Centro de Investigacin y Desarrollo de Tecnologa de Alimentos

CIDTA

Estandarizacin de un Mtodo para Determinar Benzoato de Sodio y Sorbato de Potasio en Jugos de Frutas por HPLC
Juana Betty MENACHO
Universidad Autnoma Gabriel Ren Moreno. Centro de Investigacin y Desarrollo de Tecnologa de Alimentos (CIDTA). Km 71/2 Carretera al Norte. Santa Cruz-Bolivia, 2006.
La determinacin de Benzoato de Sodio y Sorbato de potasio ha sido realizada en Cromatgrafo lquido (HPLC), marca Shimadzu, Serie 10A vp, utilizando columna Shim-pack CLC-ODS, longitud = 15 cm y detector UV, bajo un sistema Isocrtico. Las condiciones de trabajo para realizar la cuantificacin de los conservantes fueron: Fase mvil una mezcla de Metanol:acetonitrilo:Acido ctrico 5 o mM (estabilizada a un pH de 4) en una proporcin de 1:2:7, Flujo 1 ml/min, Temperatura del horrno de la columna 45 C, Presin 2 de trabajo de 81 kgf/cm , Longitud de onda: 230 nm. El Volumen inyectado: 20 l y Blanco solvente:Agua desionizada. El tratamiento de datos fue realizado en C-R5A CHROMATOPAC, filo 0, mtodo 41. Las curvas patrones de benzoato de sodio y 2 sorbato de potasio reflejaron buenos coeficientes de correlacin, obtenindose valores de R = 0.9968 y 0,9995 respectivamente, lo cual demuestra que existe buena proporcin respecto a las concentraciones de estudio. Se dosificaron muestras de jugo de limn con 300 mg/l para realizar la cuantificacin de las mismas y se obtuvieron buenos porcentajes de recuperacin respecto al valor terico de dosificacin de las mismas.

Introduccin
Los conservantes, sustancias qumicas de conservacin destinados a inhibir y controlar el crecimiento de microorganismos en los alimentos, es un pauta esencial de los procesos de produccin y necesarios, no slo para evitar la accin microbiana, sino tambin para establecer buenos sistemas de produccin y evitar las prdidas que sobre proceso o consumo se produce en los alimentos y que por su composicin, permiten la proliferacin del crecimiento bacteriano. La regulacin de estos, cada da est mas controlada debido a que se establecen criterios de calidad sobre los productos que se compran, condiciones de dosificacin y reacciones patolgicas. Los conservantes alimentarios, mas usados son el Acido Benzoico y Acido Sorbico y sus respectivas sales (por ser mas solubles), utilizados en toda clases de alimentos, estos se encuentran tambin presentes en forma natural en algunos vegetales. Existen pues razones poderosas para el control de los conservantes, los organismos oficiales correspondientes, a la hora de autorizar el uso de un determinado aditivo tienen en cuenta que ste sea un auxiliar del procesado correcto de los alimentos y no un agente para enmascarar unas condiciones de manipulacin sanitaria o tecnolgicamente deficientes, ni un sistema para defraudar al consumidor engandole respecto a la frescura real de un alimento. El objetivo del presente trabajo es la Estandarizadin de un mtodo analtico para determinar Sorbato de potasio y Benzoato de sodio en jugos de frutas por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin.

Sorbato de Potasio: Frmula: No de CAS: Peso Molecular: Pureza:

E202 CH3CH:CHCH:CHCOOK 24634-61-5 150.22 mayor a 99 %.

Sustancias de ensayos. Muestras de jugo de limn lista para

diluir y cuantificar, jugo de limn natural para preparar la muestra y jugo de limn dosificadas con sorbato de potasio y benzoato de sodio a 300 mg/l.

