VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O.

PRCTICA 1: NEFELOMETRA

INTRODUCCIN

Se trata de un mtodo turbidimtrico, este tipo de mtodos son muy usados en la prctica cotidiana del laboratorio. La base comn de estos mtodos consiste en la medicin de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano. Recordemos aqu que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partcula pequea suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersin de la luz es, dentro de ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo. La nefelometra en s es un procedimiento analtico que se basa en la dispersin de la radiacin que atraviesan las partculas de materia. Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensin de partculas slidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. La dispersin no supone la prdida neta de potencia radiante, solo es afectada la direccin de la propagacin, porque la intensidad de la radiacin es la misma en cualquier ngulo. La intensidad depende de: el nmero de partculas suspendidas, su tamao, su forma, los ndices refractivos de la partcula y del medio dispersante, y la longitud de onda de la radiacin dispersada. El procedimiento generalmente es emprico y slo se consideran 3 factores: 1. La concentracin: entre mayor sea el nmero de partculas, mayor es la dispersin. 2. Tamao de la partcula: es afectada por factores como el pH, la velocidad y orden de la mezcla, concentracin de los reactivos, duracin del estado de reposo y la fuerza inica. 3. Longitud de onda: Generalmente las muestras se iluminan con luz blanca, pero si estn coloreadas, se debe escoger una porcin del espectro electromagntico en la que la absorcin del medio se reduzca al mnimo.

OBJETIVOS Conocimiento de mtodos turbidimtricos as como la preparacin del nefelmetro de McFarland.

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ESCALA MCFARLAND

En el caso de la microbiologa, se utiliza el nefelmetro de McFarland como punto de referencia para estimar la poblacin de M.O. presentes en una muestra. La escala se basa en la capacidad de precipitacin del cloruro de bario en presencia de cido sulfrico, y se trata de una serie de tubos que contienen en su interior cantidades distintas de cloruro de bario y cido sulfrico, y que se ordenan de menor a mayor concentracin, por lo que al final de cuentas se obtiene una escala de referencia relativa a la turbidez. La utilidad de la escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a un patrn, es decir, una vez preparado el nefelmetro, se toma una muestra de nuestra bacteria y la inoculamos en un tubo con solucin salina, en el momento en que nuestra suspensin sea visualmente igual a nuestro tubo de referencia, tendremos la concentracin buscada. La finalidad de las comparaciones entre las suspensiones microbianas y el nefelmetro, es establecer una relacin entre una precipitacin qumica y la suspensin propiamente dicha. Las comparaciones son aproximadas, ya que depende de factores como el tamao de la bacteria, la formacin de agregados, etc.

MATERIALES Y REACTIVOS

H2SO4 al 1% 250 ml. BaCl2 al 1% 250 ml. 10 tubos de ensaye con tapones de rosca.

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CONCLUSIN Esta prctica es de suma importancia para nosotros, pues el nefelmetro preparado lo utilizaremos de aqu en lo sucesivo, como referencia para la preparacin de suspensiones microbianas en prcticas posteriores, por lo que fue de vital importancia poner mucha atencin en la preparacin de los tubos.

VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O. ANEXOS 1. Cules son los mtodos directos ms utilizados en el recuento de microorganismos?

Camara de recuento Petroff- Hauser. Consiste en un portaobjetos especial con

una graduacin y medidas concretas. Se cuenta al microscopio el nmero de clulas en las celdillas del portaobjetos. Contadores electrnicos de partculas. Se pasa una suspensin microbiana por un tubo capilar, entre dos polos de una corriente elctrica. Cada vez que pasa por un orificio una partcula, se interrumpe la corriente, lo que es recogido en un sistema de registro electrnico, que detecta nmero y tamao.

2. Qu es lo que representa UFC y cul es su importancia? UFC: unidad formadora de oclonias, se entiende como una clula capaz de dar origen a una colonia en un lapso de tiempo en condiciones favorables. Su importancia es al hacer recuento de M.O. en placa, los resultados se dan en UFC y no como nmero de M.O. Es sin embargo una medida estimada, pues no es posible asegurar que cada colonia procede de una clula individual, es por eso que se deben desagregar las agrupaciones de clulas antes del recuento. 3. A qu se refiere la tcnica del nmero ms probable? Se utiliza para estimar densidades de poblaciones de M.O. se basa en determinar la presencia o ausencia de algn atributo particular de los M.O. en diluciones consecutivas. El estimado de densidad se obtiene segn el patrn de ocurrencia utilizando una tabla probabilstica. 4. Citar ejemplos de mtodos para recuento microscpico. Cmaras de recuento de Newbaver. Contador electrnico de partculas. Cmara de recuento Petroff-Hausser.

