Estudio Farmacognóstico Sacha Inchi

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA E. A. P. FARMACIA Y BIOQUMICA
Estudio farmacognstico y bromatolgico de los residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. (Sacha inchi)
TESIS para optar al ttulo profesional de Qumico Farmacutica
AUTOR Iris Giovana Mondragn Tarrillo
ASESORA Arilm Gorriti Gutirrez
Lima-Per 2009
DEDICATORIA
A Dios
Por darme la oportunidad de estudiar Farmacia y Bioqumica, iluminndome en los momentos en que todo pareca difcil y confuso, slo en fe y encomendndome a l, lograron disipar y esclarecer mis dudas
A mis padres: Elas Mondragn Silva y Sara Tarrillo Linarez

Por ser las personas que ms he admirado toda mi vida, que con sus acciones me han enseado que el trabajo, la perseverancia, la superacin continua y la humildad son esenciales en la vida y para la vida.
A mis hermanos: Oscar Elas, Edgar Ronal e Ybett Roco.

Porque en toda mi etapa universitaria llena de esfuerzo, siempre me han dado su apoyo, solidaridad y compresin
A mi Madrina: Orfelina Cotrina Meja.

Por ser como una segunda madre y ser ejemplo de orden, disciplina esfuerzo y sacrificio.
A Miguel ngel Inocente.

Por su amor, su amistad, su apoyo durante nuestra etapa universitaria y por ser l una parte de mi felicidad
AGRADECIMIENTOS
A mi Directora de Tesis: Dra. Arilm Gorriti Gutirrez, por creer

en mi y permitir llevar a acabo sta investigacin, gracias sinceramente por su comprensin, por su tiempo y por cada una de las enseanzas dadas las cuales me permitieron llegar hasta aqu.
A mi Co- Asesora, Mg. Teresa Arbaiza Fernndez, por su

paciencia, dedicacin y comprensin en todo momento; por sus enseanzas e instrucciones en la realizacin del estudio
Bromatolgico.
CENTRO DE INVESTIGACIN DE BIOQUMICA Y NUTRICIN DE LA UNMSM (CIBN)
A la Mg. Ines Arnao Salas, mi eterno agradecimiento y gratitud

en esta etapa tan importante de mi vida profesional, por toda la paciencia y el tiempo dedicado, por sus sugerencias, ideas, respaldo y consejos en el desarrollo de la determinacin cualitativa y
cuantitativa de aminocidos y sobre todo por su gran amistad.
Al
Dr.
Mario
Monteghirfo
Gomero
mi
eterno
agradecimiento y gratitud por ampliar mis conocimientos y permitir culminar con su apoyo incondicional una parte importante de mi tesis.
Un agradecimiento muy especial y mi gratitud a los Docentes de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UNMSM, en especial a la : Mg. Bertha Jurado Teixeira , Dra. Augusta Crdova, Dr. Cesar Fuertes; Mg. Moiss Garca; Mg. Mirtha Roque; Q. F. Marielena Salazar; Q. F. Vicky Irey; Q. F. Gloria Gordillo; Q. F. Julio Ruiz; por su apoyo y colaboracin en el desarrollo de la tesis.
A todos los trabajadores del Instituto CIBN de la UNMSM por su apoyo, aportaciones y sugerencias en el desarrollo de la tesis, en especial a la: Dra. Doris Huerta, Mg. Silvia Surez; Mg. Raquel Or; Mg. Patricia Woll, Q. F . Rubn Valdivieso, Biol. Juan Trabuco; Biol. Rosala Callohuari.
A mi tutora del HNGAI, Dra. Rosario Chipana Florez; por su amistad, y comprensin en la realizacin y culminacin de la tesis durante el ao 2008.
A todos mis compaeros y amigos de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UNMSM y del Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen, Elizabeth Poma, Eveling Requis, Eveling Taipe ,Jazmn Alfaro, Mara Daz, Deybbis Ayala, Linne Cceres, Angi More, Erika Sinche , Henry Ostos, Dany Rueda y especialmente a Gina Grisson Salsavilca y Cristhin Zacarillas por su amistad, enseanzas y ayuda incondicional.
Y a todos los dems no mencionados. Dios los bendiga
MUCHAS GRACIAS
AGRADECIMIENTO ESPECIAL
Al Presidente y distinguidos Miembros del jurado por sus sugerencias y aportes de investigacin realizado.
Presidenta
Dra. Eloisa Maximina Hernandez Fernandez
Miembros
Q.F. Luz Fabola Guadalupe Sifuentes MG. Margarita Eva Lovatn Erazo MG. Eriberto Carrasco Raymundez
Estudio Farmacognstico y Bromatolgico de los residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. (sacha inchi)
NDICE
Pgina RESUMEN SUMMARY ABREVIATURA I.INTRODUCCIN II.GENERALIDADES 2.1. Antecedentes 9 10 11 12 14 14 16 16 16 16 17 18 18 18 19 19 20 21 21 23 24 25 25 26 27 27 27 28 29 30 32 33 34 36 36 37
2.2. Estudio Farmacognstico 2.2.1. Datos etnobotnicos y etnofarmacolgicos
2.2.1.1. Datos etnobotnicos 2.2.1.2. Uso etnofarmacolgico 2.2.2. 2.2.3. Hbitat y recoleccin Protocolo botnico
2.2.3.1. Ubicacin taxonmica 2.2.3.2. Descripcin morfolgica 2.3. Estudio bromatolgico 2.3.1. 2.3.2. 2.3.3. 2.3.4. Valor nutritivo de Digestibilidad Calidad de protenas Anlisis de aminocidos
2.3.4.1. Cromatografa lquida de alta resolucin en fase reversa 2.3.4.2. Mtodos de derivatizacin para la separacin cromatogrfica 2.3.4.3. Reactivos de derivatizacin de precolumna 2.3.4.3.1. 2.3.4.3.2. 2.3.4.3.3. 2.3.4.3.4. 2.4. Ortoftaladehido (OPA) Fenilisotiocianato(PICT) Fluorenilmetil cloroformato (FMOC-Cl) Cloruro de dansilo
Fibra diettica Inters de la fibra diettica
2.4.1. 2.5.
Potencial industrial Mercado del sacha inchi
2.5.1.
2.5.1.1. Comercio internacional 2.5.1.2. Comercio nacional 2.5.2. Residuos
2.5.2.1. Normatividad y gestin de residuos slidos 2.5.2.2. Manejo de residuos slidos 2.5.2.3. Los residuo de acuerdo a los mtodos de extraccin del aceite
UNMSM-Facultad de Farmacia y Bioqumica
-1-
Bach. Iris Giovana Mondragn Tarrillo
Pgina 2.5.2.4. Temperatura y calidad de los residuos de la extraccin de aceite 2.6. Desarrollo sostenible 38 39
III. PARTE EXPERIMENTAL 3.1. Materiales, equipos y reactivos 3.2. Metodologa 3.2.1. 3.2.2. Obtencin y preparacin de la muestra Estudio farmacognstico
40 40 44 44 44 44 48 49 51 51 51 56 57 58 58 58 58 63
3.2.2.1. Anlisis cualitativo 3.2.2.1.1. Anlisis cromatogrfico (CCF) 3.2.2.2. Determinacin cuantitativa de taninos 3.2.2.3. Determinacin cuantitativa de saponinas totales 3.2.3. Estudio Bromatolgico
3.2.3.1. Estudio qumico proximal 3.2.3.2. Determinacin de minerales y oligoelementos 3.2.3.3. Determinacin de vitaminas 3.2.3.4. Digestibilidad de protenas in vitro 3.2.3.4.1. Mtodo de pepsina y cido clorhdrico 3.2.3.4.2. Mtodo enzimtico por celulasa 3.2.3.5. Determinacin de aminocidos por HPLC 3.2.4. Evaluacin de la toxicidad aguda a dosis limite
IV. RESULTADOS 4.1. Estudio Farmacognstico 4.1.1. Ensayo organolptico 4.1.2. Anlisis cualitativo 4.1.3. Anlisis cuantitativo de taninos y saponinas totales 4.1.3.1. Determinacin cuantitativa de taninos 4.1.3.2. Determinacin cuantitativa de saponinas totales 4.1.4. Anlisis cromatogrfico 4.2. Estudio Bromatolgico 4.2.1. Anlisis qumico proximal 4.2.2. Fibra detergente neutra 4.2.3. Minerales esenciales 4.2.4. Vitaminas 4.2.5. pH y acidez total 4.2.6. Digestibilidad de protenas in vitro
65 65 65 65 67 67 70 72 75 75 78 79 79 80 83
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4.2.6.1. Nitrgeno soluble en pepsina 4.2.6.2. Digestibilidad enzimtica por celulasa 4.2.6.2.1. ANOVA de tiempo y porcentaje de digestibilidad 4.2.6.3. Determinacin de aminocidos 4.2.6.3.1. Prueba de solubilidad y determinacin de protenas 4.2.6.3.2. Extraccin y purificacin de protenas 4.2.6.3.3. Valores obtenidos del pico I del fraccionamiento proteico 4.2.6.3.4. Composicin de aminocidos de los residuos de la extraccin de aceite de sacha inchi 4.2.6.3.4.1. Anlisis de los aminocidos esenciales del sacha inchi 4.2.6.3.4.2. Puntaje qumico 4.3. Evaluacin de toxicidad aguda a dosis limite
83 84 85 86 86 87 88
89 90 91 93
V. DISCUSIN VI. CONCLUSIONES VII. RECOMENDACIONES VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS IX. ANEXOS
98 104 105 106 112
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NDICE DE TABLAS
Pgina Tabla1.Composicin qumica del sacha inchi Tabla2.Uso etnofarmacolgico de Plukenetia volubilis L. sacha inchi Tabla3. Hbitat y recoleccin Tabla 4.Digestibilidad en diferentes mezclas nutritivas Tabla 5.Puntaje qumico de algunos alimentos Tabla 6.Las protenas y aminocidos de la semilla de sacha inchi versus otras semillas Tabla 7.Reactivos de derivatizacin Tabla 8. Beneficio de la fibra soluble e insoluble en la salud Tabla 9. Clasificacin de la fibra segn su grado de fermentabilidad Tabla 10. Exportaciones de productos naturales en dlares americano Tabla 11. Composicin de los residuos slidos municipales Tabla 12. Composicin de los principios inmediatos del anlisis de Weende Tabla 13. Condiciones de la separacin de los PICT Tabla 14. Ensayo organolptico Tabla 15. Rendimiento y determinacin de sustancias solubles Tabla 16. Resultado de la marcha fitoqumica del extracto etreo Tabla 17. Resultado de la marcha fitoqumica del extracto alcohlico Tabla 18. Resultado de la marcha fitoqumica del extracto acuoso Tabla 19. Resultados de la determinacin de carbohidratos Tabla 20. Curva de calibracin de cido tnico (x/y) Tabla 21. Estadstica de la regresin del cido tnico Tabla 22. Anlisis de varianza del cido tnico Tabla 23. Porcentaje de cido tnico de residuos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L. Tabla 24. Curva de calibracin de saponina estndar y estadstica descriptiva de (x/y) Tabla 25. Estadstica de regresin de la saponina estndar Tabla 26. Anlisis de varianza de la saponina estndar Tabla 27. Porcentaje de saponinas totales de residuos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. Tabla 28. Determinacin de humedad Tabla 29. Determinacin de protenas Tabla 30. Determinacin de protenas en muestra desengrasada Tabla 31. Determinacin de extracto etreo Tabla 32. Determinacin de fibra cruda Tabla 33. Determinacin de cenizas 72 75 75 76 76 76 77 69 70 71 71 15 16 17 20 21 22 25 28 29 33 36 55 60 65 65 65 66 66 67 67 67 67
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Pgina Tabla 34. Anlisis proximal de los residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia
volubilis L. 77
Tabla 35. Determinacin de la pared celular y contenido celular Tabla 36. Determinacin de FDN Tabla 37. Resultados de la determinacin de FDN Tabla 38. Determinacin de calcio, fsforo, hierro Tabla 39. Determinacin de tiamina, riboflavina y niacina Tabla 40. Resultados de la determinacin de minerales y vitaminas Tabla 41. Resultados de la determinacin de pH Tabla 42. Resultados de la determinacin de acidez total Tabla 43. Tabla comparativa del anlisis proximal y pared celular de residuos obtenidos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L., Glycine max L., Chenopodium quinoa W. Tabla 44.Tabla comparativa de minerales, vitaminas (tiamina) de residuos obtenidos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L., Glycine max L., Chenopodium quinoa W. Tabla 45. Resultados de la digestibilidad de protenas in vitro por el mtodo enzimtico pepsina de los residuos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. Tabla 46. Resultados de la digestibilidad enzimtica in vitro por el mtodo enzimtico de celulasa Tabla 47. Resumen de ANOVA de la influencia del tiempo en el %DMS por celulasa Tabla 48. Resultado de ANOVA del %DMS en funcin del tiempo Tabla 49. Resultados de la prueba de solubilidad y determinacin de protenas de los residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L., para la utilizacin del solvente adecuado para la extraccin de la fraccin proteica Tabla 50. Condiciones de la fraccin proteica, del mayor pico obtenido del residuo de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. sacha inchi
78 78 78 79 79 79 80 80
81
82
83
84 85 85
86
88
Tabla 51. Aminograma de los residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. sacha inchi (mg/g) en comparacin con A.caudatus, Glycine max L., Chenopodium quinoa.W. Tabla 52. Comparacin de la composicin de los aminocidos esenciales de los residuos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. sacha inchi(mg/g) con Chenopodium quinoa.W, Chenopodium pallidicaule, Oxalis tuberosa, Tropaeolum tuberosum, Arachis hipogea L., Helianthus annuus L y la FAO/OMS 90
89
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Pgina Tabla 53.Puntaje qumico Tabla 54. Resultados del ensayo de toxicidad aguda oral a dosis limite Tabla 55. Resultados del comportamiento de la media desviacin estndar en la evaluacin de toxicidad aguda a los 0, 7 y 14 das. Tabla 56. Rango de la masa corporal con relacin a la edad en semanas de la especie y lnea del modelo biolgico. Tabla 57. Resumen ANOVA para el grupo control y tratado para ambos sexos Tabla 58. Anlisis de varianza para determinar la diferencia entre grupos Tabla 59. Prueba F para varianza de dos muestras para la determinacin del comportamiento del peso corporal para el grupo control y tratado hembra. Tabla 60. Prueba T para dos muestras suponiendo varianzas iguales para la determinacin del comportamiento del peso corporal para el grupo control y tratado hembra. Tabla 61. Prueba F para varianza de dos muestras para la determinacin del comportamiento del peso corporal para el grupo control y tratado macho. Tabla 62. Prueba T para dos muestras suponiendo varianzas iguales para la determinacin del comportamiento del peso corporal para el grupo control y tratado macho 97 97 96 96 93 95 95 93 91 93
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NDICE DE FIGURAS
Pgina 19 26 26 27 31 32 34 34 35 35
Figura 1. Plantaciones de sacha inchi, fruto y semilla Figura 2. Reaccin de los aminocidos con OPA.MCE=Mercaptoetanol Figura 3. Reaccin de derivatizacin de los aminocidos con PICT Figura 4. Reaccin de derivatizacin de aminocidos con FMOC-Cl Figura 5. Proceso de extraccin del aceite y residuos de Plukenetia volubilis L. Figura 6. Exportaciones de productos naturales Figura 7. Evolucin de las exportaciones de sacha inchi y derivados Figura 8. Estimacin de residuos basada en la poblacin total del pas Figura 9. Disposicin final de los residuos slidos Figura 10. Composicin de los residuos slidos Figura 11. Diagrama de flujo del estudio realizado a los residuos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. sacha inchi
45
Figura 12. Extraccin sucesiva al residuo de la extraccin de Plukenetia volubilis L. sacha inchi para la marcha fitoqumica Figura 12. Marcha fitoqumica del extracto etreo Figura 13. Marcha fitoqumica del extracto alcohlico Figura 14. Marcha fitoqumica del extracto acuoso Figura 15. Procedimiento de extraccin, identificacin y cuantificacin de saponinas totales Figura 16. Determinacin de fibra cruda Figura 17. Determinacin de fibra detergente neutro 46 47 47 48 52 53 54
Figura 18. Procedimiento de extraccin de protenas solubles de residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. sacha inchi. Figura 19. Procedimiento de hidrlisis de la protena soluble y derivatizacin de los aminocidos de residuos industriales de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L. sacha inchi Figura 20. Proceso de separacin de los feniltiocarbamilaminocidos de residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. sacha inchi Figura 21. Recta de regresin del cido tnico Figura 22. Recta de regresin de la saponina estndar. Figura 23. Comparacin del anlisis proximal y pared celular de residuos obtenidos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. sacha inchi, Glycine max L. soya; Chenopodium quinoa W. quinoa Figura 24. Comparacin de minerales, calcio, fsforo y hierro de residuos obtenidos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. sacha inchi, Glycine max L.soya; Chenopodium quinoa W. quinoa 82 81 63 69 71 62 61
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Pgina Figura 25. Comparacin en g/g % de tiamina de residuos obtenidos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. sacha inchi, Glycine max L.soya;Chenopodium quinoa w. quinoa Figura 26. Curva de la absorbancia de la fraccin proteica de la muestra del residuo al 20% en Tris-HCl 0.05M 6.5pH a una lectura de 280nm y 30 mL/h de elucin Figura 27. Curva de la absorbancia de la fraccin proteica de la muestra del residuo al 30% en Tris-HCl 0.05m 6.5ph a una lectura de 280nm y 30 mL /h de elucin una concentracin de 2.5 moles*mL-1, en una dilucin de 20 uL en 300uL de buffer acetato de amonio 0.05M, pH 6 Figura 29.Composicin de aminocidos de los residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L.sacha inchi. (30%) en una dilucin de 3.7mg de protena soluble en 500uL de buffer acetato de amonio 0.05M,pH 6 Figura 30.Composicin de aminocidos de los residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L.sacha inchi. (20%) en una dilucin de 3.4 mg de protena soluble en 500uL de buffer acetato de amonio 0.05M,pH 6 Figura 31. Ganancia de peso en el ensayo de toxicidad aguda a dosis nica oral en el grupo control y tratamiento de hembras a los 7 y 14 das de ensayo Figura 32. Comportamiento del peso corporal para el grupo control y tratado hembra Figura 33. Comportamiento del peso corporal para el grupo control y tratado macho 94 96 97 92 92 91 velocidad de 87 velocidad de 87 83
Figura 28.Composicin de la solucin estndar de aminocidos stock NAA-S-18 (Sigma Aldrich) a
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ABREVIATURAS
FONAM HPLC UV FAO WHO CFR OPA PICT FMOC-Cl CERPER SAT Tris-HCl
: Fondo Nacional del Ambiente. : High Performance Liquid Chromatography. : Ultravioleta. : Food and Agriculture Organization. : World Health Organization. : Cromatografa en fase reversa. : Ortoftaladehido. : Fenilisotiocianato. : Fluorenilmetil cloroformato. : Certificaciones del Per. : Sociedad de Asesoramiento Tcnico. : 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol, hydrochloride; Tris HCl; Tris (hydroxymethyl) aminomethane Hydrochloride.
Vo AA-STD-18 pp ANOVA R R2 ppm
: Volumen muerto. :18 aminocidos estndar. : Precipitado. : Anlisis de varianza. : Coeficiente de correlacin. : Coeficiente de determinacin. : Partes por milln. : Media. : Desviacin estndar : Distribucin F de Fisher-Snedecor. : Fibra detergente neutra. : Digestibilidad de materia seca. : Flavina mononucletido : Flavina adenina dinucletido
x s
F FDN DMS FMN FAD
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RESUMEN
La produccin de biomasa residual, como consecuencia de las actividades humanas constituye fuente de energa y materiales desaprovechados con grave peligro para la biosfera y dao a sus recursos naturales. Dentro de la composicin de residuos slidos, se encuentran en mayor proporcin los de materia orgnica y dentro de estos se encuentran los residuos producidos por la industria aceitera y de granos oleosos que se incrementa en estos ltimos aos. El presente trabajo de investigacin realiz un estudio, farmacognstico, bromatolgico y toxicolgico de los residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. para su aprovechamiento total y contribuir al desarrollo sostenible del pas. En los resultados del estudio farmacognstico se ha encontrado: esteroides, taninos y saponsidos. Los valores promedios obtenidos de taninos y saponinas totales en g% de muestra fueron: 1,3 x 10-5 y 0,420.01 respectivamente. En el estudio bromatolgico: humedad, protenas totales, extracto etreo, fibra bruta, cenizas, extracto libre de nitrgeno (g%):5,090,06; 34,260,01; 37,332,87; 3,161,08 y
3,240,33 respectivamente. Fibra detergente neutro 16,33. Calcio, fsforo, hierro y tiamina en mg/100g: 317,83; 560,00; 4,19 y 0,31 respectivamente. La digestibilidad de protenas in vitro por nitrgeno soluble en pepsina y celulasa fue de (g%) : 86,890,33 y 90,711.73. y aminocidos esenciales mg/g: histidina 9,00; isoleucina 180,00; leucina 69,00; lisina 39,00; metionina 13,00; fenilalanina+tirosina 31,00; treonina 68,00 y valina 31,00. El estudio del ensayo toxicolgico a dosis limite demostr la inocuidad de los residuos a dosis de 2000 mg/kg
Palabras claves: Plukenetia volubilis L., residuo, taninos, saponinas, anlisis proximal, digestibilidad in vitro aminocidos, HPLC.
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SUMMARY
The production of residual biomass as a result of human activities, in addition to being a source of energy and materials almost entirely untapped, it presents a great danger to the biosphere where uncontrolled discharge or abandonment damages or destroys natural resources. Within the composition of solid waste, is in the highest proportion of organic matter and within these are the wastes produced by the oil industry and oil seeds. The industrial production of oil sacha inchi this increase in recent years, therefore, the production of waste is increasing. This research conducts a survey pharmacognostic, dieticians, and toxicology of industrial waste from the extraction of oil sacha inchi to be harvested at 100% and thus contribute to sustainable development of the country. In the study results pharmacognostic were found as secondary metabolites: steroids, tannins and saponins heterosides. The average values derived from tannins and saponins in g% of total sample were: 1.3 x 10-5 and 0.42 0.01 respectively. The study bromatological: Moisture, total protein, ether extract, crude fiber, ash, nitrogen free extract (g %): 5.09 0.06; 34.26 0.01; 37.33 2.87; 3.161.08 and 3.24 0.33 respectively. Neutral detergent fiber, 16.33. Calcium, phosphorus, iron, thiamine mg/100g: 317, 83; 560, 00; 4, 19 and 0, 31 respectively. In vitro protein digestibility of nitrogen soluble in pepsin and cellulase (g%): 86.890.33 and 90.711.73
Essential amino acids mg / g: histidne 9,00; isoleucine 180,00 ; leucine 69,00; lysine 39,00; methionine 13,00; phenylalanine + tyrosine 31,00; threonine 68,00 and valine 31,00. The results demonstrated the toxicological safety of the aqueous extract fixed dose of 2000 mg / kg.
Keywords: Plukenetia volubilis L., residue, tannins, saponins, proximate analysis, in vitro digestibility, amino acids, HPLC.
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I.
INTRODUCCIN
La gran produccin de residuos que supone la normal actividad del hombre sobre nuestro planeta es uno de los principales problemas de hoy; ya que, provocan una progresiva degradacin del medio ambiente.
Las industrias de productos alimenticios y bebidas no son tan contaminantes como otros sectores; sin embargo, son responsables de contaminar el medio ambiente al descargar efluentes lquidos con grandes cantidades de sedimento y residuos slidos, por ejemplo, las industrias elaboradoras de aceite comestible que eliminan fibras, cscaras y residuos resultantes de la extraccin de aceite y grasa.
De acuerdo con el ADEX, PROMPEX y Biocomercio Per, el aceite de sacha inchi y derivados han presentado una tendencia exportadora, relacionndose directamente a la produccin de residuos. Plukenetia volubilis L., sacha inchi, es una Euphorbiaceae que comnmente se conoce como man del monte, sacha man o man del inca. Se encuentra distribuida desde Amrica Central y en el Per se le encuentra en estado silvestre en diversos lugares de San Martn, Ucayali, Hunuco, Amazonas, Madre de Dios y Loreto. Crece desde los 100 hasta los 2 000 m.s.n.m. Fue cultivado tambin en la costa peruana en la poca prehispnica y se han encontrado semillas y representaciones en cermicas (Brack, 1 999). La primera mencin cientfica de Plukenetia volubilis L., fue hecha en 1980 a consecuencia de los anlisis de contenido graso y proteico realizados por la Universidad de Cornell en USA, que demostraron que las semillas de Plukenetia volubilis L., poseen 33% de protenas y de 49% , lo que conllev a un programa de investigaciones de las bondades del aceite como se describe y en la literatura; as como, estudios qumicos, bromatolgicos y ensayos clnicos en marcha. Pascual, G., et al encontraron cidos grasos del aceite crudo de Plukenetia volubilis L., destacando el cido linolnico (43,75 %) y el cido linoleico (36,99 %) y cidos grasos saturados como el cido palmtico (5,61 %). Gorriti, A., et al demostraron la actividad hipolipemiante del aceite de Plukenetia volubilis L., y no presentar toxicidad a dosis lmite; tambin se ha realizado el estudio clnico Fase I de un alimento funcional a base de aceite de Plukenetia volubilis L., encontraron que el consumo a dosis diarias de 400 mg, 600 mg durante 30 das, en voluntarios sanos, no ocasionaron efectos adversos, ni alteracin de signos vitales, revelando seguridad y tolerancia. De acuerdo a lo anteriormente referido las investigaciones realizadas, muestran una mayor atencin a las propiedades del aceite; sin embargo, se ha dejado de lado los residuos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L.
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En nuestro pas, en el ao 2000, el Congreso de la Republica promulg en El Peruano la Ley General de Residuos Slidos, Ley N 27314, para gestionar y manejar los residuos slidos en el Per, que generan rentabilidad econmica con derivados que puedan ser insertados en las cadenas de produccin y mercados ya existentes.
La produccin de aceite de sacha inchi genera residuos, que an no han sido estudiados. Por tal motivo, se ha realizado: El estudio Farmacognstico y Bromatolgico de los residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. (sacha inchi).
El presente trabajo de investigacin tiene como objetivo general:
Aprovechar los residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. (sacha inchi), mediante el conocimiento integral de esta especie nativa, fomentando el desarrollo econmico y social sostenible.
Sus objetivos especficos son:
1. Realizar el estudio farmacognstico de los residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. (sacha inchi). 2. Realizar el estudio bromatolgico de los residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. (sacha inchi). 3. Determinar el valor nutritivo a travs de la digestibilidad in vitro y la determinacin de aminocidos esenciales de los residuos industriales de la extraccin del aceite de volubilis L. (sacha inchi). 4. Evaluar la toxicidad aguda oral a dosis limites del extracto acuoso de los residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. (sacha inchi). Plukenetia
La presente investigacin se ha realizado gracias al apoyo de la Ctedra de Farmacognsia, Laboratorio de Bioqumica y Nutricin Animal del Centro de Produccin de la Facultad de Medicina de Veterinaria de la UNMSM y el Centro de Investigacin de Bioqumica y Nutricin de la Facultad de Medicina Humana de la UNMSM.
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II. GENERALIDADES
2.1. ANTECEDENTES
En la dcada de los ochenta, el gobierno peruano realiz diferentes estudios con el objetivo de buscar un producto agrario alternativo de gran productividad, que pudiera sustituir las plantaciones de hoja de coca, para apoyar a la lucha contra la pobreza. (1) Entre estos estudios apareci la investigacin de Plukenetia volubilis L., hasta la fecha hay un sin nmero de investigaciones sobre esta planta, a continuacin se presentan las ms relevantes: Huamn. J., et al
(2)
determinaron que la ingesta de 50g de Plukenetia volubilis L. (sacha inchi)
que contena 11g de omega 3 e ingerido como man disminuy la trigliceridemia posprandial en adultos jvenes. Pascual, G., et al
(3)
encontraron cidos grasos del aceite crudo de sacha inchi, destacando el
cido linolnico (43,75 %) y el cido linoleico (36,99 %) y cidos grasos saturados como el cido palmtico (5,61 %). Gorriti, A., et al
(4)
encontraron cidos esenciales poliinsaturados (82,21 %), monoinsaturados
(9,62 %) y saturados (7,62%) en el aceite de sacha inchi, destacando: cido linolnico (48,54 %) y el cido linoleico (36,67 %). Asimismo ha demostrado la actividad hipolipemiante del aceite de sacha inchi, la cual no produce toxicidad a dosis lmite. Gorriti, A., et al
(5)
realizaron el estudio clnico Fase I de un alimento funcional a base de aceite
de sacha inchi, encontrando que la aplicacin a dosis diarias de 400 mg, 600 mg durante 30 das, en voluntarios sanos, no ocasion efectos adversos, ni alteracin de signos vitales. En el ao 2001, a travs del convenio INIA Agroindustria Amaznica, analiz muestras de semilla del germoplasma de la estacin experimental El Porvenir en los laboratorios del Instituto Tecnolgico Pesquero del Per, se encontr 44,24% y 54,21% de contenido de aceite (6).
Benavides, J.; Morales, J.; y Chagman, J.; presentaron los resultados de su investigacin en un documento titulado: Avances en la caracterizacin del aceite y protenas del cultivo Plukenetia volubilis L. como alternativa para la alimentacin humana y animal (Yurimaguas Per; Instituto Nacional de Investigacin Agraria. 1994. 17 h.). Los ecotipos Lamas y Shanao, procedentes de Tarapoto, se seleccion para este estudio. Los resultados mostraron que el ecotipo Lamas destac en contenido de aceite 41,7 %, superando en 1,2 % al ecotipo de Shanao, tambin Lamas destac en contenido de protenas. La calidad del aceite est dada por el alto contenido de cidos grasos insaturados; Lamas y Shanao arrojaron 91,33 y 88,81% (7).
- 14 -
En el ao de 1995, Vela, L., desarroll la tesis de grado Ensayos para la extraccin y caracterizacin del aceite de sacha inchi en el departamento de San Martn. (8)
El Instituto Nacional de Produccin, a travs de estudios realizados por Gmez I., Reyna, J., Obregn, A., y Vela, L., determinaron que esta oleaginosa silvestre, contiene 48% de grasa , este equipo determin tambin la calidad de la protena de Plukenetia volubilis L., utilizando polvo atomizado y harina desengrasada por prensado. (8)
El Instituto de Ciencias de los Alimento de la Universidad de CORNELL,

