T-A-G-C-G-C-T 5' 3' 5' T-C-G-C-G-A-T-A-T-C-G-C-G-A (a) Marquecadauna de lassiguientes aseveraciones unaV con si esverdadero con una F si esfalso. o (b) No existeforma de distinguir el extremoderechode la doble hlicedel extremoizquierdo. (c) Si una solucin estas de molculas calienta se hasta desnaturalizarlas, molculade cadena cada senciliade la capazde hibridar con una de cadados solucin sera molculas.
(d) Si la molcula se corta en dos mitades por su punto medio, sera posible distinguir Ia mitad izquierda de la mitad derecha.
(0
En una cadena sencillade estamolcula,seraimposible determinarcul esel extremo3' y culel extremo5'.
18.4 Mapasde restriccin de DNA. El genomade un recindescubierto una molculade DNA lineal es bacterifago pares nucletidos. incubuna con una longitudde 10.500 de Se muestrade eseDNA con una enzimade restriccinX y otra muestracon la enzimade restriccinY. Por electroforesis gel, en sehan determinadolaslongitudes(en miles de paresde bases) de de los fragmentos restriccinproducidospor lasdos enzimas como sigue: X-l : 4,5; X-2 : 3,6; X-3 : 2,4 EnzimaX: Fragmento E n z i m a Y : F r a g m e n t o Y - l : 5 , 2 ; Y - 2 : 3 , 8 ; Y - 3: 1 , 5 obtenidosen Ia reaccincon Lo siguiente, que los fragmentos es y la enzimaX seaslan setratan con la enzimaY,y los fiagmentosde la reaccinde la enzimaY setratan con la enzimaX. Los resultados los siguientes: son de con Losfragmentos X tratados Y X- 1 --+4,5 (no cambia) X-2---+ + 1,5 2,1 X-3 --+ I,7 + 0,7 de con Losfragmentos Y tratados X: Y-1--+4,5 + 0,7
Y-)--+)1+17
v -
i,s (no cambia)
Dibuje un mapa de restriccindel DNA del fago,indicandola posicin todoslos sitiosde restriccin la enzima y de la de X de enzimaY,y Ia longitud del DNA entre ellos. 18,5 Secuenciacin DNA. Ha aisladoel fragmentode del 18.3perono sabe secuencia su completa. DNA del Problema la de usada, Conociendo especificidad la enzimade restriccin puedesaberlas cuatroprimerasbases extremode la del y un de izquierda ha preparado primer (cebador) DNA de de 5' 3'. Explique cadena sencilla secuencia T-C-G-C cmo utilizando determinarael restode la secuencia marcados colorantes. con Dibujeel patrn dideoxinucletidos indicando secuencia bases la de de gelque seobservara, de que DNA de cadabanday el patrnde colores detectara la de cmara un secuenciador DNA. en .18,6 Fusindel DNA. En la Figura18.35 muestran se las de curvasde fusin para dos muestras DNA que se en desnaturalizaron trmicamente lasmismascondiciones.
E
c N
o o
'F
o q)
.( O c (
_o
@
75
80 85 ('C) Temperatura
(e) Si las dos cadenassencillas se separan, no sera posible