BIBLIOGRAFA

Atlas, R. M. Microbiologa, fundamentos y aplicaciones. Editorial CECSA Ingrham J. L. y G. A. Ingrham. Introduccin a la microbiologa I y II. Editorial
Reverte S. A.

Prescott- Harley- Klein. Microbiologa. Editorial Mc. Graw Hill. Madigan M. T. J. M Martinko y J. Parker. Biologa de los microorganismos. 8
edicin Prentice Hall Iberia Espaa. Pelczar y Col. Microbiologa general. Editorial Mc. Graw Hill.

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PRCTICA 2: INFLUENCIA DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO Y MUERTE DE LOS MICROORGANISMOS (AGENTES FSICOS)

INTRODUCCIN
Debido a su pequeo tamao y a su estilo de vida individual, los microorganismos sufren los cambios ambientales de un modo mucho ms directo e inmediato que los organismos eucariontas. A lo largo de miles de millones de aos, las bacterias han venido estando sometidas a diversas presiones ambientales, y han respondido evolutivamente creando numerosos mecanismos de adaptacin. Actualmente, las nicas formas de vida existentes en determinados ambientes extremos son exclusivamente procariticas. Es importante para las personas que trabajan con microorganismos, al cual est indisolublemente ligado el trabajo experimental en laboratorio, conocer y tener en cuenta los factores ambientales, es decir, una serie de agentes fsicos y qumicos que pueden: 1. modificar la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos; 2. condicionar la distribuicin de los microorganismos en sus ecosistemas y hbitats naturales; 3. permiteir a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijacin de parmetros para: a. la mutagnesis, b. la esterilizacin y desinfeccin, c. la quimioterapia. No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. As, unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio ser neutras o beneficiosas para otra. Los principales tipos de factores a considerar se pueden desglosar de la siguiente manera: Agentes fsicos Temperatura Desecacin Radiaciones Ondas sonoras Presin hidrosttica Presin osmtica Agentes qumicos Desinfectantes y antispticos Quimioterpicos de sntesis Antibiticos

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Efecto de la temperatura.

La temperatura es uno de los parmetros ambientales ms importantes que condicionan el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos. La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al tiempo de generacin, g). Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones ambientales se mantienten constantes) muestra una curva caracterstica de tasa de crecimiento en funcin de la temperatura, donde podemos distinguir tres puntos caractersticos llamados temperaturas cardinales: Temp. mnima: por debajo de ella no hay crecimiento; Temp. mxima: por encima de ella tampoco existe crecimiento Temp. ptima: permite la mxima tasa de crecimiento (o sea, g mnimo). Diferentes especies microbianas varan ampliamente en sus fluctuaciones de temperatura ptima para su desarrollo: Las llamadas psicrfilas crecen mejor a temperaturas bajas (15 a 20C), las formas mesfilas lo hacen mejor de 30 a 37C, la mayor parte de la termfilas entre 50C y 60C. La mayor parte de los microorganismos son mesfilos, 30C es la temperatura ptima para muchas de las formas de vida libre y la temperatura del husped es ptima para los simbiontes de los animales de sangre caliente. El lmite superior de temperatura tolerada por cualquier especie se correlaciona bien con la estabilidad trmica general de las protenas de dicha especie. Los microorganismos comparten con los vegetales y los animales la respuesta al choque por calor, una sntesis de protenas por el calor cuando son expuestos a una elevacin sbdita en la temperatura por arriba de la ptima para el crecimiento. Al parecer estas protenas son resistentes al calor y estabilizan a las protenas de la clula sensible al calor. Las bacterias tambin exhiben fenmeno denominado choque por fro, sea la muerte de las clulas por un enfriamiento rpido, en oposicin a uno lento. Por ejemplo, el enfriamiento rpido de la escherichia coli desde 37C a 5C puede matar al 90% de las clulas Al subir la temperatura por encima de la temperatura mxima de crecimiento, se dejan sentir los efectos sobre la viabilidad: la prdida de viabilidad significa que las bacterias dejan de ser capaces de crecer y dividirse. La muerte se debe a la destruccin o inactivacin irreversible de una molcula o estructura esencial (como p. ej. el ADN cromosmico o por creacin de un dao irreparable en la membrana). Cmo podemos

VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O. caracterizar o medir en la prctica la inactivacin por calor de una suspensin bacteriana? He aqu algunos parmetros utilizados:

periodo trmico mortal: es el tiempo mnimo requerido para que mueran todas las bacterias de una determinada suspensin a una determinada temperatura; tiempo de reduccin decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la densidad de la suspensin, a una determinada temperatura (tambin llamado valor D); punto trmico mortal: es la temperatura mnima que mata a todas las bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min).

