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Chap. II.

Techniques d'tudes de la cellule Diverses techniques ont t utilises pour tudier la cellule : Etudes morphologiques (Techniques Microscopiques) Etudes physico-chimiques (Techniques de fractionnement des constituants cellulaires dont Centrifugation, etc...). L'volution de ces techniques d'tude a permis de mieux comprendre la biologie cellulaire. I- Techniques microscopiques - La majorit des cellules sont petites et transparentes la lumire visible et ne peuvent tre dcel par lil humain: le pouvoir sparateur de lil est de l'ordre de 200 m ( 25 cm, lil distingue 2 points voisins de 0,2 mm). - La dcouverte des microscopes et la mise au point de prparation du matriel augmenter le pouvoir sparateur de lil, et liminer la transparence du matriel. 1. Prparation de l'chantillon pour l'examen a. tude des cellules encore vivantes: * La microchirurgie (examen vital) : introduction de microinstruments (microsondes, microaiguilles) informations sur les proprits physico-chimiques de la cellule. * La culture des cellules animales et vgtales aprs leur isolement (examen supravital) : obtention d'un clone (Population de cellules provenant d'une seule cellule parentale). * Les colorants vitaux des structures de la cellule (Ex. Raction l'acide priodique spcifique des sucres; raction de Feulgen pour lADN). b. tude des cellules pralablement tues: Agents chimiques ou physiques (conglation) qui "fixent" la cellule complte, on utilise: Une analyse morphologique

* Un fixateur chimique: colorant qui cause la mort de la cellule, mais conserve la structure et la composition de celle-ci. Ex. Lugol (acide) pour noyaux et chromosomes ;et pour enzymes: l'actone et la formaldhyde,.. * La cryodessiccation: conglation rapide l'chantillon dans un bain d'azote liquide (-160 morphologie -190C), puis dshydratation ou dessiccation sous vide une T de -30 -40C cellulaire conserve et mme maintien de la vie (spermatozode). 2 autres tapes sont ncessaires pour analyse au microscope: * L'inclusion: dans une substance solide (paraffine ou cellodine). Le tissu fix est d'abord dshydrat (bain d'alcool), dans un solvant intermdiaire (xylme ou tolune pour la paraffine, thanol ther pour la cellodine). Pour le microscope lectronique, l'inclusion se fait dans des rsines trs dures (les mthacrylates et les rsines poxy). * Prparation des coupes minces: Des tranches plus au moins fines sont ralises l'aide d'un microtome. paisseur exige 2 5 m pour la microscopie photonique et 50 80 nm pour la microscope lectronique.

Etapes de prparation des chantillons en microscopie optique

2. Microscope optique Dfinition : outil permettant l'examen dobjets agrandis en prsence de photons (UV & visible). Pouvoir sparateur amen 0,2 m en lumire visible. Grossissement 1000 fois et plus. Plusieurs types: * Ceux qui donnent une observation directe des structures cellulaires: microscope transmission et contraste de phase. * Ceux qui donnent des informations indirectes de la structure cellulaire: microscope fond noir et mic. polarisant.

Microscope photonique

2. 1. Microscope fond claire Description Partie mcanique: Statif, Tube binoculaire, Tube porte objectif Partie optique: Source lumineuse, Systme condenseur diaphragme, Objectifs 4x/10x/40x/100x, Oculaires 10x/ Principe de formation de limage Objectif image agrandie inverse relle Oculaire image intermdiaire agrandie inverse virtuelle Caractristiques essentielles du microscope Ouverture numrique : Produit du sinus de langle incident maximal possible pour un rayon et de lindice optique du milieu incident. ON = n . sin a Limite de sparation : la limite de rsolution (transverse) d d'un microscope, c'est--dire la plus petite distance en dessous de laquelle deux points voisins ne seront plus distingus, peut tre exprime simplement l'aide de la longueur d'onde d'illumination , de l'indice de rfraction n en sortie d'objectif, et du demi angle du cne de lumire maximum accessible .

