Aplicacin del tomillo (Thymus vulgaris) en el manejo de Enfermedades de la Salmonicultura

Aplicacin del Tomillo (Thymus vulgaris)

en el manejo de Enfermedades de la Salmonicultura
Autores Mara Isabel Toledo Alex Manrquez Lagos German Olivares Cantillano Andrea Soto Azocar Luis Gonzlez Carvajal

FUNDACIN PARA LA INNOVACIN AGRARIA MINISTERIO DE AGRICULTURA

GOBIERNO DE CHILE

Andrea Soto Azocar Ingeniero Pesquero P.U.C.V. Participa en Proyectos de investigacin en el rea de alimentacin

Autores
Mara Isabel Toledo Ingeniero Pesquero P.UC.V. Magster en Agricultura de la U. de Oregon. Docente e Investigacin en el Area de Produccin y Alimentacin de Recursos Acucolas de la Esc. de Cs del Mar P.U.C.V.

Lus Gonzlez Carvajal Bilogo P.U.C.V. Participa en los bioensayos con tratamientos con tomillo en baos y alimentacin

Alex Manrquez Lagos Ingeniero Pesquero P.U.C.V. Participa en Proyectos de investigacin en el rea de alimentacin German Olivares Cantillano Ingeniero Pesquero P.U.C.V. Participa en Proyectos de investigacin en el rea de alimentacin

Aplicacin del Tomillo (Thymus vulgaris)

en el manejo de Enfermedades de la Salmonicultura
Autores Mara Isabel Toledo Alex Manrquez Lagos German Olivares Cantillano Andrea Soto Azocar Luis Gonzlez Carvajal

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE VALPARASO Escuela de Ciencias del Mar

Para mayores informaciones: Laboratorio de Cultivo de Peces y Alimentacin para la Acuicultura. Escuela de Ciencias del Mar. Pontificia Universidad Catlica de Valparaso. Avenida Altamirano 1480 oficina. 204. Fono / Fax 56 32 2274263 Fax: 56-32-2274206 e-mail: isabel.toledo@ucv.cl Valparaso - Chile

INDICE DE CONTENIDOS
1. Introduccin 2. Captulo 1 / Cultivo del tomillo 3. Captulo 2 / Produccin de aceites esenciales a partir de especies aromticas 4. Captulo 3 / La enfermedad de la saprolegniosis en la salmonicultura 5.Captulo 4 / El tomillo (Thymus vulgaris) en el manejo de saprolegniosis

Introduccin
Debido a la importancia econmica que representa la produccin de salmnidos para Chile y las prdidas que origina la saprolegniosis, es fundamental buscar alternativas al verde malaquita para favorecer la produccin limpia y el desarrollo de la acuicultura orgnica. La utilizacin de extractos oleicos de plantas medicinales, como el tomillo, en el control de la saprolegniosis y su adopcin por parte de la industria salmonera, potenciara de manera importante la actividad agrcola. La utilizacin de aceite de tomillo (Thymus vulgaris), en el control de la saprolegniosis se presenta como una opcin, tanto para la acuicultura orgnica como para la tradicional, en consideracin a la composicion de sus aceites esenciales como por sus propiedades antifngicas. El presente documento se compone de cuatro captulos. En el primero se sealan brevemente los aspectos relacionados con el cultivo del tomillo. En la segunda seccin, se indica la produccin de aceites esenciales a partir de especies aromaticas. En el tercer captulo se presentan las caractersticas de la saprolegniosis, el ciclo de vida de Saprolegnia parastica y su efecto en la salmonicultura. En el cuarto y ltimo captulo se resumen los aspectos ms relevantes del Proyecto Aplicacin del Tomillo (Thymus vulgaris) en el manejo de enfermedades de la salmonicultura FIA-PI-C-2004-1-D-089, desarrollado por el Laboratorio de Cultivo y Alimentacin de Peces (LABCPAC) de la Escuela de Ciencias del Mar de la PUCV, investigacin que cont con el apoyo financiero de FIA y los aportes de las empresas participantes Luxcamp, Nutriservice y CETECSAL.

Captulo 1* El cultivo del tomillo (Thymus vulgaris)

El tomillo es una planta aromtica, vivaz, leosa y muy poliforme. La planta puede alcanzar una altura de 10 a 45 cm. con numerosas ramas, leosas, erectas, compactas, parduscas o blanco aterciopeladas. Las hojas de 3 a 8 mm. son lineares o brevemente ped celadas, opuestas, sus mrgenes revueltos hacia abajo y blanquecinas por su envs, con buena resistencia a temperaturas extremas. Crece mejor en suelos ricos en materia orgnica. Sus frutos son de color marrn y florece desde marzo en adelante (Fernando, M. 1993). En cuanto a su ecologa se puede destacar que esta planta aromtica se adapta bien a climas templados, resiste las heladas y sequas, aunque no resiste al exceso de humedad o inundaciones permanentes. Se adapta a todo tipo de suelo y su cultivo puede durar entre 3 y 5 aos, dependiendo del manejo al que sea sometida.

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Figura 1.1 Plantas de tomillo (Thymus vulgaris)

* Este captulo fue preparado por la empresa participante Agrcola Luxcamp. Productora Deshidratadora y Comercializadora de plantas aromticas y especias.

Multiplicacin
Por lo general, como en la mayora de las plantas perennes, existen varias formas de propagacin siendo las ms conocidas por semillas y vegetativamente.

Figura 1.2 Almcigos de tomillo (Thymus vulgaris)

Establecimiento de almcigos
La siembra se realiza sobre un suelo ligero cuidadosamente preparado y alisado o sobre bandejas speedlings. La temporada de siembra abarca desde agosto a octubre e incluso en meses posteriores. Se recomienda mezclar las semillas con arena debido al tamao pequeo de las semillas para facilitar su siembra. No se recomienda realizar una siembra directa. La semilla se planta en el suelo o recipiente y se cubre con una ligera capa de tierra o turba, con riegos diarios con aspersores o regadera fina. Se logra una buena germinacin en las tres semanas siguientes. Cuando las plantas alcanzan una altura de 6 a 8 cm, alrededor de 45 das despus de la siembra, se efecta el trasplante al lugar definitivo donde se realizar el cultivo.

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Esquejado
Segn la literatura, el esquejado se practica en toda poca siempre y cuando el tomillo est con actividad vegetativa. Cada pie permite obtener algunos centenares de esquejes. El enraizamiento tiene lugar a los 2 meses y los esquejes pueden plantarse bien en otoo o mejor a principios de primavera. El porcentaje de prendimiento es alrededor de un 85%. Este porcentaje se reduce al 30% o 40%, cuando el esquejado se realiza durante el reposo vegetativo, es decir, en invierno

Preparacin de suelo y plantacin

Una buena preparacin de suelo es un factor de mucha incidencia en el xito de un cultivo, sobre todo al tratarse de una especie perenne que se mantiene econmicamente productiva por varias temporadas. Al momento de realizar esta labor idealmente se recomienda utilizar implementos tradicionales, ya sea arado de disco o cincel y rastras de disco. La plantacin se realiza a principios de octubre. Previo al trasplante se recomienda melgar a la distancia definitiva del cultivo. Segn experiencias de Luxcamp la distancia ptima de plantacin es de 0,7 m entre hileras y 0,25 m sobre la hilera. Antes de trasplantar se deben regar las melgas para asegurar un buen prendimiento de plantas. La densidad de plantacin vara entre 55.000 y 60.000 plantas /ha.

Labores culturales y fertilizacin

Adems de riegos oportunos y con poco agua, se sugiere la aplicacin de herbicidas de pre-plantacin. stos se debe cultivar mecnicamente para el control de malezas entre hileras y desmalezar manualmente sobre la hilera. Por ser un cultivo intensivo, el suelo debe estar bien provisto de materia orgnica, la cual debe ser aportada al menos en el momento de la preparacin del suelo. Para estos efectos, se puede usar guano bien descompuesto o haber incluido abono verde en la temporada anterior. Los fertilizantes de fondo, se aportan en el momento de la preparacin superficial para el trasplante. Ms tarde, se aportar nitrgeno en cobertura, despus del arraigue de las plantas, de manera parcializada y en bajas dosis. Segn literatura se recomiendan las proporciones que se citan en Tabla 1.1.

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Tabla 1.1 Proporciones para preparado de fertilizantes de fondo

Fertilizantes Nitrgeno Fsforo Potasio

Unidades 75 a 80 50 a 60 100 a 120

Control de malezas
Como se mencion anteriormente, se sugiere la aplicacin de un producto de pre- plantacin, como productos a base de Simazina que se encuentran disponible en el mercado. Para el control de malezas de semillas anuales y perennes, se recomienda el uso de herbicidas de post-emergencia, como productos a base de Terbacilos.

Enfermedades
Sobre la parte area de la planta, a veces aparece un color amarillo en las hojas de algunas ramas de la parte superior. Esto se debe a un ataque de nematodos a nivel de las races cuyo responsable principal es el Meloidogyne hapla. El nico control posible es la desinfeccin del suelo de los viveros mediante la multiplicacin vegetativa. No se debe implantar el cultivo del tomillo en parcelas donde se haya detectado la presencia de nematodos. Esta enfermedad tambin puede ser provocada por exceso de humedad o riegos excesivos. La defoliacin de las sumidades y el amarilleo, constatado despus de la floracin, son fenmenos naturales que no deben confundirse con enfermedades.
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Recoleccin y rendimiento
En cultivos nuevos o establecidos en la misma temporada slo se puede realizar una cosecha. Al segundo ao es posible realizar dos y hasta tres cosechas dependiendo de la temperatura y las lluvias, siempre que stas no se presenten en abundancia en los meses de marzo y abril pudiendo realizar la cosecha a mediados de mayo. En el primer ao, el rendimiento fresco vara entre 800 y 1000 Kg/ha y en los aos siguientes el rendimiento fresco puede alcanzar los 5000 Kg./ha. El rendimiento seco corresponde entre un 15% y un 20% del peso fresco. Despus de cada cosecha se repiten las labores culturales, es decir, el cultivo, la limpieza manual y la fertilizacin nitrogenada.

Recoleccin y secado de semillas

Para la recoleccin de semillas se termina el ciclo reproductivo y se deja una superficie aproximada de 30 m2 para la extraccin. En esta superficie se dejan las semillas, se cortan, se secan al sol, se extraen manualmente y se almacenan en bolsas de papel. Las alternativas de secado son: Secado a la sombra: Se aprovecha la temperatura ambiente y el proceso de secado demora alrededor de 7 das. Secado con mquina deshidratadora: El proceso de secado de semillas tarda aproximadamente 48 horas.

Bibliografa
Fernando, M. L. 1993. Plantas Medicinales y Aromticas Estudio, cultivo y proceso. Dr. Ingeniero de Montes del Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias. 2 Edicin, 365 p. Curioni, A. y O. Arizio. 2006. Plantas aromticas y medicinales. Buenos Aires: Hemisferio Sur, 125 p.