(9)
encontr en
Plukenetia volubilis L., un elevado contenido de aceite (49%), un contenido relativamente alto de protenas (33%) y alto grado de digestibilidad .
Tabla 1. Composicin de la torta desengrasada de Plukenetia volubilis L.
Fuente: Extraccin y caracterizacin de Plukenetia volubilis L. Pascual G. 1992
- 15 -
2.1. ESTUDIO FARMACOGNSTICO
2.1.1. DATOS ETNOBOTNICOS Y ETNOFARMACOLGICOS 2.1.1.1. Datos etnobotnicos

La familia Euphorbiaceae comprende plantas anuales, de importancia ornamental, medicinal, alimentaria e industrial, que se caracterizan por la presencia de una sustancia lechosa, tipo ltex y frutos tricapsulares. Abarca alrededor de 1280 gneros con 8000 especies aproximadamente, y se observa que est distribuido en todo el orbe (10). Plukenetia volubilis L., es una planta nativa de la Amazona Peruana descrita por primera vez, como especie, en el ao 1753 por el Naturalista Linneo; de ah su nombre cientfico. Crece desde los 100 msnm hasta 1500 msnm. Es un arbusto trepador o rastrero comnmente se le encuentra en bordes de bosques secundarios (purmas), en caaverales, sobre cercos vivos y como maleza en platanales y cultivos permanentes
(12)
. Se cultiv en la costa peruana desde la poca prehispnica y se han encontrado
semillas y representaciones de su fruto en cermicas de las culturas Chim y Mochica. Actualmente se estudia la presencia de esta planta en la milenaria cultura Caral, al norte de Lima-Per, con ms de 3000 aos de antigedad (13).
2.1.1.2. Uso etnofarmacolgico

En las reas rurales de San Martn los pobladores utilizan la almendra de Plukenetia volubilis L., en su alimentacin, ya sea cocida o tostada en la preparacin de diversos platos como inchicapi, aj de sacha inchi, cutacho, mantequilla de sacha inchi, inchi cucho, tamal de sacha inchi, turrn de sacha inchi, ingesta de hojas crudas o cocidas por los pobladores nativos de la Amazona, particularmente los huitotos , por considerar sus semillas muy nutritivas (10-12).
Las ancianas mayurunas, chayuhuitas, campas, huitotas, shipibas, yaguas y boras (pueblos indgenas de la amazona peruana) mezclan el aceite de Plukenetia volubilis L. con harina de esta misma almendra y preparan una crema especial para revitalizar y rejuvenecer la piel (Especies vegetales promisorias de los pases del Convenio Andrs Bello, 1992) (14).
- 16 -
Tabla 2. Uso etnofarmacolgico de Plukenetia volubilis L.
Nombres vulgares, sacha inchi, sacha inchic, sacha man, man del inca, man del monte,inca pennut Profesional Familiar Hierbero Raz Tallo Hojas Flores Semilla Planta entera Recomendaciones de uso, el sabor ligeramente amargo ("patco") de la almendra cruda desaparece durante el cocido, el tostado. Otras Disminuye el colesterol malo Cuidados ninguno Origen biolgico Plukenetia volubilis L. Familia Euphorbiaceae Familia Nombre cientfico Plukenetia volubilis L. Nombre Vulgar sacha inchi Dolencias Estrategia De Obtencin Recoleccin Lugar de Obtencin Campos
Euphorbiaceae
Hipercolesterolemia
2.1.2. HBITAT Y RECOLECCIN

El gnero Plukenetia ha sido reportado en Malasia, Nueva Guinea, Borneo, Mxico, etc. (Biblioteca Conmemorativa Orton, 1987). El nmero de especies reportadas en Amrica Tropical vara de 7 a 12 (Stanley y Steyemark, 1949; Hutchinson, 1969). En Amrica del Sur, la presencia de Plukenetia volubilis L., ha sido registrada en Bolivia y en la Amazona Peruana en los departamentos de Madre de Dios, Hunuco, Oxapampa y San Martn (15).
Tabla 3. Hbitat y recoleccin de Plukenetia volubilis L.

Amplia adaptacin a diferentes tipos de suelo; crece en suelos cidos (pH por debajo de 5.5) y con alta concentracin de aluminio. Franco arcillosos y arenosos (pH 5.5 a 6.5) Hmedo Mnimo 10 C, mximo 36C. Crece desde los 100 msnm en la Selva Baja y 2 000 msnm en la Selva Alta. Bosque tropical Entre los 6.5 y 8.0 meses despus del trasplante, cuando los frutos estn secos, recogindose las cpsulas manualmente cada 15 30 das. Invierno
Suelo Clima Temperatura Altitud Hbitat Edad Estacin
- 17 -
2.1.3. PROTOCOLO BOTNICO 2.1.3.1.Ubicacin taxonmica

La clasificacin botnica de la planta es la siguiente. (12,16)
Reino
Vegetal Magnoliophyta Magnoliopsida Euphorbiales Euphorbiaceae Plukenetia Plukenetia volubilis Linneo. Pinto Recodo
Divisin : Clase Orden : :
Familia : Gnero : Especie : Ecotipo :
La especie Plukenetia volubilis L., es conocida de acuerdo al idioma o lugar con los siguientes nombres: Sacha inchi , mani estrella, mani inca, mani de monte, mani de bejuco, cacahuate inca, Ngart, Inca peanut, supua, amui-o, sacha yuchi, sacha yuchiqui,sampannankii,suwaa.Debido a la alta variabilidad gentica se tienen los siguientes ecotipos: Pinto Recodo, Tambo Yaguas, Muyuy, Cumbaza, Lamas, Shanao y Ro Putumayo (10).
2.1.3.2. Descripcin morfolgica

Es una planta trepadora, voluble, semileosa, de altura indeterminada de hojas alternas, de color verde oscuro, oval - elpticas, aseruladas y pinnitinervias, de 09 16 cm de largo y 06 10 cm. ancho. El pice es puntiagudo y la base es plana o semi-arrionada; las flores presenta un alto porcentaje de polinizacin cruzada, lo que implica es una especie algama. En el sacha inchi se observan 2 tipos de flores: las masculinas son pequeas, blanquecinas, dispuestas en racimos y las femeninas se encuentran en la base del racimo y ubicadas lateralmente de una a dos flores; el fruto es una cpsula, de 3,5 a 4,5 cm. de dimetro, con 4 lbulos aristados (tetralobados) dentro de los cuales se encuentran 4 semillas y las semilla son ovaladas marrn oscuro, ligeramente abultadas en el centro y aplastadas hacia el borde. Segn los ecotipos, el dimetro flucta entre 1,3 y 2,1 cm. y de 48 a 100 g de peso. En condiciones de medio ambiente y al aire libre, la semilla se conserva por ms de un ao (15).
- 18 -
Figura 1. A la izquierda, plantaciones de sacha inchi en la amazona peruana. A la derecha, fruto y semilla de Plukenetia volubilis L.
2.2. ESTUDIO BROMATOLGICO
2.2.1.
VALOR NUTRITIVO
El valor nutritivo de los alimentos est determinado por la biodisponibilidad de nutrientes y la
dinmica de los procesos de solubilizacin e hidrlisis en el tracto gastro-intestinal. La utilizacin neta de la protena, de leguminosa, en monogstricos est en torno al 65 70% en animales en crecimiento, mientras que los valores observados con protenas de origen animal suelen superar el 90%. Esto se debe principalmente a tres causas: el perfil de aminocidos de la protena del grano leguminoso, su digestibilidad, y la presencia de sustancias no nutritivas (17). Para valorar el empleo de leguminosas grano en la alimentacin de rumiantes, es necesario conocer las caractersticas de estas semillas como fuente de protena, su degradabilidad y digestibilidad, as como su efecto sobre la produccin y composicin de la leche.
- 19 -
2.2.1.1. Digestibilidad
La composicin qumica de un alimento es solamente un indicativo del contenido de nutrientes, pero no de su biodisponibilidad; entonces, si una fuente de protena ha sido procesada inadecuadamente, no puede ser bien digerida por el animal y contribuir muy poco a su crecimiento y a la produccin. La digestibilidad se define como el porcentaje de un nutriente que desaparece a su paso por el tracto gastrointestinal. Es la proporcin de alimento ingerido que no aparece en las heces. Se expresa en porcentaje (%). A medida que aumenta el contenido de pared celular y principalmente el de lignina, disminuye el % de protena bruta del forraje. A medida que aumenta la madurez, disminuye su contenido de protenas y de azcares solubles, y se eleva el contenido de fibra (principalmente celulosa y lignina). (18) Los mtodos para medir la digestibilidad de los nutrientes, implica el empleo de animales, pero resultan costosos en cuanto a tiempo, mano de obra calificada y nmero de anlisis qumicos. Generalmente se utilizan mtodos qumicos para la determinacin de digestibilidad. Los mtodos qumicos consisten en exponer los alimentos a la accin de enzimas digestivas como la pepsina, la celulasa y lquido rumial, incubandose las muestras durante cierto periodo bajo condiciones controladas. (19)
Tabla 4. Digestibilidad en diferentes muestras mezcla/proporciones en %

Mezcla Quinua Kiwicha Frijol Quinua Caihua Haba Kiwicha Arroz Tarwi Kiwicha Tarwi Caihua Caseina Proporcin % 61 19 20 75 15 10 56 44 47 51 51 49 PER* corregido 2.59 Digestibilidad aparente 79.39
2.36
79.20
2.48 1.35 1.34 2.50
80.60 82.03 83.77
Fuente: Reupo Carrasco, 1992. *Relacin de eficiencia de protena.
- 20 -
2.2.2. CALIDAD DE PROTENAS

El anlisis de las protenas es de gran importancia para determinar el valor nutritivo de los alimentos. La calidad de una protena esta definida por la cantidad y proporcin de aminocidos para satisfacer las necesidades nutricionales
(20)
En general, el contenido de aminocidos esenciales en los alimentos es un buen indicador de la calidad de una protena, particularmente si la digestibilidad es alta, por lo tanto; si se conoce el contenido de aminocidos esenciales de un alimento y se comparan con un patrn de referencia, se puede calcular su calidad respecto a cada aminocido. El contenido de aminocidos esenciales de un producto es corregido con respecto al contenido de protena y luego es comparado con el porcentaje de aminocidos de la protena de referencia, otorgndole as puntuacin a cada aminocido. Los aminocidos esenciales son: metionina, cistena, lisina, treonina, valina, isoleucina, leucina, fenilalanina, tirosina y triptfano (21).
2.2.3. ANLISIS DE AMINOCIDOS

La mayora de procedimientos para el anlisis de aminocidos dependen del uso de mtodos cromatogrficos, en especial la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), que constituye una tcnica cuantitativa, rpida y altamente sensible, capaz de producir una buena resolucin de compuestos qumicamente similares, por ejemplo, aminocidos y vitaminas. Esta tcnica emplea columnas con dimetro de 2-5 mm, empacadas con partculas muy pequeas (3-10 ) y fases mviles cuyo flujo se controla de manera muy precisa. El nico inconveniente de esta tcnica se debe a la preparacin de derivados antes o despus de la separacin cromatogrfica; ya que, por s solos los aminocidos no son detectados fcilmente por UV o fluorescencia (21,22).
Tabla 5. Puntaje qumico de algunos alimentos

Alimentos Leche Huevo Carne de res Protena aislada de soya Frijol rojo Arveja Garbanzo Frijol negro Arroz Avena Lentejas Haba Trigo
Fuente: Torum, B. et. al. 1996. Recomendaciones dietticas diarias del
PQ % 100 100 100 97 84 82 81 74 73 63 60 55 44

INCAP. Edicin 45
Aniversario.INCAP/OPS.Guatemala.
UNMSM-Facultad de Farmacia y Bioqumica - 21 Bach. Iris Giovana Mondragn Tarrillo
Tabla 6. Las protenas y aminocidos de la semilla de Plukenetia volubilis L. versus diferentes semillas y patrones recomendados por la FAO/WHO/ONU
PROTEINAS Y AMINOCIDOS Sacha Inchi 27 Soya 28 SEMILLAS (2) (3) Patrones FAO/WHO/ONU Girasol 24 -.-
Man 23
Algodn 23
PROTEINAS (1)
AMINOCIDOS ESENCIALES Histidina 26 Isoleucina 50 Leucina 64 Lisina 43 Metionina 12 Cistena 25 Metionina + cistena 37 Fenilalanina 24 Tirosina 55 Fenilalanina+tirosina 79 Treonina 43 Triptofano 29 Valina 40 AMINOCIDOS NO ESENCIALES Alanina 36 Arginina 55 Asparagina 111 Glutamina 133 Glicina 118 Prolina 48 Serina 64 TEAA* 411 TAA** 976 TEAA (% de TAA) 42
25 45 78 54 13 13 26 49 31 80 39 13 48 43 72 117 187 42 55 51 418 985 42
24 34 64 35 12 13 25 50 39 89 26 10 42 39 112 114 183 56 44 48 349 945 37
27 33 59 44 13 16 29 52 29 81 33 13 46 41 112 94 200 42 38 44 365 936 39
23 43 64 36 15 15 34 15 19 54 37 14 51 42 80 93 218 54 45 43 366 941 39
19 28 66 58 -.-.25 -.-.53 34 11 35 -.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-
Fuente: Hamaker et al. 1992. Universidad de Arkansas, USA*TEAA= Aminocidos esenciales totales **TAA= Total de aminocidos
1. 2. 3.
Los valores estn indicados en mg/g de protenas Valores para soya, man, algodn y girasol (Bodwel y Hopkins (1985) ) Niveles recomendados para nios en edad pre-escolar (2-5 aos). La recomendacin para la evaluacin de la calidad de la dieta proteica para todos los grupos, a excepcin de infantes (Expertos FAO/WHO 1990).
- 22 -
2.2.3.1. Cromatografa lquida de alta resolucin de fase reversa

