LABORATORIO N2: PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO, UBICUIDAD Y TCNICAS DE SIEMBRA MICROBIOLGICA.

DIEGO FERNANDO LPEZ CHRISTIAN JAVIER RUANO JESUS MAURICIO CHAVES

UNIVERSIDAD DE NARIO IV SEMESTRE PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA 2012 LABORATORIO N2: PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO, UBICUIDAD Y TCNICAS DE SIEMBRA MICROBIOLGICA.

PRESENTADO POR: DIEGO FERNANDO LPEZ CHRISTIAN JAVIER RUANO JESUS MAURICIO CHAVES TRABAJO DEL REA DE MICROBIOLOGIA PRESENTADO A LA PROFESORA: KATIA BENAVIDES ROMO.

UNIVERSIDAD DE NARIO IV SEMESTRE PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA 2012 INTRODUCCIN

El siguiente trabajo es una descripcin de las pruebas y resultados realizados en la practica de laboratorio realizada el da 23 de agosto, en el cual se pretenda abordar como se realiza un medio de cultivo, y adems, el uso de diferentes tcnicas de siembra microbiolgica, dependientes del medio a utilizar y de las caractersticas de la bacteria. METODOLOGA MATERIALES Erlenmeyer Papel aluminio Baja lenguas Varilla de vidrio Bandas plsticas Agua destilada Cinta indicadora de pH Muestra de leche Caja de petri con cepas bacterianas Medios de cultivo microbiolgicos (para preparar) Medios de cultivo slidos Medios de cultivo lquidos (caldos de enriquecimiento) Medios inclinados Medio de cultivo agar sabouraud para hongos Asa bacteriolgica: recta, circular. Cinta de enmascarar. EQUIPOS Estufa Autoclave Mechero de bunsen Incubadora

PROCEDIMIENTO

A. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

1. Revise la etiqueta del medio de cultivo que le correspondi, anote el

nombre de este, la composicin y la forma de preparacin. R// NOMBRE: Agar de Hierro y Lisina (LIA) Introduccin: El Agar de Hierro y Lisina es un medio utilizado para la diferenciacin de microorganismos entricos en base a su capacidad para desaminar o descarboxilar la lisina y de producir sulfuro de hidrgeno. Este medio tambin es conocido como LIA. Edwards y Fife desarrollaron este medio para diferenciar la Salmonella arizonae. Debido a que la S. arizonae fermenta la lactosa rpidamente, la produccin de HS es suprimida en el Agar de Hierro y Triple Azcar. Eliminando la lactosa e incorporando la lisina, Edwards y Fife encontraron que este medio diferencia a los bacilos entricos en base a su capacidad para descarboxilar o desaminar la lisina y producir HS. Este medio es especialmente recomendado para la identificacin de bacilos que fermentan rpidamente la lactosa. FORMULA: Peptona de Gelatina 5.0 L-Lisina 10.0 Extracto de Levadura 3.0 Tiosulfato de Sodio 0.04 Dextrosa 1.0 Citrato de Hierro y Amonio 0.5 Prpura de Bromocresol 0.02 Agar Bacteriolgico 1305 pH 6.7 0.2 FORMA DE PREPARACIN: Rehidratar 34 g del medio en un litro de agua destilada. Calentar y dejar hervir 1 minuto tras su completa disolucin. Generalmente se distribuye en tubos posicionados horizontalmente para lograr pico de flauta con fondo inclinado. UTILIDAD: Hongos y bacterias (bacilos) fermentadoras de lactosa.

NOMBRE: AGAR SABORAUD

Introduccin: El Agar Dextrosa Sabouraud es un medio utilizado para el cultivo de hongos y levaduras. El Agar de Dextrosa Sabouraud es una modificacin a la frmula original del Agar de Dextrosa desarrollado por Raymand Sabouraud. Este medio es utilizado para el cultivo de hongos patgenos, particularmente de aquellos asociados con infecciones de piel. La alta concentracin de dextrosa y la acidez del pH hacen a ste un medio selectivo para hongos. Con la adicin de cicloheximida, estreptomicina y penicilina, se obtiene un excelente medio para el aislamiento primario de dermatofitos. Este medio es tambin utilizado para la determinacin microbiolgica en cosmticos y para evaluar la presencia de hongos en alimentos. En este medio las peptonas proveen la fuente de carbono y nitrgeno para el crecimiento de los microorganismos, la dextrosa acta como fuente de energa y el agar es agregado como agente solidificante. FORMULA: Dextrosa 40.0 Peptona de Casena 5.0 Digerido Pancretico de Tejido Animal o Peptona de carne 5.0 Agar Bacteriolgico 15.0 pH 5.6 0.2 FORMA DE PREPARACIN: 65 gramos en 1 litro de agua, calentar y dejar hervir 1 minuto tras su completa disolucin. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Generalmente se vierte en cajas de petri estriles. UTILIDAD: En las muestras positivas se observa el crecimiento de hongos y levaduras. 2. Realice los clculos para preparar 100 ml del medio de cultivo, aplicando clculo por regla de tres. R// Para Agar de Hierro y Lisina (LIA) 34 g ------------------- 1000 ml X g ------------------- 100 ml X= 100 ml X 34 g = 3.4 g 1000 ml

