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UNIVERSITE MOHAMMED V-AGDAL FACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE Filire Sciences de la Vie (SVI) Module de Biochimie (M 11) Elment : Biochimie structurale - Semestre 3 2008-2009

Cours des Acides Nucliques


Pr. BELLAOUI Hicham

Plan sance 3 et 4
III- Structure des acides nucliques:

1.LADN a . Structure primaire et polymrisation des nuclotides b. Structure secondaire . La doubles hlice: modle de Watson et Crick . Principales caractristiques des chanes d'ADN . Les variants conformationnels de la double hlice c . Structure tertiaire de lADN IV- Caractristiques physicochimiques et fonctionnelles de lADN 1. Proprits physicochimiques de l'ADN a- Nature fibreuse et taille b- Dnaturation et renaturation thermique c- Densit, charge et proprits spectrales 2. Mthodes dtudes des ADN a- Purification et extraction de lADN b- Hydrolyse chimique et enzymatique c- Action dautres enzymes d- Techniques danalyses de lADN: Southern blot, PCR et squenage 3. Conservation de linformation gntique: Rplication semi-conservative de lADN

ACIDES NUCLEIQUES
STRUCTURE PRIMAIRE DE LADN
Taille des ADN

virus : phage l : 48 kb soit 32.106 Da soit 17 m bactrie : E.coli : 4000 kb soit 2600.106 Da soit 1,36 mm
La rgle de Chargaff (1940)

(A + G) = (C + T) ou A/T = 1 G/C = 1

(A+G) / (C+T) = 1

(A+T)/(C+G) varie beaucoup : il est caractristique de lespce. Ce coefficient est appel coefficient de Chargaff

Structure primaire des Acides Nucliques


La liaison Phosphodiester

dinuclotide

Structure primaire des Acides Nucliques

Les nuclotides peuvent se lier les uns aux autres par leur sucre (dsoxyribose) et leur groupement phosphate.

Structure primaire des Acides Nucliques


Polymrisation des Acides nucliques Enchanement des nuclotides

Structure primaire des Acides Nucliques

Structure primaire des Acides Nucliques

Structure primaire des Acides Nucliques

Structure Secondaire de lADN


Appariements spcifiques des bases

A s'apparie avec T et C avec G:


A avec T : deux liaisons hydrogne (liaisons faibles)

C avec G : trois liaisons hydrogne

Structure Secondaire de lADN Deux chanes de nuclotides peuvent s'unir l'une l'autre si leurs bases sont complmentaires (A face T et C face G)

Structure Secondaire de lADN


5
0,34 nm petit sillon

bases

G
grand sillon

G C T G
liaison hydrogne

A C
3

sucre

2 nm

liaison phosphodiester

Structure Secondaire de lADN


Modle de Watson et Crick (Propos en 1953.)
Les bases sapparient par 2 pour former des paires de bases. Elles sont lies lune lautre par des liaisons H. Les 2 chanes sont antiparallles : orientes en sens inverse le pas de lhlice = distance pour un tour de spire = 3,4 nm Il y a donc 10 paires de base en moyenne par tour de spire. Lediamtre de lhlice et de 2nm Le squelette central est hydrophobe; l'extrieur est hydrophile

Structure Secondaire de lADN

ADN-A

ADN-B

ADN-Z

Structure Secondaire de lADN Hlice A


Sens de lhlice Diamtre Rsidus par tour Ecart entre 2 pb Pas de lhlice droit 2,6 nm 11 0,26 nm 2,8 nm

Hlice B
droit 2,0 nm 10 0,34 nm 3,4 nm 36 6

Hlice Z
gauche 1,8 nm 12 (6 dimres) 0,37 nm 4,5 nm -60 (par dimre) 7

Rotation de lhlice par rsidu 33 Inclinaison normale des bases 20 vers laxe de lhlice

Structure Secondaire de lADN


Vues de dessus

ADN A

ADN B

ADN Z

Structure Tertiaire de lADN


LADN des cellules eucaryotes

Structure Tertiaire de lADN


ADN

Histones

Chaque molcule d'ADN s'enroule sur des protines (histones) et forme un chromosome.
Un chromosome = une molcule d'ADN et les protines sur lesquelles elle s'enroule. L'ensemble des chromosomes forme la chromatine

Structure Tertiaire de lADN


Diffrents niveaux d'organisation de l'ADN pour former un chromosome
ADN double brin Nuclosome

Fibre de chromatin e

Section dun chromosome en mtaphase

Chromosome entier

Structure Tertiaire de lADN


LADN des cellules eucaryotes

LADN eucaryote est sous forme de plusieurs molcules (correspondant aux chromosomes ltat condens)) inclues dans la chromatine ( ltat dcondens) double brin, bicatnaire. Squences rptes nombreuses (40 70%) , non codantes Associ des protines : les histones pour former un complexe nucloprotique.