Reactivos y solventes (Calidad HPLC). Metanol grado

HPLC ( 99,9%), Acetonitrilo grado HPLC (99,9%), Acido ctrico p.a. (99.5%), citrato de sodio p.a.(99.8%), Hexacionaferrato de potasio (II) Trihidratado (99%, M=422.41), Sulfato de Zinc heptahidratado (98%, M=287.55), Agua calidad desionizada (0,06 us)

Condiciones de Medida(.2). Las condiciones de trabajo en

HPLC para realizar la cuantificacin de los conservantes fueron: Fase mvil una mezcla de Metanol:acetonitrilo:Acido ctrico 5 mM (estabilizada a un pH de 4) en una proporcin de 1:2:7, Flujo 1 o ml/min, Temperatura del horrno de la columna 45 C, Presin de 2 trabajo de 82 kgf/cm , Longitud de onda: 230 nm. El Volumen inyectado: 20 l y Blanco solvente:Agua desionizada.

Preparacin de soluciones para la curva patrn y cuantificacin. Mezcla de soluciones madres de Benzoato de
sodio y Sorbato de potasio son preparadas pesando alrededor de 0,015 g de cada uno y enrasando con agua destilada a un volumen de 50 ml. Estas soluciones contienen 300 mg de conservante por litro de solucin. Se preparon diluciones destinadas al establecimiento de la curva patrn en las siguientes concentraciones:15, 30, 60 y 180 mg/ml.

Materiales y Mtodo
Sustancia de referencia
Benzoato de sodio: Frmula: No de CAS: Peso Molecular: Pureza: E211 C6H5COONa 532-32-1 144.11 99.0 100.5 %

Muestras de ensayo. Las muestras analizadas fueron jugo de

limn (A y B) pertenecientes al primer Ensayo Interlaboratorio en Conservadores en bebidas analcoholicas del Instituto Nacional de Tecnologa Industrial (INTI), adems de muestras preparadas por el Centro de Investigacin y desarrollo de Tecnologa de Alimentos (CIDTA), las mismas que fueron dosificadas con los conservantes en estudio en una concentracin de 300 mg/l.

Preparacin de las muestras y Extraccin del conservante. Como la muestra A es una muestra de jugo de limn ya preparada esta fue diluida e inyectada directamente en HPLC. Tanto la muestra B como la muestra dosificada en CIDTA, fueron preparadas de la siguiente manera: Se peso entre 1,5 a 10 g de jugo de limn se disolvieron con 20 ml de agua destilada y se llev a bao de agua a 60C por 30 minutos. Se enfri y se adicion 10 ml de reactivo Carrez I y 10 ml de reactivo Carrez II sucesivamnete, enrasasando luego a un volumen de 100 ml. La muestra fue filtrada a travs de papel filtro y luego en filtros de 0,45 um para inyectar en HPLC.

Clculo de la concentracin en la muestra. La

concentracin de cada conservante en las muestras es determinada a travs de la curva patrn pasada en el curso de la misma secuencia de inyeccin, aplicando la siguiente formula: Conc. de Conserv. (mg/kg) =

C Vit . C Extr .

VF Dil PM
Fig. 1. Cromatogramas de Benzoato de sodio y sorbato de potasio presentes en la curva patrn. Cuadro N1. Establecimiento de la curva patrn de Benzoato de sodio y cuantificacin de las muestras dosificadas.
ENSAYO INTERLABORATORIO N1 (CONSERVANTES EN JUGOS) FECHA: 14-09-06 PRODUCTO: Benzoato de sodio INSTRUMENTO DE MEDIDA: HPLC SHIMADZU Serie 10A vp Columna: Tipo: Shim-pack CLC-ODS (C18) Longitud (cm): 15 Fase mvil: Metanol:Acetonitrilo:Acido Citrico 5mM (pH:4,01) (Estabilizado con citrato de sodio) Proporcin : 1:2:7 Presin (Kg/cm2): 81 Flujo (ml/min): 1,0 Bomba A Detector: UV: longitud de onda (nm): 230 T(C): 45 Volumen inyectado (ul): 20 Inyeccin: Tiempo de retencin (min): 11,2 Tratamiento de datos: file 0, C-R5A CHROMATOPAC SOLVENTE: Agua desionizada
CONCENTRACIONES DE TRABAJO Ref. Respuesta (%) R = 0,9968 Ordenada Origen = 531152 Pendiente = 71842
25000000 20000000 15000000 10000000 5000000 0 0 100 200 300 400
y = 71842x + 531152 R2 = 0,9968

Donde: C
vit. C extr.