La cromatografa de intercambio inico es el mtodo de anlisis de aminocidos ms utilizados; sin embargo, si el anlisis no se lleva a cabo de manera rutinaria, los altos costos hacen que la cromatografa de fase reversa sea el mtodo de eleccin (23,24). En la cromatografa de fase reversa, la fase estacionaria es menos polar que la fase mvil y se utilizan fundamentalmente dos tipos de fases estacionarias: partculas esfricas de poliestireno y divinilbenceno, unidos por enlaces cruzados; y el tipo ms comn lo constituyen partculas de slice recubiertas por grupos no polares orgnicos como CH3, -C8H7 y C18H37. De stas, las fases
estacionarias de octadecilsilano (denominados ODS o C18) son las ms populares y con menor frecuencia se utilizan las C8. La particin de los componentes de la muestra depender de sus respectivas caractersticas de solubilidad. Los componentes menos hidrofbicos se asociaran primariamente con la fase hidroflica, mientras que los componentes ms hidrofbicos se encontrarn en la fase lipoflica (23). En cuanto a las fases mviles empleadas en la separacin de la fase reversa, los disolventes poco polares son eluyentes ms poderosos y se presentan en gran variedad. La fase mvil puede ser considerada como una solucin acuosa de un disolvente orgnico, el tipo y concentracin determinarn su poder extractor. Algunos solventes orgnicos usados comnmente para la hidrofbicidad son metanol, propanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano. La eleccin del componente orgnico depende de su selectividad para separar ciertos pares de aminocidos y por la forma en que su presencia influye en la presin de la columna. Los cambios en el disolvente producen desplazamientos entre el equilibrio en las fases mviles y estacionarias (24). La separacin cromatogrfica se puede mejorar pasando de una elucin isocrtica (pasa un nico eluyente) a una elucin en gradiente; esta ltima se consigue mezclando dos o ms eluyentes diferentes de manera que la composicin de la fase mvil cambie con el tiempo (25). Dependiendo del poder extractor del eluyente, una menor o mayor parte del componente de la muestra ser retenido reversiblemente por la fase estacionaria. Los compuestos hidroflicos se movern siempre ms rpido, ya que la fase mvil es siempre ms hidroflica que la fase estacionaria.
- 23 -
2.2.3.2. Mtodos de derivatizacin para la separacin cromatogrfica de aminocidos

La mayora de los aminocidos no derivatizados, no contienen cromforos adecuados para su deteccin, excepto a longitudes de ondas muy cortas por ejemplo a 200nm, como hay muchos compuestos que se absorben a esta longitud de onda, pueden presentarse muchas interferencias; por lo tanto, los aminocidos tienen que convertirse en derivados adecuados antes o despus de la separacin cromatogrfica. Los procedimientos de derivatizacin se dividen en postcolumna y precolumna (26). La derivatizacin postcolumna involucra los siguientes pasos: separacin de los aminocidos en la columna cromatogrfica, introduccin de un reactivo de derivatizacin en el sistema de efluente de la columna; paso de los lquidos combinados a travs de un colector mezclador seguido por una espiral de reaccin (debe calentarse) y finalmente bombeo de los aminocidos derivatizados a travs de un sistema de deteccin . La separacin se lleva a cabo mediante cromatografa de intercambio inico En la derivatizacin precolumna la mezcla de aminocidos reaccionan con el agente de derivatizacin antes de que los aminocidos sean separados. Las tcnicas difieren principalmente en las condiciones de reaccin (temperatura, tiempo, separacin del reactivo, estabilidad de los derivados, y mtodo de deteccin). Una de las desventajas de esta tcnica es que una porcin sustancial de todos los derivados ser idntica (la parte del reactivo de derivatizacin). Las pequeas diferencias entre las cadenas laterales de los aminocidos derivatizados tendrn un efecto menor en el comportamiento cromatogrfico de los aminocidos. La derivatizacin precolumna elimina la necesidad de utilizar reactores postcolumna costosos, y los derivados hidrofbicos de los aminocidos pueden se separados rpida y eficientemente con columnas de fase reversa. Estos sistemas, acoplados con detectores sensibles, permite la deteccin de aminocidos presentes en concentracin picomolar. Aunque la derivatizacin precolumna ofrece las ventajas mencionadas, no se ha podido desplazar completamente a los mtodos postcolumna tradicionales; para la aplicacin del anlisis de aminocidos de manera rutinaria, por lo que el agente de derivatizacin precolumna debe satisfacer los siguientes requerimientos: 1) Debe reaccionar rpidamente bajo condiciones moderadas para obtener rendimientos cuantitativos del derivado. 2) Debe reaccionar tanto con aminocidos primarios como secundarios. 3) Los derivados deben ser estables por varios das, de preferencia a temperatura ambiente para permitir el anlisis automatizado de varias muestras. 4) No debe haber interferencia del reactivo, productos de rupturas o reacciones secundarias. 5) Debe presentar respuesta lineal a los intervalos de concentracin tpicos de la mayora de las aplicaciones. 6) Los derivados deben poseer factores de respuesta molar razonablemente similares.
- 24 -
Se han investigado diferentes reactivos de derivatizacin precolumna, pero ninguno ha podido alcanzar una aceptacin universal debido a que no cumplen con uno o mas de los requerimientos mencionados anteriormente para esta tcnica. (27)
Tabla 7. Reactivos de derivatizacin

REACTIVOS Ninhidrina OPA Fluorescamina PITC Cloruro de dansilo Cloruro de dabsilo FMOC-Cl NBD-Cl NBD-F Complejos Mtodo de con: separacin 1os CIC o electroforsis os 1 CFR (en postcolumna,CIC) 1os CIC o electroforsis os os 1 y2 CFR 1os y 2os CFR os os 1 y2 CFR 1os y 2os CFR os os 1 y2 CFR 1os y 2os CFR Post- o precolumna PostPre- y postPostPrePrePrePrePre- y postPre- y postDeteccin VIS 570 nm Fluorescencia Fluorescencia UV 240-255 nm Fluorescencia VIS Fluorescencia Fluorescencia Fluorescencia
Fuente: Quattrocchi, A; Abelaira, S; Laba, R. Introduccin a la HPLC.
2.2.3.3. Reactivos de derivatizacin de precolumna 2.2.3.3.1. Ortoftaladehido (OPA)

Es el reactivo de derivatizacin ms comnmente usado en la cromatografa de fase reversa. La reaccin entre el OPA y los aminocidos primarios tienen lugar en presencia del grupo tiol como el del 2mercaptoetanol o etanodiol para formar derivados altamente fluorescentes. La ventajas que presenta este mtodo de derivatizacin es que la reaccin se lleva a cabo rpidamente (1 minuto a temperatura ambiente), midiendo la emisin a longitudes de onda superior a 430nm . No es necesario remover el exceso de OPA antes de la inyeccin de la muestra ya que OPA por s no interfiere con la separacin o la deteccin. Sin embargo; los derivados de OPA- aminocidos, son inestables. El OPA no reacciona con aminocidos secundarios. Esta desventaja puede solucionarse mediante la adicin de cloroformato. un segundo reactivo de derivatizacin, . utilizandose comnmente 9- Fluorenilmetil
(23, 26)
- 25 -
Figura 2. Reaccin de los aminocidos con opa.mce=mercaptoetanol.

Fuente: Development and evaluation of an HPLC method for the analysis of carotenoids in foods Chemistry.1995; 54:101-111. Hart, D.; Sccott, J.
2.2.3.3.2. Fenilisotiocianato (PICT)

El fenilisotiocianato ha sido utilizado por ms de 30 aos en la degradacin de Edman para secuenciar pptidos y protenas. El PICT reacciona con los aminocidos libres para dar feniltiocabamilaminocidos. Con este mtodo se puede cuantificar aminocidos secundarios como la prolina y la hidroxiprolina, as como, los productos de oxidacin de la metionina y cistena, metionina sulfato y cido cisteico, respectivamente . Bajo condiciones moderadas, la reaccin es prcticamente completa entre los 5 a 10 minutos; ya que el reactivo es voltil, se puede usar en exceso y eliminarlo fcilmente bajo presin reducida en un rotavapor
(50)
. Aunque, no es tan sensible como algunos reactivos
fluorescentes, sus derivados pueden cuantificarse en niveles picomolares en la regin ultravioleta a 254 nm. Estos derivados pueden ser estables hasta por cuatro semanas a 20C (23,26).
Figura 3. Reaccin de derivatizacin de los aminocidos con PICT

- 26 -
2.2.3.3.3. Fluorenilmetil cloroformato (FMOC-Cl)

Otro reactivo fluorescente de derivatizacin precolumna es el FMOC-Cl. Originalmente se us como un reactivo protector del grupo amino durante la sntesis de pptidos. Reaccionan rpidamente con todos los aminocidos a temperatura ambiente, pero ms lentamente que el OPA. Los derivados son estables y pueden almacenarse por varios das en el refrigerador (26).
2.2.3.3.4. Cloruro de dansilo

El cloruro de dansilo es un reactivo de derivatizacin fluorognico para la determinacin de aminas secundarias y primarias. La dansilacin ha sido ampliamente utilizada como un mtodo para determinar aminocidos. Los aminocido dansilados son altamente fluorescentes (excitacin: 360nm-emisin: 470nm), siendo posible detectarlos en la regin ultravioleta (250nm). Los niveles de deteccin caen dentro del intervalo picomolar (26).
Figura 4. A la izquierda muestra la reaccin de derivatizacin de aminocidos con FMOC-CL. A la derecha, estructura del cloruro de dansilo
2.3. FIBRA DIETTICA

La fibra diettica o fibra alimentaria es un conjunto de componentes, procedentes de las paredes de las clulas vegetales (celulosa, hemicelulosa, lignina y otras), que no son hidrolizables por las secreciones endgenas del aparato digestivo humano. Dentro de la fibra alimentaria podemos distinguir una parte que puede ser fermentada por la flora bacteriana del intestino, que se conoce como fibra soluble, y el resto no fermentable, que se denomina fibra insoluble.
- 27 -
2.3.1.
INTERS DE LA FIBRA DIETTICA

La fibra insoluble circula por el intestino delgado sin ser digerida, por lo que llega ms o menos
intacta al colon y ejerce efecto laxante. La fibra soluble se degrada parcialmente por la flora del colon y libera cidos de cadena corta que pueden ser parcialmente absorbidos y metabolizados. Los principales cidos producidos por fermentacin de la fibra soluble son: cido butrico, cido propinico y cido actico. La acidez que producen dificulta el crecimiento de microorganismos patgenos y tienen un efecto antiinflamatorio, con una accin protectora frente a la colitis ulcerosa. La fibra consumida en cantidades adecuadas presenta una serie de ventajas sobre el trnsito gastrointestinal, que repercute directa en la prevencin y evolucin de ciertas patologas tal y como se indica en la tabla N 8. Un exceso de fibra en la dieta puede causar trastornos como: problemas de malabsorcin de nutrientes y un trnsito excesivamente rpido de las heces. La ingesta de fibra recomendada diaria es de 30 40g/da.(18)
Tabla 8. Beneficio de la fibra soluble e insoluble en la salud
Efecto Sensacin de saciedad
Debido a Fibra soluble Fibra insoluble
Beneficio sobre: Obesidad
Modifica volumen de heces Modifica consistencia de heces Disminuye el tiempo de trnsito intestinal Facilita la excrecin Disminuye la absorcin del colesterol Disminuye la absorcin de cidos biliares Facilita su eliminacin fecal Disminuye la absorcin de glcidos Retrasa la absorcin de glucosa Disminuye el ndice de glucemia Mantenimiento y desarrollo de la flora bacteriana
Fibra soluble Fibra insoluble
Estreimiento Diverticulosis Megacolon Cncer de colon
Fibra soluble
Aterosclerosis Trastornos cardiovasculares
Fibra soluble
Diabetes
Fibra soluble
Proteccin frente a infecciones bacterianas
Fuente: Kuklinski, C. 2003.Nutricin y Bromatologa. pg 23.
- 28 -
Tabla 9. Clasificacin de la fibra segn grado de fermentabilidad.
Gomas FIBRA ALIMENTARIA Fibra soluble No digerible Muclagos Pectinas Inulina
Fermentable por una parte de la flora microbiana intestinal dando cidos grasos de cadena corta
Celulosa Fibra insoluble Hemicelulosa Lignina
No digerible No fermentable No absorbible
Fuente: Kuklinski, C. 2003.Nutricin y Bromatologa.
2.4. POTENCIAL INDUSTRIAL

El cultivo de Plukenetia volubilis L., significa un gran potencial para el sector agrario y de la industria nacional, pero el mundo todava no conoce de sus virtudes; sin embargo, una somera proyeccin tendra como mira atender el mercado japons y europeo que demandan 200 toneladas de aceite al ao.
La Ley N 11367 2004 ha declarado a Plukenetia volubilis L. como patrimonio gentico nacional y producto alternativo de la pobreza. En el artculo 107 de la Constitucin Poltica del Per y en concordancia con el artculo 75 del Reglamento del Congreso propone al Congreso de la Repblica lo siguiente: se declar al sacha inchi como un importante recurso gentico y un valioso aporte de nuestra amazona peruana a la humanidad por sus cualidades nutraceticas, alimenticias, cosmticas y otras
(8)
La especie vegetal Plukenetia volubilis L. , es considerada por el Programa Amaznico Regional de Biocomercio, PROMPEX y Consejo Nacional de Ambiente CONAM para aplicacin industrial con gran potencial dentro del grupo de ingredientes naturals, cosmticos y alimenticios
(28)
- 29 -
Luego de la extraccin del aceite queda una torta con alto valor nutritivo que puede sustituir a la torta de la soya que es importada en cantidades apreciables para la crianza de monogstricos en la amazona peruana (29). En la Universidad de San Martn en Tarapoto, se est realizando investigaciones para cultivar Plukenetia volubilis L., y evaluar su uso como suplemento en la alimentacin de aves de corral (29). Plukenetia volubilis L., puede ser consumido tradicionalmente y convertido en harinas, pepin, ocopa, tamales, mazamorra, juanes e inchicapi (8).
El Programa de Nutricin y la Agencia Adventista de Desarrollo y Recursos Asistenciales (ADRA), han preparado un recetario popular para su consumo directo e inform que el producto residual de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L., se est promoviendo para ser consumida en la dieta de 37,000 familias de nueve departamentos con altos porcentajes de desnutricin
(8)
. E n base a la elevada
cantidad de protenas de los residuos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L., se estn realizando concentrados proteicos de harina desengrasada para lactantes (19). En la Universidad San Ignacio de Loyola, en el ao 2006, se ha realizado la elaboracin, produccin y caracterizacin de mantequilla de Plukenetia volubilis L (30).
2.4.1.
EL MERCADO DE SACHA INCHI

Mercedes Ins Carazo, Coordinadora Nacional de la Red de Centros de Innovacin Tecnolgica
(CITES), ha sealado que el mercado externo para plantas alimenticias, medicinales y cosmticas es grande, pero que la oferta no cubre la demanda actual, asimismo, la demanda mundial de estos productos ha venido creciendo y se estima que seguir creciendo en los prximos aos. Antonio Brack sostena: "La demanda de los productos naturales en los pases del primer mundo crece entre 15 y 20% anualmente (8,31). Aunque, las comunidades indgenas de las selvas amaznicas utilizan Plukenetia volubilis L. desde tiempos milenarios, la industrializacin y comercializacin de este producto es reciente, lo que se debe a la difusin de nuevos estudios que destacan su alto contenido de Omega 3 y Omega 6, protenas y antioxidantes (32).
- 30 -
Siembra
Cosecha
Reunin de semillas
envioo
Envo a Lima
05.Seleccin y
descascarado de semilla
06. Prensado de
aceite
Residuo
07. Filtrado de aceite

Aceite
Figura 5. Proceso de extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L. , y obtencin del residuo

Fuente: Prensado en frio .Katherine Roco Chacn Bringas.USMP
- 31 -
El aceite de Plukenetia volubilis L., no tiene partida arancelaria especfica. Los flujos de comercio se registran bajo la partida 33.01.29.90.00 cuya descripcin corresponde a los dems esenciales
(33)
aceites
Figura 6: Exportaciones de productos naturales (1996-2010)

Fuente: ADEX
2.4.1.1. Comercio internacional

Las perspectivas del aceite de Plukenetia volubilis L., en el mercado internacional son favorables gracias a las tendencias del mercado en el campo de la salud y de la nutricin. Una prueba de esto es el premio que recibi en los aos 2004 y 2006 como el mejor aceite del mundo en el World Ethnic & Specialty Food Show que se celebra anualmente en Pars (34). El reconocimiento que se da a Plukenetia volubilis L., en el mercado internacional ha logrado que el gobierno peruano proyecte invertir en la ampliacin de la produccin, industrializacin y comercializacin en conjunto con el sector privado; crendose el proyecto Omega que vincula asociaciones de productores, empresas y entidades estatales de investigacin en torno a este aceite esencial. Este proyecto incluye la produccin de aceite de Plukenetia volubilis L., ecolgico. (32, 34).
- 32 -
Otras iniciativas llevadas a cabo en Per a favor del aceite de Plukenetia volubilis y sus subproductos son el registro de la marca inca inchi en los mercados en los que se comercializa actualmente (Japn, Europa y Estados Unidos) y la gestin de la patente de la semilla en los mercados internacionales (33).
2.4.1.2. Comercio nacional

De acuerdo con ADEX (Asociacin de Exportadores del Per) entre enero y septiembre del 2005, Per export aceite de Plukenetia volubilis L., por un valor aproximado de trece mil dlares. Los principales destinos fueron Francia, 92%; Italia, 6% y Japn, 2%. (35) En los ltimos aos, el Per ha presentado una creciente tendencia exportadora americanos, tabla N 10 y figura N 7
(32)
en dlares
Tabla 10. Exportacin de productos naturales en dlares americanos
Producto Yacn Maca Sacha inchi Camu camu
2005 101,948 3 600,000 25,194 906,000
2006 221,456 3 700,000 113,255 2 100,000
2007 229,023 4 017,000 422,559 5 000,000
Fuente: Superintendencia Nacional de Administracin Tributaria
- 33 -
Figura 7: Evolucin de las exportaciones de Plukenetia volubilis l. y derivados

Fuente Elaboracin : Superintendencia Nacional de Administracin Tributaria : Biocomercio Per / PROMPEX
2.4.2.
RESIDUOS
Es cualquier objeto material, elemento slido, lquido o gaseoso; resultado del consumo o uso de un
bien en actividades domsticas, industriales, comerciales o institucionales, que el generador abandona, rechaza y que es susceptible de aprovechamiento o transformacin en un nuevo bien, con valor econmico o disposicin final (36).
Generacin de residuos slidos a nivel nacional (2007) 30,061 Ton/da*
19,3% 80,7%
Disposicin final en rellenos sanitarios adecuados 5,802 Ton/da
Resto (Botaderos, ros, mar y lagos, reciclaje informal, chancheras 24,259 Ton/da
Figura 8: Estimacin de residuos basada en el total de poblacin del pas

Fuente: Ministerio Del Ambiente, 2008
- 34 -
Disposicin en rellenos sanitarios Disposicin en botaderos controlados Reciclaje Vertido al ambiente
Figura 9. Disposicin final de residuos slidos

Fuente: Encuesta Nacional de la evaluacin regional de los servicios de manejo de los residuos, 2002
Materia orgnica
Material reciclable controlados Material no reciclable
Figura 10. Composicin de los residuos slidos Fuente: Encuesta Nacional de la evaluacin regional de los servicios de manejo de los residuos, 2002
- 35 -
Tabla 11. Composicin de residuos slidos municipales
% Papel Cartn Plsticos Vidrios Metales ferrosos Metales no ferrosoos Textiles y trapos Cueros y caucho Maderas Otros Orgnicos 6.49 0.97 4.30 3.39 2.20 0.16 1.56 0.30 0.93 25.20 54.50 100.00
Ton/dia 842.81 125.97 558.41 440.23 285.70 20.78 202.58 38.96 120.77 3272.53 7077.49 12986.23 1. 2. 3. 4. 5. Fuente de Residuos orgnicos Actividad agropecuaria Actividad agroindustrial Industria lctea Industria frigorifica Industria de cereales
6. Industria aceitera y de granos oleosos 7. 8. 9. 10. Industria de la pesca Industria forestal Resduos slidos urbanos Resduos slidos domicilirios
Fuente: Encuesta Nacional de la evaluacin regional de los servicios de manejo de los residuos, 2002
2.4.2.1. Normatividad y gestin de residuos slidos en el Per (37)

Ley General de Residuos slidos, Ley N 27314 Reglamento de la Ley General de residuos slidos, D.S. N057-2004-PCM NTP 900.058-GESTION AMBIENTAL. Gestin de Residuos. Ordenanza 295-2001/MML.Sistema Metropolitano de Gestin de Residuos slidos.
2.4.2.2. Manejo de residuos slidos en el Per

La Ley General de residuos slidos Ley N 27314-, en el Ttulo III, captulo I, artculo 14; establece las operaciones para un adecuado manejo de residuos slidos en virtud a lo establecido en la normatividad nacional para evitar los riesgos que causan a la salud y el ambiente, y estas son (37): 1. Minimizacin de residuos 2. Segregacin en la fuente 3. Reaprovechamiento 4. Almacenamiento 5. Recoleccin
- 36 -
6. Comercializacin 7. Transporte 8. Tratamiento 9. Transferencia 10. Disposicin final Si bien las industrias de productos alimenticios y bebidas no contaminan tanto como otros sectores(, tambin han sido responsables de la contaminacin del aire y del agua al despedir polvos y olores desagradables en la atmsfera, descargar efluentes lquidos con un elevado contenido orgnico y generar grandes cantidades de sedimentos y residuos slidos; por ejemplo, algunas empresas dedicadas a la produccin de fcula de patata producen anualmente entre 100,000 y 250,000 m3 de almidn. En el sector de la conservacin y elaboracin de hortalizas, se puede desechar hasta un tercio del volumen total de materias primas. La elaboracin de aceite comestible genera cantidades considerables de residuos slidos y lquidos, tales como fibras, cscaras y residuos resultantes de la extraccin de aceites y grasas (38,39). En respuesta a la aplicacin de una reglamentacin ms estricta del medio ambiente por muchas comunidades, varias fbricas de productos alimenticios y bebidas han instalado aparatos modernos para el tratamiento de la biomasa residual. Los desechos vegetales que solan verterse en el ocano se utilizan ahora como alimento para animales, aunque esta actitud no se considere nueva tecnologa (39).
Las empresas japonesas que tratan el residuo de la extraccin de aceite, transforman los residuos slidos en diversos fertilizantes orgnicos y naturales para la jardinera. Esto no slo ha reducido el volumen de desechos generados sino que tambin ha permitido que las empresas desarrollen actividades en un nuevo sector, generando rentabilidad. (39,40)
2.4.2.3. Residuos de acuerdo a la extraccin de aceite