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Captulo 2* Produccin de aceites esenciales a partir de especies aromticas

El trmino aceite esencial, o esencia, presenta muchas dificultades cuando se busca una definicin que generalice este concepto. Existen definiciones desde el punto de vista qumico, botnico y desde una perspectiva industrial. Todas coinciden en aspectos como su insolubilidad en agua, que pertenecen al metabolismo secundario de las plantas, que estn formadas por varios compuestos qumicos de estructura diferente y que en su composicin poseen algn terpenoide. Se podra definir un aceite esencial como la fraccin qumica de un vegetal arrastrada por vapor de agua, voltil, formada mayoritariamente por compuestos de naturaleza terpenoide y que genera el olor caracterstico de ese vegetal. En ciertos ambientes industriales o tcnicos se diferencian los trminos aceite esencial y esencia, dejando este ltimo trmino para los productos de sntesis y el trmino aceite esencial para los productos naturales derivados de las plantas. Se debe sealar que los aceites esenciales forman parte del llamado metabolismo secundario, ya que se sintetizan a partir de metabolitos primarios como glcidos, protenas y lpidos. Son productos con una variada y compleja composicin qumica, con grandes variaciones en calidad aun cuando provengan de una misma especie vegetal, como la gran mayora de los productos naturales. Los aceites esenciales cumplen un papel determinado en las plantas que los poseen; en algunos casos se les atribuyen funciones de defensa ante el ataque de microorganismos y/o animales depredadores. En otros casos, se cree que la sntesis de estas fracciones qumicas es slo para poder transformar excedentes del metabolismo primario difcil de eliminar. Es indiscutible, que desde tiempos antiguos hasta la actualidad, el uso de los aceites esenciales ha ido en aumento tanto en la diversidad de usos como escalas de produccin. En las antiguas civilizaciones se extraan para perfumar, para curar algunas afecciones y en definitiva siempre para buscar una mejor calidad de vida. Actualmente est en franca expansin el uso de aceites esenciales naturales principalmente en la industria alimenticia y farmacutica, en la industria de perfumes y cosmtica en reemplazo de productos sintticos.
* Este captulo fue preparado por el profesor invitado Sr. Jorge Ringuelet de la Universidad de Mar del Plata, Argentina, gracias al apoyo de FIA. Proyecto FIC-CO-C-2007-3-M-001.

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Objetivos del cultivo de especies aromticas

Las especies de las cuales se extraen los aceites esenciales se denominan plantas aromticas y se cultivan principalmente para las siguientes producciones: 1. Produccin de hierba seca o droga cruda, destinada a la industria herbcea o alimenticia, con la finalidad de utilizarla como condimento o en infusiones. 2. Produccin de hierbas aromticas frescas, destinada a la cocina, representa una actividad muy intensiva y de escaso peso relativo en la economa. 3. Produccin de aceite esencial, destinada principalmente a la industria de perfumes, cosmtica, alimenticia y farmacutica.

Posibilidades para instalar una agroindustria de aceites esenciales

La factibilidad de producir aceites esenciales est directamente relacionada con las posibilidades de producir la materia prima de la cual se van a extraer. La mayora de las especies a procesar deben producirse en el mismo lugar o muy cerca de donde se procesan. Este es el caso de hierbas como mentas, lemongrass, romero, tomillo, etc.

Posibilidades para instalar una agroindustria de aceites esenciales

En muchas familias botnicas podemos encontrar especies con aceites esenciales. Aunque se han identificado ms de 60 familias, las ms caractersticas son las Asteraceae (o Compuestas), Labiatae, Umbeliferae, Mirtaceae, Rutaceae y Lauraceae. Los aceites esenciales se pueden localizar en distintos rganos de la planta. Algunos slo estn presente en las hojas y flores; en otros casos, slo se encuentran en la raz, en la corteza o en los frutos, etc. Algunos ejemplos:
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En las races: aceite de sndalo (Santalum album), aceite de valeriana (Valeriana officinalis), aceite de vetiver (Vetiveria zizanioides), aceite de jengibre (Zingiber officinale). En las semillas: aceite de anfs (Pimpinella anisum), cardamomo (Aframomum stipulatum), hinojo (Foeniculum vulgare), coriandro, o cilandro (Coriandrum sativum), eneldo (Anethum graveolens). En las hojas: mentas (Mentha sp.), organo (Origanum sp.), romero (Rosmarinus officinalis), salvia (Salvia officinalis), albahaca (Ocimun basilicum), lemongrass, o hierba limn (Cymbopogon citratus). En el leo: palo santo (Bulnesia sarmientoi). En la corteza: canela (Cinamomun zeylanicum). En las flores: lavanda (Lavandula sp.), ylang-ylang (Cananga odorata), jazmn (Jasminum sp.), rosa (Rosa sp.). Algunas especies contienen esencias en diferentes partes de la planta, pero en muchos casos difiere enormemente la composicin y por lo tanto sus propiedades y usos segn el lugar en que se encuentran. Por ejemplo, es muy distinta la composicin qumica, y por lo tanto el aroma, de la esencia extrada de los frutos del cilantro o de sus hojas. Por ello en este caso hay que indicar si la esencia proviene de los frutos o de las hojas, aunque con esta especie es muy extrao que alguien se interese por la esencia de las hojas. Lo mismo sucede con la esencia extrada de las cscaras de los ctricos y de sus hojas. En el caso del limn, la esencia extrada de la cscara se utiliza en todo el mundo principalmente como aromatizante de bebidas. En cambio, hay variedades de naranja donde el valor est en la esencia extrada de las hojas y brotes tiernos, que se conoce comercialmente como esencia de petit grain (Citrus aurantium) y es muy usada en perfumera. En la corteza de la canela de Ceiln predomina el aldehdo cinmico, en las hojas predomina el eugenol, mientras que en las races el componente mayoritario es el alcanfor. En el caso de la ruda (Ruta graveolens), en las hojas predominan compuestos oxigenados como cetonas, alcoholes y furanocumarinas; mientras que en las races los componentes mayoritarios son hidrocarburos como geigerenos (C12 H18 , C12 H16). Hay especies herbceas donde la esencia se concentra en las hojas, sumidades florales y en las flores. En general, hay bajos contenidos de esencias en los tallos. Sin embargo, por el costo que implica separar tallos de hojas, en la prctica se extrae toda la parte area de la planta. Es el caso de hierbas como mentas, tomillo, organo, romero, salvia, laurel y muchas otras.

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Plantas aromticas y plantas medicinales

Al referirnos a los aceites esenciales no podemos dejar de mencionar el grupo de las plantas aromticas, que reciben su nombre debido a que sintetizan y acumulan esos compuestos. Aunque la gran mayora de las plantas superiores sintetizan algn o algunos componentes voltiles y con olor caracterstico, se llama aromticas a aquellas plantas que acumulan esas fracciones en ciertas estructuras anatmicas o cavidades extracelulares como glndulas epidrmicas, tricomas glandulares, canales resinferos, entre otras. Precisamente, su importancia econmica radica en la presencia de esos componentes. Como los aceites esenciales tienen alguna actividad biolgica referida al tratamiento de trastornos o enfermedades, tambin las plantas aromtica se consideran plantas medicinales. Sin embargo, en sentido estricto las plantas medicinales tienen mayor implicancia, ya que por sus antecedentes puede ser utilizadas en el tratamiento de algunas afecciones. Dicha actividad puede deberse a la presencia de cualquier componente qumico, no exclusivamente al aceite esencial. Por lo tanto, se puede afirmar que toda planta aromtica es medicinal, pero no toda planta medicinal es aromtica. Hay muchas especies medicinales que no son consideradas plantas aromticas, ya que de ellas no se extrae ningn aceite esencial. Es el caso de especies como el Aloe sp., Silibum marianum (cardo mariano), etc.

Composicin de los aceites esenciales

Las tecnologas analticas de las ltimas dcadas han permitido identificar una gran cantidad de compuestos en las esencias analizadas. En algunas, se han identificado ms de 100 compuestos, siendo en su mayora terpenoides. Otros son alcoholes simples, cidos, steres, aldehdos o compuestos nitrogenados de estructura sencilla. Cada componente le confiere a la esencia una caracterstica odorfera, la que es responsable de una nota o sensacin al olfato. La combinacin de las distintas sustancias cambian la nota u olor, lo que caracteriza el aroma de la planta de la cual proviene.

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Tabla 2.1 Caractersticas odorferas de algunos componentes de esencias

Compuesto Acetato de 3-hexenilo Acetato de bencilo Salicilato de bencilo Geraniol Linalool Nota herbcea floral floral floral, rosa, geranio herbcea Compuesto Acetato de linalilo Cariofileno Benzoato de metilo Pineno Farnesol Nota floral, herbcea madera frutal madera frutal

En la mayora de las esencias existen 1 2 compuestos mayoritarios y muchos compuestos minoritarios, algunos en proporcin muy baja, pero que otorgan las caractersticas ms deseables desde el punto de vista organolptico. El limoneno, es un monoterpeno monocclico que se encuentra en un 96,02 % en la cscara de la mandarina Citrus nobilis, mientras que en la mandarina Citrus reticulata se encuentra en un 83,71%. En la mandarina Citrus reticulata los componentes ms abundantes son el terpineno en un 3,85 % y el terpinoleno en un 5,95%. En cambio, en la mandarina Citrus nobilis, el componente ms abundante despus del limoneno es el -mirceno con un 3,66%, todos monoterpenos monocclicos. (Blanco Tirado et al., 1995). Algunos ejemplos de la composicin de aceites esenciales obtenidos en La Plata, Argentina se presentan en la siguiente tabla.

Tomillo (Tymus sp) Timol Carvacrol p-cimeno -terpineno Linalol -pineno -pineno -terpineno -cariofileno Terpinen -4ol -tuyeno Sabineno Mirceno 1,8 cineol Acetato terpinilo Metil eugenol Limoneno Otros 55,4 2,9 18 13,1 2,4 sd 2 1,8 sd sd sd sd sd sd sd sd sd 4,4

Organo (O. majoricum) 22,2 1 sd 6,7 sd sd sd 3,6 sd 12,6 sd 3,8 2 sd sd sd sd 48,1

Organo (O. vulgare) 0,3 62 7 10,7 sd sd sd sd sd sd 1,1 sd 1,8 sd sd sd sd 17,1

Ajedrea (S. montana) 0,2 35,7 4,8 40,4 sd sd 2,2 3,6 1,9 sd sd sd sd sd sd sd sd 18,1

Laurel (L. nobilis) sd sd sd sd 10,6 5,2 3,6 sd sd sd sd 8,9 sd 35,6 11,7 4,8 2,1 sd

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Los pases productores de aceites naturales son tanto pases desarrollados como en vas de desarrollo. En estos ltimos existen producciones de diversos aceites esenciales extrados de plantas silvestres, muchos de ellas en peligro de extincin. La demanda de productos naturales para las distintas industrias requiere calidad conforme a especificaciones internacionales que muchos no pueden cumplir. Por esto es que cada vez es ms difcil colocar en el mercado aquellos productos que no satisfacen esas exigencias. El desarrollo de esta agroindustria es muy importante para toda regin en desarrollo ya que entre otras cosas: Impulsa el aumento de mano de obra con el consiguiente desarrollo socioeconmico. Promueve el uso de los recursos naturales como pueden ser algunas especies vegetales nativas o silvestres de la regin. Permite al productor agropecuario disponer de una alternativa para diversificar la produccin. Este factor es de gran impacto a mediano y largo plazo, teniendo en cuenta que una rotacin de cultivos ayuda enormemente a la sustentabilidad y preservacin del recurso tierra. Representa una industria que por sus caractersticas tecnolgicas no produce residuos peligrosos, ya que en la gran mayora de las producciones se utiliza agua como insumo principal. Algunos de los problemas asociados a la industria de los aceites esenciales en muchos pases son: Procedimientos tcnicos ineficientes para producir altos rendimientos, buena calidad y por lo tanto, dificultad para colocar la produccin en el mercado a precios que cubran los altos costos unitarios de produccin. Insuficiente disponibilidad de recursos humanos capacitados. Falta de polticas de investigacin y desarrollo adecuadas por parte de los estados, ya que la mayora prioriza producciones tradicionales de alto impacto econmico. Cada vez son ms escasos los recursos silvestres debido a la cosecha indiscriminada y a la falta de Buenas Prcticas Agrcolas. Poca informacin disponible en cuanto a mercado y posibles compradores. Falta de fabricantes locales de equipos industriales para manejo de los cultivos, tratamientos post-cosecha y extracciones propiamente dichas. Falta de crditos, recursos financieros y otras fuentes de capital.

