Insulina - como fator de crescimento I promove cordo umbilical maturao das clulas T atravs de moncitos e inibe a sua apoptose,

em parte, atravs de a interleucina-6

Contexto: A imaturidade funcional das clulas T contribui para a suscetibilidade de recm-nascidos para infeces e menos graves de doena enxerto-versus-hospedeiro associados com o sangue do cordo (CB) transplante. Ns apresentamos previamente que a insulina - fator de crescimento semelhante - I (IGF-I) promove a maturao das clulas T induzida por fitohemaglutinina (PHA) CB e inibe a sua apoptose em de clulas mononucleares de cultura (MC). Ns a hiptese de que os efeitos de IGF-I (fatores de crescimento semelhantes insulina) pode ser mediada por clulas acessrias e fatores solveis. Resultados: Este estudo mostrou que a cintica de PHA induzido maturao em purificado CD3 + de clulas T foi atrasado em comparao com que, em CBMC. A adio de autlogas CD14+ moncitos aumentou Maturao das clulas T e potenciou o efeito do IGF-I. A adio de IL-6 no teve efeito sobre a maturao das clulas T do CB mas reduziu apoptose induzida por PHA de forma significativa. Concluso: Os resultados sugerem que o efeito de maturao de IGF-1 parcialmente mediada pela moncitos e do efeito anti-apopttica em parte atravs de IL-6. necessria mais investigao para explorar o uso teraputico de IGF-I no reforo imunidade neonatal. Contexto Os recm-nascidos, em especial os prematuros, tm aumentado susceptibilidade a infeces. Tem sido a hiptese de que a imaturidade funcional dos recm-nascidos podem ser os resultados de um nmero de factores, incluindo a imaturidade do componente celular, a falta de exposio anterior ao antignios, e a singularidade do ambiente de citocinas . Insulina - factor de crescimento semelhante I (IGF-I), que conhecido por ser o mediador para o crescimento muitos efeitos de promoo hormnio do crescimento, tambm mostrou ter uma influncia directa na manuteno da funo imune normal Nosso estudo anterior sobre o sangue do cordo mononuclear de cultura de clulas (CBMC) demonstraram que o IGF-I tem importante efeitos sobre a proliferao imunobiolgicos, IL-6 e IFN- produo [9] e aumento da atividade da telomerase [10]. IGF-1 tambm promove a maturao e inibe a apoptose espontnea e PHA induzido de clulas T CB O objetivo do presente estudo delinear o efeito de IGF-I em purificada de cultura de clulas T + CD3 e para determinar os papis de clulas acessrias e factores solveis na mediao do efeitos de IGF-I. Recm-nascidos so imunologicamente ingnuo, com pouca exposio a microorganismos e antignios estranhos. Portanto, a maior neonatais clulas T so ingnuas e expressa CD45RA, enquanto tanto ingnuo CD45RA + e maduros CD45RO + T so de aproximadamente nmeros iguais no sangue perifrico adulto mononuclear clulas( medida que o sistema imune ativado pela presena de antgenos, as + + clulas T no ativadas (CD45RA ) so gradativamente substitudas pelas clulas TCD45RO (ou CD45RA )agindo sobre a regulao do 31-35 crescimento e proliferao de linfcitos T e B . A placenta constitui barreira eficaz contra a entrada de microorganismos e antgenos ao + feto, razo pela qual geralmente h um predomnio correspondente a 90% de subpopulaes celulares T CD45 na circulao e nos rgos + + do feto e do recm-nascido. Com a idade, as clulas CD45RA so progressivamente substitudas pelas CD45RO , at atingir um plat na + adolescncia. Assim, a observao de presena desproporcional de CD45RO no recm-nascido reflete resposta a estmulos antignicos de 5,11,36 origem intra-uterina . Recentemente, demonstrou-se haver similaridade entre neonatos e adultos quanto cintica de resposta + + 35 mudana de fentipo CD45RA para CD45RO , ao primeiro estmulo com fito-hemaglutinina A (PHA) , bem como aumento no percentual destas clulas (CD45RO+) no sangue de cordo umbilical de crianas que desenvolveram doena alrgica at o final do primeiro ano de 37 vida .) Aps a exposio do apropriado na estimulao in vitro, CD45RA + clulas podem adquirir fenotpica e as caractersticas funcionais do CD45RO + de clulas, em particular a funo da clula auxiliar e produo de citocinas Tem sido reconhecido anteriormente de que as clulas acessrias, moncitos em particular, desempenham