Durante el proceso de extraccin de aceites se generan subproductos como harinas, expeller, cascarillas, gomas, lecitina que son ampliamente utilizados para la industria en general, la alimentacin humana y animal. Se entiende por subproductos oleaginosos, a los residuos slidos resultantes de la extraccin industrial del aceite de granos oleaginosos, obtenidos por presin y/o disolvente, provenientes de la elaboracin de mercadera normal, sin el agregado de cuerpos extraos ni aglutinantes. En funcin del proceso de industrializacin que se somete a la materia prima, se ha establecido para la comercializacin de estos insumos la siguiente clasificacin:
- 37 -
a) Expellers: residuos de elaboracin por prensa continua. b) Harina de extraccin: residuos de la elaboracin por disolvente y salvo estipulacin especial no se diferencian por su granulacin, pudiendo ser: fina, en grumos, aglomerados o pedazos, segn los distintos sistemas de extraccin y secado. c) Pellets: comprimidos (cilindros) provenientes de los residuos de la extraccin del aceite de los granos oleaginosos definidos anteriormente. El largo y el dimetro de los comprimidos podrn ser de cualquier medida, salvo estipulaciones expresas en el boleto de compra-venta. La referencia a expeller significa material de extraccin por prensado, harina es el material obtenido por solvente y pellets se denomina a la forma fsica (comprimidos) de presentacin de estos subproductos (41). En el Per la principal forma de extraccin de aceites se realiza combinando presin-solvente (PS), debe considerarse que cuando se habla de pellets (los cilindros compactos de largo y dimetros variables) pueden fabricarse tanto a partir de expeller como de harinas o la combinacin presin-solvente.
2.4.2.4. Efecto de la temperatura en la calidad de los residuos

La composicin qumica y el valor nutritivo de estos residuos industriales son muy variables. El mtodo industrial utilizado para la extraccin de aceite, junto a la calidad de la materia prima de origen representan las fuentes de variacin ms importantes. Es fundamental el correcto control de la temperatura durante el proceso de manufactura porque la falta de coccin puede causar serios problemas de salud y desempeo de los animales (monogstricos y rumiantes muy jvenes); sin embargo, los excesos de calor tambin pueden daar la calidad de las protenas. Si las temperaturas son excesivamente altas y aplicadas por tiempos muy prolongados las protenas cambian su configuracin; ya que, el exceso de calor conduce a la formacin de productos indigeribles, a travs de la conocida reaccin de Maillard. La reaccin de Maillard constituye un proceso no-enzimtico de caramelizacin, donde los residuos de los azcares se condensan con ciertos aminocidos, seguido de una polimerizacin, para formar una sustancia de color marrn que posee muchas de las caractersticas qumicas de la lignina (18).
- 38 -
2.5. DESARROLLO SOSTENIBLE

De acuerdo William Hughes, el desarrollo sostenible implica que el ser humano es el centro de todo desarrollo, promoviendo una vida saludable y productiva en armona con la naturaleza
(42)
. Este
concepto sugiere la bsqueda de la satisfaccin de las necesidades actuales no comprometan la capacidad de que las generaciones futuras tambin puedan lograrlo, incluyendo de esta manera, al medio ambiente. El desarrollo sostenible es un concepto que se ha venido desarrollando en las ltimas dcadas. Implica el manejo integrado de los recursos naturales mediante la aplicacin de polticas eficientes que permitan un balance entre el desarrollo y la conservacin tomando en cuenta las necesidades de las generaciones presentes y futuras.La importancia y trascendencia que tiene el manejo sostenido de los recursos naturales, as como la preservacin de la biodiversidad; pero sobre todo, la necesidad de buscar tecnologas limpias, polticas adecuadas y permitir la activa participacin de los pobladores locales para lograr el desarrollo sostenible en el Per, brindando bienestar y una mejor calidad de vida a largo plazo. Existen cuatro hiptesis que se pudieran esbozar sobre la correlacin del desarrollo humano y los factores ambientales, a saber segn Mallela V. Prez Palomino (43):

La contaminacin ambiental incide negativamente en el desarrollo humano, Un proceso productivo que degrade el ambiente convierte el desarrollo humano en no sostenible, El ambiente contaminado perjudica la vida vegetal y animal del planeta; y a la postre, La degradacin de los ecosistemas implicar una variable negativa del desarrollo.
La base legal en el Per para el desarrollo sotenible constituye(44)

1. Ley Orgnica del Sector de Agricultura, D. Ley N 25902 2. Ley N 26821 Ley Orgnica para el Aprovechamiento sostenible de los recursos naturales. 3. Ley N 26834 Ley de reas naturales protegidas
- 39 -
III. PARTE EXPERIMENTAL

3.1. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS
MATERIALES Bureta Crisoles de porcelana Crucibles para ceniza Dedales celulsicos de extraccin. Desecador. Portadedales de vidrio. Tubos de digestibilidad 20 x 2.5 cm. Capilares. Cromatofolio Merck Silicagel 60 F254. Embudos. Fiolas de 25,50,100 mL. Frascos de vidrio. Matraz 250 ml. Papel Whatman N 1. Papel picrosado. Pera de decantacin. Pipetas 1, 2, 5, 10 mL. Probetas de 50 mL. Bolsa de dilisis. Columna gel Sephadex G- 25 Hilo dental Tubos eppendorff. Cnula intragstrica. Jaulas de acero inoxidable Jeringas y agujas Vasos de extraccin Goldsfich
MATERIAL BIOLGICO 20 ratas albinas Sprangue Dawley
- 40 -
EQUIPOS
Agitador magntico. Balanza analtica marca OHAUS Pioner. Bomba de vacio. Cocinilla elctrica. Colector de fracciones marca LKB BROMMA 7000 ULTROPAC. Columna para HPLC de fase reversa Octadecilo (C18) MERCK. Cromatografia lquida de alta performance (HPLC) marca WWR HITACHI- EZChrom Elite. Equipo Macro Kjheldahl SISTEMA TECATOR. Equipo para digestin con calentadores individuales y condensadores. Espectrofotmetro UV- visible marca CARY 50 CONC eQUIPO. Estufa con aire circulante marca MEMMERT. Extractor tipo Goldsfich.de 6 unidades. Lmpara de luz ultravioleta 365nm. Liofilizador marca VIRTIS. Microcentrfuga EPPENDORF. Mufla de incineracin DERIVER INSTRUMENT COMPANY. Reacti-Therm marca PIERCE. Rotavapor rotatorio marca BUCHI modelo R-205 con BM 60C.
REACTIVOS
a) Solventes:
Acetato de amonio SIGMA Chemical co. Acetona Merck. Acetonitrilo grado HPLC SIGMA Chemical co. cido clorhdrico 10% Colman. cido clorhdrico concentrado Colman. cido fosfomolibdico hidratado Merck. cido sulfrico concentrado Colman. Cloroformo Colman. Etanol de 96 ter de petrleo Colman.
- 41 -
ter dietlico anhidro Q.P. Merck Hidrxido de amonio Merck. Metanol Q.P. Merck N-Butanol Colman. N-Hexano Colman. Trietilamina Q.P. SIGMA Chemical co.
b) Reactivos :
cido clorhdrico 6N Colman. cido sulfrico 0.1 N Colman. cido sulfrico al 1.25%. Asbesto preparado SIGMA Chemical co. cido clorhdrico 6N SIGMA Chemical co. cido fosfrico SIGMA Chemical co. Agua destilada, bidestilada. Buffer Tris HCl 50 Mm pH 6.5 SIGMA Chemical co. Catalizador. Fenilisotiocianato (PICT) SIGMA Chemical co. Fenol SIGMA Chemical co. Fosfato monopotsico Q.P. SIGMA Chemical co. Hidrxido de sodio al 1.25% SIGMA Chemical co. Indicador Tashsiro. Molibdato de amonio SIGMA Chemical co. Piridina SIGMA Chemical co. Solucin Buffer acetato 0.1 M. Solucin de cido brico 3%. Solucin Detergente Neutro (FDN). Standard de aminocidos SIGMA Chemical co. Sulfato de amonio SIGMA Chemical co.
- 42 -
c) Reactivos cromgenos:
cido Tnico St. Colman. Alcohol amlico Colman. Caoln SIGMA. Carbonato de sodio Merck. Cloruro de cobalto Colman. Cloruro de sodio Merck. Fehling A. Fehling B. Gelatina 25%. Hidrxido de potasio Merck. Hidrxido de sodio Merck. Magnesio metlico. Ninhidrina. Reactivo de Baljet. Reactivo de Dragendorf. Reactivo de Keller-Killiani. Reactivo de Mayer. Reactivo de Molish. Saponina St. Merck. Solucin tricloruro ferrico 5%. Tungstato de sodio dihidratado Merck.
ENZIMAS:
Celulasa del hongo Penicilliun funicullosum E.C. 3.2.1.4. chemical co. Pepsina N.F. XII (The proteolytic enzime obtainid from the glandular layer of fresh hig stomach standardized according to the method giver in the National formulary 12 th edition. DIFCO Laboratories. Detroit- Michigan. USA. SIGMA
- 43 -
3.2.
METODOLOGA
3.2.1.
OBTENCIN Y PREPARACIN DE LA MUESTRA
Los residuos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L., sacha inchi pertenecientes al ecotipo Pinto Recodo de la provincia de Tarapoto del departamento de San Martn y clasificados como residuos tipo expeller fueron proporcionados por la Ctedra de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UNMSM en septiembre del 2007.1
Los residuos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L., se encontraban distribuidos en 14 bolsas de polietileno hermticamente cerradas con un peso promedio de cada bolsa de 2 Kg. con 600g, present las siguientes caractersticas al realizar el muestreo: polvo heterogneo, color crema, olor sui generis y sabor amargo astringente. Se procedi a tomar una muestra representativa (200g), aleatoria, homognea y en cantidad suficiente con la ayuda de una cuchara medidora (20g).
La muestra se tamiz y se sec en estufa a 40 C durante 72 horas. Luego se envas en frascos hermticos de vidrio mbar, rotulndose (nombre y fecha) y se almacen en refrigeracin.
3.2.2. ESTUDIO FARMACOGNSTICO 3.2.2.1.
Anlisis cualitativo
El residuo seco (30g) se someti a extracciones sucesivas, figura N11. A cada extracto (etreo, alcohlico y acuoso) se determin su concentracin (g/mL), se tom una alcuota de 5mL, se evapor a sequedad en bao de agua en una placa petri tarada y se pes (45-47). Posteriormente a cada extracto, se procedi con la marcha fitoqumica de acuerdo a las figuras N 12, 13 y 14.
1 Obtenidos del estudio de investigacin: Caracterizacin qumica, farmacolgica y toxicolgica del aceite de sacha inchi destinada al mercado de productos funcionales. Esta investigacin la hicieron la UNMSM en convenio con la Empresa Agro negocios PERUAGRO SRL.2007
- 44 -
Residuo de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L.
Muestreo
ESTUDIO FARMACOGNSTICO
ESTUDIO BROMATOLGICO
ESTUDIO TOXICOLGICO
Screening fitoqumico Cuantificacin de taninos Cuantificacin de saponinas
Anlisis Proximal
Ensayo a dosis limite
Digestibilidad enzimtica Determinacin de vitaminas y minerales
Determinacin de aminocidos
Figura 11. Diagrama de flujo del estudio de toxicidad realizado a los residuos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L. (sacha inchi)
- 45 -
30g de RESIDUO
Extraer con 90 mL DE TER ETLICO Y MACER DURANTE 48 h
EXTRACTO ETREO
RESIDUO SLIDO
EXTRAER CON ETANOL EN UNA PROPORCIN DE 1:3 Y MACER DURANTE 48 h
RESIDUO SLIDO
EXTRACTO ALCOHLICO
EXTAER CON AGUA EN UNA PROPORCIN DE 1:3 Y MACER DURANTE 48 h
RESIDUO SLIDO
EXTRACTO ACUOSO
Figura 12. Extraccin sucesiva del residuo de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L. para la marcha fitoqumica
- 46 -
EXTRACTO ETREO
FRACCIONES
1mL Ensayo de HAUCHERCORNE ACEITE Y GRASAS
1mL Ensayo de BALJET LACTONAS Y CUMARINAS 1mL Ensayo de LIEBERMAN BUCHARD TRITERPENOIDES - ESTEROIDES
4 mL (dividir en 4 porciones) Ensayos de DRAGENDORFF, MAYER, BOUCHARDART, SONNENSCHEIN ALCALOIDES
Figura 13. Marcha fitoqumica del extracto etreo
1mL 1mL
Ensayo de CATEQUINA Ensayo de LIEBERMAN BUCHARD
1mL
Ensayo de BORNTRAGER
TRITERPENOIDES -
QUINONAS
1mL
Ensayo de FEHLING
1mL
Ensayo de KELLER KILIANI
AZCARES REDUCTORES
1mL
Ensayo de FeCl3
HETEROSIDOS CARDIOTONICOS
FENOLES - TANINOS
EXTRACTO ALCOHLICO
FRACCIONES
1mL
4 mL (dividir en 4 porciones) Ensayos de DRAGENDORFF, MAYER, BOUCHARDART, SONNENSCHEIN
1mL
Ensayo de NINHIDRINA
ALCALOIDES
1mL
Ensayo de
AMINOCIDOS
ANTOCIANIDIN A 1mL 1mL

Ensayo de ESPUMA Ensayo de BALJET
1mL
Ensayo de SHINODA
FLAVONOIDES FLAVONOIDES FLAVONOIDES
LACTONA
SAPONINAS
Figura 14. Marcha fitoqumica del extracto alcohlico
- 47 -
EXTRACTO ACUOSO
FRACCIONES
1mL Ensayo de CLORURO FERRICO TANINOS
1mL Ensayo de SHINODA FLAVONOIDES
1mL Ensayo de ESPUMA SAPONINAS 1mL Ensayo de MUCILAGOS
4 mL (dividir en 4 porciones) Ensayos de DRAGENDORFF, MAYER, BOUCHARDART, SONNENSCHEIN ALCALOIDES
1mL Ensayo de FEHLING AZ. REDUCTORES
Figura 15. Marcha fitoqumica del extracto acuoso
3.2.2.1.1. Anlisis Cromatogrfico

Mtodo: Cromatografa en capa fina Fundamento: Se fundamenta en los fenmenos fsicos de adsorcin, siempre hay un soporte slido
microporoso al que se adsorben las sustancias, acumulndose en el extremo superior. Los distintos componentes pueden ser separados haciendo pasar disolvente puro a travs del mismo. De este modo, las sustancias retenidas descienden lentamente y se separan ms entre s (48-50).
Procedimiento: Se utiliz cromatofolios con silicagel 60F

254,
en el cual se aplica el extracto hidroalcohlico, utilizando
capilares nuevos; posteriormente colocados en cmaras de separacin cromatogrfica, previamente saturada con los sistemas de solventes:
Para taninos: 1-Butanol: cido Actico: Agua (4:1:5)
Para saponinas: Cloroformo: Acetato de etilo (9:1)
- 48 -
3.2.2.2. Cuantificacin de taninos

Mtodo: analtico para la cuantificacin de taninos en el extracto acuoso de romerillo (51). Fundamento: El mtodo se basa en la reaccin de los compuestos fenlicos con el reactivo de Folin (tungstato fosfomolbdico; carbonato de sodio 20%) el cual produce un complejo de color azul, cuya extensin es medida a 700nm, determinndose el contenido total de fenoles. Posteriormente se utiliz una solucin de gelatina al 25% para garantizar el secuestro de los taninos, obtenindose de la diferencia de ambas determinaciones el porcentaje de taninos reportados como cido tnico (50,51).
3.2.2.2.1. Diseo experimental El mtodo consta de 2 etapas: la etapa (A) donde se cuantifican los polifenoles totales en el extracto acuoso de los residuos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L., y la etapa (B) donde se cuantifican los polifenoles residuales despus del secuestro de los taninos con gelatina (51).
Solucin tungstato-fosfomolbdico Se disolvi 10 g de tungstato de sodio dihidratado, 0.2 g de cido fosfomolbdico hidratado y 5.0 mL de cido fosfrico al 85% en 75 mL de agua desionizada. La solucin se refluj por 2 horas (hasta aparicin de color amarillo; no verde, ni azul) y se complet con agua desionizada a 100 mL.
Ensayo A: cuantificacin de polifenoles totales Se midi y transfiri 4mL de extracto a un matraz aforado de 250 mL, diluyendo con agua desionizada hasta enrase. De la solucin anterior se tomaron porciones de 1, 2, 3, 4 y 5 mL y se llev a matraces aforados de 25 mL; a cada matraz, se agreg 2 mL de solucin tungstato- fosfomolbdico, se agit y se dej reposar durante 5 minutos. Luego se aadi 1mL de solucin de carbonato de sodio al 20%, se agit, enras con agua desionizada y homogeniz. Se lee la absorbancia de las soluciones a 700nm despus de transcurridos 2 minutos de la reaccin.
Ensayo B: cuantificacin de polifenoles residuales Se midi y trasfiri 20 mL del extracto a un matraz aforado de 250 mL con tapa, luego se adicion 60 mL de agua desionizada, 50 mL de solucin de gelatina al 25%, 100 mL de solucin saturada de cloruro de sodio acidificado y 10 g de caoln y luego enrasado con agua desionizada. Se tap y agit durante 1 hora, posteriormente se filtr.
- 49 -
Del filtrado se tom y transfiri 10 mL a un matraz aforado de 50 mL completado con agua desionizada. Luego se tom y llev 1, 2, 3,4 y 5 mL a matraces aforados de 25 mL; a un matraz, se agreg 2 mL de solucin de tungstato- fosfomolbdico, se agit y se dej reposar durante 5 minutos. Luego se aadi 1 mL de solucin de carbonato de sodio al 20% se agit, enras con agua desionizada y homogeniz. Se ley la absorbancia de las soluciones a 700 nm despus de transcurridos 2 minutos de la reaccin.
Sustancia de referencia Se pes 25 mg de cido tnico, se transfiri a un matraz aforado de 100 mL y se complet el volumen con agua desionizada. Posteriormente se midi y trasnfiri 20 mL a un matraz aforado de 100 mL enrasando con agua desionizada. De la solucin anterior se transfiri 1,2,4,6,8,10 y 12 mL a matraces aforados de 25 mL a cada matraz, se agreg 2 mL de solucin tungstato-fosfomolbdico, se agit y se dej reposar durante 5 minutos. Luego se aadi 1 mL de solucin de carbonato de sodio al 20%, se agit, enras y homogeniz. Se ley la absorbancia de las soluciones a 700 nm despus de transcurridos 2 minutos de la reaccin.
Blanco (Mtodo A) Se aadi 1, 2, 3, 4 y 5 mL de agua desionizada a matraces aforados de 25 mL; a cada matraz, se agreg 2 mL de solucin tungstato-fosfomolbdico, se agit y se dej reposar durante 5 minutos. Luego se aadi 1 mL de solucin de carbonato de sodio al 20%, se agit, enras y homogeniz. Se ley la absorbancia de las soluciones a 700 nm despus de transcurridos 2 minutos de la reaccin.
Blanco (Mtodo B) Se adicion 80 mL de agua desionizada, 50 mL de solucin de gelatina al 25%, 100 mL de solucin saturada de cloruro de sodio acidificada y 10 g de caoln, y enras con agua en un matraz aforado de 250 mL con tapa. Se tap y agit durante 1 hora, se dej reposar para posteriormente filtrar. Del filtrado se tom y se transfiri 10 mL a un matraz aforado de 50 mL, , luego se tom y llev 1, 2, 3, 4 y 5 mL a matraces aforados de 25 mL; a cada matraz, se agreg 2 mL de solucin tungstatofosfomolbdico, se agit y se dej reposar por 5 minutos, Luego se aadi 1 mL de solucin de carbonato de sodio al 20%,se agit, enras y homogeniz. Se ley la absorbancia de las soluciones a 700 nm despus de transcurridos 2 minutos de la reaccin
- 50 -
3.2.2.3. Cuantificacin de saponinas totales

Mtodo: metodologia de cuantificacin espectrofotomtrica de las saponinas de pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen Amaranthaceae (52).
Fundamento: El cido sulfrico concentrado produce la hidrlisis de los hetersidos saponnicos, los cuales reaccionaran con el cloruro de cobalto. La reaccin da una coloracin rosada tenue, cuya extensin es medida a 280nm, determinndose el contenido total de saponinas.
3.2.3. ESTUDIO BROMATOLGICO
3.2.3.1. Estudio qumico proximal

Se realiz el anlisis proximal empleando, las tcnicas estandarizadas del Laboratorio de Bioqumica, Nutricin y Alimentacin Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria de la UNMSM (Arbaiza, 1997) (53).
1. Determinacin de la humedad
Mtodo Fundamento : gravimtrico (A.OA.C. 1997) (54) : se basa en la perdida de humedad de la muestra, por volatilizacin, a causa del calor,
cuando es sometida a una temperatura de 60 C.
2. Determinacin de extracto etreo

Mtodo Fundamento
: Goldsfich (A.OA.C. 1997) (54) : el ter se evapora y condensa continuamente y al pasar a travs de la muestra se extrae
los materiales solubles en el solvente orgnico.
3. Fibra 3.1. Determinacin de fibra cruda