= Concentracin de Benzoato Sorbato en la muestra obtenida con la curva patrn (g/ml) VF = Volumen final al que se diluye la muestra (ml) PM = Masa tomada para el ensayo (g) Dil = Factor de dilucin (si lo hubiese)

Resultados y Discusin
Cuantificacin muestras de los conservantes en las

0,996

Segn las condiciones de medida, la curva patrn de 2 Benzoato de sodio y = 71842x + 531152C con R = 0.9968, y Sorbato de potasio y = 51630x + 217646C nos muestran 2 valores de coeficiente de determinacin (R ) superior al valor de referencia (0.996) (ver cuadro N1 y cuadro N2),

Conc.(ug/ml)

Superficie

Conc.real (ug/ml)

adems la buena resolucin del pico cromatogrfico (fig.1) con tiempo de retencin de 11,2 y 13,1 min para Benzoato y Sorbato. nos aseguran que para el rango lineal establecido (15 300 mg/l) existe una respuesta proporcional de las reas calculadas respectos a las concentraciones de estudio. Segn las muestras dosificadas con soluciones de benzoato y sorbato ambas en concentraciones de 300 mg/l se observaron
buenos porcentajes de recuperacin respecto al valor de osificacin (ver cuadro N 1 y 2), adems de la buena resolucin de los picos cromatogrficos donde se observa claramente la presencia de benzoato de sodio y sorbato de potasio en los tiempos de retencin mencionados anteriormente (Ver fig. 2).

15,062 15,062 30,124 30,124 60,249 60,249 180,747 180,747 301,245 301,245
Muestras
Jugo A-14 (4) Jugo A-14 (5) Jugo A-14 (6) Jugo B-12 (4) Jugo B-12 (5) Jugo B-12 (6) Blanco matriz Limn -1 (sin tx) Limn -2 (sin tx) Limn -1 (con tx) Limn -2 (con tx)

1381919 1354537 2432208 2436562 5094545 5058386 14443956 14059478 21570345 21883872
Superficie

11,842 11,461 26,461 26,522 63,520 63,016 193,657 188,306 292,852 297,216
Conc.real (ug/ml)

78,6% 76,1% 87,8% 88,0% 105,4% 104,6% 107,1% 104,2% 97,2% 98,7%
Conc. (mg/kg)

Conc. (mg/100g)

Peso muestra (g) 1,5670 2,6206 3,5473 10,4933 10,0210 10,0180 10,0408 10,0084 10,0149 15,0933 15,0154

Promedio (mg/kg)

3585356 5742012 7803865 14870339 13874009 13218929 0 5424949 4810764 2100148 1929274

42,51 72,53 101,23 199,59 185,72 176,61 -7,39 68,12 59,57 21,84 19,46

678,25 691,94 713,44 475,52 463,34 440,72 -18,41 170,15 148,70 144,70 129,61

67,82 69,19 71,34 47,55 46,33 44,07 -1,84 17,02 14,87 14,47 12,96

694,54

459,86
Recuperacin %

113,4 99,1 96,4 86,3

Fuente: Elaboracin propia en base a datos experimentales

Conclusin
La cuantificacin de los conservantes por esta metodologa ofrece buenos porcentajes de recuperacin en relacin al valor de dosificacin de las muestras los cuales revelan un porcentaje de recuperacin entre 90 a 109%. Se obtuvieron buenas resoluciones de los picos cromatogrficos tanto para la curva patrn como para las muestras analizadas. Las curvas de calibracin de Benzoato de sodio y Sorbato de potasio reflejaron buenos coeficientes de correlacin para las concentraciones en estudio obtenindose coeficientes de 0,9968 y 0,9995 respectivamente, adems hubo buena repetibilidad de las reas obtenidas de una misma concentracin. Se pudo comparar resultados de muestras analizadas (muestra dosificada) con tratamiento y sin tratamiento donde se obtuvieron porcentajes de recuperacin similares. Por tal motivo la estandarizacin de la presente metodologa permite determinar el contenido de conservantes tanto de Benzoato de sodio como Sorbato de potasio presentes en muestras de jugos de frutas y bebidas analcoholicas.