Captulo 2 11

Los problemas mencionados estn siendo abordados por muchos gobiernos, organizaciones intermedias, empresas y otros actores econmico-sociales, al observar el lento pero firme aumento en la demanda de productos naturales como fuente de principios activos. Las industrias qumicas, farmacuticas, alimenticias, de perfumes y cosmticas buscan intensamente producciones homogneas que cumplan con las especificaciones internacionales aceptadas. Cubrir esas necesidades es una oportunidad para los que se dediquen a esta agroindustria.

Contenido de aceites esenciales en las plantas

El contenido de aceites esenciales en las plantas se expresa generalmente en porcentaje (%), pudiendo ser peso sobre peso (p/p) o volumen sobre peso (v/p). Como la densidad de los aceites es similar a la densidad del agua, ambas expresiones no difieren mucho. Aunque la primera expresin es la ms correcta, ya que en el mercado se comercializa por unidad de peso (kilos), en adelante se expresarn los valores en % v/p excepto que se indique lo contrario. O sea, que el dato presentado corresponde a los ml de aceite esencial que rinden 100 gramos de material vegetal. Es importante sealar que en todo valor de rendimiento, o contenido, debe indicarse si es a partir de material vegetal fresco, seco u oreado. Las diferencias pueden ser importantes ya que el contenido de agua de las plantas es muy variable dependiendo del momento del da, de la poca del ao, del estado fenolgico y de la extraccin de la esencia, que puede realizarse sobre material cosechado varias horas antes o incluso sobre material completamente deshidratado. Por ejemplo, las plantas de menta al cosecharse pueden tener entre un 55% y un 70% de agua, es decir, un contenido de materia seca entre 45% y 30% respectivamente. Apenas cortada comienza a perder agua por evaporacin con una velocidad directamente relacionada a la temperatura y humedad relativa del aire que la rodea. A medida que se deshidrata, el rendimiento de esencia ser mayor expresado en porcentaje, pero eso no indica que aumente el contenido en la planta de menta, sino que aumenta la cantidad relativa al peso de la menta en estudio.

Captulo 2 12

Un ejemplo: - Si tomamos una tonelada de Mentha piperita, que al cosechar tiene 41,05% de materia seca, y la destilamos fresca, recin cortada, rendir 8 litros de esencia. Por lo tanto, el rendimiento es 0,8% sobre el peso fresco (s/pf). - Si tomamos la misma tonelada de Mentha piperita y la destilamos seca, quedan 410,5 kilos de menta y tambin rendir 8 litros de esencia. Por lo tanto, el rendimiento es 1,94% sobre el peso seco (s/ps). En muchos casos, la destilacin se realiza con material cortado algunas horas antes y que an no se ha deshidratado totalmente. Con es lgico, el rendimiento en porcentaje ser intermedio de los valores mencionados. Hay que considerar en el ejemplo anterior que si el secado del material se realiz en buenas condiciones, la prdida de esencia durante el proceso de secado ser marginal. Por eso se menciona que en ambos casos (destilando de material fresco y seco) se obtienen 8 litros de esencia. En el contenido de esencias de una especie vegetal es importante como dato complementario indicar la procedencia de ese material y si es posible, el estado fenolgico de la planta as como la parte de la cual se extrajo (toda la parte area, hojas, ramas, tallos, flores, frutos, semillas o races). A continuacin se indican algunos resultados obtenidos a partir de muchas evaluaciones de material cosechado y destilado en la zona, realizadas en la Estacin Experimental de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de La Plata, Argentina (Lat. 34 52'S/Long.57 58'W).

Captulo 2 13

Tabla 2.3 Resultados del contenido de esencias de especies vegetales en la estacin experimental de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de La Plata, Argentina
Material Ajedrea (Satureja montana ) Planta entera, parte area, en floracin Lemongrass (Cymbopogon citratus) Planta entera, parte area, en verano Albahaca (Ocimun basilicum ) Planta entera, parte area, comienzo de floracin Albahaca (Ocimun basilicum) Planta entera, parte area, en plena floracin Tomillo (Thymus vulgaris ) Planta entera, parte area, en floracin, en primavera Chinchilla (Tagetes minuta ) Inflorescencias y parte superior de tal los y hojas Melisa (Melissa officinalis ) Planta entera, parte area, comienzo de floracin Falso alcanfor (Cinamomum glandulfera ) Hojas, invierno Estragn francs (Artemisia dranunculus ) Planta entera, parte area, inic del verano Jenjibre (Zingiber officinale) Rizomas frescos Menta inglesa, o peppermint ( Mentha piperita ) Planta entera, parte area, plena floracin Menta japonesa (Mentha arvensis ) Planta entera, parte area, plena floracin Menta spearmint (Mentha spicata ) Planta entera, parte area, plena floracin Organo (Origanum vulgare) Planta entera, parte area, plena floracin Organo (Origanum X applii) Planta entera, parte area, plena flor acin Lavandn (Lavandula hybrida) Inflorescencias enteras pednculos Romero (Rosmarinus officinalis) Planta entera, parte area, en floracin Malva rosa (Pelargonium graveolens) Hojas y tallos, comienzo floracin Salvia morada (Lippia alba) Quimiotipo linalol, ramas enteras en floracin Salvia morada (Lippia alba ) Quimiotipo dihidrocarvona, ramas enteras en floracin Pronto alivio (Lippia alba) Quimiotipo carvona, ramas enteras en floracin Laurel (Laurus nobilis) Ramas con flores Laurel (Laurus nobilis) Frutos maduros enteros Laurel (Laurus nobilis) Frutos maduros molidos Cedrn (Aloysia triphylla) Hojas y tallos Poleo (Lippia turbinata) Hojas y tallos Salvia (Salvia officinalis) Hojas y tallos Ajenjo (Artemisia absinthium) Hojas y tallos Ruda (Ruta graveolens) Planta entera, parte area, en floracin s/ps = sobre peso seco. s/pf = sobre peso fresco. Rendimiento 0,36% s/pf 0,32% s/pf 0,09% s/pf 0,56% s/ps 0,80% s/ps 1,65% s/ps 0,09% s/ps 4,5% s/ps 0,63% s/pf 0,13% s/pf 2,1% s/ps 2,8% s/ps 1,2% s/ps 3,35% s/ps 2,50% s/ps 1,90% s/pf 1,30% s/ps 0,10% s/pf 0,83% s/ps 1,36% s/os 1,43% s/ps 0,90% s/ps 0,22% s/pf 0,50% s/pf 0,50% s/ps 0,80% s/ps 2,36% s/ps 1,60% s/ps 0,62% s/ps
Captulo 2 14

Principales mtodos de extraccin

Existen muchos mtodos de extraccin de aceites esenciales segn el material a procesar y el objetivo. Entre los ms comunes podemos mencionar: Destilacin con agua, o hidrodestilacin, en el cual se coloca el material vegetal en contacto con el agua. Es quizs el ms econmico de implementar, pero en la mayora de los casos se obtiene un producto de baja calidad por alteraciones en la composicin. Destilacin por arrastre con vapor, que consiste en generar vapor en un lugar y luego ste se aplica sobre el material. Destilacin con agua y vapor, semejante al anterior, consiste en colocar agua debajo del material vegetal, separado por una rejilla o material que deje pasar el vapor. Expresin, slo aplicado a cscaras de ctricos. Como su nombre lo indica, se comprimen las cscaras para sacar el aceite contenido en las glndulas, sin calor para evitar la alteracin de sus componentes. Por fluidos en estado supercrtico, que consiste en aplicar altas presiones para llevar el fluido acarreador al estado supercrtico. Se obtiene un aceite distinto en su composicin, an es muy caro y slo se utiliza en procesos muy especficos, como en el descafeinado o la extraccin de sustancias muy sensibles. Por microondas, slo se aplica a escala experimental, no industrial, debido principalmente a los altos costos involucrados. Enflorado, tcnica antigua, de uso actual slo en flores muy delicadas y de un alto costo de mano de obra. Los mtodos ms utilizado segn experiencia, eficiencia y costos de produccin son la destilacin por arrastre con vapor y la destilacin con agua y vapor. Para llevar a cabo este proceso es necesario contar con un equipo destilador de aceites esenciales.

Equipo destilador
Este equipo debe dimensionarse de acuerdo a la superficie a cosechar y a la especie en cultivo, pero siempre debe disponerse de una fuente de agua y una fuente de calor (lea, gas, fuel-oil, gas-oil, etc.)
Captulo 2 15

Las partes principales son: Alambique o reactor donde se pone a destilar el material vegetal. Dispositivo o conexin que conduce la mezcla vapor de agua-esencia hacia el condensador. En la figura se lo denomina cuello de cisne; su diseo permite una eficiente conduccin de la mezcla. En la figura inferior, el diseo del equipo no requiere de esta parte, slo de una caera que une el alambique y el condensador. Condensador, puede ser un cao serpentina introducido en un bao de agua fra, o tambin una serie de tubos expuestos a una corriente de agua, como se muestra en la figura inferior. Vaso separador de esencia, tambin llamado vaso florentino, es una construccin que permite separar el agua condensada del aceite condensado, que funciona bajo el principio de que las esencias son ms livianas que el agua. Si la esencia es ms pesada, como es el caso de la esencia de nuez moscada, el diseo debe modificarse. Una fuente de calor, que puede ubicarse en la parte inferior del alambique bajo el agua o formar parte de una caldera que genere vapor de agua independiente del alambique y que se conecta a l a travs de caeras.

Figura 2.1 Principales componentes de equipo de extraccin mediante arrastre con vapor

Captulo 2 16

El material a utilizar en la construccin del equipo es clave para asegurar la calidad del producto. Debe ser inalterado por las esencias, de ah que el material recomendado sea acero inoxidable. Tambin puede usarse hierro con revestimiento de galvanizado. Pero en este caso, se recomienda que algunas partes como el cuello de cisne, conexiones al condensador, el condensador y el vaso separador sean de acero inoxidable. Con el fin de calcular el tamao del alambique, o reactor, debe considerarse que su capacidad de carga corresponde la quinta y la dcima parte de su volumen expresado en peso; por ejemplo, un alambique de 1000 litros tiene una capacidad de carga entre 100 a 200 kilos de hierba a extraer. El rango de variacin est dado por la humedad del producto. Si la hierba est seca entran menos kilos que si est fresca, pero rinde ms cantidad de esencia en cada proceso de destilacin. El tiempo de destilacin vara de acuerdo al material. Generalmente los frutos secos y semillas, como el cilantro, ans, comino, tardan ms horas que las hierbas. El proceso de estas ltimas pueden demorar entre 1 y 2 horas. Al destilar, primero se extraen los componentes ms livianos y al final los ms pesados. Por eso el tiempo de destilacin est directamente relacionado con la calidad deseada y al costo de destilacin. Como el combustible a usar incide fuertemente en el costo de destilacin, debe calcularse cul es el tiempo adecuado para cada material y cada equipo. A continuacin se presenta el caso de una destilacin de laurel, o laurel de condimento (Laurus nobilis) aplicando el mtodo de destilacin con agua y vapor.
Tabla 2.4 Rendimiento de aceite esencial de Laurus nobilis a diferentes tiempos de destilacin