Structure Tertiaire de lADN


LADN des cellules eucaryotes

Les histones
5 types dhistones interviennent dans le chromatine : H2A, H2B, H3, H4, et H1 Ce sont des protines trs basiques du fait dun grand nombre de rsidus Arg et Lys dans leur structure. Elles sont riches en charge positive et pourront tablir des liaisons avec les phosphates.

Structure Tertiaire de lADN


LADN des cellules eucaryotes Les nuclosomes
Ce sont les sous-units de la chromatine. Ils sont forms par lassociation histones / ADN selon : Les histones H2A, H2B, H3, H4 sassocient par paire puis entre eux pour former un octamre dhistones autour duquel lADN senroule par 1,8 tours (soit 146 pb) en superhlice. (core) Entre 2 nuclosomes, il y a environ 50 pb correspondant lADN de liaison : partie la plus sensible aux nuclases (= enzymes de digestion de lADN) Cette association forme la fibre en collier de perle de 10 nm ; qui correspond une rduction de longueur de lADN dun facteur 6.

Structure Tertiaire de lADN


LADN des cellules eucaryotes La fibre de 30 nm
Elle correspond un compactage de la fibre de collier de perle assur par les molcules dhistones H1 fixes sur lADN de liaison et qui sassocie chaque nuclosome. Ce compactage entrane la formation dun arrangement hlicodal (= solnode) qui diminue la longueur de la molcule dADN dun facteur 50. (la chromatine) Remarque : pour que la longueur de la chromatine entre dans la longueur des chomosomes, il faut un facteur 7000 ; ce niveau suprieur dorganisation est encore mal connu.

Proprits physicochimiques de ADN


Solubilit
L'ADN est un polyanion dont les sels de sodium sont solubles dans leau en formant des solutions viscosit leve.

Les alcools, et en particulier l'thanol, prcipitent les molcules d'ADN sous forme d'agglomrat en longues fibres

Proprits physicochimiques de ADN


Densit

La densit des molcules d'ADN est telle qu'on peut les sparer par ultracentrifugation dans des gradients de densit (chlorure de csium)
LARN est plus dense que lADN qui est lui-mme plus dense que les protines

Proprits physicochimiques de ADN


Charge

La charge de ces molcules pH physiologique est ngative. Charge dont la contribution est uniquement due aux groupements phosphates ( ce pH, les bases ne portent aucune charge). Cette proprit est utilise pour les sparer par lectrophorse.

Proprits physicochimiques de ADN


Proprits spectrales
Spectre dabsorption dans lultra-violet (UV) des bases azotes pH 7 Spectre dabsorption dun acide nuclique

Coefficients dabsorption molaire des nuclotides 260 nm

Proprits physicochimiques de ADN


Dnaturation et renaturation:

5P- A T C G T A -3OH 3OH - T A G C A T - 5P

dnaturation

5P- A T C G T A -3OH

renaturation

3OH - T A G C A T - 5P

Dnaturation et renaturation:

Proprits physicochimiques de ADN


Densit optique 260 nm
5P- A T C G T A -3OH

ADN monocatnaire
3OH - T A G C A T - 5P

5P- A T C G T A -3OH 3OH - T A G C A T - 5P

ADN bicatnaire

Tm

Temprature (C)

Proprits physicochimiques de ADN


Leffet Hyperchrome
ADN simple brin

ADN double brin

par la chaleur (chauffage 100C) ou par l'ure ou encore pH trs alcalin. L'ADN dnatur a une absorption 260 nm plus leve que l'ADN natif, d'un facteur 1,6. Cette proprit estappele l'effet hyperchrome ou hyperchromicit La courbe de refroidissement rapide aboutit la mme valeur originale de l'absorption, mais une valeur plus leve de Tm : c'est le phnomne d'hystrsis.