Mtodo Fundamento : hidrlisis cida y bsica (A.OA.C. 1997) (54) : se basa en la digestin cida-alcalina por accin del cido sulfrico y el hidrxido de
sodio diluido a ebullicin, para obtener luego de la incineracin la fibra cruda.
- 51 -
200 mg de
RESIDUO DE LA EXTRACCIN DE ACEITE DE SACHA INCHI
Se desengras con 30 ml de hexano por dos horas
RESIDUO El residuo fue sometido a extraccin por reflujo con tres alcuotas por 1 1/2 hora cada una de 20mL de metanol agua (4:1)
EXTRACTO METANOLICO
La fraccin metanlica se concentr en rotavapor a 600mbar, 50 rpm, a un bao mara de 40 C y a temperatura ambiente de 23C
EXTRAER CON TRES PORCIONES DE 60mL DE 1-BUTANOL SATURADA CON AGUA (1:2), por 72 horas
REACCIN DE IDENTIFICACIN CCF
CUANTIFICICACIN DE SAPONINAS TOTALES
Se tom 60 ml de la fraccin butanlica y se concentr en rotavapor.
El extracto se disolvi en 25 ml. Se tom 5ml y se transfiri a una fiola de 25ml.
Se aadi 1mL de cloruro de cobalto y 1mL de H2SO4 y se enras a 25ml. Efectuar la lectura a los 20 min. de la reaccin, a una longitud de onda de 284nm.
Patrn de saponina: 1mg/mL. Se prepar 6 concentraciones: 0.08; 0,12; 0,16; 0.20; 0.28 y 0,32mg/ml en fiolas de 25mL.
Figura 16. Procedimiento de extraccin, identificacin y cuantificacin de saponinas totales
- 52 -
3.1. Fibra detergente neutro

Mtodo Fundamento : Van Soest (A.OA.C. 1997) (54) : se basa en la ruptura de la pared celular de las clulas vegetales usando como
detergentes la solucin de sulfato lauril sdico en un pH neutro.
La porcin de muestra de alimento insoluble en un detergente neutro est bsicamente compuesta por celulosa, hemicelulosa, lignina y slice, y se la denomina pared celular. La misma se correlaciona inversamente con el consumo voluntario de materia seca (18).
RESIDUO
EXTRACTO TEREO
Lpidos
DIGESTIN CIDA
Sustancias solubles en cido
Residuos insolubles en cido DIGESTIN ALCALINA
Sustancias solubles en lcali
Residuos insolubles en lcali INCINERACIN
RES. INSOL. EN CIDO Y ALCALI CENIZAS INSOL. = FIBRA CRUDA
Figura 16. Determinacin de fibra cruda

Fuente: Protocolo de Prcticas de Laboratorio de Bioqumica y Nutricin Animal. Teresa Arbaiza Fernndez. 2007
- 53 -
Se pes 0.5g de residuo + 100 mL de sol. detergente neutro
Ebullicin por 60 min. en condensador con refrigerante
Se filtr (papel filtro sin ceniza) y Lav con agua caliente. Se lav los residuos indigeribles con 3mL de acetona
Se report el porcentaje de pared celular
Se sec los papeles filtro por 24 horas a una temperatura 60. Se coloc al desecador por 60min. y se pes
Se pes y coloco en un crisol tarado. Se inciner por 3 horas a una temperatura de700C
Se estim el material soluble por sustraccin de 100 (Contenido celular)
Se deseco el crisol y pes
FDN
Figura 17. Determinacin de fibra detergente neutro
4.
Determinacin de protenas
: Kjeldhal. (A.OA.C. 1997) (54). : se produce la digestin de protenas con cido sulfrico y catalizadores para convertir
4.1. Nitrgeno total.

Mtodo Fundamento
el nitrgeno orgnico en iones amonio, estos son desplazados por un lcali y recepcionado en un cido de concentracin conocida. Se valora el cido recepcionado. El resultado final es el N contenido en la muestra.
5.
Mtodo
Determinacin de ceniza (54)

: calcinacin e incineracin simple (A.O.A.C. 1997) (54,55). : se produce la oxidacin de la materia orgnica mediante carbonizacin e incineracin,
Fundamento
dando lugar a la formacin de xidos y sales minerales.
- 54 -
Tabla 12. Composicin de los principios inmediatos del anlisis de Weende.
Aminocidos no indispensables Aminocidos PROTENAS

NITROGENADOS
Ac.glutmico,alanina,ac.aspa rtico,serina Arginina,glicina,histidina,cist ina,tirosina,prolina Lisina,triptofano,valina,meti onina, fenilalanina,treonina, leucina,isoleucina Aminas
semiindispensables Aminocidos indispensables
NO PROTENAS Acilgliceridos ORGNICOS NEUTROS

LIPIDOS
cidos nucleicos Trigliceridos Colesterol,Vit D. Caroteno, Vit A Lecitina Esfingomielina Tiamina,rivoflavina,niacina, Vitaminas vit.B6,cido pantotnico,biotina,vit.B12, cido ascrbico. Monosacridos Polisacridos (soluble) Pentosa o hexosas simples, azcares compuestos, almidones Celulosa Hemicelulosa Ca,Mg,Na,K,P,Cl,S. Mn,I,Cu,Fe,Zn,Co,Mo,Se, Cr,Sn,F,Ni,V,Si. As,Ba, Br,Cd,F,Pb,Hg,Sr.
Esterides Terpenoides
FOSFOLIPDIOS
Fosfogliceridos Esfingolipidos
EXTRACTO LIBRE DE
CARBOHIDRATOS
hidrosolubles
NITROGENO
FIBRA BRUTA Elementos MACRO Elementos MICRO INORGNICOS Elementos

CENIZAS
Polisacridos (insoluble)
POSIBLEMENTE ESENCIALES Elementos POTENCIALMENTE TOXICOS Elementos Esenciales Cu, Mo,Se, As, Cd, F,Pb,Hg,Si. Al,Sb,Bi,B,Ge,Au,PB,Hg, Ag, Ti
Fuente: Protocolo de prcticas de Laboratorio de Bioqumica y Nutricin Animal. Teresa Arbaiza Fernndez. 2007.
- 55 -
6.
Mtodo
Determinacin de extracto libre de nitrgeno

: Matemtico (A.OA.C. 1997) (54,55) : Se obtiene por diferencia al restar al total 100% la suma de los 5 macronutrientes
Fundamento
restantes (protenas, fibra cruda, extracto etreo, cenizas y humedad.).
3.2.3.2. Determinacin de minerales y oligoelementos. La determinacin de calcio, hierro fue realizado en CERPER, Certificaciones del Per S.A. : se realiz mediante el mtodo Absorcin Atmica (56).
Mtodo Fundamento
: se basa en la disociacin del elemento de inters en la muestra utilizando lmparas de
ctodo hueco, estas lmparas emiten solo el espectro del elemento buscado. La absorcin es selectiva y se produce a una determinada longitud de onda, dependiendo nicamente del agente absorbente y siguiendo la Ley de Lambert y Beer.
El procedimiento para la determinacin de Calcio y hierro es como sigue a continuacin:
3.2.3.2.1.
Determinacin de calcio
Despus de la incineracin de la muestra se diluy con cido ntrico y cido clorhdrico, luego se atomiz con llama de xido nitroso-acetileno y se agreg a cada muestra 200ppm de cloruro de potasio como regulador de ionizacin. Se midi la absorcin a una longitud de onda de 422 nm .
(56)
3.2.3.2.2.
Determinacin de hierro
Para determinar los elementos inorgnicos, entre ellos el hierro, se inciner la muestra en seco y se disolvi en cido ntrico y cido clorhdrico. La muestra que contena hierro en solucin se atomiz en una flama de aire-acetileno y se midi la absorcin a una longitud de onda de 248 nm (56).
- 56 -
3.2.3.2.3.
Determinacin de fsforo
: Espectrofotomtrico con molibdovanadato (A.O.A.C. 1997) (60,61).
Mtodo Fundamento
: se basa en la reduccin del molibdovanadato de amonio a fosfomolbdovanadato de
amonio obtenindose un intenso color azul y cuya intensidad es leda a 400nm
3.2.3.3. Determinacin de vitaminas : fluoromtrico (56)
Mtodo Fundamento
: el fundamento del mtodo reside en la excitacin del tomo por una energa
electromagntica, que hace que los e- del tomo la absorban cambiando de capa, y al volver a su lugar, el tomo vuelve a estado de reposo produciendo una energa luminosa. La intensidad de la energa electromagntica que produce la materia es proporcional a la concentracin del tomo que medimos.
La determinacin de tiamina, riboflavina y niacina fue realizado en la Sociedad de Asesoramiento Tcnico S.A.C. (SAT) por el mtodo fluoromtrico y la determinacin de niacina se realiz por el mtodo colorimtrico.
3.2.3.3.1.
Determinacin de tiamina
A partir del tiocromo formado por la oxidacin de la tiamina con ferricianuro de potasio en solucin acuosa de hidrxido de sodio (54,56).
3.2.3.3.2.
Determinacin de riboflavina
La medida total de riboflavina se di despus de la hidrlisis acida de FMN y FAD; completada con cido clorhdrico 0.1 N. Las protenas son removidas a pH 4.5. Para destruir la interferencia de sustancias fluorescentes se acidific con cido actico glacial y oxidado con exceso de KMnO4 al 3%. Para eliminar el exceso KMnO4 se aadi H2O2 al 3% gota a gota. El KMnO4 se agreg para asegurar que toda la vitamina presente se encuentre en la forma oxidada fluorescente. Las forma oxidada presenta fluorescencia amarillo verdosa con picos mximos de absorcin a 220 - 225, 266, 371, 444 y 475 nm. La riboflavina se reduci reversiblemente a leucobase (un dihidro compuesto que no presenta fluorescencia) por el hidrgeno, Na2S2O4 y SnCl2, para corregir la fluorescencia que queda despus de las permanganato oxidaciones para reducir los pigmentos extraos o sustancias fluorescentes interferentes
(54,56)
- 57 -
3.2.3.3.3. Mtodo
Determinacin de niacina
: colorimtrico (56).
Fundamento
: el anillo piridinico del cido nicotnico liberado por hidrlisis, se abre con bromuro de
ciangeno, el producto de la escisin reacciona con el cido sulfanlico quien proporciona el colorante amarillo de polimitina. La lectura se realiza a una longitud de onda de 436nm.
3.2.3.4. Digestibilidad de protenas in vitro

Los estudios de digestibilidad demandan tiempo por lo cual se han hecho numerosos intentos para reproducir en el laboratorio las reacciones que tienen lugar en el tracto digestivo del animal, por este motivo, se realiz la digestibilidad de las protenas mediante las tcnicas multienzimticas, ataque in vitro con pepsina y cido clorhdrico (53-55).
3.2.3.4.1.
Mtodo
Digestibilidad enzimtica por pepsina

: pepsina y cido clorhdrico (55).
Fundamento
: se basa en la propiedad que tienen las protenas de hidrolizarse y solubilizarse
utilizando enzimas proteolticas en condiciones controladas.
3.2.3.4.2.
Mtodo
Digestibilidad enzimtica por celulasa

: enzimtico por celulasa y pepsina (53,55).
Fundamento
: la solubilidad de la pared celular no lignificada y lignificada moderadamente por
accin de la celulasa y remocin de los componentes solubles (contenido celular) con pepsina y cido clorhdrico.
3.2.3.5. Determinacin de aminocidos por HPLC de fase reversa

Mtodo Fundamento : Heinrikson, R.L. and Meredith, S.C, modificado por Monteghirfo,M., y Arnao,I.(57-60) : la protena purificada despus de someterse a hidrlisis es desecada y derivatizada
(reaccin qumica del aminocido con el fenilisotiocianato). Los feniltiocarbamilaminocidos formados de la derivatizacin se separan por HPLC de fase reversa.
- 58 -
Los feniltiocarbamilaminocidos menos hidrofbicos se asociaran primariamente con la fase hidroflica (eluyendo primero), mientras los feniltiocarbamilaminocido ms hidrofbicos se encontrarn en la fase lipoflica (mayor retencin).
3.2.3.5.1.
Preparacin de los residuos para la determinacin de aminocidos
Se emple (50 g) residuos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L. desecados y desengrasados con ter de petrleo en proporcin de 1:3 durante 4 horas por un periodo de tres das con ayuda de un agitador magntico a velocidad constante . La muestra desengrasada se tamiz y almacen en refrigeracin.
Para determinar la mejor solubilidad de los residuos desengrasados y tamizados con la finalidad de elegir el solvente que extrajera mejor las protenas se prepar concentraciones al 20 y 30% en suero fisiolgico, agua bidestilada y tris HCL.Para y se emple el mtodo de Lowry, por ser un mtodo sencillo para estimar las protenas totales.
3.2.3.5.2.
Mtodo Fundamento
Determinacin de protenas
: Lowry (61) : El principio de este mtodo consiste en la reaccin de las protenas con el reactivo de
Folin Ciocalteau que forma un complejo coloreado azul. El color se debe a la reaccin del cobre del reactivo en medio alcalino con la protena y la reduccin del fosfomolibdato por la tirosina y el triptfano presentes en la protena.
3.2.3.5.3. Mtodo Fundamento
Extraccin de protenas
: cromatogrfico de exclusin por tamao o filtracin en gel (61) : consiste en la separacin de las protenas en funcin de su tamao. Las protenas
mayores se desplazan ms rpidamente que las de menor tamao y siguen una ruta ms directa a travs de la columna, eluyendo ms rpidamente. Las ms pequeas penetran en los poros y son retardadas por la ruta laberntica que describen a travs de la columna.
- 59 -
3.2.3.5.4.
Separacin de los PICT-aa por HPLC en fase reversa.
Previamente a la separacin de los PICT-aa se realiz la hidrlisis de la protena (figura 20) y la derivatizacin de los aminocidos (figura 21) . La separacin de los PICT-aa se realiz en un sistema de HPLC marca HITACHI, modelo La Chrom Elite que consiste en un sistema de control de EZChorm-Elite con tres bombas, se emple dos solventes (tabla 13) y un detector de longitud fijado a 254nm. Para la separacin se utiliz una columna de fase reversa Octadecilo (C18) MERCK de 25 cm de longitud a una temperatura circulante de 52C y el flujo fue de 1,0mL.min-1.
Tabla 13. Condiciones de separacin de los PICT-aa

Solvente Solvente A Solvente B
Tiempo
%A 100 85 50 0 0 100 100
%B 0 15 50 100 100 0 0
Acetato de amonio 0.05 M pH 6
0 15 Acetato de amonio 0.1 M 30 pH 6 en acetonitrilo, 34 metanol y agua 37 (44:10:46) 40 50 Detector de longitud de onda de 254 nm. Temperatura 52C Flujo 1 mL /min
- 60 -
EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE LA PROTENA SOLUBLE
PREPARACIN DE LA MUESTRA Y DETERMINACIN DE PROTENAS
Se desengras (50 g) residuos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L., con ter de petrleo en una proporcin 1:3 durante 4 horas por un periodo de tres das con ayuda de un agitador magntico a una velocidad constante (0,5).
La muestra desengrasada se tamiz con una malla N 200 y almacen en refrigeracin hasta antes de su uso.
Se emple para la prueba de solubilidad tres disolventes: suero fisiolgico, agua bidestilada, TRIS HCl 50mM a pH 6,5 y se determin la protena con Lowry
Se prepar extractos al 20 y 30% de residuo de Plukenetia volubilis L., con TRIS HCl 50mM a pH 6,5
EXTRACCIN DE LA PROTENA SOLUBLE
Se aadi 2 mL del extracto a la columna cromatogrfica de exclusin por tamao con gel Sephadex , G-25, (2.2 por 27 cm), previamente equilibrada con un volumen de 300mL de buffer TRIS-HCl 0,05M y pH 6,5
La muestra fue eluda con buffer tris - HCl 0,05M, pH 6,5 y un flujo de 30mL/h a temperatura ambiente (25C).
Las fracciones colectadas (1mL) ledas a 280 nm
PURIFICACIN
Los eluatos con mayor absorbancia, fueron reunidos y dializados por 24 horas, con ayuda de un agitador magntico
CONSERVACIN
Luego se liofiliz, pes y almacen en recipientes de plstico hermeticamente cerrados y protegidos con papel de aluminio. Los recipientes de plstico se guardaron en la refrigeradora, en desecadores.
Figura 18. Diagrama de flujo del procedimiento de extraccin y purificacin de protena soluble de residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. (sacha inchi)
- 61 -
Se pes (3,0 mg) en tubos eppendorff de 1.5mL protena soluble liofilizada Se adicion en L, HCl 6N en una proporcin de 1:100 (Si la cantidad de protena soluble es de 3.2mg se le aade 320 L de HCl 6N).
Se adicion agentes protectores: 2 L de sulfito de sdio y fenol 1%

HIDRLISIS DE LA PROTENA
Se homogeniz y llev a centrifugacin, a una velocidad de 1000 rpm por un tiempo de 3 min.
Se trasvas el sobrenadante a los tubos de digestin Reacti Therm marca PIERCE con la ayuda de una pipeta Pasteur
Se llev los tubos de digestin al vaco por 5 min.
Se hidroliz al vaco a 150 C por 2 h
Se Desec la muestra al vaco
El hidrolizado desecado se disolvi en 100 L de buffer de acoplamiento Acetonitrilo:Piridina:Trietilamina:Agua (10:5:2:3)
Se Desec la muestra al vaco

DERIVATIZACIN DE LOS AMINOCIDOS
La muestra desecada se disolvi nuevamente en 100 L de buffer de acoplamiento, adicionndole 5 L de fenilisotiocianato (PITC; reactivo de Edman), se dej cinco minutos a temperatura ambiente Se Desec la muestra al vaco
Figura 19. Diagrama de flujo del procedimiento de hidrlisis de la protena soluble y derivatizacin de los aminocidos de residuos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L.
- 62 -
SEPARACIN DE LOS FENILTIOCARBAMILAMINOCIDOS
La muestra derivatizada se diluy en 500 L de buffer acetato 0.05M, pH 6.
El patrn utilizado para el anlisis fue AASTD-18 (Sigma; St. Louis, MO, EEUU)
Se inyect una cantidad de 20 L.
20 L de solucin patrn se someti a las mismas condiciones de derivatizacin de la muestra problema
El patrn derivatizado se diluy en 300 L de buffer acetato 0.05M, pH 6.
Se inyect una cantidad de 20 L.
Figura 20. Procedimiento de separacin de los feniltiocarbamilaminocidos de los residuos industriales de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L.
3.2.4. EVALUACIN DE LA TOXICIDAD AGUDA A DOSIS LIMITE

Mtodo : procedimiento a Dosis Fijas, internacionalmente validado, aceptado y adoptado en la Gua N 420 de la OECD y modificado por Betancourt (62, 64). Fundamento : Esta basado en un estudio cuali-cuantitativo de los fenmenos txicos y de su aparicin
en funcin del tiempo tras la administracin de una dosis nica de la sustancia o de varias dosis fraccionadas en el transcurso de 24 horas.
3.2.4.1. Preparacin de la muestra para el ensayo de toxicidad a dosis limite. Se utiliz el extracto acuoso del residuo industrial de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L. a una concentracin de 200mg/mL.
- 63 -
3.2.4.2. Modelo biolgico Se utilizaron 20 ratas albinas Sprague Dawley, de ambos sexos con una masa corporal de 200 20g y edad de 7,5 0,5 semanas. Los animales se mantuvieron en el bioterio de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UNMSM, a una temperatura de 20 2 C, con humedad relativa de 70 y 80 % y ciclos de luz/oscuridad de 12/12 horas. Recibieron como alimento dieta balanceada, y agua apta para consumo humano. El acceso a los alimentos y el agua fue ad libitum. Los animales fueron sometidos a cuarentena e inspeccin clnica durante una semana antes del inicio del experimento, evitando el estrs
(64)
3.2.4.3. Diseo experimental Aleatoriamente se conform cuatro grupos experimentales, dos grupos tratados (01 grupo de machos y 01 grupo de hembras). La muestra fue administrada con ayuno previo de 24 horas por va oral mediante cnula intragstrica, a dosis nica de 2000mg/kg. de masa corporal, teniendo en cuenta la ausencia de signos o sntomas de toxicidad por est va de administracin. Se dosific y administr al peso de cada rata un volumen de 2 mL de extracto acuoso y 2 mL de suero fisiolgico para los grupos controles (64).
Los animales fueron observados individualmente durante 30 minutos, con especial atencin durante las primeras 24 horas y diariamente hasta los 14 das del experimento. Las observaciones estuvieron dirigidas a la determinacin de: muerte y tiempo de ocurrencia de la misma, signos de toxicidad incluyendo su comienzo y duracin, adems de cambios en la piel, membranas de mucosas y ojos, en el sistema respiratorio, en el nervioso central, en la actividad somatomotora y en la conducta y prest especial atencin a la ocurrencia de convulsiones, salivacin, diarrea, letargo, somnolencia y coma (64).
- 64 -
IV. RESULTADOS
4.1. ESTUDIO FARMACOGNSTICO Para obtener informacin de sus constituyentes qumicos se realiz la marcha fitoqumica de los residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L., sacha inchi que present los siguientes constituyentes qumicos que se indican en la tablas 16, 17,18 y 19.
4.1.1. Ensayo Organolptico
Tabla 14. Ensayo organolptico

Caracterstica Aspecto Color Olor Sabor Resultado Polvo heterogneo crema Sui generis Amargo, astringente
4.1.2. Anlisis cualitativo
Tabla 15. Rendimiento y determinacin de sustancias solubles

Etreo (1mL) 0,34g 0,12g 35% Alcohlico (1mL) 0,34g 0,06g 17% Acuoso (1mL) 0,34g 0,06g 17%
Peso inicial (droga) Peso final (droga) Rendimiento
Tabla 16. Resultado de la marcha fitoqumica del extracto etreo

Constituyentes qumicos Aceite y grasas Carotenoides Alcaloides Reactivo Hauchercorne Carr-Price Dragendorf Mayer Bouchardat Baljet Lieberman- Burchard Borntrager Precipitado +++ ++ +++ Color pardo Azul fugaz pp. anaranjado pp. blanco pp. blanco pp.rojo rosado Rosada/roja
Cumarinas Triterpenoides y esteroides Antraquinonas
- 65 -
Tabla 17. Resultado de la marcha fitoqumica del extracto alcohlico