Tiempo A los 15 minutos A los 30 minutos A los 45 minutos A los 60 minutos

Rendimiento 26% v/peso seco 48% v/peso seco 63% v/peso seco 76% v/peso seco

Tiempo A los 75 minutos A los 90 minutos A los 105 minutos A los 120 minutos

Rendimiento 83% v/peso seco 90% v/peso seco 96% v/peso seco 100% v/peso seco
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Rendimiento: 0,82 % v/peso seco

Muchos aceites esenciales se utilizan para aprovechar sus propiedades antimicrobianas y otras actividades biolgicas, como anti-alimentarios de insectos, repelentes, atrayentes, txicos, etc. En el estudio de las interacciones qumicas que se producen entre seres vivos y entre seres vivos y el medio, los aceites y sus componentes juegan un rol muy importante. Interacciones qumicas Planta Planta Planta Medio Planta Animal Animal Animal Animal Medio Como ejemplo de interacciones qumicas entre planta-planta podemos mencionar la alelopata, fenmeno en que algunas especies segregan sustancias que inhiben el desarrollo de otras. Estas sustancias pueden ser de naturaleza fenlica, terpenoide, etc. Un ejemplo es el cineol, componente que est presente en varios aceites esenciales, que inhibe la germinacin de algunas semillas. Las interacciones qumicas planta-medio corresponden a varias sustancias que se sintetizan en las plantas para adaptarse a las heladas, stress hdrico, altas temperaturas, condiciones extremas de alta temperatura, etc. Ejemplos de interacciones planta animal son sustancias que son responsables de acciones de defensa de la planta frente al ataque de microorganismos, insectos o animales superiores. Todos aquellos compuestos qumicos que se relacionan con todas esas interacciones se denominan semi-qumicos y pertenecen a diversos grupos qumicos. A continuacin se presentan metabolitos responsables como semi-qumicos: Alcaloides Saponinas Taninos Flavonoides Glicsidos Enzimas Terpenoides: Monoterpenos y sesquiterpenos

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Los monoterpenos y sesquiterpenos son componentes principales de los aceites esenciales y en cuanto a su funcin biolgica en la literatura se sealan dos hiptesis: a. Que son productos de desecho del metabolismo celular. b. Que cumplen un rol importante en esas interacciones qumicas. Ejemplos de componentes de aceites esenciales utilizados por alguna actividad biolgica de inters para el hombre se presentan en la siguiente tabla.
Tabla 2.5 Aceites esenciales utilizados por alguna actividad biolgica de inters para el hombre
Aceites esenciales alcanfor y 1,8-cineol geraniol, mentol, -terpineol Aceites de citronela, lemongrass albahaca Aceites de Nepeta cataria, malva rosa Pelargonium graveolens ), ciprs Cupressus sp.) Aceite de chinchilla (Tagetes minuta Actividad anti -nutriente o antifeeding o repelente gustatorio Como atrayentes de insectos Actividad biolgica de inters para el hombre Alelopticos Alelopticos Repelente de mosquitos, moscas Repelente de varios insectos

Repelente de larvas de mosquitos Cariofileno, xido de cariofileno, alcanfor -terpineol (en citrus) y pulegona (en M pulegium) como atractivo de mosca domstica

Compuestos involucrados en esas actividades: citronelal, eugenol, metil chavicol, limoneno, citral, etc. En muchos ensayos in vitro e in vivo se ha descubierto un marcado sinergismo entre los aceites esenciales empleados, o sea, una mayor actividad cuando se emplean juntos 2 o ms aceites comparado con la accin de los aceites aplicados individualmente. Albahaca y eucalipto para larvas de mosquitos: dosis 6 veces menores que los aceites aplicados individualmente. Lemongrass y tomillo para Paenibacillus larvae (bacteria causante de la loque americana de las abejas melferas): mitad de dosis que los aceites aplicados individualmente.

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Ejemplos de algunas actividades de aceites esenciales probados en la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales de la UN La Plata, Argentina: 1.- Aceite esencial de laurel (Laurus nobilis) sobre el pulgn Myzus persicae en repollo: Pulverizacin de las plantas con soluciones al 3% caus un 63% de mortalidad. Aplicaciones de papeles impregnados con aceite al 3% caus un 23% mortalidad. (Padn et al., 2006a). 2.- Cineol solo, con la tcnica de papeles impregnados se obtuvo un 46% de mortalidad sobre el mismo insecto. (Padn et al., 2006 b). 3.- Aceite esencial de laurel (Laurus nobilis) sobre el pulgn Brevicoryne brassicae en repollo: Pulverizacin y papeles al 3% caus un 52% de mortalidad. Cineol: 27% de mortalidad (Kahan A., 2007). 4.- Aceite esencial de lemongrass (Cymbopogon citratus): Sobre Sipha maydis (hemptero). Pulverizacin al 4%: repelencia a las 6 horas (Kahan, A., 2003). Sobre Brevicoryne brassicae. Papeles al 3%: 63% mortalidad a las 24 horas. Sobre Myzus persicae. Papeles al 3%: 61% mortalidad a las 24 horas. (Ringuelet, J., 2005a). Sobre Schizaphis graminum. Papeles al 4%: 70% de repelencia. Sobre Diuraphis noxia en trigo. Papeles al 4%: 90% de repelencia (Padn, S., 2002). 5.- Mezcla de lemongrass, laurel y cineol sobre fidos. Brevicoryne brassicae en repollo. Myzus persicae en lechuga. Cavariella aegopodii Scop en pimiento. Schizaphis graminum en apio. Diuraphis noxia en trigo. Repelencia entre 40 y 98% mediante papeles y pulverizacin. (Cerimele, E., 2005). 6.- Sobre gorgojos en granos almacenados: Aceite esencial de falso alcanfor (Cinamomum glandulfera), atractivo de Sitophilus oryzae a 22 l/l de aire.

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Aceite esencial de romero (Rosmarinus officinalis), txico para Tribolium castaneum a 60 l/l de aire. (Padin, S., 2000). 7.- Aceite esencial de salvia orada, o juanilama, (Lippia alba) sobre Tribolium castaneum: Caus un 100% de mortalidad a las 24 horas, con pulverizacin directa sobre los granos a una concentracin de 526 l/l de aire. (Ringuelet, J., 2005 b) 8.- Ensayos sobre la bacteria Paenibacillus larvae Subsp larvae, se obtuvieron alentadores resultados para el control in vitro con las siguientes concentraciones: Lemongrass: 50 100 mg/l Tomillo: 100 150 mg/l Ajedrea y organo: 250 450 mg/l Falso alcanfor y laurel: 700 mg/l Albahaca: 350 450 mg/l Chinchilla: 500 650 mg/l Cilantro: 600 700 mg/l 9.- Ensayos sobre Paenibacillus larvae subsp larvae con mezclas: Lemongrass 25 mg/l + tomillo 100 mg/l (20%+80%). Lemongrass 25 + tomillo 50 mg/l + ajedrea 100 mg/l + organo 125 mg/l + albahaca 175 mg/l (5%+11%+21%+26%+37%). Lemongrass 50 mg/l + tomillo 100 mg/l + albahaca 350 mg/l (10%+20%+70%) (Albo, G., 2003) (Alippi, A., 2001). 10.- Ensayos sobre Ascosphaera apis, hongo causante de cra yesificada en abejas melferas: La Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) obtenida en pruebas in vitro: Lemongrass 250 ppm. Tomillo, menta inglesa, organo altas CMI. Laurel, coriandro, falso alcanfor bajas CMI (Larrn, S., 2001).
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Bibliografa
Albo, G., C. Henning, J. Ringuelet, F. Reynaldi, M. De Giusti y A. Alippi. 2003. Evaluation of some essential oils for the control and prevention of American Foulbrood disease in honey bees. Apidologie 34: 417-427. Alippi, A., J. Ringuelet, C. Henning y A. Bandoni. 2001. Actividad antimicrobiana in vitro de algunos aceites esenciales y mezclas de esencias sobre Paenibacillus larvae subsp. larvae. Vida Apcola. Barcelona, Espaa. 106: 41-44. Cerimele, E., J. Ringuelet, M.S. Henning, C. Ricci, A. Kahan, S. Padn y P. Sceglio. 2005 Aceites esenciales para el control de fidos. Bienal de Ciencia y Tecnologa. CIC. La Plata. Kahan A, S. Padn, M. Ricci, J. Ringuelet, E. Cerimele, M. Henning y C. Basso, 2007. Biocontrol de Brevicoryne brassicae L. con aleloqumicos en repollo. XXX Congreso Argentino de Horticultura. La Plata, 24-29 de septiembre de 2007.Libro de Resmenes: 32. Kahan, A., M. Ricci, S. Padn, J. Ringuelet, P. Catalano y P. Sceglio. 2003. Actividad biolgica del aceite esencial de Cymbopogon citratus (STAPF.) sobre Sipha maydis (PASS.)(Hemiptera: Aphididae). XXV Congreso Nacional de Entomologa. Talca, Chile. 26/28 de noviembre 2003. Resmenes: 46. Larrn, S., J. Ringuelet, M. Carranza, C. Henning, E. Cerimele y M. I. Urrutia. 2001. In vitro fungistatic effect of essential oils against Ascosphaera apis. Journal of Essential Oil Research, 13: 122-124. Padin, S., J. Ringuelet, G. Dal Bello, E. Cerimele y C. Henning, 2000. Effect of essential oils on mortality and repellence of stored-grain insects. Journal of Herbs, Spices y Medicinal Plants, Vol 7 (4): 67-73. Padn, S. B., E. Ricci, J. Ringuelet y A. Kahan, 2002. Actividad repelente de Cymbopogon citratus STAPF. Lemongrass sobre Schizaphis graminum Rond. y Diuraphis noxia Mordv. (Homoptera: Aphididae) en trigo. XI Jornadas Fitosanitarias Argentinas, junio de 2002, Ro Cuarto, Crdoba. Resmenes: 141. Padn, S., A. Kahan, M. Ricci, J. Ringuelet, C. Henning, P. Catalano y P. Sceglio. 2006a. Actividad biolgica del aceite esencial de Laurus nobilis L. sobre Myzus persicae Sulz. (Hemptera: Aphididae) en repollo. XII Jornadas Fitosanitarias Argentinas. Catamarca, 28-30 de junio 2006. Resmenes: 413.

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Padn, S., M. Ricci, C. Henning, E. Cerimele, J. Ringuelet, M. Catalano y M. Basso. 2006b Myzus persicae (Sulz.): bioactividad de productos naturales. ExpoUniversidad 2006. UNLP. La Plata, 28 agosto a 8 septiembre de 2006. Ringuelet, J., C. Henning, A. Kahan, M. Ricci, S. Padn y P. Catalano. 2005a. Actividad txica del aceite esencial de lemongrass Cymbopogon citratus Stapf. Sobre Brevicoryne brassicae L. y Myzus persicae Sulz. en plantas de repollo. V Reunin de la Sociedad Latinoamericana de Fitoqumica. 28 nov.2 dic. 2005. Montevideo, Uruguay. Libro de Resmenes: 51.