2.1. DETERMINACIN DEL PUNTO TRMICO MORTAL

EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS

MATERIAL Mechero Asa Marcador Termmetro Gradilla 2 pipetas de 1.0ml 10 tubos de 16150, con 5.0ml de sol. Salina 0.85% estriles 1 tubo de 16150 2 cajas de petri con agar nutritivo Baos mara a las sig. Temperaturas: 50, 60, 70, 80, y ebullicin. Cultivos de 24 hrs. De escherichia coli y stapylococcus aureus.

VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O. DESARROLLO DE LA PRCTICA 1. Identificar cada bao mara con su temperatura 2. En una gradilla, colocar los tubos con soluciones salinas, etiquetar cada tubo, anotando lo temperatura y el nombre del microorganismo 3. Dividir la parte extrema de las dos cajas de petri en seis partes iguales con un marcador. Marcar los segmentos con: T (testigo), 50, 60, 70,80, y ebullicin.

4. Inocular 5 tubos con E. Coli y 5 con Staphylococcus, para ello, con una pipeta estril y en condiciones de asepsia, transferir 0.1 ml del cultivo a cada uno de los tubos que tienen SOLUCION SALINA AL 0.85% y homogenizar. Repetir el procedimiento con el segundo cultivo. 5. Tomar una asada de E. Coli y en una de las cajas de siembra por estra recta en el segmento marcado con una T, empezando por el borde extremo. Repetir el procedimiento en la segunda caja con B Staphylococcus. 6. Colocar en bao mara un tubo de cada cultivo, introducir un tercer tubo que contenga agua de la llave y colocar en este el termmetro.

7. Dejar calentar y esperar a que el agua del tubo alcance la temperatura de 50C, mantener esta temperatura durante 10 minutos 8. Sacar los tubos y sombrar cada microorganismo en la caja y segmento correspondiente. 9. Repetir los incisos 6 y 7 con los otros tubos, a 60, 70, 80 y ebullicin y sembrar los segmentos correspondientes. 10. Incubar las cajas en posicin invertida a 37C durante 48 horas. 11. Efectuar las observaciones y registrar las observaciones en una tabla.

VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O. CALCULOS Y REPORTE DE RESULTADOS 1. Observar sus cajas e indicar a partir de que temperatura no se registro desarrollo. 2. Indicar cul es la temperatura que corresponde al punto trmico mortal

E. Coli:

S. Aureus:

3. Comparar sus resultados obtenidos con los de sus compaeros e indicar si el punto trmico mortal es igual para los microorganismos estudiados. Los resultados con las bacterias utilizadas fueron los siguientes:

E. Coli

S. Aureus

CONCLUSIONES En esta prctica determinamos la temperatura mnima que puede matar a todas nuestras bacterias, pero no slo eso, al trabajar con diferentes temperaturas, en los resultados pudimos observar de cierta forma la cintica del crecimiento microbiano, pues se observa primeramente un crecimiento gradual hasta la que tentativamente es la temperatura ptima (que fue aquella dnde se obtuvo mayor crecimiento), y cmo despus de ese punto, el crecimiento decrece o ya no se obseva. Fue importante pues esto nos permite tener una idea de bajo qu condiciones de temperatura podemos manipular esas bacterias, trabajar con ellas, o al contrario, que temperatura debemos utilizar para estar seguros que estamos libres de ellas.