Pouvoir de rsolution : 1/d Grossissement : G = g1 . g2 Applications: Histologie, Hmatologie, Parasitologie, Bactriologie 2. 2. Microscope fond noir Principe clairage par un condenseur fond noir Aucune lumire ne pntre dans lobjectif Observations des contours de la cellule par diffraction Applications en Bactriologie

Image obtenue par microscopie fond noir. 2. 3. Microscope contraste de phase Principe Objectif avec anneau de phase intgr Modification de la phase des rayons lumineux variation dintensit lumineuse Applications: Observation de cellules vivantes

Image obtenue par microscopie contraste de phase

2. 4. Microscope fluorescence Principe de la fluorescence Cest lmission de lumire suite labsorption de photons, E = h . n = h . c/l l2 > l1 Diffrents types de fluorescence: Primaire : produite naturellement par certaines substances biologiques (ex : chlorophylle) Secondaire : obtenue artificiellement en liant un compos non fluorescent avec un compos fluorescent (fluorochromes) Les microscopes fluorescence sont: A lumire transmise ou lumire rflchie (pifluorescence) Applications: Bactriologie (cytomtrie sur filtre), Immunofluorescence

Image obtenue par microscopie fluorescence 2. 5. Microscope confocal Principe: Ce microscope permet de collecter limage rflchie au niveau dun plan focal et dliminer les images du dessus (dessous) de ce plan par balayage laser Applications: Neurobiologie

Image obtenue par microscopie confocal

3. Microscopes lectroniques Principe Etude de l'ultrastructure biologique : utilise les lectrons mis par une cathode, et acclre par une forte diffrence de potentiel, l'image prend forme sur l'cran fluorescent et dpend de la dispersion des lectrons par les noyaux atomiques contenus dans l'objet: pouvoir sparateur de 0,5 nm (5 ). Agrandissement de 106 et plus. Types: Microscope lectronique transmission Principe: On diminue la limite de sparation en diminuant la longueur donde dexcitation utilisation des lectrons la place des photons Caractristiques 1. d = 1 nm 2. G = de 1400x 500 000x Description Canon lectrodes Acclrateur dlectrons Lentille lectromagntique cran fluorescent de visualisation

Microscope lectronique balayage Principe: Les cellules sont traites par des sels de mtaux lourds. Les lectrons mis par la cathode vont balayer la surface de la cellule Caractristiques 1. d = 10 nm 2. G = 20 000x Applications: Biologie cellulaire

Microscope lectronique
Filament de Tungstne (source dlectrons) Condensateur (lentilles de) chantillon

Lentilles Objectif

Lentilles Projecteur

Image sur cran fluorescent

Cytoplasme

Ribosomes

Inclusions

Membrane plasmique

Paroi cellulosique

Aspect de la cellule bactrienne au microscope lectronique transmission

3. Prparation des chantillons Coloration positive 1. Fixation chimique 2. Dshydratation 3. Inclusion dans la rsine 4. Coupes de 50 100 nm 5. Dpt de sels de mtaux lourds augmentation du contraste

Image obtenue par coloration positive Coloration ngative Les sels de mtaux lourds se dposent aprs vaporation de leau autour des particules

Image obtenue par coloration ngative

Ombrage de particules & rplication de surface Ralisation de rpliques quand la surface est trop paisse pour tre traverse par les lectrons

Image obtenue par ombrage Cryodcapage & cryofracture associe la microscopie balayage. Obtention des rpliques (impression de relief) des ultrastructures cellulaires Cryofracture Fixation par Conglation des organites dans lazote liquide -196C. Fracture du bloc: Clivage tangentielle des membranes en leur milieu. Rplication par ombrage Cryodcapage Conglation ultra rapide Fracture de lchantillon Sublmation de leau sous vide Rplication Vaporisation: La surface fracture est vaporise par un mtal lourd (or ou platine) puis par du carbone (pour renforcer la coupe).