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Captulo 3 Saprolegniosis en la salmonicultura Antecedentes generales

Antiguamente la saprolegniosis se inclua entre los hongos debido a sus caractersticas morfolgicas, ya que estos organismos producen hifas cenocticas y micelio. Seymour (1970) realiz la descripcin del gnero Saprolegnia y en su trabajo delimita las especies segn criterios morfolgicos, inducidos por el uso de semillas de camo (Cannabis sativa) como sustrato en un medio de agua destilada estril. La mayora de las cepas obtenidas desde peces de cultivo, no producen estructuras sexuales de identificacin. A estas cepas, Coker en 1923 las llam Saprolegnia parastica, denominacin que se mantiene actualmente (Hatai et al., 1990; Hughes, 1994). Mortada et al, 2001, realizaron una identificacin de especies de Saprolegnia en base a la formacin de oogonias y determinaron que S. parastica no presenta formacin de oogonias entre los 5 C y 20 C, a diferencia de S. australis y S. salmonis. (Tabla 3.1 y Fig. 3.1). No obstante, un nmero pequeo de Saprolegnia parastica produce estructuras sexuales de identificacin, despus de prolongadas incubaciones y bajo ciertas condiciones de temperatura y nutricin. Para las cepas que no presentan sexualidad, se han adaptado tcnicas moleculares como DNA fingerprinting o identificacin por anticuerpos monoclonales contra esta especie (Whisler, 1996; Bullis y col., 1996; Bangyeekhun y col., 2001).

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Tabla 3.1 Caractersticas morfolgicas y biolgicas de Saprolegnia spp. aislado en salmn y ovas de salmn con saprolegniosis en Hokkaido (Japn)
Grupo A NJM9852 Formacin Oogonial 5C 15 20 Forma Oogonial Oosporas Ramas Anteridiales Germinacin zoosporas Formacin 5C 15 20 Identificacin Grupo B NJM9858 Grupo C NJM9868 Grupo D NJM9873

+ +++ +++ esfrica subcntrica diclino directa

++ -b esfrica, pyriforme o elongada cntrica o subcntrica diclino directa o indirecta

NOC NO NO indirecta

NO NO NO indirecta

++ +++ ++ S. australis

S. salmonis

+++ +++ ++ S. parastica

S. parastica

Formacin leve: +; buena formacin ++; excelente formacin: +++ b Indica que no hay formacin. c No observado. Fuente: Mortada et al 2001

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Figura 3.1 Ciclo de vida de Saprolegnia sp. (Raven et al 1999)

Saprolegnia parastica ha sido reconocida como la principal especie patgena de organismos relacionados con hongos en peces, actuando principalmente como patgeno secundario. Otras especies de Saprolegnia, mencionadas ocasionalmente son Saprolegnia ferax, Saprolegnia diclina, entre otras (Smith y col., 1985, Bruno y Wood, 1999). Saprolegnia no sobrevive en ambientes con alta concentracin de sal, por lo tanto, la saprolegniosis no ocurre durante la fase marina ni estuarina considerndose una enfermedad de agua dulce (Padgett, 1984). Sin embargo, Langvad en 1994, report que Saprolegnia parastica podra sobrevivir y crecer en ambientes con una salinidad relativa de aproximadamente 1.75% de NaCl. No se observ desarrollo en concentraciones iguales o superiores a 3.5% de NaCl. Las enfermedades micticas producen grandes prdidas econmicas en la acuicultura. En Japn, la mortalidad anual ha llegado a sobrepasar el 50% en salmn coho, debido a Saprolegnia parastica (Bruno y Wood, 1999). En Chile, Intesal 2003, report que las prdidas pueden alcanzar un 10% de la produccin. En pisciculturas de la Quinta Regin de Chile, la mortalidad de las ovas fluctan entre un 15% y un 25%. (Vivar y Bernal, 1998). La infeccin por Saprolegnia es fcilmente controlada mediante la aplicacin de verde malaquita, un colorante que puede aplicarse slo o en combinacin con otros fungicidas. Sin embargo, este compuesto qumico ha sido prohibido en gran parte de los pases productores, ya que se le han atribuido propiedades teratognicas, volviendo Saprolegnia a ser un problema de importancia econmica en las pisciculturas (Alderman, 1994). Por esta razn, en la actualidad se estn desarrollando investigaciones cuya finalidad es definir nuevos productos que puedan ser eficientemente utilizados en la prevencin y control de la saprolegniosis. El presente trabajo proporciona antecedentes generales de Saprolegnia parastica, relativos a su taxonoma, signos clnicos, patogenicidad y mecanismos de infeccin. Como tambin compuestos utilizados para su control y resultados parciales de una investigacin realizada por el Laboratorio de Cultivo de Peces y Alimentacin para la Acuicultura LABCPAC, de la PUCV y financiado por FIA, que contempla definir en placas de cultivo la concentracin de aceite esencial de tomillo con efecto preventivo y/o curativo para distintas cepas de Saprolegnia.

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Taxonoma y caractersticas generales

De acuerdo a lo expresado por Zaror et al, 2004, la clasificacin que normalmente se aplica al agente causal de la saprolegniosis, el gnero Saprolegnia y los dems Oomycetes (Achlya, Pythium, Aphanomyces) no pertenece al reino Fungi, clasificndose actualmente en el reino Chromista (tambin llamado Stramenopila), filogenticamente ms cerca de las algas y del reino vegetal que de los hongos y los animales (Alexopoulos y col., 1996; Guarro y col., 1999). Sin embargo, Bruno y Wood (1999) entrega la siguiente clasificacin taxonmica para Saprolegnia:

Tabla 3.2 Taxonoma de la especie

Reino Divisin Phylum Clase Orden Familia Gnero Especie

Protoctista Oomycota Heterokonta Oomycotea Saprolegniales Saprolegniaceae Saprolegnia diclina Humphrey-parasitica Coker complex

El gnero al cual pertenece la Saprolegnia es el Oomycotea, es decir, hongos de agua. A la fecha se han clasificado las siguientes especies de Saprolegnia: Saprolegnia kauffmania Saprolegnia shikotsuensis Saprolegnia australis Saprolegnia monoica Saprolegnia mixta Saprolegnia feray Saprolegnia thureti Saprolegnia parasitica (= diclina) Siendo esta ltima especie la que afecta principalmente a los cultivos de salmnidos.

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Caractersticas de Saprolegnia parastica

Saprolegnia se encuentra en todos los sistemas de agua dulce. Estos hongos acuticos son saprfagos, normalmente proliferan y se alimentan de materia orgnica muerta, como deshechos de peces, alimento no ingerido, heces. Tambin resultan ser oportunistas, invadiendo peces daados y/o estresado. Toda infeccin producida por hongos se le denomina micosis. El aspecto de estos hongos acuticos es el de una maraa de filamentos individuales llamados hifas. A medida que sta crece y se vuelve ms compacta, recibe el nombre de micelo, el cual puede ser visto fcilmente sin microscopio. Los hongos se reproducen liberando esporas al medio, las que son altamente resistentes a la sequedad y productos qumicos. Esto hace que las esporas y hongos de Saprolegnia parastica sean tan comunes en los estanques de cultivo.

Figura 3.2 Peces afectados severamente con Saprolegnia

La saprolegniosis es principalmente una infeccin secundaria, la cual invade al pez luego que ste ha sido previamente atacado por parsitos, virus u otro microorganismo que ha daado su tegumento epitelial o cuando un factor externo ha disminuido su capacidad inmune. Se cree que el mucus de los peces contiene fungicidas efectivos que previenen el crecimiento de hongos bajo circunstancias normales. Otros factores que predisponen a esta enfermedad son: Contaminacin del agua Altas densidades de cultivo Manejo inadecuado de peces Malas prcticas productivas de manejo sanitario y de limpieza Etapa de desarrollo del pez
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La saprolegniosis tambin afecta a los huevos, de los cuales, los primeros en ser atacados son los huevos infrtiles. Sin un tratamiento, el hongo se difunde rpidamente a los huevos sanos. Esta invasin probablemente se deba a una quimiotaxis positiva en donde los huevos sanos emiten una seal qumica que atrae a los hongos. (Lawrence, 2000). Las etapas de mayor incidencia de ataques de hongos son las de incubacin y esmoltificacin. Los huevos son extremadamente frgiles las primeras 175 unidades trmica, por lo cual no pueden manipularse hasta que stos hayan alcanzado la etapa de huevos con ojos. Por este motivo, durante ese lapso de tiempo no se puede extraer ningn huevo muerto. De ah entonces la importancia de tratar los huevos con algn fungicida que evite la proliferacin del hongo. Para la etapa de incubacin se ha estimado una prevalencia de un 50% de moderada a alta y un 50% leve, a su vez en la etapa de esmoltificacin se estima un 85% de moderada y un 13% ausente. (Intesal, 2003).

Signos clnicos
Los hongos en los peces aparecen como unas manchas algodonosas de color grisceo. A medida que crecen y atrapan sedimentos y algas en suspensin el color cambia a caf-verdoso. La Saprolegnia se establece como un pequeo foco infeccioso que luego se difunde rpidamente a los tejidos sanos. La mayora de la infeccin es superficial, sin embargo el peligro se desencadena debido a la rapidez con que el hongo infecta otras zonas en especial cuando ataca el epitelio de las branquias lo que puede resultar fatal si no se trata a tiempo a los peces. La recuperacin es directamente proporcional a la rapidez del diagnstico y del tratamiento.

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Figura 3.3 Huevos invadidos por Saprolegnia, se pueden observar las hifas

Figura 3.4 Hifas de Saprolegnia

Figura 3.5 Peces con presencia de Saprolegnia.

Patogenicidad
La patogenicidad de la enfermedad puede diferir dependiendo de la cepa, el tipo aislado y de la poblacin. (Whisler, 1996.) En estudios realizados en la prefectura de Miyagi Japn en salmn coho, la enfermedad atac a peces inmaduros de 20 a 60 gramos. Se encontr que Saprolegnia parastica tiene una mayor patogenicidad que las otras especies de Saprolegnia, probablemente debido a la longitud de los flagelos de las zoosporas secundarias. (Figura 3.6) Las zoosporas primarias de Saprolegnia sp. se forman en el esporangio, en la seccin final de las hifas. Estas zoosporas generalmente, luego de un periodo corto se encistan, para dar origen a una zoospora secundaria la cual es liberada desde el cisto primario, sta es de vida ms larga y la de mayor capacidad de infestacin. Cuando estas zoosporas se encistan, eliminan sus flagelos y forman una pared celular de glicoprotenas. Las esporas se adhieren al sustrato (Ej.: piel) gracias a un material adhesivo que es secretado desde unas vesculas ubicadas en la parte ventral de las zoosporas. (Figura. 3.6)

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Figura 3.6 Esquema de zoospora secundaria