Proprits physicochimiques de ADN


Temprature de fusion : Tm

Tm = 81,5 + 16.6 log [Na+] + 0.41%(G+C)- 600/n-0,1(% form)

[Na+] en Molaire, entre 0,01 et 1 M n = nombre de paires de bases > 100 Form = formeamide (entre O et 50 %) %(G+C) : 75 et 30

Proprits physicochimiques de ADN


Densit optique 260 nm %GC = 50%

%GC = 30%

%GC = 70%

Tm=63C

Tm=70C

Tm=80C

Temprature (C)

Interactions de lADN
Les ions divalents (Mg2+, Cu2+) peuvent stabiliser ou dstabiliser lADN. Mg2+

OO=P-O-CH2 O

O - O-P-O-CH 2 O

Le magnsium transforme une rpulsion -/- en (+/-)2 : stabilisation de lhlice (augmentation de la temprature de fusion de lADN). Le cuivre se lie avec les bases (N et O) : dstabilisation de lADN (diminution de la temprature de fusion de lADN).

Interactions de lADN
On a retrouv de leau fortement lie lADN (cristaux). Pour quune molcule puisse se lier un sillon de lADN il faudra chasser leau. NH2
3 5

N H 2N

- CH2 - CH3 Br

bromure dthidium (BET)

Interactions de lADN
Certains antibiotiques peuvent sinsrer dans un des sillons de lADN (Ntropsine par exemple) et dautres sintercalent entre les bases (Daunomycine par exemple).

Ntropsine (rouge)

Daunomycine (rouge)

Diffrents types et tat des ADN


LADN mitochondrial

Les mitochondries des cellules eucaryotes contiennent 4 6 molcules dADN bicatnaire et circulaire de composition nuclotidique diffrente de celle du noyau avec taux de GC faible

Diffrents types et tat des ADN


LADN bactrien
Il correspond lADN des Procaryotes. Non contenu dans un noyau pourvu dune enveloppe nuclaire. ADN = 1 seule molcule Circulaire Bicatnaire Structure trs condense Exemple : E.coli : ADN = 4.106 pb ; 3.109 Da ; 1,36 mm dans une bactrie denviron 5 m de long Structure en superhlices avec des torsades ngatives.

Diffrents types et tat des ADN


LADN des plasmides

Plasmides = lments gntiques extrachromosomiques prsents chez de nombreuses bactries, porteurs de gnes et capables dautoreproduction. ADN = bicatnaire, circulaire et de taille variable

Diffrents types et tat des ADN


LADN viral

Les virus ne comportent pas tous de lADN (certains virus portent de lARN) La structure la plus courante de lADN des virus ADN : bicatnaire et circulaire Mais il existe aussi des virus ADN monocatnaire circulaire (phage X174 dE.coli) ADN linaire (phage T7) ADN circulaire ou linaire selon le stade de son dveloppement (phage ) car possde des extrmits monocatnaires complmentaires permettant la cyclisation.

Mthodes dtude des acides nucliques

Extraction dADN
Echantillon Lysat Digestion des protines (protases) Extraction par le phnol Prcipitation par lthanol ADN

Hydrolyse chimique des Acides Nucliques

- les ADN rsistent aux pH basiques : par exemple, pH 13 et 37C on a une dizaine de coupures de ponts phosphodiester par million de ponts - les ARN sont totalement hydrolyss en leurs ribonuclotides en quelques minutes 37C et pH 11. C'est la prsence de l'hydroxyle libre en 2' qui permet cette hydrolyse qui donne un intermdiaire cyclique 2':3' P, aboutissant des nuclotides 2' P ou 3' P.

Hydrolyse enzymatique des Acides Nucliques

Ce sont phosphodiestrases spcifiques appeles nuclases Elles prsentent des niveaux de spcificit et sont classes par : - leur mode d'attaque de la chane : extrmit (exo) ou intrieur (endo) - leurs spcificit vis--vis du substrat : ADN, ARN ou les deux et de la structure, simple ou double brin leur spcificit de reconnaissance des sites : bases ou leur enchanement - le type de coupure de la liaison phosphodiester

Hydrolyse enzymatique des Acides Nucliques

Exonuclases : librent par hydrolyse le nuclotide situ lextrmit 5 ou 3

Endonuclases : hydrolysent une liaison ester interne.


extrmit 5 Endonuclase extrmit 3

3 5 3

P
5

OH

Exonuclase

Exonuclase

Hydrolyse enzymatique des Acides Nucliques


S : simple brin, d : double brin N : reprsente n'importe lequel des nuclotides

Nuclases

Substrats

Type coupure

Spcificit coupure

Exonuclases
phosphodiestrase de venin phosphosdiestrase de la rate exonuclase I d'E.Coli exonuclase III d'E.Coli ARN, ADN (s) ARN, ADN (s) ADN (s) ADN (d) 3 5' 3 3 extrmit 3' extrmit 5' extrmit 3' extrmit 3