Fig. 2 Cromatogramas de la muestra A de jugo de limn.

Cuadro N2. Establecimiento de la curva patrn de Sorbato de potasio y cuantificacin de las muestras dosificadas.
ENSAYO INTERLABORATORIO N1 (CONSERVANTES EN JUGOS) FECHA: 14-09-06 PRODUCTO: Sorbato de potasio
INSTRUMENTO DE MEDIDA: HPLC SHIMADZU Serie 10A vp Columna: Tipo: Shim-pack CLC-ODS (C18) Longitud (cm): 15 Fase mvil: Metanol:Acetonitrilo:Acido Citrico 5mM (pH:4,01) (Estabilizado con citrato de sodio) Proporcin : 1:2:7 Presin (Kg/cm2): 81 Flujo (ml/min): 1,0 Bomba A Detector: UV: longitud de onda (nm): 230 T(C): 45 Volumen inyectado (ul): 20 Inyeccin: Tiempo de retencin (min): 13,1 Tratamiento de datos: file 0, C-R5A CHROMATOPAC SOLVENTE: Agua desionizada CONCENTRACIONES DE TRABAJO Conc.(ug/ml) Superficie Conc.real (ug/ml) Respuesta (%) R = 0,9995 Ordenada Origen = 219064 Pendiente = 51706
18000000 16000000 14000000 12000000 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0 0,000
y = 51706x + 219064 R2 = 0,9995

Referencias
1. Manual de Amlisis Fisico-Qumicos de Alimentos, Agua y Suelos. Ministerio de Salud. Instituto de Salud Pblica de Chile Subdepartamento Laboratorios del Ambiente. 1998. 2. Methods of Anlisis in Health Science, 2005. pag. 301-306. JAPAN

Ref.

0,996

15,345 15,345 30,690 30,690 61,380 61,380 184,14 184,14 306,90 306,90
Muestras
Jugo A-14 (4) Jugo A-14 (5) Jugo A-14 (6) Jugo B-12 (4) Jugo B-12 (5) Jugo B-12 (6) Blanco matriz Limn -1 (sin tx) Limn -2 (sin tx) Limn -1 (con tx) Limn -2 (con tx)

867507 938615 1828069 1821082 3434926 3468480 9822884 9857407 16232185 15806507
Superficie

12,541 13,916 31,119 30,983 62,196 62,844 185,740 186,408 309,698 301,465
Conc.real (ug/ml)

81,7% 90,7% 101,4% 101,0% 101,3% 102,4% 100,9% 101,2% 100,9% 98,2%
Conc. (mg/kg)

100,000

200,000

300,000

400,000

Conc. (mg/100g)

Peso muestra (g) 1,5670 2,6206 3,5473 10,4933 10,0210 10,0180 10,0408 10,0084 10,0149 15,0933 15,0154

Promedio (mg/kg)

799552 1074110 1472833 1191183 1155345 1073417 1056666 3267966 3552607 1366820 1484679

11,23 16,54 24,25 18,80 18,11 16,52 16,20 58,97 64,47 22,20 24,48

179,11 157,76 170,89 44,79 45,17 41,23 40,33 147,29 160,94 147,07 163,01

17,91 15,78 17,09 4,48 4,52 4,12 4,03 14,73 16,09 14,71 16,30

169,25

43,73
Recuperacin %

98,2 107,3 98,1 108,7

Fuente: elaboracin propia en base a datos experimentales