Mecanismos de infeccin
Qu adaptaciones son las que hacen que un parsito sea daino para un husped y para otro no lo sea, incluso en huspedes estrechamente relacionados? En algunos casos, se han encontrado mecanismos nicos para un tipo de sistema husped-parsito, se estima que pueden estar asociados a un cierto gen. Tambin podran estar relacionados a la presencia o ausencia de algn producto gentico, que sea reconocido por los receptores del husped (Dangl y Holub, 1997), o bien, por la produccin de una toxina potente o por el producto de algn gen que inactive los mecanismos de defensa del husped. La interaccin podra ser un balance de acciones ofensivas y defensivas, de tal forma que el hongo produzca un mix que degrade enzimas, toxinas etc. Las adaptaciones al parasitismo podran tambin obedecer a cuestiones ms generales relacionadas con las distintas circunstancias ambientales que vinculan al husped y al parsito. Para que una infeccin se establezca en el husped, se requiere que ocurran uno o varios de estos pasos: Primero el patgeno debe encontrar y adherirse a un husped mediante un proceso pasivo, en el que las zoosporas pueden ser atradas quimiotcticamente hacia fuentes potenciales de nutrientes. Algunos atractantes han sido caracterizados qumicamente como aminocidos, flavonoides, aldehdos y cidos grasos. (Anderson, 2001). Estos elementos podran ayudar a encontrar alguna herida, ya que la penetracin es ms exitosas en articulaciones y heridas de la piel. El segundo paso es la adhesin, para lo cual la zoospora secreta glicoprotenas que le sirven como material adhesivo (Deacon y Donalson, 1993). El tercer paso es la germinacin, lo cual significa el crecimiento de hifas o estructuras de penetracin de las esporas. Si por alguna razn no es posible que la germinacin ocurra luego de producirse el encistamiento, las zoosporas tienen la facultad de reproducirse en cantidades repetidas. Para que la infeccin se produzca, las zoosporas germinadas deben penetrar las barreras del husped. Esto se logra por fuerzas mecnicas, la accin de enzimas lticas o por la combinacin de ambos procesos.
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Situacin actual
En Chile, el Ministerio Nacional de Salud public el 12 de enero de 2004 una resolucin que seala que a partir de esa fecha, el Lmite Mximo de Residuos (LMR) para verde malaquita y leucomalaquita en carne de peces ser cero. Sin embargo, establece que para verde leucomalaquita habr un plazo de seis meses en que el LMR ser de 0.5 ug/Kg. En el Diario Oficial Chileno el 19 de enero de 2004 se public la resolucin N 1925 de 2003 del Servicio Nacional de Pesca, mediante la cual se aprueba el Programa Sanitario General de Control de Residuos (PSGRES). Este programa lleva un anexo denominado Verde Malaquita y Leuco Verde Malaquita el cual recalca que el verde malaquita no est autorizado para ser usado en la acuicultura y determina el tipo de muestreo y anlisis a realizar, en qu etapas de desarrollo del pez y en plantas de proceso. Adems, especifica que en peces nacidos de desoves previos a junio de 2003 se aceptar una concentracin residual, para LVM, de 5 ppm como mximo durante el periodo de gradualidad comprendido entre el 1 de junio de 2003 y el 30 de enero de 2005 y para los peces nacidos a partir de desoves ocurridos con posterioridad al 1 de junio de 2003 no se aceptar ningn nivel de LVM, con independencia de la mortalidad de muestreo que se utilice.

Tipos de tratamiento y control de la Saprolegniosis en la industria

Formalina: La formalina como solucin al 37% de formaldehdo (Van Waters y Rogers, 1988), es una alternativa relativamente eficaz en el tratamiento de la Saprolegniosis (Mitchell y Collins, 1977). Es uno de los pocos fungicidas acuticos registrados para ser utilizado en acuicultura y su uso como sustituto del verde malaquita ha ido en aumento. Se han realizado varias experiencias utilizando este qumico, principalmente en ovas de salmn, catfish y carpa, concluyendo que la formalina a 250 y 400 ppm por 60 minutos, da mejores resultados en comparacin a otros qumicos, en los porcentajes de eclosin, y que en todas ellas, la formalina es efectiva en prevenir y atacar la proliferacin de hongos y bacterias en ovas de distintas especies.

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Sal (sal de mar): Estudios indican que la sal es un tratamiento efectivo para eliminar la infestacin de hongos (Taylor y Col., 1979 y Edgell y Col., 1993), como tambin es un elemento de bajo costo y de fcil disponibilidad. A pesar de lo anterior, existen desventajas en el uso de la sal, principalmente por el volumen requerido de este insumo y la imposibilidad de su dilucin en el agua debido a que tiende a decantar en los estanques cuando se realiza el tratamiento en alevines y reproductores que requieren una dosis al 1%. En ovas se utilizan dosis de 5, 25, 30 ppm y 1000 ppm, con flujos cerrados en sistemas artificiales, dependiendo de cada especie en condiciones de hatchery. Willoughby (1994) concluy que la sal en altas concentraciones (25 y 30 ppm por 60 minutos) es letal para la Saprolegniosis y efectiva para controlar la Saprolegnia parastica, adems no presenta daos al ambiente ni a las personas. (Espeland y Hansen, 2004). Perxido de hidrgeno: Este elemento fue aceptado por la FDA en 1994 como un profilctico efectivo para ser utilizado en ovas de peces. Es un promisorio qumico para el tratamiento de Saprolegnia sp. (Marking y Col., 1994; Fitzpatrick y Col., 1995), con un mnimo impacto medioambiental (Bruno y Col., 1994; Mitchell y Col., 1997). Se han realizado varias investigaciones para evaluar el perxido de hidrogeno en especies salmondeas, como en truchas arco iris (Marking y col., 1994; Schreier y col., 1996; Kitancharoen y col., 1998) y salmn chinook (Waterstrat y Col., 1995). Al aplicar los tratamientos, de la misma manera como se hace con la formalina, se encontr que a 500 y 1000 ppm es efectiva para controlar los agentes patgenos y mejorar los porcentajes de eclosin. (Espeland y Hansen, 2004). Yodo: En la industria salmonera en Chile, uno de los qumicos ms utilizados para realizar la profilaxis es el yodo, debido a que es un desinfectante especialmente formulado para la desinfeccin de huevos (Quezada, 1997). Dentro de las aplicaciones del yodo, en salmones (salmn salar, salmn coho y trucha arco iris) la concentracin usada es de 100 ppm por 60 minutos en condiciones de hatchery, aplicndose a intervalos de das, en bateas horizontales con flujo cerrado, hasta antes de la eclosin.

Captulo 3 33

Pyceze: Este nuevo producto ha sido aprobado por Gran Bretaa y actualmente se utiliza en cultivos en Noruega, Suecia, Finlandia e Islas Faroe. Tambin podra ser utilizado en Amrica, incluyendo Chile. Pyceze es un lquido que contiene 50% p/v de bronopol BP (2-bromo-nitropropano 1,3 diol). El qumico, tiene un perfil seguro y la dosis estndar a suministrar es 1 ml de Pyceze por 10 litros de agua de incubacin (equivalente a 50 mg bronopol/L) durante 30 minutos. El mtodo de aplicacin va a depender de las condiciones de cultivo y el sistema de incubacin del hatchery. (Espeland y Hansen, 2004). Myco Killer: Es un antifngico elaborado para el control de Saprolegnia en ovas, smolts y reproductores salmnidos. Es un lquido cuya frmula es C3H6BrNO4 + CH2O. Forma de uso en ovas: Utilizar Myco Killer 25%, 50 mg/lt, que corresponde a 1 ml por cada 5 litros de agua. Este bao se realiza con flujo detenido por 30 minutos y se repite diariamente desde el da uno de siembra de las ovas hasta que las ovas posean ojos bien pigmentados. Smolts y reproductores: Usar Myco Killer en dosis de 15 mg/lt, (1 ml por 17 litros de agua) en bao a flujo detenido por 10 minutos durante 10 das consecutivos. Es adecuado suministrar oxigeno mientras dura el bao. Repetir en caso necesario, previo a un descanso de 4 das entre cada tratamiento. Presentacin: Balde de 20 litros. Su uso no est prohibido, sin embargo, an no cuenta con autorizacin del SAG. Saprofin: Es un producto orgnico (certificado) a base de una mezcla de aceites esenciales, 100% natural. Se utiliza en dosis de 30 ml/m3 por una hora, se ha probado una efectividad de 20 das en comparacin a los 13 das de efectividad que presentan la formalina y Pyceze (fuente: http://saprofin.tripod.cl). Aceite esencial de timol: El aceite esencial de tomillo se obtiene por destilacin de follaje en estado de floracin. El mtodo por arrastre de vapor es el mtodo ms eficiente de extraccin, con mayor rendimiento de aceite esencial y menor alteracin de los compuestos por hidrlisis (Garca, 1953). Una vez extrada la esencia se determina el rendimiento del proceso en % (kilos sobre el peso inicial de la materia prima), se analiza la composicin qumica y se miden los siguientes parmetros fsicos: densidad, solubilidad en alcohol, punto de fusin y de ebullicin, punto de congelacin, poder rotatorio, ndice de refraccin. En general, la cantidad de esencia contenida en la planta puede variar entre un 0,01% y un 10% sobre peso fresco o seco dependiendo de la especie. En los prrafos siguientes se presentan los resultados preliminares de una investigacin in vitro, en la cual se evala el timol como posible agente antifngico de la saprolegniosis plantendose como objetivo definir en placas de cultivo la concentracin de aceite esencial de tomillo con efecto preventivo y/o curativo para distintas cepas de Saprolegnia.

Captulo 3 34

Bibliografa
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Captulo 3 37

Captulo 4 El Tomillo (Thymus vulgaris) en el manejo de la saprolegniosis

En este captulo se presentan las actividades y resultados ms relevantes del proyecto FIA-PI-C-2004-1-D-089 Aplicacin del tomillo (Thymus vulgaris) en el manejo de enfermedades de la salmonicultura, indicando proveedores, composicin de los aceites utilizados, el efecto del aceite de tomillo en baos como tratamiento de la saprolegniosis en ovas de trucha y salmn. Los agentes proveedores y/o productores a nivel mundial son variados (Anexo 1). La comercializacin a nivel nacional no est muy definida, sin embargo se orienta principalmente a la aromaterapia y la mayora de las principales entidades comercializadoras ofrecen un producto importado. (Anexo 2). Tanto la composicin qumica del aceite de tomillo como el rendimiento son muy variables y dependen directamente de algunos factores como la poca del ao, el estado de floracin, el desarrollo de la planta, la humedad ambiental, la metodologa de extraccin, entre otros. Si bien es cierto, se busca una estabilizacin y estandarizacin de los aceites esenciales de tomillo, en anlisis realizados en diversos productos comerciales se observa una gran diferencia en el contenido de los aceites esenciales. No obstante se mantienen el p-cimeno y el timol como los aceites en mayor porcentaje. (Tabla 4.1).

Captulo 4 38

Tabla 4.1 Perfil de aceites esenciales de tomillo segn distintos productos comerciales
Principales compuestos identificado A. de tomillo blanco de la India (g/100g de muestra) 1,3 0,3 2,3 15,2 2,3 1,5 19,0 0,7 A. de Tomillo Marca Flavex Extrac. CO2 (g/100g de muestra) 0,4 0 0,5 27,3 1,9 0,7 33,2 1,8 A. de Tomillo blanco de la CEE (g/100g de muestra) 1,4 0,2 0,5 21,4 7,1 0,8 49,5 6,1 A .de Tomillo blanco de Luxcamp (g/100g de muestra) 1,0 0,2 1,0 27,4 3,2 1,5 48,6 2,1

- pineno - pineno Eucaliptol p-Cimeno Linalol Borneol Timol Carvacrol

Efecto curativo y preventivo de distintas concentraciones de aceite esencial de tomillo para distintas cepas de Saprolegnia
Para el desarrollo del proyecto se obtuvieron seis muestras de agua provenientes de: Piscicultura Ro Blanco (Saladillo, V Regin) Piscicultura Entre Ros (Talagante, Regin Metropolitana) Lago Natri (Chilo, X Regin) Lago Tarahuin (Chilo, X Regin) Lago Llanquihue (Puerto Varas, X Regin) Piscicultura CETECSAL (Chilo, X Regin) De cada una se cultivaron 4 cepas que se mantuvieron en un medio GYA, de agar, glucosa y extracto de levadura. En estas cepas, se evaluaron concentraciones entre 50 a 500 ppm de aceite de tomillo ms una cepa control (0 ppm de aceite de tomillo) en tratamiento preventivo, obteniendo los siguientes resultados: No todas las cepas reaccionan de la misma manera. (Tabla 4.2) Se observ que en la mayora de las cepas que hubo inhibicin del crecimiento a partir de los 150 ppm de aceite de tomillo. (Figura 4.1 y 4.2). Que el efecto inhibitorio es directamente proporcional al tiempo de exposicin. (Tabla 4.2) (Perrucci y Cecchini, 2006).
Captulo 4 39

a)

b) (b) Placa control con crecimiento de micelio.

abundante.