um papel crucial na regulao de diferenciao de linfcitos T e ativao [22-24]. Moncitos expressar Apresentando antignio e co-estimuladora molculas (como molculas de MHC de Classe II, CD1, CD40, CD80 e CD86) e citocinas (tais como de libertao de TNF-, IL-1 e IL-6) que actuam sobre os linfcitos T. IL-6 tem sido relatada como sendo uma citocina anti-apopttico o que pode prevenir a apoptose das clulas T Uma vez que o IGF-I tem Tambm foi relatado que estimulam a libertao de citocinas a partir de moncitos [27] e CBMC. Mtodos Preparao de clulas Amostras de sangue do cordo umbilical foram coletados da placenta normal de termo sem complicaes gravidez foi realizada para isolar o baixa densidade de clulas mononucleares. CD3 + e CD14 + de clulas foram isoladas por imunomagntica positivos separao de acordo com as instrues do fabricante recomendao com pequenas modificaes ). Elevado grau de pureza CD3 + e CD14 + as clulas foram obtidos de forma consistente. Cultura de Clulas Toda a cultura foi realizada em um soro de insulina suplementado com 50 UI / mL de penicilina e 50 ug / mL de estreptomicina IGF-I, PHA e IL-6 foram adicionados em vrias combinaes, como descrito no os resultados. As culturas foram incubadas a 37 C em CO2 5% com 100% de ar humidificado e colhidas no dia 3, 6 e 9. Anlise por citometria de fluxo ( uma tcnica utilizada para contar, examinar e classificar partculas microscpicas suspensas em meio lquido em fluxo. Permite a anlise de vrios parmetros simultaneamente. Atravs de um aparelho de deteco ptico-eletrnico so possveis anlises de caractersticas fsicas e/ou qumicas de uma simples clula.) O fentipo de clulas foi analisada por 3-cores do fluxo citometria Apoptose em diferentes subconjuntos de clulas T foi detectada dentro de 10 minutos de colorao Nesta regio, mais de 90% das clulas CD3 + so e clulas CD14 + no foram detectados. Resultados IGF-I significativamente promovida PHA induzido por CD45 isoforma converso para CD4 + e CD8 + na cultura CBMC Ns previamente relatado o efeito de IGF-I no CD45 isoforma de converso em clulas CD3 + em CBMC cultura [11]. Neste estudo, foram investigados os efeitos de IGF-I no CD4 + e CD8 +. Na cultura CBMC, a maioria de clulas T em CBMC so clulas naive (As clulas conhecidas como "naive" CD4 T (do ingls, inocente) formam a defesa inicial do organismo contra as infeces. Cerca de metade de todas as clulas CD4 T presentes no corpo de um adulto saudvel so "naive") Uma pequena proporo de clulas expressa o fentipo intermedirio ou o fentipo maduro Quando estimulados por PHA sozinho, o CD4 + CD45RA + CD45RO-clulas em cultura CBMC diminuiu gradualmente a partir de cerca de 80% a 40% a partir do Dia 0 ao Dia 9. Houve uma aumento complementar no CD4 + CD45RA + CD45RO + populao positiva dupla que atingiu um nvel mximo de cerca de 40% no Dia 3 e diminuiu para cerca de 20% no Dia 6. A proporo de maduros clulas de memria manteve-se em cerca de 10% para os primeiros 3 dias de ativao antes de aumentar a cerca de 30% no dia 6, e depois mantida a esse nvel at ao Dia 9. A adio de IGF-I para o CBMC no alterou o geral cintica

de CD45RA para CD45RO converso, mas significativamente promoveu a diminuio na proporo de ingnuos clulas T e o aumento da memria / fentipo maduro ). Os efeitos de IGF-I no CD4 + e As clulas CD8 + em culturas CBMC foram semelhantes. para consolidar nossa observao, foram comparados os percentuais de ingnuo e T helper madura e clulas T citotxicas em cultura Dia 6 com PHA IGFI. IGF-I significativamente diminuda as percentagens de clulas CD45RA + (p <0,001, n = 8) e aumentou as porcentagens de clulas CD45RO + (p <0,001; n = 8). Quando as clulas CD3 + de purificados T foram cultivadas em soro meio livre ou IGF-I sozinho, no houve espontnea converso de CD45 isoformas e clulas muito poucos sobreviver aps o dia 6 para anlise fenotpica (dados no mostrados). Semelhante para a observao de CBMC, PHA sozinho induziu o de converso de CD45RA + CD45RO + clulas em clulas do CD3 + de cultura de clulas. A cintica de CD45 isoforma de comutao em cultura com PHA + IGF-I era muito semelhante ao observado em CD3 + T As clulas cultivadas com PHA sozinho IGF-I s promoveu