Para Agar Sabouraud 65 g ------------------- 1000 ml X g ------------------- 100 ml X= 100 ml X 65 g = 6.5 g 1000 ml 3. Pese la cantidad de medio calculada.

4. En un Erlenmeyer adicione el medio de cultivo deshidratado y agua

destilada en la cantidad correspondiente, recuerde que el volumen del Erlenmeyer siempre debe ser mayor a la cantidad de medio que se va a preparar.

5. Mezcle con el agitador.

6. Lleve la preparacin a disolver en estufa, agitando constantemente con la

varilla de vidrio hasta que ebulla para lograr la disolucin total del agar. Mida con la cinta indicadora del pH del medio, el cual debe oscilar entre 7 7.5.

7. Tape el Erlenmeyer con papel aluminio y asegrelo con la banda plstica. 8. Lleve a esterilizacin en autoclave, a 121 C por 15 minutos.

9. Esterilizando el medio, deje enfriar.

10. Proceda a servir el medio en presencia del mechero y en las cajas de

petri, previamente esterilizadas, deje enfriar hasta que se solidifique. Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan abanicando brevemente la superficie con la flama del mechero.

B. TCNICAS DE SIEMBRA DE MICROORGANISMOS 1. realice la siembra de Medio slido a medio lquido (utilice la caja de petri con cepas bacterianas): Siembre por dispersin.

2. Siembre de medio lquido a slido (use la muestra lquida que tom y

simbrela en medio slido), aplicando la tcnica de agotamiento y estras.

3. Realice la siembra en pico de flauta (puede usar muestra lquida o la caja de bacterias entregadas)

4. Realice la siembra en agar Sabouraud por puncin

PREGUNTAS: 1. Realice el dibujo de un autoclave y sus partes

R//

2. Qu es un medio de cultivo? R// Se denomina medio de cultivo a un gel, o solucin que posee nutrientes necesarios para permitir el crecimiento de virus, microorganismos, clulas, tejidos vegetales y hasta pequeas plantas (bajo condiciones favorables de pH y temperatura). Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados, al prepararse podemos encontrarlos en estado slido, semislido y lquido. El objetivo ltimo del cultivo es variado: antibiograma, identificacin, multiplicacin.

3. Consulte de acuerdo al medio de cultivo que le correspondi, la composicin de ste, la forma de prepararlo y para qu tipo de bacterias se utiliza.

R// NOMBRE: Agar de Hierro y Lisina (LIA) Introduccin: El Agar de Hierro y Lisina es un medio utilizado para la diferenciacin de microorganismos entricos en base a su capacidad para desaminar o descarboxilar la lisina y de producir sulfuro de hidrgeno. Este medio tambin es conocido como LIA. Edwards y Fife desarrollaron este medio para diferenciar la Salmonella arizonae. Debido a que la S. arizonae fermenta la lactosa rpidamente, la produccin de HS es suprimida en el Agar de Hierro y Triple Azcar. Eliminando la lactosa e incorporando la lisina, Edwards y Fife encontraron que este medio diferencia a los bacilos entricos en base a su capacidad para descarboxilar o desaminar la lisina y producir HS. Este medio es especialmente recomendado para la identificacin de bacilos que fermentan rpidamente la lactosa. FORMULA: Peptona de Gelatina 5.0 L-Lisina 10.0 Extracto de Levadura 3.0 Tiosulfato de Sodio 0.04 Dextrosa 1.0 Citrato de Hierro y Amonio 0.5 Prpura de Bromocresol 0.02 Agar Bacteriolgico 1305 pH 6.7 0.2 FORMA DE PREPARACIN: Rehidratar 34 g del medio en un litro de agua destilada. Calentar y dejar hervir 1 minuto tras su completa disolucin. Generalmente se distribuye en tubos posicionados horizontalmente para lograr pico de flauta con fondo inclinado. UTILIDAD: Hongos y bacterias (bacilos) fermentadoras de lactosa. NOMBRE: AGAR SABORAUD Introduccin: El Agar Dextrosa Sabouraud es un medio utilizado para el cultivo de hongos y levaduras. El Agar de Dextrosa Sabouraud es una modificacin a la frmula original del Agar de Dextrosa desarrollado por Raymand Sabouraud. Este medio es utilizado para el cultivo de hongos patgenos, particularmente de aquellos asociados con infecciones de piel. La alta concentracin de dextrosa y la acidez del pH hacen a ste un medio selectivo para hongos. Con la adicin de cicloheximida, estreptomicina y penicilina, se obtiene un excelente medio para el aislamiento primario de dermatofitos. Este medio es tambin utilizado para la determinacin microbiolgica en cosmticos y para evaluar la presencia de hongos en alimentos. En este medio las peptonas proveen la fuente de carbono y nitrgeno para el crecimiento de los