Image obtenue par cryodcapage II. Les techniques de fractionnement des constituants cellulaires (fractionnement cellulaire) Prparation de lhomognat cellulaire 1. Mthodes permettant la rupture de la membrane plasmique a. Mcanique : broyage b. Choc osmotique c. Conglations dconglations successives d. Ultra-sons e. Attaque enzymatique 2. Prcautions respecter pour obtenir un bon homognat a. Liquide isotonique b. Basse temprature c. En prsence dagents rducteurs d. PH neutre Sparation des organites Par centrifugation diffrentielle: Augmentation de la vitesse et du temps Par centrifugation en gradient de densit (ultracentrifugation): Principe : sparation des organites en fonction de leur constante de sdimentation, fonction de leur masse molaire: 1. Sparation en solution de saccharose de 5 20 % 2. Dpt des organites en surface 3. Centrifugation : arrt de la migration quand les organites rencontrent une couche de saccharose de densit suprieure la leur 4. Sparation des organites en fractions (= aliquotes) Suivi de la sparation des fractions Utilisation de marqueurs molculaires des organites: Ce sont des enzymes caractristiques de ces organites. On peut aussi valuer la purification par microscopie Applications Utilisation de systmes cellulaires. Ex : synthses protiques in vitro

Synopsis gnral des techniques pour aller de l'observation des tissus la purification et l'analyse des macromolcules biologiques

Techniques et Buts
Techniques coupes de tissus (microtome) - isolement de cellules coloration - histologie - immunohistochimie cytomtrie en flux culture cellulaire immunohistochimie lyse des cellules (dtergents, chlorure guanidinium, lysozyme, ...) ultracentrifugation en gradient de densit (saccharose) ultracentrifugation diffrentielle techniques de chromatographie (change d'ions, gel de filtration, affinit, ...) immunocytochimie (ELISA, EIA, "radioimmunoassay", ...) electrophorse sur gel d'agarose electrophorse sur gel de polyacrylamide en conditions natives ou dnaturantes (SDS) mthodes de dosage spectrophotomtrique (absorption 280 nm, mthode de Bradford, mthode de Lowry ...) dosage enzymatique construction de banques et clonage d'ADNc But Prlvement observation microscopique - cytologie tri des cellules - observation de diffrents marqueurs phnotypiques - apoptose multiplication des cellules - sauvegarde des cellules localisation intracellulaire - mise en vidence d'organites, de macromolcules typiques rupture de la membrane plasmique - extraction de macromolcules ou d'organites sparation des cellules en fonction de la constante de sdimentation (Svedberg) sparation et purification des organites sparation et purification des macromolcules biologiques (surtout protines) localisation cellulaire des macromolcules biologiques analyse de l'ADN (tailles et formes des fragments) analyse des protines (masse molaire / nombre de sous-unit / structure quaternaire) dtermination de la concentration des protines mesure de l'activit catalytique des enzymes surexpression de protines recombinantes

Centrifugation

Homognisation

Centrifugation diffrentielle

Surnageant
Culot riche en dbris cellulaire et nucliques

Tissu Homognat Cellules

Culot riche en mitochondries et chloroplaste (cellule vgtale

Culot riche en Microsomes (Dbris de membrane)

Culot riche en ribosomes

Isolement partir d'une population de cellules un organite bien dfini pour lui subir des mthodes d'analyse physiques ou biochimiques de ses constituants molculaires.

chelles de taille en Biologie

4000 ans 1 an 1 mois 2 jours 20 min 20 sec 1 ms 10 ps

Dure de vie des plus vieux arbres Dure de vie dune souris Dure de vie dune drosophile Reproduction dune cellule animale en culture Reproduction dune bactrie Synthse dune protine Raction enzymatique Interaction initiale dun photon avec loeil ou les chloroplastes

Spatiales

Temporelles