Constituyentes qumicos Azcares reductores Triterpenoides y esteroides Aminogrupos libres Alcaloides Reactivo Fehling Lieberman- Burchard Ninhidrina 2% Dragendorf Mayer Bouchardat Shinoda Baljet Molish Lieberman- Burchard Espuma Borntrager Papel picrosado Precipitado +++ +++ +++ +++ +++ +++ Color pp.rojo ladrillo Rosado/azul Azul pp. anaranjado pp. blanco pp. blanco Naranja/rojo pp. rojo Anillo violeta Rosado Verde/azul >2mm x2 min. Rosada/roja Rojo
Flavonoides Cumarinas Glucosidos Saponinas
Triterpenoides Esteroides
Antraquinonas Glicsidos cianogenticos
Tabla 18. Resultado de la marcha fitoqumica del extracto acuoso
Constituyentes qumicos Azcares reductores Triterpenoides y esteroides Aminogrupos libres Alcaloides
Flavonoides Cumarinas Glicsidos Saponinas Triterpenoides Esteroides
Reactivo Fehling Lieberman- Burchard Ninhidrina 2% Dragendorf Mayer Bouchardat Shinoda Baljet Molish Lieberman- Burchard Espuma Borntrager Papel picrosado Cloruro ferrico 5% Acetato de plomo 5% Hipoclorito e sodio Cianuro de potasio
Precipitado +++ +++ +++ +++ +++ +++ + + -
Color pp.rojo ladrillo Rosado/azul Azul pp. anaranjado pp. blanco pp. blanco Naranja/rojo pp. rojo Anillo violeta Rosado /azul >2mm x2 min. Rojo cereza rojo Azul/verde blanco Anaranjada pp. amarillo
Antraquinonas Glicsidos cianogenticos Taninos
- 66 -
Tabla 19. Resultados de la determinacin de carbohidratos

Reaccin Reacciones generales Reacciones de azcares reductores Reaccin aldosas Reaccin cetosas Reactivo Molish Fehling Pelouze Selivanoff Resultado +++ +++ +++ +++ Caracterstica violeta rojo ladrillo Amarillo naranja rosado
Leyenda: (+++) (++) (+) (-) : Abundante : Moderado : Escaso : Negativo
4.1.3.
ANLISIS CUANTITATIVO DE TANINOS Y SAPONINAS TOTALES
4.1.3.1. Cuantificacin de taninos
La curva de calibracin del cido tnico en el rango de concentracines estudiadas responde a la ecuacin y= 0,0475X + 0,0205, un coeficiente de correlacin 0,9973 y a un intervalo de confianza 95%.Al realizar la significacin estadstica de la varianza de la pendiente (Tabla ANOVA para la regresin lineal simple, mediante el anlisis de regresin ). El Fc (1816,03)>F (1,34) por lo tanto se rechaz la hiptesis Ho (=0) por lo que x e y estn relacionadas linealmente. La utilizacin de la ecuacin de regresin para la prediccin y estimacin es aconsejable.
De acuerdo al valor del coeficiente de correlacin lineal simple, se puede afirmar que la variable X (ppm) se encuentran asociadas en forma directa de una manera muy fuerte con la variable dependiente Y (absorbancia), en un 99%. La prueba de hiptesis para la correlacin a un nivel de significancia de =0,05, tc (42,61)>t(2,57), entonces se rechaza la hiptesis Ho:=0; con lo que se afirma la correlacin. De acuerdo al coeficiente de determinacin R2, se puede afirmar que el 99% de las absorbancias se explican por las concentraciones ppm del cido.
- 67 -
Tabla 20. Curva de calibracin de cido tnico (x/y)

X [Estndar] ppm 1 2 4 6 8 10 12 Y Absorbancia 0,058 0,112 0,221 0,307 0,410 0,504 0,575 (X/Y) 0,058 0,056 0,055 0,051 0,051 0,050 0,048
N 1 2 3 4 5 6 7
Tabla 21. Estadsticas de la regresin del cido tnico

Coeficiente de correlacin Coeficiente de determinacin R^2 R^2 ajustado Error tpico Observaciones 0,998 0,997 0,997 0,011 7
Tabla 22. Anlisis de varianza del cido tnico

Grados de libertad Regresin Residuos Total 1 5 6 Suma de cuadrados 0,227830438 0,000627276 0,228457714 Promedio de los cuadrados 0,22783044 0,00012546 F Valor crtico de F 1,34
1816,03
- 68 -
Tabla 23. Porcentaje de cido tnico en el residuo de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L.
Absorbancia
Polifenoles Totales (T) 0,0728 0,0726 0,0730 Residuales (T) (R) 0,0522 0,0520 0,0524
Gramos de droga para 1mL de solucin Porcentaje Taninos
g/mL
- (R)
1 2 3
0,0206 0,0206 0,0206
0,0001 0,0001 0,0001
8x10-4 8x10-4 8x10-4 PROMEDIO
1,3 x 10-5 1,3 x 10-5 1,3 x 10-5 1,3 x 10-5
CURVA DE CALIBRACIN DEL CIDO TNICO CURVA DE CALIBRACIN DEL CIDO TNICO CURVA DE CALIBRACIN DEL CIDO TNICO 0.7 0.7 0.7 0.6 0.6 0.6 0.5 0.5 0.5 Absorbancia Absorbancia Absorbancia 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 0.1 0.1 0.1 00 0 00 0 22 2 44 4 66 6 ppm ppm ppm 88 8 10 10 10 12 12 12 14 14 14 yy= 0.0475x + 0.0205 y= 0.0475x + 0.0205 = 0.0475x + 0.0205 2 R 2= 0.9973 R 2= 0.9973 R = 0.9973 Absorbancia Absorbancia Absorbancia Pronstico Absorbancia Pronstico Absorbancia Pronstico Absorbancia Lineal (Absorbancia) Lineal (Absorbancia) Lineal (Absorbancia)
Figura 21. Recta de regresin del cido tnico
- 69 -
4.1.3.2. Cuantificacin de saponinas totales

La curva de calibracin de saponina estndar en el rango de concentracin estudiadas responde a la ecuacin Y = 1,9582X + 0,3836 y coeficiente de correlacin 0,9513 y a un intervalo de confianza 95%.Al realizar la significacin estadstica de la varianza de la pendiente (Tabla ANOVA para la regresin lineal simple, mediante el anlisis de regresin utilizando Excel 2007, Microsoft office). El Fc (78,076021)>Fo (0,00090555), se rechaz la hiptesis Ho(=0) por lo que X e Y estn relacionadas linealmente. La utilizacin de la ecuacin de regresin para la prediccin y estimacin es aconsejable.
De acuerdo al valor del coeficiente de correlacin lineal simple, se puede afirmar que la variable X (mg/mL) se encuentran asociadas en forma directa de una manera muy fuerte con la variable dependiente Y (absorbancia) en un 97,5%.La prueba de hiptesis para la correlacin a un nivel de significancia de =0,05, tc (8,84)>to(2,77), entonces se rechaza la hiptesis Ho:=0; con lo que se afirma la correlacin. De acuerdo al coeficiente de determinacin R2, se puede afirmar que el 95% de las absorbancias se explican por la regresin.
Tabla 24. Curva de calibracin de saponina estndar

X [Estndar] mg/mL 0,12 0,16 0,20 0,24 0,28 0,32 Y Absorbancia 0,462 0,540 0,608 0,663 0,848 0,904
N 1 2 3 4 5 6
(X/Y) 0,500 0,533 0,526 0,560 0,600 0,625
- 70 -
Tabla 25. Estadstica de la regresin de la saponina estndar
Coeficiente de correlacin mltiple Coeficiente de determinacin R^2 R^2 ajustado Error tpico Observaciones
0,975 0,951 0,939 0,043 6
Tabla 26. Anlisis de varianza de la saponina estndar
Regresin Residuos Total
Grados de libertad 1 4 5
Suma de cuadrados 0,14315852 0,00733431 0,15049283
Promedio de los cuadrados 0,14315852 0,00183358
F 78,076021
Valor crtico de F 0,000906
Figura 22. Recta de regresin de la saponina estndar
- 71 -
Tabla 27. Porcentaje de saponinas totales de residuos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L.
Absorbancia
mg/mL
Gramos de residuo para 1mL de solucin
Porcentaje de saponinas Totales
1 2 3
0,464 0,470 0,466
0,041 0,044 0,042
0,01 0,01 0,01 PROMEDIO
0,410 0,440 0,420 0.423
4.1.4. ANLISIS CROMATOGRFICO
4.1.4.1. Taninos
I. Krameria triandra RfSt 1:0.90
II. Plukenetia volubilis L.
Fase estacionaria: Silica Gel 60F254 Fase mvil: 1-Butanol: Ac. Actico: Agua (4:1:5) Revelador: Cloruro Ferrico
II
Fotografa N 1. Cromatografa en capa fina de taninos
- 72 -
4.1.4.2.
Saponinas
Fase estacionaria Fase mvil Revelador : Silica Gel 60F254 : Cloroformo: Acetato de etilo (9:1) : Lieberman - Burchard
RfM5
RfM4
RfM3 RfM2 RfM1
RfSt 1
RfM2
II I
Fotografa N2. Cromatografa de saponinas triterpenoides
I. Quillaja saponaria
RfSt 1:0.60
RfM1:0.46 RfM2:.0.62 RfM3: 0.82 RfM4:0.94 RfM5:100
RfM5 RfM4 RfM3

I. Quillaja saponaria
RfSt 1
RfM2 RfM1
RfSt 1:0.60
RfM1:0.31 RfM2:0.46 RfM3: 0.62 RfM4: 0.82 RfM5:0.94 RfM6:100
II
Fotografa N 3.cromatografa de saponinas triterpenoides

I. Glycyrrhiza glabra RfSt 1:0.34
RfM3 RfSt 3 RfM2
RfSt 2:0.43 RfSt 3:0.62 II. Plukenetia volubilis L.
RfSt 2 RfSt 1 RfM1
RfM1:0.34 RfM2:0.62 RfM3:0.82
II
Fotografa N 4. Cromatografa de saponinas triterpenoides
I. Glycyrrhiza glabra
RfM3
RfSt 1:0.32 RfSt 2:0.43 RfSt 3:0.62
RfSt 3 RfSt 2 RfSt 1
RfM2
RfM1
RfM1:0.38 RfM2:0.62 RfM3:0.82
II
Fotografa N 5. Cromatografa de saponinas triterpenoides
- 74 -
4.2.
4.2.1.
ESTUDIO BROMATOLGICO
ANLISIS QUMICO PROXIMAL
Para obtener informacin del contenido de humedad, grasa, protena y cenizas, se realiz el anlisis proximal. Estos procedimientos qumicos revelaron el valor nutritivo de los residuos
industriales de la extraccin de aceite de Plukenentia volubilis L., sacha inchi y de esta manera nos da una referencia de cmo pueden ser combinados con otras materias primas para alcanzar el nivel deseado de los diferentes componentes de una dieta (tabla N 28 a la N 34).
Tabla 28. Determinacin de la humedad
Muestra A B
Porcentaje de base hmeda 5,13 5,05 5,090,057
Porcentaje de base seca 94,87 94,95 94,910,057
xs
Tabla 29. Determinacin de protenas
Muestra A B C
Porcentaje de base hmeda 32,51 32,42 32,65 32,530,12
Porcentaje de base seca 34,25 34,15 34,39 34,260,012
xs
- 75 -
Tabla 30. Determinacin de protenas en muestra de residuos desengrasados
Muestra A B C
Porcentaje de base hmeda 48,74 50,08 47,41 48,741,34
Porcentaje de base seca 51,36 52,77 49,95 51,361,41
xs
Tabla 31. Determinacin de extracto etreo
Muestra A B
xs
Tabla 32. Determinacin de fibra cruda
Muestra A B
Porcentaje de base hmeda 3,73 2,28 3.001,03
Porcentaje de base seca 3,93 2,40 3.161.08
x s
- 76 -
Tabla 33. Determinacin de cenizas
Muestra A B
xs
Tabla 34. Anlisis proximal de los residuos industriales de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L.
Porcentaje de base hmeda Humedad Protena Extracto etreo Fibra cruda Cenizas Extracto no nitrogenado 5,09 32,53 35,44 3,00 3,07 20,87
Porcentaje de base seca 94,91 34,26 37,33 3,16 3,24 22,01
- 77 -
4.2.2.
FIBRA DETERGENTE NEUTRO(FDN)
Tabla 35. Determinacin de pared celular y contenido celular
Muestra A B
Porcentaje de pared celular 23,86 27,46 25,662,55
Porcentaje de contenido celular 76,14 72,54 74,342,55
xs
Tabla 36. Determinacin de FDN
Muestra A B
Porcentaje de FDN 16,39 16,26 16,332,74
xs
Tabla 37. Resultados de la determinacin de fibra detergente neutro
Porcentaje de base hmeda Pared celular Contenido celular FDN 24,35 70,56 15,49
Porcentaje de base seca 25,66 74,34 16,33
- 78 -
4.2.3.
MINERALES ESENCIALES
Tabla 38. Determinacin de calcio, fsforo y hierro

Macroelementos > 100 mg/da Calcio mg/100g 317,83 Fsforo mg/100g 560,00 Microelementos < 100 mg/da Hierro mg/100g 4,18
4.2.4.
VITAMINAS
Tabla 39. Determinacin de tiamina, riboflavina, niacina
Tiamina mg/100g 0,31
Riboflavina mg/100g No detectable
Niacina mg/100g No detectable
Tabla 40. Resultados de la determinacin de minerales y vitaminas
Porcentaje de base hmeda

Calcio Fsforo Hierro Tiamina Riboflavina Niacina 301,65 531,50 3,97 0,29 No detectable No detectable
Porcentaje de base seca

317,83 560,00 4,18 0,31 No detectable No detectable
- 79 -
4.2.5.
pH
Tabla 41.Resultados de la determinacin de pH

Temperatura pH 23,2 pH 5,89
4.2.6. ACIDEZ TOTAL
Tabla 42. Resultados de la determinacin de acidez titulable total

Porcentaje de base hmeda
1.10 x 10-3 ACIDEZ TOTAL 2.14 x 10-3 2.26 x 10-3
Porcentaje de base seca

1.20 x 10-3
- 80 -
Tabla 43. Tabla comparativa del anlisis proximal de residuos obtenidos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L., respecto a Glycine max L. y Chenopodium quinoa W.
Plukenetia volubilis L. RESIDUO SACHA INCHI 5,09 34,26 35,44 3,00 3,07 20,87 24,35 Glycine max EXPELLER SOYA1 5,00 11,00 30,00 42,00 13,2 22,5 4,70 6,48 4,61 5,37 30,9 34,00 12,00 29,50 Chenopodium quinoa W GRANO QUINUA2 7,83 15,25 7,49 5,09 3,54 68,79 54,63
Humedad Protena Extracto etreo Fibra cruda Cenizas ELN Pared Celular
Fuente:
1 2
Gallardo, M et al. (2008) Collazos et al (1996). Tablas Peruanas de Composicin de Alimentos.
80 70 P orcen taje g/100g 60 50 40 30 20 10 0 1

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
HUMEDAD PROTEINA EXTRACTO TEREO FIBRA CRUDA CENIZAS EXTRACTO NO NITOGENADO PARED CELULAR
Pl u k e n e ti a vol u bi l i s L. RES IDUO S AC HA INC HI Gl yci n e m ax EXPELLER S O YA Gl yci n e m ax EXPELLER S O YA C h e n opodi u m qu i n oa W GRANO Q UINO A ran go mi n ran go max
Figura 23. Comparacin del anlisis proximal de residuos obtenidos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. , respecto a Glycine max L., y Chenopodium quinoa W.
- 81 -
Estudio Farmacognstico y Bromatolgico de los residuos industriales de la extraccin del
aceite de Plukenetia volubilis L. (sacha inchi)
Tabla 44. Tabla comparativa de minerales y vitaminas de residuos obtenidos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L., respecto a Glycine max L. y Chenopodium quinoa W.
Minerales y vitaminas Calcio Fsforo Hierro Tiamina Riboflavina Niacina

Fuente:
1 2
Plukenetia volubilis L. Resduo sacha inchi 301,65 531,50 3,97 0,31 No detectable No detectable
Glycine max Expeller soya1 200,00 620,00 15,70 0,50 0,80 9,00
Chenopodium quinoa W Grano quinoa2 127,10 534,48 16,23 0,45 1,19 1,40
Gallardo, M et al. (2008) Collazos et al (1996). Tablas Peruanas de Composicin de Alimentos.
700 600 500 400 300 200 100 0 CALCIO mg/100g FOSFORO mg/100g HIERRO mg/100g
PORCENTAJE g/%
Plukenetia volubilis L Glycine max.L. Chenopodium quinoa W.
Figura 24. Comparacin de minerales, calcio, fsforo y hierro de residuos obtenidos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L., Glycine max L.; Chenopodium quinoa W.
- 82 -
600 PORCENTAJE ug/100 g 500 400 300 200
Plukenetia volubilis L
100 0 TIAMINA ug/100g
Glycine max.L. Chenopodium quinoa W.
Figura 25. Comparacin en g/g% de tiamina de residuos obtenidos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L., Glycine max L; Chenopodium quinoa W.
4.2.6. DIGESTIBILIDAD DE PROTENAS IN VITRO 4.2.6.1. Nitrgeno soluble en pepsina
Tabla 45. Resultados de la digestibilidad de protenas in vitro por el mtodo enzimtico pepsina de residuos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L.
Muestra A B C A1 B1 C1
Protena indigerible mg
4,43 4,57 4,43 4,50 4,66 4,35
Protena digerible %
87,07 86,66 87,07 86,86 86,40 87,30
xs
4,480,111
86,890,325
- 83 -
4.2.6.2. Digestibilidad enzimtica por celulasa
Tabla 46. Resultados de la digestibilidad de protenas in vitro por el mtodo enzimtico celulasa de residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. sacha inchi.
Muestra
A B C A1 B1 C1 A2 B2 C2
Residuo 24h (g)

0,0346 0,0256 0,0281 -
Residuo 48h (g)

0,0217 0,0288 0,0358 -
Residuo 72h (g)

0,0176 0,0258 0,0257
%DMS
86,53 86,32 88,97 91,38 88,26 85,70 92,90 89,63 89,60
Promedio
87,271,47
88,452,84
90,711,73
- 84 -
4.2.6.2.1.
Anlisis de varianza de la influencia del tiempo y el porcentaje de digestibilidad enzimtica por celulasa
Los tres conjuntos de datos forman muestras aleatorias simples e independientes, extradas de tres poblaciones que son similares excepto por las condiciones estudiadas.
Hiptesis
Ho: 1 = 2 = 3(en promedio las cuatro condiciones producen la misma respuesta) HA: No todas las son iguales (al menos una condicin produce una respuesta promedio diferente del promedio de cuando menos una de las dems condiciones)
Tabla 47. ANOVA de tiempo y %DMS por celulasa
Grupos %DMS 24H %DMS 48H %DMS 72H
Cuenta 3 3 3
Suma 261,82 265,34 272,13
Promedio 87,27 88,45 90,71
Varianza 2,17 8,09 3,60
Tabla 48. Anlisis de varianza de tiempo y %DMS por celulasa

Suma de cuadrados 18,31 27,72 46,03 Grados Promedio de de los libertad cuadrados 2 9,16 6 4,62 8 Valor Probabilidad crtico para F 0,22 5,14
Origen de las variaciones Entre grupos Dentro de los grupos Total
1,98
Decisin estadstica
Podemos comparar la F calculada con la F terica de las tablas para 2 y 6 grados de libertad, con un nivel de significancia : 0,05: El resultado ANOVA le da el valor estadstico de F. El valor de F calculado entre los tres grupos es 0,22 y el obtenido en las tablas F 0,95; 2,6 es 5,143; p>0,05 para esta prueba.
- 85 -
Podemos afirmar que al ser menor el F calculado que el F 0,95; 2,6 terico y ser el p- valor es mayor a 0,05 hemos de aceptar la hiptesis nula y que no hay diferencias significativas en las digestibilidades respecto a las 24, 48 y 72 horas, es decir no hay relacin entre las variables.
4.2.6.3. Determinacin de aminocidos
4.2.6.3.1.
Prueba de solubilidad y determinacin de protenas del residuo de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. sacha inchi
En la prueba de solubilidad para la extraccin de una mayor cantidad de protenas, se observ una mejor extraccin con el Buffer Tris-HCl 0.05M a un pH 6.5 y a una temperatura de 25C. y que se corroboro con la determinacin de protenas (mtodo de Lowry ).
Tabla 49. Resultados de la prueba de solubilidad en la extraccin de la fraccin proteica de residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L
Disolvente Muestra problema Prueba de solubilidad pH Temperatura Desecho Muestra solubilizada Longitud de onda Cuantificacin % protena (Lowry)
Suero fisiolgico 1,02g 7,0 25C 0,64 g 0,37g 700nm 41
Agua bidestilada 1,05 g 7,4 25C 0,65 g 0,40g 700nm 37
TRIS HCl 1,04 g 6,5 25C 0,25 g 0,78g 700nm 46
- 86 -
4.2.6.3.2.
Extraccin y purificacin de protenas totales de residuos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. sacha inchi mediante la cromatografa por filtracin en gel sephadex G-25.
FRACCIN PROTECA DE LA MUESTRA B (30%) A UNA LECTURA FRACCIN PROTECA DE LA MUESTRA A (20%) A UNA LECTURA DE 280 nm
DE
Absorbancia
2.5
280 nm
2
A S R A CA2 0n BO V N I 8 m
COLUMNA PICO I
1.5
Dimetro :2.2 cm Altura :27 cm Flujo :30 m L/h Eluente :Tris-HCl 50mM pH 6.5 Volumen/Tubo: 1mL
PICO II
0.5
4 8
5 2
5 4
5 6
5 8
6 0
6 2
6 4
6 6
6 8
7 0
7 2
7 4
7 6
7 8
8 0
8 2
8 4
8 6
8 8
9 0
9 2
9 4
N DE FRACCIN VOLUME N(mL)/TUBO 30mL/h
Figura 26. Curva de absorbancias de la fraccin proteica de la muestra al 20%
FRACCIN PROTECA DE LA MUESTRA A (30%) A UNA LECTURA DE DE 280 nm 280 nm