microorganismos, la dextrosa acta como fuente de energa y el agar es agregado como agente solidificante. FORMULA: Dextrosa 40.0 Peptona de Casena 5.0 Digerido Pancretico de Tejido Animal o Peptona de carne 5.0 Agar Bacteriolgico 15.0 pH 5.6 0.2 FORMA DE PREPARACIN: 65 gramos en 1 litro de agua, calentar y dejar hervir 1 minuto tras su completa disolucin. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Generalmente se vierte en cajas de petri estriles. UTILIDAD: En las muestras positivas se observa el crecimiento de hongos y levaduras. 4. Complete la siguiente tabla: Medio de Cultivo SIMPLE Componentes Especiales Componentes mnimos de desarrollo de microorganismos. Utilidad Ejemplos (2) Microbiolgica Crecimiento de Agar Tripcase de bacterias que no Soja necesiten Agar requerimientos Columbia. especiales. Agar nutritivo Agar comn. Crecimiento de Gonococo. microorganismos Medio para exigentes la Haloflica (mediante adicin (halococcus). de factores indispensables como sangre, suero, leche, bilis, etc). Poner en Mac evidencia Conkey. caractersticas Agar bioqumicas, que Sangre. ayuden en la diferenciacin de gneros o especies. Densidad de Agar poblacin C.E.L.D. (cistina, microbiana en el

ENRIQUECIDO

factores indispensables como sangre, suero, leche, bilis, etc

DIFERENCIAL

uso comn de azcar fermentable, o sustrato metabolizable

PARA RECUENTO

A partir de triptosa, lactosa, cloruro de sodio,

sales biliares, medio goma guara y un exceso de rojo de fenol.

lactosa electrolito deficiente). Medio de deteccin de bacterias Coliformes

5. Con respecto a los medios de cultivo, Cual es la diferencia entre un caldo de cultivo y un medio slido? R// El modo en que las bacterias son cultivadas, y el propsito de los medios de cultivo, varan ampliamente. Los medios lquidos son utilizados para el crecimiento de lotes de cultivos puros mientras que los medios slidos son ampliamente utilizados para el aislamiento de cultivos puros, para la estimacin de poblaciones de bacterias viables, y una variedad de otros propsitos. El agar, agente glido ms utilizado para medios slidos o semislidos, es un hidrocoloide derivado de las algas rojas. El agar es utilizado por sus propiedades fsicas nicas (se funde a 100 grados y permanece lquido hasta enfriarse a 40 grados, la temperatura a la que se vuelve gel) y porque no puede ser metabolizado por la mayora de las bacterias. Por lo tanto, como un componente del medio es relativamente inerte, simplemente mantiene (geliza) los nutrientes que se encuentran en la solucin acuosa.

6. A qu se denomina siembra en pico de flauta?

R// Pico de flauta es una tcnica de vaciado de medios de cultivo (agar) en el laboratorio de microbiologa. Se emplea para realizar pruebas bioqumicas a partir de material biolgico (muestras), como por ejemplo las entero-bacterias, material biolgico (heces fecales, orina etc.), generalmente se utilizan tubos de ensayo con tapa (esterilizados), se vaca el medio de cultivo (estril), debe coagular de manera inclinada, por eso se llama "pico de flauta".