Tambin se realizaron pruebas para determinar la actividad antifngica curativa del aceite de tomillo en las cepas cultivadas obteniendo los siguientes resultados. A las 72 horas de cultivo, todas las muestras estudiadas presentaron crecimiento abundante, no observndose inhibicin del crecimiento fngico. Al no observarse inhibicin del crecimiento se procedi a realizar las siguientes pruebas: a) Trozos de 4 mm de dimetro de agar GY, con hifas en crecimiento activo, se inocularon al centro de placas, de 10 cm de dimetro, con 20 ml de agar GY y se mantuvieron por 24 horas a 20 C. Posteriormente, se insertaron en forma equidistante 3 cilindros de vidrio en los cuales se adicion 0,1 ml de solucin de aceite de tomillo a concentraciones de 50, 100 y 150 ppm; 200, 250 y 300 ppm; 350, 400 y 450 ppm. b) Trozos de agar con hifas de Saprolegnia sp. en crecimiento activo, se dejaron por distintos tiempos (30, 60, 90 y 120 minutos) en concentraciones crecientes de aceite esencial (0-500 ppm) y posteriormente se lavaron en agua destilada estril, se inocularon en placas con agar GY y se incubaron a 20 C por 72 horas. Para cada cepa y concentracin las pruebas se realizan en triplicado. Es posible observar que con el procedimiento (a) se obtuvo inhibicin del crecimiento a partir de los 200 ppm y con el procedimiento (b) se observ inhibicin del crecimiento en algunas de las colonias (Tabla 4.2) a partir de 100 ppm por 90 minutos. En concentraciones superiores no se observ crecimiento miceliar.

Captulo 4 40

Tabla 4.2 Crecimiento de las cepas a diferentes tiempos y concentraciones de aceite de tomillo

Cepa 1 100 ppm 30 min 60 min 90 min 120 min (+) = crecimiento (-) = inhibicin (+) (+) (-) (-) (+) (+) (+) 150 ppm (+) (+) (+) 200 ppm (+) (+) (-) 100 ppm (+) (+) (-)

Cepa 2 150 ppm (+) (-) (-) 200 ppm (+) (-) (-) 100 ppm (+) (+) (-)

Cepa 3 150 ppm (+) (+) (-) 200 ppm (+) (-) (-) 100 ppm (+) (+) (+)

Cepa 4 150 ppm (+) (-) (-) 200 ppm (+) (-) (-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(a)

(b)

Figura 4.2. (a) Colonia en crecimiento despus de aplicar aceite esencial de tomillo a diferentes concentraciones. (b) Inhibicin del crecimiento a partir de los 150 ppm de aceite esencial.

Captulo 4 41

Concentracin tolerable de aceite esencial de tomillo en ovas de trucha arco iris a nivel de laboratorio
En diversos ensayos realizados por el Laboratorio de Cultivo y Alimentacin de Peces de la Escuela de Ciencias del Mar LABCPAC de la Pontificia Universidad Catlica de Valparaso, se determinaron concentraciones tolerables de aceite de tomillo en ovas. Se probaron concentraciones entre 10 y 1000 ppm, las cuales se aplicaron en baos a distintos periodos de tiempos (Tabla 4.3 y 4.4). De acuerdo a los resultados obtenidos, se sugiere aplicar una concentracin de 400 ppm de aceite de tomillo por un mximo de 2 horas. Los resultados indicaron que a medida que aumenta la concentracin y el tiempo de aplicacin de los baos, aumenta la mortalidad de las ovas. La mxima concentracin y tiempo de aplicacin resultaron ser de 600 ppm y una hora de exposicin. (Tabla 4.4).
Tabla 4.3 Porcentaje de sobrevivencia y mortalidad de ovas de trucha sometidas a baos con aceite de tomillo a concentraciones entre 10 y 200 ppm a distintos tiempos

[ ] aceite de tomillo (ppm) 10 20 30 40 50 100 150 200 Control

15-30 min. % ovas vivas 100 100 100 100 100 100 100 80 100 % ovas muertas 0 0 0 0 0 0 0 20 0

45 -60 min . % ovas vivas 100 100 100 100 100 100 100 100 100 % ovas muertas 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3 horas % ovas vivas 100 100 100 100 100 90 100 90 100 % ovas muertas 0 0 0 0 0 10 0 10 0
Captulo 4 42

Tabla 4.4 Porcentaje de sobrevivencia y mortalidad de ovas de trucha sometidas a baos con aceite de tomillo a concentraciones entre 400 y 1000 ppm a distintos tiempos

60 min.
[ ] Aceite de tomillo (ppm) 400 600 800 1000 Control % ovas vivas 100 100 80 40 100 % ovas muertas 0 0 20 60 0

120 min.
% ovas vivas 90 40 0 0 100 % ovas muertas 10 60 10 10 0

180 min.
% ovas vivas 10 0 0 0 100 % ovas muertas 90 100 100 100 0

Concentraciones de aceite de tomillo para tratamientos saprolegniosis en ovas de trucha arco iris a nivel de laboratorio

preventivo

de

Una vez definidas las concentraciones tolerables para ovas, se evaluaron distintas concentraciones para el control de la Saprolegnia mediante tratamientos preventivos a nivel de laboratorio. Se probaron en ova verde de trucha arco iris, baos de aceite a concentraciones de 50 ppm de Bronopol y concentraciones de 0 a 400 ppm de aceite de tomillo (Tabla 4.5), resultando ms efectivo el bao con 100 ppm de aceite de tomillo, en trminos de sobrevivencia y porcentaje de ovas con y sin hongos. Un porcentaje mayor de ovas muertas con hongos significa que en el medio existen mejores condiciones de propagacin para la Saprolegnia, efecto que el tratamiento con 100 ppm de tomillo anulara. Por lo tanto, con estos resultados es posible indicar que baos con 100 ppm de aceite de tomillo resultaran ms efectivos que los otros tratamientos aplicados para la prevencin del crecimiento del hongo.
Tabla 4.5 Porcentaje de sobrevivencia y mortalidad en ovas verde de trucha arco iris expuestas a baos a distintas concentraciones de aceite de tomillo y Bronopol

[ ] de aceite de tomillo % Sobrevivencia % Mortalidad % C/Hongos % S/Hongos

Bronopol 0 ppm 50 ppm 96 4 64 36 90 10 68 32

100 ppm 95 5 55 45

200 ppm 48 52 35 65

300 ppm 8 92 57 43

400 ppm 0 100 12 88

Captulo 4 43

Validacin del aceite esencial de tomillo para su uso en ovas de salmn del Atlntico a nivel de laboratorio
Para validar el uso de aceite esencial de tomillo en ovas de salmn del Atlntico, se trabajo con concentraciones de 0, 200, 400 y 500 ppm por 30 minutos al da. Los resultados obtenidos indican que en los tratamientos de 400 y 500 ppm la mortalidad producida alcanza niveles sobre un 80% luego del primer bao, efecto similar al obtenido en ovas de trucha.

Tabla 4.6 Mortalidad producida en ovas verdes de salmn del Atlntico

Ppm

Total

Bao 1

Bao 2

Bao 3

Bao 4

Ac. Ovas tomillo 0 200 400 500 750 750 750 750

% % % % % vivas muertas vivas muertas vivas

% % % muertas vivas muertas

99,7 94,3 18,3 8,3

0,3 5,7 81,7 91,7

83,3 81,7 21,7 0

16,7 18,3 78,3 100

46,7 28,3 0 0

53,3 71,7 100 100

0 0 0 0

100 100 100 100

Para observar el efecto del aceite de tomillo sobre la propagacin del hongo, se continu realizando el tratamiento en las ovas muertas. En aquellos tratamientos con 400 y 500 ppm de aceite de tomillo, el hongo no prolifer pasados 15 das de la muerte de las ovas, al contrario de lo ocurrido en los tratamientos control y con 200 ppm de aceite esencial de tomillo Figura 4.3 y 4.4 (Smith et al. 1985).

Captulo 4 44

(a)

(b)

Figura 4.3. Efecto del aceite de tomillo en la proliferacin del hongo en ovas muertas de salmn del Atlntico sometidas a baos con (a) 0 ppm y (b) 200 ppm de aceite esencial de tomillo.

(a)

(b)

Figura 4.4. Efecto del aceite de tomillo en la proliferacin del hongo en ovas muertas de salmn del Atlntico sometidas a baos con (a) 400 ppm y (b) 500 ppm de aceite esencial de tomillo. Se aprecia una menor formacin de hongos.

Segn estos resultados se recomiendan baos no superiores a las 300 ppm de aceite de tomillo para prevenir la aparicin de hongos en ovas de salmn del Atlntico.

Captulo 4 45

Tratamiento curativo por baos en ova verde de trucha arco iris a escala piloto
El trmino curativo se emplea en ovas ya invadidas con Saprolegnia para diferenciar los tratamientos preventivos aplicados en ovas sin hongos. Las experiencias fueron realizadas en la Piscicultura de Ro Blanco, Los Andes. Se probaron baos con aceite de tomillo de 400 a 800 ppm, teniendo como control un tratamiento de 50 ppm de Bronopol. Los resultados de esta experiencia estn dados segn el porcentaje de ovas vivas, ovas muertas con hongo y sin hongo, as como el rea cubierta por el hongo luego de haber efectuado baos cada 48 hrs. durante 35 das, hasta obtener ovas con ojos. En el tratamiento con 400 ppm de aceite de tomillo (Tabla 4.7) se observ que al trmino de la experiencia haba un 33% de ovas vivas en las cunas. Aunque la cantidad de ovas vivas fue baja, el rea cubierta por el hongo tambin fue menor, comparado con las otras dos concentraciones de aceite de tomillo utilizadas. Este resultado sugiere que es posible utilizar aceite de tomillo a una concentracin de 400 ppm como tratamiento curativo en ovas verdes de trucha arco iris. En los baos a 600 ppm y 800 ppm de aceite de tomillo, muri la totalidad de las ovas, por lo cual se puede indicar que no es conveniente el uso de aceite de tomillo en concentraciones de 600 y 800 ppm en tratamiento de Saprolegnia sp., en ova verde de trucha arco iris. Comparativamente los baos con Bronopol mostraron mejores resultados que los baos de aceite de tomillo. Sin embargo, se hace crtico el tiempo de exposicin, ya que en las primeras semanas el micelio del hongo en el tratamiento control era significativamente mayor, el hongo creca a su mxima expresin, no as con cualquiera de los tratamientos con tomillo. Esto fue ms evidente en los primeros 15 das de tratamiento (Pottinger y Day 1999). Por lo tanto, es preciso indicar que para los baos con 400 ppm se deben definir estrategias de aplicacin en la periodicidad de los baos y tiempo del tratamiento. Para esto ltimo, es necesario verificar el tiempo en el cual se produce la reaparicin de la Saprolegnia en el agua de cultivo, una vez efectuado el tratamiento (Branson, 2002).