um ligeiro aumento (<10%) na maturao de clulas T Resumindo dados de 14 experimentos (Figura 2b), que confirmou que o IGF-I significativamente promovido PHA induzido maturao de clulas T em cultura de clulas CD3 + T (Fig. 2b). No entanto, o efeito de IGF-I em purificado CD3 + de cultura de clulas T foi mais fraca do que a observada em Cultura CBMC sugerindo que os factores presentes no CBMC cultura, mas ausente em clulas CD3 + cultura de clulas T pode ser crtico mediadores do efeito do IGF-I.A adio de moncitos por si s aumentou a percentagem de clulas maduras, mas no alcanou significncia estatstica Na presena de tanto o IGF-I e moncitos, as clulas CD4 + CD45RA-CD45RO + clulas atingiu 31,6%. Isto significativamente mais elevado do que o PHA sozinho ou PHA + moncitos mas no PHA + IGF-I. IL-6 no modulam PHA induzido por CD45 isoforma converso em cultura de clulas CD3 + T IGF-1 sozinho estimulou um ligeiro, mas aumento significativo da IL-6 PHA sozinho tambm IL-6, estimulou a produo, mas devido variao da amostra, as alteraes no tenham alcanado significncia estatstica. IGF-1 induziu uma significativa aumentar em PHA induzido por produo de IL-6. IL-6 foi mais eficiente do que o IGF-I na inibio induzida por PHA apoptose em cultura de clulas CD3 + T Neutralizao da IL-6 em cultura CBMC anula o antiapopttica efeito do IGF-1 Neutralizao da IL-6 por 1-20 ug / mL de anti IL-6 anticorpos resultou em aumento semelhante nas percentagens de clulas apoptticas em cultura. Discusso IGF-I tem sido relatada a ter profundos efeitos positivos na funo imune [7] e, mais recentemente, IGF-I tem mostrados para aumentar a sobrevivncia num modelo de spsia murinho IGF-I pode significativamente promover o PHA induzido sangue do cordo umbilical de clulas T helper e maturao de clulas T citotxicas em CBMC mas menos eficientemente no CD3 + purificada de cultura de clulas T em que acessrio As clulas esto ausentes. Outras experincias so por conseguinte, necessrio para determinar se o efeito de IGF-I na promoo a alterao na CD45RA para isoformas CD45RO em clulas neonatais devido a expresso diferencial de IGF-I receptores nestas subpopulaes. Ns, portanto, sugerem que o IGF-I actua sobre moncitos que por sua vez promove a PHA induzido CD45 converso isoforma em clulas T de CB. Tem sido relatado que o IGF-I estimula a libertao de citocina a partir de moncitos [27] e tem sido mostrado para estimular a liberao de quantidades significativamente maiores de IL-6 no PHA induzida pela cultura CBMC Neste estudo, o IGF-I s estimulou uma muito baixa nvel de IL-6 no CD3 + de clulas T purificadas, sugerindo que a principal fonte de IL-6 em cultura CBMC de no-T clulas. Ns mostraram que a IL-6, um factor que regulada por IGF-1 no CBMC cultura [9], fortemente inibida apoptose induzida por PHA em purificado T de cultura de clulas (Figura 5). A concentrao de IL-6 utilizado (10 ng / mL) comparvel concentrao mxima testada na cultura CBMC (~ 5 ng / mL). O papel anti-apopttico desempenhado pela IL-6 foi ainda confirmada pelas experincias de neutralizao Uma vez que o efeito anti-apopttico de IGF-I no foi completamente neutralizados por anti-IL-6 anticorpos, o resultado sugeriu que outros factores celulares ou moleculares para o misto CBMC cultura pode ser mediao dos efeitos de IGF-I. . Tem sido relatado que a IL-6 impede a activao TCR/CD3 celular induzida a morte pela diminuio da expresso de Expresso de Fas e FasL. Concluso Neste estudo, ns descrevemos o papel de clulas acessrias e IL-6 na mediao do efeito de IGF-I no PHA induzido CB T maturao de clulas e apoptose. O conhecimento sobre a mecanismo pelo qual os moncitos desempenhar o seu papel acessrio pode ser usada para desenvolver novos protocolos de teraputica manipulao de clulas. Com a alta freqncia de neonatal sepse e aumento do uso de CB para reconstituio hematopotica, uma melhor compreenso do BC fisiologia de clulas T e o potencial de algumas citocinas para promover a sobrevivncia e ativao de clulas T vai ajudar a diminuir a mortalidade causada pela infeco em lactentes [63-66]. O conhecimento tambm dar insights sobre projetando ex-vivo expanso de clulas para a imunoterapia e engenharia de enxerto.