Absorbancia
1.8 1.6
FRACCIN PROTECA DE LA MUESTRA A (20%) A UNA LECTURA
PICO I COLUMNA
A S R A C 2 0n B O V N IA 8 m
1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
Dimetro :2.2 cm Altura :27 cm Flujo :30 m L/h Eluente :Tris-HCl 50mM pH 6.5
PICO II
4 8
5 1
5 3
5 5
5 7
5 9
6 1
6 3
6 5
6 7
6 9
7 1
7 3
7 5
7 7
7 9
8 1
8 3
8 5
8 7
8 9
9 1
9 3
N DE FRACCIN VOLUMEN(mL)/TUBO 30mL/h
Figura 27. Curva de absorbancias de la fraccin proteica de la muestra al 30%
- 87 -
9 5
9 6
4.2.6.3.3.
Valores obtenidos del Pico I de la fraccin proteica extrada de las protenas totales y rendimiento del volumen dializado y peso del liofilizado.
Tabla 50. Condiciones de la fraccin proteica del mayor pico (Pico I) de residuos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L.
Extracto Concentracin Muestra (%) trasvasado a la columna (mL) Peso del liofilizado (Protena soluble) (mg) Rendimiento Protena soluble/residuo (%) Rendimiento Protena soluble/protena total (%)
A B Promedio
20 30 25
2mL 2mL 2mL
45 57 51
11.25 9.5 10.38
21.42 18.38 19.90
Muestra cargada
Partculas de gel Molcula de la muestra de tamao molecular inferior al poro del gel Molcula de la muestra de tamao molecular superior al poro del gel (azul dextrano)
Fotografa Composicin de aminocidos de los cromatografa en columna.Der. mecanismo de 4.2.6.3.4. N 6. Izq. equipo recolector de fracciones y residuos de la extraccin del aceite de flujo de las partculas y molculas de la Plukenetia volubilis L. sacha inchi (mg/g) cromatografa en columna.
- 88 -
Tabla 51. Aminograma de los residuos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. (mg/g) en comparacin con Amarantus caudatus, Glycine max L., Chenopodium quinoa W.
Aminocidos
Plukenetia volubilis L.
Protena aislada de 35 KDa A.caudatus (1)
Fraccin albmina A.caudatus (1) 18 134 72 174 40
Semilla
Chenopodium quinoa W
Glycine max L. (2) 117 187 51 42 25 39
(3) 73 119 37 52 24 35 47 71 31 28 45 20 36 60 41 56
Asprtico Glutmico Serina Glicina Histidina Treonina Alanina Arginina Prolina Tirosina Valina Metionina Isoleucina Leucina Fenilalanina Lisina
132 239 58 38 9 68 35 63 24 22 31 13 180 69 9 39
121 100 67 90 22
108 29 54 39 64 18 49 95 56 86
72 89 97 33 64 46 52 59 22 27
43 72 55 31 48 13 45 78 49 54
(1) Fuente. Villanueva, O., Arnao, I. Purificacin de una protena de 35 KDa rica en lisina, de la fraccin albmina de Amaranthus caudatus (Kiwicha).2007. (2) Fuente. Hamaker et al. 1992. Universidad de Arkansas, USA. (3) Aporte de los cultivos andinos a la nutricin humana. Raices Andinas.Guido Ayala.pag102-111
- 89 -
4.2.6.3.4.1. Anlisis de aminocidos esenciales de los residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. sacha inchi (mg/g) TABLA 52. COMPOSICIN DE AMINOCIDOS ESENCIALES DE LOS RESIDUOS DE LA EXTRACCIN DEL ACEITE DE
Plukenetia volubilis L. (mg/g) EN COMPARACIN CON A.caudatus, Glycine max L.,Chenopodium quinoa W, Chenopodium pallidicaule, Oxalis tuberosa, Tropaeolum tuberosum, Arachis hypogaea L., Helianthus annuus L Y LA FAO/OMS
Plukenentia volubilis L. Aminocido
sacha inchi**
Chenopodium quinoa W.
quinua ( 1)
Chenopodium pallidicaule
caihua ( 1)
Amaranthus caudatus
kiwicha ( 1)
Oxalis tuberosa
oca ( 1)
Tropaeolum tuberosum
mashua ( 1) 28.08 46.53 33.78 27.90 49.41 23.69 6.66 40.59
Ullucus tuberosum
olluco ( 1) 41.1 49.0 48.0 30.5 59.5 26.5 9.1 35.0
Plukenentia volubilis L.
sacha inchi (2) 50 64 43 37 79 43 29 40
Glycine max L.
soya (2) 45 78 54 26 80 39 13 48
Arachis hypogaea L. Mani

(2) 34 64 35 25 89 26 10 42
Helianthus annuus L. girasol

(2) 43 64 36 34 54 37 14 51
FAO/OMS
Isoleucina Leucina Lisina Metionina+cisteina Fenilalanina +tirosina Treonina Triptofano Valina
180 69 39 13(*) 31 68 ND 31
69 67 68 33 40 45 13 35
64 58 58 16 35 47 8 45
52 46 67 35 35 51 11 45
36.36 53.63 59.08 25.45 31.81 45.45 5.50 48.17
52 70 55 35 60 40 10 35
Fuente (1): Aporte de los cultivos andinos a la nutricin humana. Races Andinas. Guido Ayala. pg. 102-111. (2) Hamaker et al. 1992.Universidad de Arkansas, USA.
( )
: metionina : residuo industrial de la extraccin del aceite del Plukenetia volubilis L. : no determinado
** ND
4.2.6.3.4.2. Puntaje qumico En las muestras analizadas se observa que el aminocido limitante en los residuos industriales de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L. es la histidina (48) .No se pueden hacer inferencias sobre el triptfano debido a que no fue posible determinarlo en esta investigacin. Empleando el dato terico de 87% de digestibilidad (nitrgeno soluble en pepsina), el puntaje qumico corregido (PQC) para los residuos es 42%.
Tabla 53. Puntaje qumico

Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina + tirosina 31 60 52 Treonina Valina Histidina
Sacha inchi FAO PQ
180 52 346
69 70 99
39 55 71
13 17 76
68 40 170
31 35 89
9 19 48
16
4 5 1 2 3 6 8 7 9
10
11 12 15 14 13
1. Asprtico. 2. Glutamico. 3. Serina. 4. Glicina. 5. Histidina. 6. Treonina. 7. Alanina. 8. Arginina. 9.Prolina.10.Tirosina. 11. Valina. 12. Metionina. 13. Isoleucina. 14.leucina.15. Fenilalanina. 16.
Figura 28. Composicin de solucin estndar de aminocidos stock a una concentracin de 2.5 moles*mL-1, en una dilucin de 20 L en 300 L de buffer acetato de amonio 0.05M, pH 6
- 91 -
16
4 3 2 1 6 5 8 7 9 10 11 14 13 12 15
1. Asprtico. 2. Glutamico. 3. Serina. 4. Glicina. 5. Histidina. 6. Treonina. 7.Alanina.8.Arginina. 9.Prolina.10.Tirosina. 11. Valina. 12. Metionina. 13. Isoleucina. 14.leucina.15. Fenilalanina. 16.
Figura 29. Composicin de los aminocidos de residuos de la extraccin de aceite de Plukennetia volubilis L. (20%) en una dilucin de 3,7mg de protena soluble en 500 L de buffer acetato de amonio 0.05M, pH 6
16 2
4 3 7 8 6 5 9 10 11 14 12 13 15
1. Asprtico. 2. Glutamico. 3. Serina. 4. Glicina. 5. Histidina. 6. Treonina. 7. Alanina. 8. Arginina. 9.Prolina.10.Tirosina. 11. Valina. 12. Metionina. 13. Isoleucina. 14.leucina.15. Fenilalanina. 16.
Figura 30. Composicin de los aminocidos de residuos de la extraccin de aceite de Plukennetia volubilis L.(30%) en una dilucin de 3,4mg de protena soluble en 500 L de buffer acetato de amonio 0.05M, pH 6
- 92 -
4.3. EVALUACIN DE TOXICIDAD AGUDA A DOSIS LMITE
El ensayo de toxicidad aguda a dosis lmite de residuos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L., la dosis administrada en ratas se expres en: gramos de extracto por kilogramo de peso corporal (tabla 54), segn el ensayo de toxicidad a dosis limite por el Mtodo OECD 420 (tabla 56) y met. Betancourt.
Tabla 54. Resultado de toxicidad aguda oral a dosis limite

ESPECIE Plukenetia volubilis L. sacha inchi DESCRIPCIN N RATAS NMUERTES SEXO HEMBRA MACHO HEMBRA MACHO 2000 mg/kg TOXICIDAD DOSIS NICA
5 5 0 0
> 2000 mg/Kg

de peso corporal
Tabla 55. Comportamiento de la media del peso corporal desviacin estndar a los 0, 7 y 14 das.
PESO CORPORAL (g) N ANIMALES EN CADA GRUPO 5 5 5 HEMBRAS GRUPO CONTROL 181,6 1,3 202,2 2,2 218,4 3,3 GRUPO TRATADO 185,4 2,7 206,4 2,3 223,2 3,4 MACHOS GRUPO CONTROL 202,2 3,6 221,8 2,7 242,8 3,6 GRUPO TRATADO 201,4 3,13 226,0 2,2 247,8 2,8
N DE DAS 0 7 14
Tabla 56. Rango de masa corporal con relacin a la edad en semanas de la especie y lnea del modelo biolgico
Edad (semanas) 7-8 8-9 9-10 Masa corporal (g) 180-200 200-220 220-240
La masa corporal como indicador de toxicidad, se comport dentro de los parmetros establecidos para la curva de crecimiento de la especie y lnea del modelo biolgico utilizado (IFFA CREDO).
4.3.1.
ANLISIS BIOESTADSTICO
4.3.1.1. Anlisis de varianza entre los grupos control y tratados hembra y macho, respecto a la ganancia de peso.
Se determin la media y desviacin estndar de los pesos corporales a los 0, 7 y 14 das por sexo y grupo. Se realiz un ANOVA de un factor y un Test de t - Student, para determinar las diferencias entre grupos.
GANANCIA DE PESO EN TOXICIDAD A DOSIS LIMITE

GANANCIA DE PESO EN EL ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA A DOSIS NICA EN
50 45 GANANCIA DE PESO 40 35 30 25 20 15 10 5 0
EL GRUPO CONTROL Y TRATADO DE HEMBRAS Y MACHOS
7 DIAS
GRUPO CONTROL HEMBRA GRUPO CONTROL MACHO
14 DIAS
GRUPO TRATADO HEMBRA GRUPO TRATADO MACHO
Figura 31. Ganancia de peso en el ensayo de toxicidad aguda a dosis nica en el grupo control y tratamiento de hembras a los 7 y 14 das de ensayo.
- 94 -
Supuesto Los cuatro conjuntos de datos forman muestras aleatorias simples e independientes, extradas de cuatro poblaciones que son similares excepto por la condicin estudiada. Hiptesis Se plantea la hiptesis para comparar las medias de los pesos corporales de cada grupo de tratamiento (cantidad de extracto 2g/Kg de peso y das (0,7 y 14))
Ho: El incremento de los pesos corporales de los grupos son iguales
HC(hembra control)=MC(macho control)= HT(hembra tratada)=MT(macho tratado) H1: El incremento de los pesos corporales en los grupos son diferentes HC(hembra control) MC(macho control) HT(hembra tratada) MT(macho tratado)
Tabla 57. Resumen de ANOVA para el grupo control y tratado para ambos sexos
Grupos Controlados hembras Controlados machos Tratados hembras Tratados machos Cuenta 3 3 3 3 Suma 603,1 664,8 615,0 670,4 Promedio 201,0 221,6 205,0 223,5 Varianza 374,4 453,7 358,7 542,1
Tabla 58. ANOVA para determinar la diferencia entre grupos

Promedio de los cuadrados 390,51 432,23 Valor crtico para F 4,06
Origen de las variaciones Entre grupos Dentro de los grupos Total Decisin
Suma de cuadrados 1171,53 3457,87 4629,40
Grados de libertad 3 8 11
Probabilidad
0,90
0,48
Debido a que el valor calculado F es 0,90 es menor que el valor crtico F0.95, 3,8 4,06 se acepta Ho. Se concluye que los cuatro grupos no tienen diferente peso corporal promedio y mostraron diferencias significativas p>0,05 en ninguno de los tiempos estudiados. no
- 95 -
4.3.1.2. Comportamiento del peso corporal para el grupo control y tratado hembra mediante la aplicacin del test de t- Student.
Tabla 59. Prueba F para varianzas de dos Tabla 60. Prueba t para dos muestras suponiendo muestras
TRATADOS CONTROL
varianzas iguales
TRATADOS CONTROL
Media Varianza Observaciones Grados de libertad F Valor crtico para F
205,80 404,28 3 2 1,19 19,00
200,40 339,04 3 2
Media Varianza Observaciones Varianza agrupada Grados de libertad Estadstico t Valor crtico de t
205,80 404,28 3 371,66 4 0,34 2,77
200,40 339,04 3
COMPORTAMIENTO DEL PESO CORPORAL DURANTE EL ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA A DOSIS NICA EN HEMBRAS 0 250 2 4 6 8 10 12 14 16 250
206.4
200
225.6 201.2 218.4

200
185.4 181.6
PESO(g)
150
150
100
100
50
50
0 0 7 TIPO DE ENSAYO (DIAS) GRUPO CONTROL GRUPO TRATADO 14
Figura 32. Comportamiento del peso corporal para el grupo control y tratado hembra.
Debido a que el valor calculado t - estadstico es 0,34 es menor que el valor crtico t 2,77; entonces, no existe diferencia del peso corporal de las hembras en los grupos controles y tratados, para un p>0,05 a los 0,7 y 14 das de tratamiento.
- 96 -
4.3.1.3. Comportamiento del peso corporal para el grupo control y tratado macho mediante la aplicacin del test de t- Student
Tabla 62.Prueba f para varianzas de dos muestras

TRATADOS CONTROL
TABLA 63. Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales