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ANEXOS. 1. Cmo se dividen los M.O. de acuerdo a la temperatura a la que se desarrolla? TIPO PSIC.OBLIGADA PSIC.FACULTATIVA MESOFILA TERMOFILA HIPERTERMOFILA MINIMA -5-5 0 15-20 45-55 60-70 OPTIMA 10-15 20-30 20-45 55-65 80-90 MAXIMA 20-22 35 45-47 80 100-113

2. Explicar a que se refieren las temperaturas cardinales?

La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al tiempo de generacin, g). Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones ambientales se mantienten constantes) muestra una curva caracterstica de tasa de crecimiento en funcin de la temperatura, donde podemos distinguir tres puntos caractersticos llamados temperaturas cardinales: Temp. mnima: por debajo de ella no hay crecimiento; Temp. mxima: por encima de ella tampoco existe crecimiento Temp. ptima: permite la mxima tasa de crecimiento (o sea, g mnimo).

3. Cul es la importancia de determinar la temperatura mxima de desarrollo?

4. Qu indica el trmino punto trmico mortal? es la temperatura mnima que mata a todas las bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min).

2.2. DETERMINACIN DEL PERIODO TRMICO MORTAL

EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS NECESARIOS Material Mechero Asa Marcador

VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O. Termmetro Gradilla 2 pipetas de 1 ml. estriles 4 tubos de 16 x 150, con 5 ml. de solucin salina 0.85% estriles 1 tubo de 16 x 150 4 cajas de Petri con agar nutritivo 2 baos Mara, uno a 60 C y otro a ebullicin Cultivos de 24 horas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus

DESARROLLO DE LA PRCTICA MTODO 1. Identificar cada bao Mara con una temperatura y poner a calentar. 2. Colocar los tubos con solucin salina estril en una gradilla y etiquetar cada tubo, anotar el tiempo de exposicin y el nombre del microorganismo. 3. Dividir la parte inferior externa de la caja de Petri en seis partes iguales, con un lpiz graso. Marcar los segmentos con C (control), T (testigo), 5, 10, 20 y 30 minutos. 4. Con una pipeta estril y en condiciones de asepsia, transferir 0.1 ml. de cultivo. Inocular dos tubos con cada microorganismo. 5. De uno de los tubos con E. coli, tomar una asada y sembrar por estra recta en la caja correspondiente y el segmento marcado con la T, empezando por el borde externo. El segmento marcado con una C servir como control de esterilidad del medio. 6. En la segunda caja repetir con Staphylococus. 7. Introducir en el bao de agua a 60 C los dos tubos con cultivos de E. coli y Staphylococus y con un tubo con agua de la llave, colocando en ste un termmetro, esperar a que en el interior del tubo se alcance la temperatura indicada y mantener los tubos sumergidos durante 5 minutos. 8. Al trmino de este tiempo tomar una muestra de cada cultivo y en la caja y segmento correspondiente sembrarla por estra recta. 9. Introducir rpidamente los tubos en el bao de agua y continuar calentando y repetir el paso 8 despus de 10, 20 y 30 minutos de calentamiento. 10. Hacer lo mismo con los otros dos tubos que se calentaran a ebullicin durante 5, 10, 20 y 30 minutos. 11. Incubar las cajas en posicin invertida a 37 C 12. Efectuar sus observaciones y registrar sus resultados en la tabla correspondiente. CLCULOS Y REPORTE DE RESULTADOS. 1. Ejemplificar una curva tpica de desarrollo.

VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O. 2. Indicar el tiempo y temperatura a las cuales no se registr desarrollo microbiano. 3. Cules son las T y tiempos establecidos para destruir cada uno de los M.O. estudiados. 4. Con base a los resultados de grupo indicar que M.O. son ms resistentes al calor. Los resultados con las bacterias utilizadas fueron los siguientes:

E. Coli

S. Aureus

CONCLUSIN Esta prctica pudimos determinar el periodo trmico mortal, a diferencia de la prctica anterior, aqu no vari la temperatura, sino el tiempo al que la muestra se someti a una sola temperatura determinada. De esta manera pudimos observar que al pasar este tiempo de exposicin, la poblacin de bacterias disminuye gradualmente, hasta cesar su desarrollo.

BIBLIOGRAFA

Atlas, R. M. Microbiologa, fundamentos y aplicaciones. Editorial CECSA Ingrham J. L. y G. A. Ingrham. Introduccin a la microbiologa I y II. Editorial
Reverte S. A.

Prescott- Harley- Klein. Microbiologa. Editorial Mc. Graw Hill. Madigan M. T. J. M Martinko y J. Parker. Biologa de los microorganismos. 8
edicin Prentice Hall Iberia Espaa. Pelczar y Col. Microbiologa general. Editorial Mc. Graw Hill.