Captulo 4 46

Tabla 4.7 Porcentajes de sobrevivencia y mortalidad en ova verde de trucha arco iris con baos de aceite de tomillo a distintas concentraciones y 50 ppm de Bronopol
Aceite de Tomillo [ ] ppm 400 600 800 50 ppm Bronopol % O vas muertas c/ hongo s/ hongo 30 55 75 5 37 45 25 15 33 0 0 80 282 405 406 98 914 1441 1429 317 % Ovas vivas rea hongo (cm 2) N ovas /rea

Tratamiento curativo por baos en ova con ojo de trucha arco iris a escala piloto
Al igual que la experiencia anterior, los resultados estn dados segn el porcentaje de ovas vivas, muertas con hongo y sin hongo, as como el rea cubierta por el hongo al final de la experiencia. Como en la experiencia con ova verde se probaron concentraciones de 400, 600 y 800 ppm, siendo las dos ltimas nocivas para las ovas, en esta experiencia con ovas con ojo, se probaron concentraciones de 200, 400 y 500 ppm de tomillo. (Tabla 4.8).
Tabla 4.8 Porcentajes de sobrevivencia y mortalidad por tratamiento curativo en ova con ojo de trucha arco iris con baos a distintas concentraciones de aceite de tomillo y Bronopol
Aceite de Tomillo [ ] ppm 200 400 500 50 ppm Bronopol % Ovas muertas c/ hongo 12 36 43 22 s/hongo 8 0 48 25 % Ovas v ivas 80 64 8 53 rea hongo (cm2) 44 78 278 103 N ovas/rea 150 329 1043 296

En esta prueba se obtuvieron mejores resultados a una concentracin de 200 ppm de aceite de tomillo, ya que se registr al final de la experiencia un mayor porcentaje de ovas vivas (80%), una menor rea de propagacin y un menor nmero de ovas infectadas. Estos resultados indican que es posible la utilizacin de 200 ppm de aceite de tomillo en el tratamiento curativo de ovas con ojos infectadas por Saprolegnia sp, ya que la mortalidad es aceptable comparada con el tratamiento control y los dems tratamientos con tomillo. No se obtuvieron buenos resultados en baos a concentraciones de 400 y 500 ppm de aceite de tomillo, por lo que no se consideran recomendables.

Captulo 4 47

Tratamiento preventivo en ova verde de trucha arco iris a escala piloto

Los resultados de esta experiencia, al igual que la experiencia anterior, estn dados por el porcentaje de ovas vivas, muertas, con hongo y sin hongo. (Tabla 4.9).
Tabla 4.9 Porcentajes de sobrevivencia y mortalidad de tratamiento preventivo en ova verde de trucha arco iris a distintas concentraciones de aceite de tomillo y Bronopol

Aceite de Tomillo [ ] ppm 400 600 800 50 ppm de Bronopol

% Ovas muertas c/hongo 24 80 40 14 s/hongo 30 20 60 34

% Ovas vivas 46 0 0 52

rea hongo (cm ) 107 327 288 135

2

N ovas /rea 380 1177 1066 522

En el tratamiento preventivo, con la aplicacin de 400 ppm de aceite de tomillo se aprecia un mayor porcentaje de ovas vivas (46%), Tabla 4.9, que en el tratamiento curativo (33%), Tabla 4.7. Lo que se podra considerar un buen resultado, debido a que en condiciones normales existe un picaje a las ovas con hongo, por lo tanto el nmero de ovas vivas a esta concentracin podra llegar a ser incluso mayor. Adems, el nmero de ovas con hongo al final de la experiencia tambin fue menor, comparado con la misma concentracin del tratamiento curativo. En definitiva se podra establecer que es factible utilizar baos con 400 ppm de aceite de tomillo como tratamiento preventivo, en la etapa de ova verde. Al utilizar concentraciones mayores de 600 y 800 ppm, no se obtuvieron ovas vivas, lo que indicara que no es factible la utilizacin de estas concentraciones para el tratamiento de Saprolegnia sp en ovas verdes de trucha arco iris. Con el tratamiento con baos de Bronopol se logr buenos resultados en cuanto a la cantidad de ovas vivas al final de la experiencia. Sin embargo, se observ que el rea cubierta por el hongo con 400 ppm de aceite de tomillo es menor que la que se obtuvo utilizando 50 ppm de Bronopol. La cantidad de ovas muertas sin hongo tambin result ser menor en el tratamiento con tomillo. Este ltimo resultado nos indica una vez ms que es posible utilizar aceite de tomillo a una concentracin de 400 ppm, ya que se obtendra una menor cantidad de ovas infectadas por el hongo. Es posible que estos resultados mejoren al afinar estrategias de manejo en la etapa de ova verde.

Captulo 4 48

Tratamiento preventivo en ova con ojo de trucha arco iris a escala piloto
Al utilizar baos con 200 ppm de aceite de tomillo (Tabla 4.10) se obtuvo al final de la experiencia un 78% de ovas vivas. Este porcentaje es levemente superior al obtenido con el tratamiento control, con el cual se logr un 77% de ovas vivas. Utilizando una concentracin de 400 ppm, al final de la experiencia, se registr un 82% de ovas vivas, cifra mayor a las otras dos concentraciones de tomillo utilizadas, 200 y 500 ppm, y al tratamiento control con Bronopol. (Tabla 4.10). Los resultados registrados con la concentracin de 500 ppm de aceite de tomillo, confirman que es demasiado alta para ser utilizada en el control de Saprolegnia sp., en ovas con ojo de trucha arco iris, puesto que se obtiene una sobrevivencia no superior a un 25% en ovas con ojo. (Tabla 4.10). En estas pruebas, de las tres concentraciones de aceite de tomillo utilizadas, el mejor resultado se obtuvo con una concentracin de 400 ppm, en trmino de porcentaje de ovas vivas, menor rea cubierta por hongo y menor nmero de ovas por rea infectada. (Tabla 4.10).
Tabla 4.10 Porcentaje de sobrevivencia y mortalidad en ovas sometidas a distintas concentraciones de aceite de tomillo y Bronopol

Aceite de tomillo [] 200 400 500 50 ppm bronopol

% Ovas muertas c/hongo 12 10 20 20 s/hongo 10 8 55.5 3

% Ovas vivas

rea hongo (cm2)

N ovas rea

Alevines al trmino de la experiencia Muertos Muertos c/hongo 3 11 14 11 Vivos 77 63 62 79

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78 82 24.5 77

62 26 220 61

207 74 840 197

4 6 37 8

Conclusiones
No todos los aceites de tomillo poseen el mismo perfil de cidos grasos esenciales, por lo que se aconseja realizar un anlisis previo de cidos grasos para determinar con mayor exactitud las concentraciones en ppm de aceite de tomillo a utilizar. Se observ que en cultivo en placas, a partir de los 150 ppm de aceite de tomillo se inhibe el crecimiento del hongo Saprolegnia. En ensayos de tolerancia en ovas de trucha arco iris, cuando stas se someten a baos de 200 ppm por tres horas, sobrevive un 90% de ellas. Mientras que en ovas de salmn del Atlntico, se logra este mismo nivel de sobrevivencia cuando el bao no sobrepasa los 30 minutos. Como tratamiento preventivo de la Saprolegnia, se pueden aplicar baos de aceite de tomillo a 400 ppm en ovas verde trucha y a 200 ppm para la etapa de ovas con ojos.

Captulo 4 50

Bibliografa
Branson E. 2002. Efficacy of bronopol against infection of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) with the fungus Saprolegnia sp. Vet Rec. 151: 539-441. Carballo, M., M. J. Muoz and J. V. Tarazona. 1990. Induccin de estrs y aumento de susceptibilidad a Saprolegnia parasitica por compuestos txicos en Oncorhynchus mykiss, p. 733-737. Actas III Congreso Nacional Acuicultura. Santiago de Compostela, Spain. Davidson, P.M. and M.E. Parish. 1989. Methods for testing the efficacy of food antimicrobials. Food Technology 43: 148155. Inouye,S., M. Tsuruoka, M. Watanabe, K. Takeo, M. Akao, Y. Nishiyama and H. Yamaguchi. 2000. Inhibitory effect of essential oils on apical growth of Aspergillus fumigatus by vapour contact. Mycoses 43: 1723. J. Stroh, M. T. Wan, M. B. Isman and D. J. Moul. 1998. Evaluation of the Acute Toxicity to Juvenile Pacific Coho, Salmon and Rainbow Trout of Some Plant Essential Oils, a Formulated Product, and the Carrier Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology Volume 60, Number 6: 923930. Mahmound, A.L.E. 1994. Antifungal action and antiaflatoxigenic properties of some essential oil constituents. Letters in Applied Microbiology 19: 110113. Paster N., B. J. Juven, E. Shaaya, M. Menasherov, R. Nitzan, H. Weisslowicz, and U. Ravid. 1990. Inhibition effect of oregano and thyme essential oils on moulds and foodborne bacteria. Letters in Applied Microbiology 11: 3337. Perrucci, S.and S. Cecchini. 2006. In Vitro antymicotic of some natural products against Saprolegnia ferax. Phytotherapy Research Vol. 9 (2): 147-149. Pottinger,T.G.and and J.G. Day, 1999. A Saprolegnia parasitica challenge system for rainbow trout: Assessment of Pyceze as an anti-fungal agent for both fish and ova. Diseases of Aquatic organisms Vol. 36: 129-141. Smith, S. N., R. A. Armstrong, J. Springate and G. Barker. 1985. Infection and colonization of Trout eggs by Saprolegniaceae. Trans. Br. Mycol. Soc. 85: 719-723.
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Anexos
Anexo 1 Catastro internacional de productores y/o comercializadores de aceite esencial de tomillo.

Producto A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. *A.E.T. A.E.T. * A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T.

Productor o vendedor Health Leads Botica Francesa Cedrosa Ecobotiga Health Leads Red Safari Red Safari Bulgarian Pharmaceutical Group Ltda. Esoteric Oils (Pty) Ltda . Productores y vendedores Global Herbal Supplies FLAVEX Naturextrakte GmbH Geobell AG VOGELE Green Tech S.A. Mehul Chemicals Industries Frutarom (UK) Ltda. Essencia, Aetherische Oele AG Florame Science Lab. Jade Oils Sigma Aldrich Co. Marlin Chemical Products Manuel Riesgo S.A. Biomedica Vitamin Usa The Cryst l Garden a

Uso o caract. Orgnico/aromateria Aromaterapia 35/40%, 22% Aromaterapia Aromaterapia Aromaterapia Aromaterapia Alimento, medicina Aromaterapia/Uso tpico Aromaterapia Teraputico Extractos naturales Aromaterapia s/i s/i Aromaterapia/Otros s/i Qumicos Aromtica Qumicos Aromaterapia Qumicos s/i s/i s/i s/i Teraputicos

Pas Espaa Per Mxico Espaa UK Canad Canad Bulgaria Sudfrica India Australia Alemania Suiza Dinamarca Francia India UK Suiza Francia USA UK USA Mxico Espaa Repblica Checa USA USA
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Anexo 2 Catastro nacional de productores y/o comercializadores de aceite esencial de tomillo en Chile

Producto A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T. A.E.T.

Productor o vendedor Aromas Naturales Chile Osmanthus AMBAR Hualapulli Ltda. LUXCAMP

Uso o caract. Aromaterapia Aromaterapia Aromaterapia Aromaterapia Aromaterapia

Fuente: Proyecto FIA-PI-C-2004-1-D-08.

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La elaboracin de este manual es gracias al aporte de la Fundacin para la Innovacin Agraria. A travs del Proyecto FIA-PI-C-2004-1-D-089. Aplicacin del Tomillo (Thymus vulgaris) en el manejo de enfermedades de la salmonicultura.

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SERVICIOS DE BIOENSAYOS EN ALIMENTACINN PARA LA ACUICULTURA

La Escuela de Ciencias del Mar de la Pontificia Universidad Catlica de Valparaso posee la experiencia y dispone de las instalaciones necesarias para evaluar y certificar la calidad de los alimentos pelletizados que se emplean en la acuicultura nacional. Para mayores informaciones de este servicio le solicitamos comunicarse al Laboratorio de Cultivo de Peces y Alimentacin para la Acuicultura (LABCPAC). Fono/Fax: 32-2274263, e-mail: isabel.toledo@ucv.cl
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