distinguir una hebra de la otra.
Figum 18.35 Desnaturalizacin dedosmuestras DNA. trmica de (VaseProblema 18.6.)
602
y el celular: cromosomas ncleo DNA, Capitulo Base 18 estructural Iainformacin de
(a) Qu conclusiones sacan respecto la composicin se con a de Explquelo. de bases lasdos muestras? (b) Podra pendientede la curva de fusin explicarla excesiva de la muestraA? (c) La formamiday Ia ureasonagentes por conocidos formar puentes hidrgeno de con purinasy pirimidinas. Qu efectos, esque hay alguno,tendrasobrelascurvasde si de fusin,la inclusinen la mezcla incubacin, de pequeas cantidades formamida o de urea? de .18,7 Renaturalizacindel DNA. Sele dan dos muestras de una DNA. cadauna de lascuales fundea92"C cuandoserealiza el desnaturalizacin trmica.Despus desnaturalizar DNA, de juntas y enfrala muestrapara permitir mezcla dos muestras las a lashebrasde DNA que sereasocien. Cuandoel DNA por reasociado desnaturaliza segunda Ia vez, nuevamente se muestra fundea 85'C. (a) Cmo podraexplicar disminucin la temperatura la de de fusinde 92"C a 85 "C? (b) Quclase experimentorealizara para explicarsu de hiptesis? (c) Si el DNA nuevamente ha reasociado fundido a92"C en extraera respecto la con a vezde a 85 "C, qu conclusiones secuencia bases lasdosmuestras DNA iniciales? de de de .18.8 Nucleosomas. Realiza experimentoen el que asle un cromatina partir de espermatozoides erizode mar y los a de digiere brevemente nucleasa micrococo. con de Cuando desaparecen protenas el DNA purificadoresultante, las y se por una seriede analza electroforesis gel,observa en de fragmentos DNA quetienenuna longitud,en pares bases, de mltiplosde 260 (esdeci,260pb, 520pb,780pb,y as sucesivamente). (a) Aunqueestos medidade los resultados difierenen alguna por explique qu resultados tpicostratados el captulo, en todava apuntana la posible existencia nucleosomas de en estetipo celular. (b) Qu puedeconcluircon respecto la cantidad DNA de se a a asociada cadanucleosoma? (c) Si la cromatina analiza despus Ia de se inmediatamente por en digestin nucleasa micrococo centrifugacin con de qu ver. gradiente densidad, de describa esperara (d) Suponga realiza experimento el quela cromatina que un en sedigiere duranteun periodomuchomslargode tiempo de antes retirarlasprotenas de de con nucleasa micrococo de se la cromatina. Cuandola preparacin DNA resultante todo el DNA aparece forma de en atalizapor electroforesis, le con fragmentos 146pb de longitud.Qu sugiere de respecto la longitud del espaciador DNA en estetipo a de celular?
18.9 Estructura y funcin nuclear.Indique lasconsecuencias paraIa funcin y la estructuranuclearde cadauna de las observaciones experimentales. siguientes (a) La sacarosa atraviesa envuelta la nucleartan rpidamente que su velocidadde movimiento no sepuedemedir con precisin. (b) Laspartculasde oro coloidalcon un dimetro de 5,5 nm seequilibranrpidamente entreel ncleoy el citoplasma pero laspartculasde cuandoseinyectanen una ameba, oro con un dimetrode 15nm no lo hacen. (c) A veces, complejos poro nuclear tien con fuerza los del se pararibonucleoprotenas. (d) Si laspartculas oro de hasta nm de dimetrose de 26 cubrencon un polipptidoque contiene una seal de Iocalzacin nuclear(SLN) y seinyectanen el citoplasma de una clula viva,setransportan ncleo. embargo, al Sin si en all. seinyectan el ncleo, quedan se (e) Cuandoseanalizan electroforesis, por muchas las de protenas la envuelta parecen lasmismas de nuclear ser a lasencontradas el retculoendoplsmico. en (f) Lasprotenas ribosomales sintetizan el citoplasma se en pero seempaquetan el rRNA, en subunidades con ribosomales el ncleo. en (C) Si los nucleolos irradiancon un microhaz luz se de ultravioleta,seinhibe la sntesis RNA ribosmico. del (h) El tratamientode los ncleos con el detergente inico Xno 100disuelve envuelta Ia nuclearpero dejael ncleointacto. 18,10 Transportenuclear.Qu determinasi una partcula proteica ser transportada activamente, haciael interior del haciael exteriordel ncleo, hacianingunode los dos o ncleo, implicado. lados? Explique mecanismo el 18.11 Nucleolo.Indiquesi cadauna de lassiguientes (V) reescriba aseveracionesverdadera o falsa(F).Si esfalsa, es la parahacerla verdadera. frase, (a) Losnucleolos estructuras son rodeadas membrana de presentes los ncleos en eucariotas. (b) Lasfibrillasque seobservan lasmicrografas en electrnicas los nucleolos de contienen DNA y RNA. (c) El DNA de los nucleolos porta los genes lost-RNAsde de que presentes gruposde copias la clula, estn en mltiples. (d) Un niconucleolo siempre corresponde una nica con (NOR). nucleolar reginorganizadora (e) Cuandoa la clulasele proporcionan ribonucletidos radiactivamente, nucleolosaparecen los marcados marcados fuertemente. (f) En animales plantas,Ia desaparicin nucleolodurante y del con de la mitosis, estrelacionada el cese la sntesis de ribosomas.
Bibliografa recomendada
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El ratnmuere vivasS (lisas) (a) Bacterias