Endonuclases
endonuclase S1 d'Aspergillus ARNase T1 d'Aspergillus ARNase de pancras ADNase II de thymus ARN, ADN (s, d) ARN (s) ARN (s) ADN (s) 3' 5' 5 5 alatoire -G #N -Pyr # N -dPyr # dPur

Hydrolyse enzymatique des Acides Nucliques

endonuclases de restriction

Origine

systme de protection des bactries spcifiques et d'une squence de 4 10 nuclotides le site est palindromique

Nomenclature Escherichia coli R y13 EcoR I : 1re enzyme trouve chez E. coli EcoR V : 5me enzyme trouve chez E. coli

Hydrolyse enzymatique des Acides Nucliques

COUPURES A BOUTS COHESIFS

Ex : EcoR I

5G A A T T C .3 3C T T A A G.5

5. G AATTC3 3.. CTTAA G5

COUPURES A BOUTS FRANCS(B LUNT ENDS) ex : Sma I 5 .C C C G G G .3 3 .G G G C C C .5 5 .C C C 3 .G G G G G G .3 C C C .5

Hydrolyse enzymatique des Acides Nucliques Visualisation des fragments de restriction

Visualisation des fragments de restriction


(lectrophorse)

Aprs coloration au BE

Hydrolyse enzymatique des Acides Nucliques Visualisation des fragments de restriction

Hydrolyse enzymatique des Acides Nucliques

Nombre de kb (chelle Log)

Migration mm

Hydrolyse enzymatique des Acides Nucliques 10 kb 7 kb 3 kb 8 kb 2 kb 5 kb 3 kb 2 kb ENZYME Eco RI CARTE DE RESTRICTION

ENZYME Hind III

ENZYMES Eco RI +Hind III

EcoRI 3kb 5kb

Hind III 2kb

Hydrolyse enzymatique des Acides Nucliques Enzymes de restriction

Fragments observs par lectrophorse

Southern blot
1- Clivage enzymatique de restriction

2- lectrophorse sur gel d'agarose

3- Dnaturation dans le gel des fragments de restriction

4- Transfert sur support solide (membrane de nylon ou nitrocellulose) par capillarit (buvardage)

5- Fixation de l'ADN sur la membrane par cuisson (mb. nitrocellulose) ou exposition U.V (mb.nylon) 6- Hybridation avec une sonde marque dnature 7- lavages

8- Autoradiographie

PCR

Exp : Amplifier une ADNc partir dune ARNm : RT-PCR

Mthode enzymatique de Squenage de lADN selon Sanger


PRINCIPE : LUTILISATION DUNE ADN-POLYMRASE Domaine dj connu

Domaine squencer
3OH 5P

3OH 532P

Domaine nosynthtis

Amorce radiomarque par du 32P en 5

Mthode enzymatique de Squenage de lADN selon Sanger

On utilise 4 tubes : chacun avec un type de ddNTP et le nombre de fragments obtenues est gale loccurrence de chaque type de nuclotides

Lecture du PAGE aprs lctrophorse


ddATP ddGTP ddCTP ddTTP
La squence du brin noform dADN se lie horizontalement : - de lanode (+) (correspondant au ct 5P) - vers la cathode (-) (correspondant au ct 3OH)
32P5-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-

____

____

____ ____

____ ____

____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____

T-X-3OH

Le brin squencer est donc: P5-X-A-G-T-C-T-C-A-C-CT-G-A-C-3OH

Conservation de linformation gntique: Rplication semi-conservative de lADN

Rplication semi-conservative de lADN

Les 2 brins dADN se sparent. Des nuclotides prsents dans le milieu viennent sapparier aux nuclotides de chacun des deux brins de la molcule

On obtient deux molcules identiques la molcule de dpart

Rplication semi-conservative de lADN

Photographie au microscope lectronique d'ADN en rplication

Reprsentation schmatique de la fourche de rplication

Une bulle de rplication s'tendant dans les deux directions

Etapes de la rplication de lADN


1 . linitiation Synth se des amorces au niveau des origines de rplication. a) Reconnaissance de lorigine de rplication par le complexe protique de rplication b) Ouverture de la chaine par lhlicase c) Synthse de lamorce. 2 llongation Synth.se de lADN dans le sens 5 3. Sur le brin galement dou synth se discontinue par petits fragments qui seront colls ensuite. 3 la terminaison Mcanisme encore mal compris. Chez les bactries des squences de terminaison (ter) sont reconnues par des facteurs spcifiques (Tus) qui arrtent la rplication

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