TRATADOS CONTROL
Media Varianza Observaciones Grados de libertad F Valor crtico F
225,06 538,89 3 2 1,18 19,00
222,20 455,16 3 2
Media Varianza Observaciones Varianza agrupada Grados de libertad Estadstico t Valor crtico de t
225,06 538,89 3 497,03 4 0,16 2,77
222,22 455,16 3
COMPORTAMIENTO DEL PESO CORPORAL DURANTE EL ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA A DOSIS NICA EN MACHOS 0 300 250 2 4 6 8 10 12 14 16 300
247.8 226 201.4 223.6 242.8 200.2
250 200 150 100 50 0
200 P S (g) EO 150 100 50 0 0
7 TIPO DE ENSAYO (DIAS) GRUPO TRATADO GRUPO CONTROL
14
Figura 33. Comportamiento del peso corporal para el grupo control y tratado macho
Debido a que el valor calculado t - estadstico es 0,16 es menor que el valor crtico t 2,77; entonces, no existe diferencia del peso corporal de los machos en los grupos controles y tratados, para un p>0,05 a los 0,7y 14 das de tratamiento
- 97 -
V. DISCUSIN
La presente investigacin realiz el estudio farmacognstico y bromatolgico de residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L. sacha inchi; al mismo tiempo que se confirmndose que en la literatura no existen referencias especificas sobre estos estudios que permitan valorar y desechar y aprovecharlos al 100%, fomentando el desarrollo econmico social sostenible que justifica el presente trabajo.
En el estudio farmacognstico se realiz la marcha fitoqumica realizndose mediante tres extracciones, en cada una de ellas se procedi a la determinacin de sustancias solubles, observndose en la tabla 15: extracto etereo, 35%; alcohlico y acuoso, 17%. De cada extracto se obtuvieron respuestas positivas para metabolitos primarios o esenciales que desempean funciones vitales para el desarrollo del vegetal
(22)
, entre los que se destacaron: glcidos (azcares reductores), lpidos y
aminocidos. Entre los metabolitos secundarios en las tablas 16, 17 y 18): triterpenos, saponinas triterpenoides, trazas de taninos, estos resultados no han sido reportados, pero segn la literatura (20,21), la familia Euphorbiaceae se caracteriza por presentar los mencionados metabolitos secundarios.
En la cuantificacin de tninos, la curva de calibracin en el rango de concentraciones estudiadas para el patrn, demostr ser lineal por tener un coeficiente de correlacin mayor a 0.990 (figura 21). De acuerdo al coeficiente de determinacin R2, se puede concluir que el 99% de las absorbancias pueden ser explicadas por las concentraciones ppm del cido tnico, con lo que se obtiene 1.3 x 10-5 %de cido tnico (tabla 23) del residuo de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L. Estos valores son inferiores a los encontrados en: Krameria triandra (12%), Plantago lanceolada (0.8 1.0%), Medicago sativa. Los valores obtenidos de los residuos de Plukenetia volubilis L. no perjudican su interaccin con las protenas.
Los principales efectos de los taninos se deberan a la interaccin de la protena con los taninos condensados (TC) y con los taninos hidrolizados (TH), los taninos se adhieren con mayor fuerza a las protenas con alto contenido de prolina. Los taninos afectan la digestibilidad de las protenas y disminuye la actividad de las enzimas digestivas, por ello su retencin de nitrgeno y aminocidos esenciales. Respecto a los aminocidos limitantes reducen la disponibilidad de
metionina, mientras para las protenas los valores de digestibilidad varan de 45.5 a 66.7% en comparacin con 89.9% de los sorgos (bajos en taninos) que explicara la alta digestibilidad de los residuos de Plukenetia volubilis L.
- 98 -
En la cuantificacin espectrofotomtrica de saponinas totales se encontr un 0.423 0.015% de saponinas (tabla 27), valores menores a los encontrados en saponina de: corteza de Quillaja saponaria (10%), Chenopodium quinoa W. quinua (0-6%), Medicago sativa alfalfa (2-3%); sin embargo, las exigencias del mercado, fijan como valor limite 0.05%.Al respecto las saponinas, son inhibidores del consumo (baja palatabilidad), un ejemplo de ello se ve en los bajos consumos de alfalfa por cerdos, atribuidos a la presencia de saponinas y sus propiedades espumantes que constituyen fuertes interferencias en la absorcin intestinal; las especies de mayores concentraciones deben ser manejadas con cuidado en los sistemas de alimentacin para evitar trastornos en el metabolismo digestivo; ya que, se unen a nutrientes como el zinc inhibiendo enzimas metablicas y digestivas.
En el estudio cromatogrfico de saponinas en capa fina se confirm la presencia saponinas triterpenoides, al ser comparadas con saponinas patrn que al ser comparado con Quillaja saponaria jaboncillo presento un componente, Rf para el patrn 0.60 y 0.62 (fotografa N2 y 3) y
Glycyrrihiza glabra presento tres componentes siendo sus Rf 0.62,0.43 y 0.32 - 034 con ambos reveladores y para el residuo 0.62, 0.38 con revelador Lieberman Bouchardat (fotografa N4) y 0.62,0.34 encontrados con revelador vainillin fosfrico (fotografa N5). La literatura reporta la presencia de saponinas triterpnicas en las dicotiledneas, clasificacin adoptada por Engler, especialmente en la familia Euphorbiaceae, Cariofilaceae, Poligalceae y solanceae entre otras; la especie vegetal pertenece a una de las familias mencionadas anteriormente (Euphorbiaceae) y servir para sealar su posible presencia, que corroborara la quimiotaxonomia de la familia (47,65, 66).
En el estudio bromatolgico, el anlisis qumico proximal, se determin la humedad un bajo contenido de agua (tabla 28) con valor promedio de 5.09 0.057. Antunez,E (1981)(67) y Pascual, G., et al (2000) (3) encontraron valores similares de agua, 4.2 y 6.37 respectivamente.
En la determinacin de protenas (tabla 29) de acuerdo al mtodo de Kjeldahl (AOAC,1997), se observ que el contenido de protenas de los residuos fue de 34.26 0.012 y para residuos desengrasados 51.36 1.41 (tabla 30) . Estos resultados son prximos a los encontrados por Antunez, E (1981) (67) ; Pascual, G, et al (2000) (3); Garca (1992) (9) y Hamaker, et al (1992) (9) encontraron. El valor de proetinas encontrados constituye una alternativa a la torta Glycine max L. soya, pues la actividad avcola y pecuaria importa aproximadamente cien mil toneladas de torta de Glycine max L. soya y que actualmente se estn formulando mezclas nutritivas. La concentracin de protena y su calidad, se ve influencian por el proceso de extraccin (menos aceite remanente) y si se procesan descascarillados (41,69).
- 99 -
En el extracto tereo se emple el mtodo de Goldsfich. Los resultados se muestran en la tabla 31, el contenido de grasa fue de, 37.33 2.87; que al compararse con los datos reportados por Antunez, E. (1981) (67); Garca (1992) (9), Hamaker, et. al, (1992 ) (9) y Pascual, G., et al (2000) (3) se observa que sus diferencias son poco significativas que se explicaran debido al almacenamiento, el cultivo, la poca de siembra y cosecha , el tiempo , la temperatura y el tratamiento post-cosecha
(25)
.Segn Gallardo, G. et al (2008) (41) valores mayores de 9% de extracto (extraccin mecnica) y no
ms de 2% cuando se combina prensa y solvente, evidencia una baja eficiencia industrial; por lo tanto, es exponer el material a la rancidez, porque podra entorpecer otros procesos industriales; por ejemplo, cuando se desean incorporar estas harinas en un balanceado comercial pelletilizado; ya que, los materiales aceitosos no corren bien. El valor obtenido para la fibra cruda en base seca que se observan en la tabla 32, 3.16 1.08 %, al comparar los datos se observa que el valor obtenido est dentro del rango reportado por Garca
(9) (9) )
, Hamaker et. al,
pero, diferente a lo reportado por Pascual, G.Estas diferencias es
muestra del ecotipo analizado, almacenamiento de las semillas, estacin de cultivo, post-cosecha y proceso de prensado. La metodologa de fibra cruda desarrollado hace ms de 100 aos se obtienen valores que subestiman al valor y el contenido de fibra insoluble; ya que, el tratamiento alcalino disuelve parte de esta fibra (gasta un 40%) (70).
En referencia a la fibra detergente neutra Van Soest, haba reportado que el 40% de los componentes de la fibra se perda en el mtodo de fibra cruda
(18)
. Por tal motivo se realiz la
determinacin en fibra detergente neutra la pared celular (celulosa, hemicelulosa, lignina y slice), corroborndose la gran variacin en la determinacin de fibra insoluble por ambos mtodos. Se muestra en la tabla 35 que los principios fcilmente digeribles se encuentran en el contenido clular del tejido vegetal y en el pool de los residuos estudiados fue de 74.342.55, valor muy elevado que proporciona mayor biodisponibilidad de nutrientes para el consumidor, que est compuesto por protenas, azcares solubles y grasas. El envoltorio del contenido celular est determinado por la pared celular, el valor encontrado para este anlisis fue de 25.66 2.55 que est formada por una trama o malla de difcil digestin. La composicin qumica de la pared celular vara segn la naturaleza y origen de la fibra
(71,72)
. A mediada que la planta madura se deposita lignina entre la
celulosa y hemicelulosa; la lignina es indigerible, contribuyendo a disminuir la digestibilidad de la celulosa y hemicelulosa para rumiantes, para el hombre y animales monogstricos es un irritante de la mucosa intestinal. La fibra detergente neutra est relacionada inversamente a la capacidad de consumo (sensacin de saciedad) que el hombre y los animales poseen sobre este alimento. El valor encontrado de la pared celular en comparacin a expeler de soya para ganado de leche y carne est dentro de rangos de 12 30%, estos valores no influyen negativamente en el consumo y digestibilidad, mientra que resultados de FDN de 63-66% si lo hacen (41).
- 100 -
El valor promedio obtenido de la determinacin de FDN es de 16.332.74 (tabla 36), valor en el que se encuentra celulosa, hemicelulosa y lignina. En referencia a la determinacin de ceniza (tabla 33) se obtuvo 3.24 0.33% , este valor es muy prximo a los encontrados por Antunez, E. (1981) (1992 ) (9) y Pascual, G., et al (2000) (3).
(67)
, Garca (1992)
(9)
, Hamaker, E ., et al
Respecto al valor de ELN su contenido fue de 20.87, tal como se observa en la tabla 34; observndose variaciones en la composicin de azcares respecto a Antunez, E. (1981) (67); Garca (1992) (9), Hamaker, E.,et. al (1992 )(9) y Pascual, G., et al (2000) (3)debido a diferentes factores como el cultivo, la poca de siembra y cosecha, tiempo y temperatura en poscosecha; y adems por los distintos procesos generando insumos de composicin diferente (41,73).
La tabla 38, presenta los valores obtenidos para los macroelementos esenciales; calcio y fsforo es 317 y 560 mg/100mg respectivamente. En la tabla 44, el valor de calcio encontrado fue mayor en comparacin a la quinua (127 mg/100g de materia seca) y respecto al los expeller de soya que se encuentra en un rango (200- 340 mg/100g de materia seca). El valor de fsforo es significativamente mayor que el encontrado en la quinua real Boliviana (530 mg/100g de materia seca), considerada como la mejor quinua a nivel internacional y est dentro del rango mnimo de los expeller de soya (600 - 790 mg/100g de materia seca). El valor obtenido para el microelemento esencial, hierro es de 4.179, que al compararlo con la quinua, resulta significativamente menor al rango mnimo reportado para la quinua blanca (Junn); 4.89 - 16,8 mg/100g de materia seca.
Respecto a las vitaminas analizadas (tabla 39), detect la presencia de 0,31 mg/g de tiamina, no reportndose riboflavina ni niacina. La presencia de tiamina se detect debido a que se encuentra ligada a las protenas, relacionndose de manera directa a ellas
(18)
. El valor de tiamina hallado en
comparacin al reportado por la quinua (tabla 44) esta dentro del rango de 0.23-1,16 mg/100g de materia seca y menor para la semilla de soya; 1.1 mg/100g de materia seca
En referencia a la acidez titulable y pH; se obtuvo 0.00023 % de acidez (tabla 42) (gramos de cido lctico por cada 100g de muestra) a un pH 5.89 (tabla 41).Su valor de acidez superior a 7,0 sugiere una alteracin microbiana de la harina. Es importante el pH, ya que, segn el pH propio del alimento (acidez natural), se producir el crecimiento de un tipo u otros microorganismos, as como tambin influenciar en las reacciones enzimticas y disponibilidad de nutrientes, entre otros.
Respecto a la determinacin de digestibilidad de protenas in vitro, el valor de nitrgeno soluble en pepsina mostr en la tabla 45, un promedio de protena indigerible de 4.48 y la protena digerible o total de 86.890.325. Este valor es muy prximo al encontrado por Vela, L, et al. 1994
- 101 -
(8)
(92.24%). La digestibilidad por el mtodo enzimtica celulasa, reporto: 90.711.73 (tabla 46),
valor similar a los obtenida por expeller de soya para ganado de leche y carne, 79-93%(41) .La digestibilidad obtenida en los residuos permite conocer el valor nutricional verdadero de las fuentes de protenas para rumiantes. La alta digestibilidad es muestra de un menor dao de la protena durante los procedimientos de extraccin; ya que, a una temperatura excesivamente alta y por tiempo prolongado hacen que las protenas cambien su configuracin, disminuyendo su digestibilidad, a travs de la reaccin de Maillard. La digestibilidad disminuye con el incremento de la madurez del cultivo, principalmente como resultado del aumento en el contenido de carbohidratos estructurales,pared celular que son menos digestibles que celular
(18, 69)
los componentes solubles, contenido
En la determinacin de aminocidos la prueba de solubilidad para la mejor extraccin de protenas de acuerdo a los resultados se obtuvo un mayor rendimiento con el buffer TRIS-HCL 50mM a un pH 6.5, corroborado por el mtodo de Lowry. En la determinacin de protenas Lowry present los siguientes resultados para TRIS-HCL, 46%; agua bidestilada, 37% y suero fisiolgico, 41%. El rendimiento de protena soluble obtenido fue de 10.38% en comparacin con los residuos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L., y 19.90% en comparacin con las protenas totales. En la metodologa para la determinacin de aminocidos, previa al anlisis cromatogrfico, las muestras se hidrolizaron en medio cido y altas temperaturas por dos horas. En estas condiciones, existen reportes de degradacin de triptfano, asparagina, glutamina y lisina que explica por qu no fue posible determinar el triptfano, y apunta a la posibilidad que los datos de lisina sean subestimados. Hidrlisis alcalinas de alimentos permiten determinar con mayor exactitud el triptfano, ya que de esta manera se asegura una mejor solubilidad y estabilidad de su estructura
(74)
La determinacin de la lisina presenta problemas adicionales suele reaccionar a temperaturas elevadas con grupos carbonilos o con la misma protena, por lo que disminuye su disponibilidad para la cuantificacin; al igual que con el triptfano: mediante una hidrlisis alcalina se consiguen mejores resultados (74, 75). En cuanto al anlisis cromatogrfico, la metodologa empleada para la determinacin de aminocidos en esta investigacin tiene la ventaja de ser rpida y sensible; ya que, en menos de una hora de anlisis de muestra se identifican simultneamente 16 aminocidos. El perfil de aminocidos obtenido en esta investigacin al ser comparado con el patrn de la FAO/OMS y los resultados obtenidos por Hamaker et al. 1992
(9)
se observan algunas diferencias (tabla 52); se debe
destacar que los residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L., presentan isoleucina, leucina y treonina en mayores proporciones que los del patrn, lo cual es atractivo cuando se desea elegir un alimento candidato para preparar mezclas nutritivas para consumo humano y animal. En los residuos, el aminocido limitante es la histidina (PQ 48%), con un valor superior al del trigo (PQ 44%) e inferior a la leche (PQ 100%). En vista que el triptfano no es un aminocido limitante, que reportan la literatura, el no haber generado este dato en el presente estudio, no es un factor crtico para evaluar la calidad de la protena.
- 102 -
Del ensayo de toxicidad, actualmente se acepta desde el punto de vista regulatorio que no es necesario definir un valor puntual de DL50 para una sustancia y que resulta prcticamente suficiente ubicar dicha dosis en un slo rango
(62)
. Las regulaciones para la ejecucin de este tipo de estudio
alternativo de toxicidad aguda plantean que si no existen informes anteriores de toxicidad de la(s) sustancia(s) que se investiga(n) es posible utilizar una dosis lmite de 2000 mg/kg de masa corporal, que se ajusta al presente estudio dado que el extracto acuoso del residuo no ha sealado toxicidad en su uso tradicional. En el ensayo realizado, los animales alcanzaron al final del estudio, un 100% de supervivencia, durante el estudio no se observaron signos de toxicidad y los animales mostraron los patrones normales de comportamiento de la especie. Los valores de peso corporal obtenidos en los das 0,7 y 14 en ambos ensayos y sexos, mostraron tendencia a su incremento continuo (tabla 55, figura 31) similar a la curva de peso reportada por la literatura internacional (tabla 56) (62, 63). Adems en la tabla 59-60 se puede observar que el anlisis estadstico (ANOVA) no arrojo diferencias entre grupos (p>0.05).Se observ una ligero aumento de peso de los tratados frente a los controles para ambos sexos (figura 32 33); sin embargo, mediante el test t-Student, este aumento no fue significativo (p>0.05) al compararse con el grupo control, igual sexo (cuadro 62 63). El peso corporal constituye uno de los principales indicadores de posibles trastornos orgnicos en los estudios de toxicidad y su disminucin podra considerarse como efecto
(64,76)
txico, estos resultados no
demostraron que el extracto del residuo de la extraccin de Plukenetia volubilis L. no afect el peso corporal de los animales . El ensayo confirma el estudio de Gorriti et., de que al no ocurrir
muertes ni signos de toxicidad aparente y de acuerdo a la clasificacin de la OECD se considera que los residuos de Plukenetia volubilis L., sacha inchi no son txicos y se encuentra como No Clasificada.
De acuerdo a los resultados obtenidos se confirma que los residuos industriales de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L., sacha inchi posee un alto valor nutritivo y no txico para ser utilizado en muchas formulaciones de mezclas nutritivas en la industria alimentaria.
- 103 -
VI.
CONCLUSIONES
1. En el estudio farmacognstico del residuo industrial de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L., se observ presencia de azcares reductores; triterpenos; glicosidos y saponinas de ncleo triterpenico, de acuerdo a las reacciones de coloracin especificas y manchas caractersticas observadas en la CCF. El estudio cuantitativo present 1.3 x 10-5 g% de taninos y 0.42g% de saponinas totales.
2. Los anlisis bromatolgicos confirmaron en el anlisis proximal que los residuos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L; en g% fueron: humedad, 5.09; protenas totales, 34.26; extracto etreo, 37.33; fibra cruda, 3.16, cenizas, 3.24 y carbohidratos 20.84 ; asimismo la determinacin en g%:pared celular, 25.66; contenido celular, 74.34; fibra detergente neutra 16.33 y en el contenido de vitaminas de residuos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L., se hallo tiamina tiamina en 0.31 mg % y los % de minerales fueron para calcio, 317.83mg%; fsforo, 560 mg % y de hierro, 4.79 mg %.
3. Respecto a las protenas por mtodos enzimticos fue de 86.89% para el mtodo enzimtico nitrgeno soluble en pepsina y 90.71% para el mtodo enzimtico de celulasa; asimismo los valores de aminocidos esenciales obtenidos en mg/g fueron: histidina, 9; isoleucina, 180; Leucina, 69; lisina, 39; metionina, 13; fenilalanina+tirosina, 31; treonina, 68 y valina 31.
4. En las condiciones del ensayo no se produjo mortalidad ni se manifestaron signos indicativos de toxicidad en los animales. La toxicidad de los residuos se encuentra por encima de 2000mg/kg de masa corporal, calificndose segn el Sistema Global Armonizado, como No clasificadas (no txicas).
- 104 -
VII. RECOMENDACIONES
1.
Aprovechar la fibra diettica del residuo de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L. en la industria alimentaria como nutrimento debido a su efecto protector frente a diversas patologas.
2.
Aplicar los residuos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L. (sacha inchi) a procesos tecnolgicos para la industria alimentaria (consumo humano y animal), cosmtica , industria farmacutica e ingeniera ambiental.
3.
Realizar estudios a la cscara de la semilla de Plukenetia volubilis L. sacha inchi para la determinacin de fibra soluble e insoluble y ser aprovechados como fibra alimentara.
4.
Realizar investigaciones complementarias de posibles antinutrientes existentes en los residuos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L (sacha inchi) que influyen en la digestibilidad y calidad de las protenas.
5.
Realizar estudios de la caracterizacin bioqumica de las protenas de residuos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L. (sacha inchi); por ser la macromolcula biolgica ms abundante y de mayor demanda internacional
- 105 -
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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- 111 -
IX.
ANEXOS
ANEXO N1. Certificacin botnica de Plukenetia volubilis L. (sacha inchi)
- 112 -
ANEXO N2. Informe de ensayo de la determinacin de fsforo,clcio y hierro de los residuos

industriales de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L.sacha inchi
- 113 -
ANEXO N3. Certificado de ensayo de la determinacin de las vitaminas tiamina, riboflavina,

niacina de los resduos industriales de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilisL.sacha inchi.
ANEXO 4. Semilla y residuos de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L. sacha inchi
- 114 -
Fotografa N7. Semillas de Plukenetia volubilis L. sacha inchi.
Fotografa N8. Homogenizado deshidratado de las muestras de los residuos industriales de la extraccin de aceite de Plukenetia volubilis L. sacha inchi.
- 115 -
ANEXO 5. Ambientes del laboratorio de Farmacognosia y Qumica Orgnica
Fotografa N9. Filtracin del extracto acuoso al 20% para la determinacin de taninos.
Fotografa N10. Etapa B en la determinacin de

taninos, para luego ser ledos a 700nm.
Fotografa N 11. Extraccin metanol-agua por

reflujo del residuo desengrasado con n-hexano para la determinacin y cuantificacin de saponinas totales.
Fotografa N 12.Concentracin de la fraccin butanlica en rotavapor para la determinacin y cuantificacin de saponinas totales.
- 116 -
ANEXO 6. Procedimiento en la cuantificacin de saponinas totales y de anlisis proximal en

los residuos de la extraccin del aceite de Plukenetia volubilis L.
E1
E2 E3
E4 E5
E6
Fotografa N 13. Preparacin del patrn se saponinas para la realizacin de la curva de calibracin de saponinas totales.
Fotografa N 14. Sembrado del extracto

alcohlico de Saponaria quillaja y de sacha inchi para la CCF
Fotografa N 15. Determinacin de humedad de la muestra de Plukenetia volubilis L. por el mtodo gravimtrico.
Fotografa N 16. Aparato extractor tipo Goldfisch

de 6 unidades para la determinacin de extracto etreo de la muestra de Plukenetia volubilis L.
Fotografa N 17. Determinacin de fibra

insoluble de la muestra de Plukenetia volubilis L. por el mtodo de detergente neutro.
Fotografa N 18. Filtracin al vaco de la

hidrlisis acida de la muestra de Plukenetia volubilis L. en la determinacin de fibra cruda, por el mtodo de hidrlisis acida y bsica.
- 117 -
ANEXO 7. Ambiente del Laboratorio de Bioqumica y Nutricin Animal de la Facultad de

Medicina Veterinaria de la UNMSM.
(21)
Fotografa N 19. Digestin del hidrolizado acido y

bsico de la muestra de Plukenetia volubilis L., para la determinacin de fibra cruda
Fotografa N20. Reaccin del catalizador y la muestra de Plukenetia volubilis L. en el tubo para digestin para la determinacin de protena por el mtodo Kjeldahl.
Fotografa N 21. Digestin de la materia orgnica

de la muestra de Plukenetia volubilis L. en los tubos para digestin para la determinacin de protena por el mtodo Kjeldahl.
Fotografa N22. Destilacin de la muestra

digerida de Plukenetia volubilis L.con hidroxido de sodio en el equipo Macrojeldahl SISTEMA TECATOR.
Fotografa N23. El destilado bajo la forma de borato de amonio con tres gotas del indicador de tashiro por triplicado.
Fotografa N24. Punto final de la titulacin

(violeta), con acido sulfrico para la determinacin de protena por el mtodo de Kjeldhal.
- 118 Bach. Iris Giovana Mondragn Tarrillo
Fotografa N25. Peso de las muestras en tubos para digestin para la determinacin de digestibilidad in vitro por el mtodo enzimtico por pepsina.
Fotografa N26. Muestras por triplicado para la determinacin de digestibilidad in Vitro por el mtodo enzimtico por pepsina y celulasa.
Fotografa N27. Incubacin en bao mara a 39C

de las muestras con la solucin enzimtica durante 24 horas, 48horas, 72 horas para la determinacin de digestibilidad in Vitro por el mtodo enzimtico por celulasa
Fotografa N 28. Adicin de HCl 6N para

detener la digestin de la solucin enzimtica por celulasa, a la cual se le agregara 6mL de pepsina buffer y se incubara a 39C por 24 horas ms.
M1
M2 E4
E3
E2
E1
Fotografa N 29. Preparacin del material, muestra

y reactivos para la determinacin de fsforo por el mtodo espectrofotomtrico con molibdovanadato
Fotografa N30. Preparacin del estndar de

fsforo(KH2PO4)con solucin molibdovanadato para la realizacin de la curva de calibracin(E) y determinacin de fsforo en muestra (M).
- 119 -
ANEXO 8. Ambiente del Laboratorio Centro de Investigacin de Bioqumica y nutricin

(CIBN) de la facultad de Medicina Humana de la UNMSM.
Fotografa N31.Extraccin de muestra deshidratada y desengrasada de sacha inchi con TRIS HCL 50mM pH 6.5 para el fraccionamiento y purificacin de protenas por cromatografa en columna.
Fotografa N32. Dializacin de la fraccin de

protena soluble (pico I) para la eliminacin de la sal.
Fotografa N 33. Muestra liofilizada de protena

soluble
Fotografa N34. Trasvasado de una cantidad de muestra liofilizada en tubos eppendorff para el procedimiento de hidrlisis.
Fotografa N 35. Hidrlisis de la protena con

HCL 6N en vacio con el equipo Reacti-Therm marca PIERCE a una temperatura de 150C por 2 horas.
Fotografa N36.Secado al vaco del hidrolizado y derivatizado de la muestra de Plukenetia volubilis L. y estndar.
- 120 -
Fotografa N 37. Hidrolizado de la muestra de

Plukenetia volubilis L. al 20 y 30%.
Fotografa N38. Estndar y muestra de Plukenetia

volubilis L. al 20 y 30% desecada y derivatizada con buffer de acetonitrilo, piridina, agua y trietilamina con fenilisotiocianato
Fotografa N 39. Filtracin al vaco de los solventes y buffer de acetato de amonio previo a la determinacin de aminocidos por HPLC.
Fotografa N40. Determinacin de aminocidos de la muestra Plukenetia volubilis L. y estndar por HPLC Elite la Chrom.
Fotografa N41. Anlisis de toxicidad aguda a dosis nica realizado en el bioterio de Farmacia y Bioqumica. Conformacin de dos grupos tratados y dos controles de ambos sexos por grupo.
Fotografa N 42. Administracin del extracto

acuosos de Plukenetia volubilis L por va oral mediante cnula intragstrica a dosis nica de 2000 mg/Kg de masa corporal
- 121 -

Estudio Farmacognóstico Sacha Inchi

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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA E. A. P. FARMACIA Y BIOQUMICA

TESIS para optar al ttulo profesional de Qumico Farmacutica

AUTOR Iris Giovana Mondragn Tarrillo

ASESORA Arilm Gorriti Gutirrez

A mis padres: Elas Mondragn Silva y Sara Tarrillo Linarez

A mis hermanos: Oscar Elas, Edgar Ronal e Ybett Roco.

A mi Madrina: Orfelina Cotrina Meja.

A Miguel ngel Inocente.

A mi Directora de Tesis: Dra. Arilm Gorriti Gutirrez, por creer

A mi Co- Asesora, Mg. Teresa Arbaiza Fernndez, por su

CENTRO DE INVESTIGACIN DE BIOQUMICA Y NUTRICIN DE LA UNMSM (CIBN)

A la Mg. Ines Arnao Salas, mi eterno agradecimiento y gratitud

cuantitativa de aminocidos y sobre todo por su gran amistad.

Y a todos los dems no mencionados. Dios los bendiga

Dra. Eloisa Maximina Hernandez Fernandez

2.2. Estudio Farmacognstico 2.2.1. Datos etnobotnicos y etnofarmacolgicos

Fibra diettica Inters de la fibra diettica

Potencial industrial Mercado del sacha inchi

2.5.1.1. Comercio internacional 2.5.1.2. Comercio nacional 2.5.2. Residuos

UNMSM-Facultad de Farmacia y Bioqumica

Bach. Iris Giovana Mondragn Tarrillo

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98 104 105 106 112

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Figura 28.Composicin de la solucin estndar de aminocidos stock NAA-S-18 (Sigma Aldrich) a

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Vo AA-STD-18 pp ANOVA R R2 ppm

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El presente trabajo de investigacin tiene como objetivo general:

Sus objetivos especficos son:

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determinaron que la ingesta de 50g de Plukenetia volubilis L. (sacha inchi)

encontraron cidos grasos del aceite crudo de sacha inchi, destacando el

encontraron cidos esenciales poliinsaturados (82,21 %), monoinsaturados

realizaron el estudio clnico Fase I de un alimento funcional a base de aceite

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Bach. Iris Giovana Mondragn Tarrillo

El Instituto de Ciencias de los Alimento de la Universidad de CORNELL,

Tabla 1. Composicin de la torta desengrasada de Plukenetia volubilis L.

Fuente: Extraccin y caracterizacin de Plukenetia volubilis L. Pascual G. 1992

UNMSM-Facultad de Farmacia y Bioqumica

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2.1. ESTUDIO FARMACOGNSTICO