7. Cmo se realiza el control de calidad de los medios de cultivo

microbiolgicos? R// CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 1. Los medios de cultivo deshidratados son higroscpicos y la absorcin de agua del exterior, as como la formacin de agua dentro de la botella como consecuencia de las fluctuaciones de temperatura en el ambiente, favorecen el crecimiento bacteriano. Esto puede conducir al consumo de nutrientes, variaciones de Ph y cambios en el color del medio. Adems la exposicin a la luz puede llevar a importantes alteraciones en los constituyentes del medio de cultivo. Se debe mantener un registro de cada frasco de medio de cultivo deshidratado, con el nombre del producto, nombre y nmero telefnico de la casa proveedora, nmero de control del frasco, fecha de recibo, fecha de expiracin, nmero de lote y fecha en que se abri el frasco.

2. Tomando en cuenta los factores antes sealados, los medios de cultivo deshidratados deben almacenarse siempre en lugares frescos, a temperatura ambiente y protegidos contra la humedad y la luz. La mayora de los suplementos se guardan en refrigeracin. Utilizando condiciones de almacenamiento adecuadas, los medios elaborados en polvo tienen una vida til de al menos 3 aos. El material que ha sufrido cambios substanciales, tales como hidratacin, endurecimiento y cambio de color, deben descartarse. 3. El grado de disolucin de un medio deshidratado, as como la eficacia del mismo ya preparado, depende en gran medida del procedimiento empleado en la rehidratacin. Se recomienda utilizar agua recin destilada o completamente desmineralizada y un erlenmeyer con capacidad del doble del medio que se quiere preparar. Si el medio va a distribuirse en tubos, debe agitarse constantemente para asegurar una adecuada homogenizacin al momento de servirlos. 4. Cuando se va a esterilizar, debe asegurarse en seguir las instrucciones de tiempo, presin y temperatura para la obtencin de medios de cultivo ptimos. Una temperatura de 121 C, presin de 15 libras y un tiempo de esterilizacin de 15 minutos, son suficientes para la mayora de los medios. Si no se dispone de autoclave, es posible esterilizar en marmita de vapor a 100 C por 30 minutos. En tal caso la esterilizacin debe repetirse durante 3 das consecutivos. 5. El medio esterilizado debe ser enfriado a 45-60C en un bao mara, para evitar la formacin de agua de condensacin. Al ser vertidos en las placas Petri, evitar la formacin de burbujas y cogulos. Durante el proceso de servida, debe tomarse una muestra del medio para realizar el control de calidad por esterilidad y eficiencia. 6. El medio de cultivo reconstituido tiene una vida til limitada. Si no se emplea de inmediato, debe almacenarse bajo condiciones apropiadas para garantizar su utilidad durante un periodo de tiempo. El almacenamiento a 4C es el mejor para la mayora de los medios. Sin embargo, aquellos que contienen Tioglicolato, deben guardarse a temperatura ambiente. 7. Los medios deben mantenerse preferiblemente en sitios oscuros, ya que la luz puede afectar algunos de sus componentes. Para evitar la desecacin se aconseja que se guarden en bolsas plsticas bien cerradas. Los platos Petri almacenados as, deben mantenerse con el fondo hacia arriba. 8. Dado que los medios almacenados en refrigeracin, cuando pasan a temperatura ambiente tienden a formar agua de condensacin en la superficie, se recomienda poner los platos Petri en la incubadora a 35C por 2 horas, colocndolos con el fondo hacia arriba para obtener una superficie seca. Esto es particularmente importante para que el agua no afecte la individualidad de las colonias. 9. Cada lote preparado de medio de cultivo se prueba antes de su uso rutinario. 10.Evite el congelamiento de los medios preparados. 11. Al colocar en la refrigeradora los medios preparados, debe colocar los de ms reciente preparacin al fondo y los ms viejos adelante.

12.Rotular todos los medios preparados, tanto en platos Petri como en tubos, indicando adems, la fecha de preparacin y expiracin. BILBLIOGRAFA CONSULTADA http://www.mcd.com.mx/pdfs/agar_dextrosa_saboraud.pdf http://www.mcd.com.mx/pdfs/agar_hierro_lisina.pdf http://mx.answers.yahoo.com/question/index? qid=20091005170506AAUQ73h http://www.monografias.com/trabajos/mmbiologia/mmbiologia.shtml http://es.wikipedia.org/wiki/Medio_de_cultivo http://perso.wanadoo.es/sergioram1/medios_de_cultivo.htm

Gracias