sano El ratnse mantiene vivas R (b) Bacterias (rugosas)

sano El ratnse mantiene por S (c) Bacterias muertas calentamiento

El ratnmuere (d) BacteriasR vivas mezcladas con

(e) BacteriasS vas en la sangrede un ratnmuerto

gentico 559 qumica material del Naturaleza

y el Capitulo Base 18 estructuralla informacin de celular: cromosomas ncleo DNA,

Protena marcaoa con'"5

de la radiactividad est en el lquido

con Mezclade bacterias

para Agitacin un agitador en de separarlos fagos del exterior de la clulabacteriana su contendo

medidade la Centrifugacin: radiactividad el precipitado en v en el louido

/],l'F ' Lf"

gentlco 5 6 1 qumica material del Naturaleza

A ne x o F.COS:SISTEMA MoDELo PARA ESTUDIAR GENES

Placabasal Fibrasde la cola

Capitulo Base 18 estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo DNA, Vel

(b) Bacteria partculas fagounidas con de

Liberacin de nuevaspantcutas del fago con lisis cerurar

(a) Replicacin fago del

qumica material gentico 563 Naturaleza del

rt.tugo unea la se. cetuta nuespeo el e inyecta DNA

Cromosoma bacteriano (DNA)

La bacteria se proouce connormalidad

y el DNA, 18 estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo Captulo Base

Tabla 18.1 Gomposicinbases DNA varios de del de orgenes

28,1 28,3 28,0 30,3

19,5 20,5 t7,7 22,7 2,7 25,1 t8,7 14,0

32,1 27,1 47,3

Cangrejo marino (moho) Aspergillus Saccharmycescerevisiae (levadura) o Clo r idiu m (bacteria) st

La estructura del DNA

oo " ' " . ' . " . " .H - N \ HrC-O- P:O

y el DNA, 18 de celular: cromosomas ncleo Capitulo Base estructuralla informacin

iento rollam Superen negativo (a)

rollam iento Superen posrtrvo

y el DNA, Captulo Base 18 estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo

Corteen una solahebra

El DNA rotay la hebra intactapasa a travsdel orificio

generar el superenrollamiento, pero no para relajar una molcula ya suDerenrollada.

Laestructura DNA del

hasta Enfriar 20'C Actode nucleacin cremallera)

La organizacn del DNA

y el de celular: cromosomas ncleo DNA, Gapitulo Base 18 estructural la informacin

Mezclade DNA de diferentes tamaos

Gel Placas de vidrio Anodo (a) (b)

Gel migrado (c)

Anexo Lns TNZIMAS DE RESTRICCIN EN DETALLE

u,lcel fccl.. a ' l CI I G Gl s ' C

vlErc I lEee l"

que por (a) Digestin enzimas producen extremos romos

s.lonRrr].' EcoRl .,lcrrnnelu'

u,[ol lnF1rTls. s'lCrrAA I lels' u.[e cl lercccclg,

y el DNA, 18 estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo Gaptulo Base

y que Tabla 188,1 Enzimas restriccin usocomn secuencias reconocen de de

3' s', 3',

5' 3' 5'

Eco Rl Haelll EcoRl+ Haelll

Tamao los de (Kb) fragmentos 7,0

los de secuenciado genomas numerosos Sehan ofganismos

y el 18 DNA, Captulo Base estructural la informacin de celular: cromosomas ncleo

f DNA polimerasa + dATP,dCTP,dTTP, dGTP + ddATP', ddCTPO, ddTTP' ddGTP'

ls':TTofcoAAGrcA. ll-iie iccAAGrc. l s '- r r e i c c A A G r .

Los fragmentosse separan