RICARDO RIBEIRO DE OLIVEIRA

CARACTERIZAO MORFOLGICA, FISIOLGICA E PATOGNICA DE ISOLADOS DE Corynespora cassiicola (BERK. & CURT.) WEI.

MARING PARAN BRASIL

FEVEREIRO 2005

RICARDO RIBEIRO DE OLIVEIRA

CARACTERIZAO MORFOLGICA, FISIOLGICA E PATOGNICA DE ISOLADOS DE Corynespora cassiicola (BERK. & CURT.) WEI.

Tese

apresentada

Universidade

Estadual de Maring, como parte das exigncias Graduao do em Programa de Pspara

Agronomia,

obteno do ttulo de Mestre.

MARING PARAN BRASIL FEVEREIRO 2005

A Deus Por tudo, dedico.

Ao meu pai, Juracy Aparecido de Oliveira, a minha me, Arlete Ribeiro de Oliveira e aos meus irmos Adriano Antonio de Oliveira e Juracy Junior de Oliveira Pelo amor, apoio e carinho durante esta etapa da minha vida, dedico.

A minha namorada e amiga, Brbara de Melo Aguiar e a toda sua famlia Pelo apoio nos momentos de dificuldade e amor que sentem por mim, dedico.

Ao Professor Dr. Joo Batista Vida Mais que orientador foi um amigo, dedico.

ii

AGRADECIMENTOS

Aos amigos Mrcio Ueda e Eleni Sayuri Eto e a toda famlia, que me acolheram como se eu fizesse parte de sua famlia.

Aos amigos Junior, Mauro, Alcides e Rudimar, pelo incentivo, apoio e momentos de descontrao no perodo de realizao deste trabalho.

Ao Professor Dr. Dauri Jos Tessmann pela co-orientao e conselhos durante a execuo deste trabalho.

Ao Dr. Nelson Sato e a toda equipe da Med Line que me acolheram na empresa durante o primeiro ano de Mestrado, perodo este em que no fui contemplado com bolsa de estudos.

Aos professores e pesquisadores: Dr. Robert W. Barreto, da Universidade Federal de Viosa, Dr. Gilson Soares da Silva, da Universidade Estadual do Maranho, Dr. Luiz Sebastio Poltronieri, pesquisador do Centro de Pesquisa Agropecuria do Trpico mido-CPATU e ao Dr. lvaro Manoel Rodrigues Almeida pesquisador do Centro Nacional de Pesquisa de Soja-CNPSo, pela concesso dos isolados de C. cassiicola utilizados neste trabalho.

A todos aqueles que, direta ou indiretamente, contriburam para a realizao deste trabalho.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), pela concesso de bolsa de estudos.

iii

BIOGRAFIA

RICARDO RIBEIRO DE OLIVEIRA, filho de Juracy Aparecido de Oliveira e Arlete Ribeiro de Oliveira, nascido em Mandaguari, Estado do Paran, aos 26 dias do ms de abril de 1976. Em 1994, formou-se em Tcnico em Agropecuria pela Escola Agrotcnica Federal de Muzambinho, no Estado de Minas Gerais. Iniciou o curso de Agronomia na Universidade Federal de Viosa, Minas Gerais, em 1996, graduando-se em setembro de 2002. Em maro de 2003, iniciou o curso de Mestrado em Agronomia na rea de Proteo de Plantas na Universidade Estadual de Maring (UEM), Maring, Paran.

iv

NDICE

RESUMO............................................................................................................ ABSTRACT......................................................................................................... 1. INTRODUO................................................................................................ 1.1. Objetivos................................................................................................. 2. REVISO DE LITERATURA.......................................................................... 2.1. O patgeno.............................................................................................. 2.2. Corynespora cassiicola no Brasil............................................................ 2.3. Danos econmicos no Brasil................................................................... 2.4. Crescimento, esporulao e mtodos de inoculao............................. 2.5. Sobrevivncia e disseminao............................................................... 2.6. Sintomatologia........................................................................................ 2.7. Variabilidade morfolgica x ambiente..................................................... 2.8. Patogenicidade....................................................................................... 3. MATERIAL E MTODOS............................................................................... 3.1. Local dos experimentos.......................................................................... 3.2. Obteno dos isolados de Corynespora cassiicola................................ 3.3. Espcies de plantas utilizadas nos experimentos de patogenicidade.... 3.4. Obteno de isolados............................................................................. 3.6. Avaliao das caractersticas culturais...................................................

vii ix 1 2 3 3 4 4 6 7 9 10 12 14 14 14 16 16 18

3.5. Culturas monospricas............................................................................ 17 3.6.1. Avaliao do crescimento micelial e da colorao das 18 colnias............................................................................................ 3.6.2. Avaliao da esporulao................................................................ 3.6.3. Avaliao da formao de clamidsporos....................................... 3.6.4. Caracterizao morfolgica de condios.......................................... 3.6.4.2. Caracterizao morfolgica de condios produzidos in vivo..... 3.7.1. Produo de mudas......................................................................... 19 19 20 20 22

3.6.4.1. Caracterizao morfolgica de condios produzidos in vitro..... 20 3.7. Patogenicidade........................................................................................ 21 3.7.2. Preparo do inculo, inoculao e avaliaes................................... 22

3.7.3. Agressividade de isolados de Corynespora cassiicola a hbridos de pepino tipo japons.................................................................. 4. RESULTADOS............................................................................................... 4.1. Avaliao das caractersticas culturais................................................... 4.1.1. Avaliao do crescimento micelial e da colorao das colnias............................................................................................ 4.1.2. Avaliao da esporulao................................................................ 4.1.3. Avaliao da formao de clamidsporos....................................... 4.1.4. Caracterizao morfolgica de condios.......................................... 4.1.4.1. Caracterizao morfolgica de condios produzidos in vitro..... 4.1.4.2. Caracterizao morfolgica de condios produzidos in vivo..... 4.2. Patogenicidade........................................................................................ 4.2.1. Agressividade de isolados de Corynespora cassiicola a hbridos de pepino tipo japons.................................................................. 5. DISCUSSO................................................................................................... 6. CONCLUSES............................................................................................... 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................... 8. APNDICE.....................................................................................................

24 26 26 26 26 27 31 31 32 37 38 45 52 54 61

vi

RESUMO

OLIVEIRA, Ricardo Ribeiro de. CARACTERIZAO MORFOLGICA, FISIOLGICA E PATOGNICA DE ISOLADOS DE Corynespora cassiicola (BERK. & CURT) WEI. Universidade Estadual de Maring, fevereiro de 2005. Professor Orientador: Joo Batista Vida. Professor Co-orientador: Dauri Jos Tessmann

O patgeno Corynespora cassiicola, anteriormente relatado como de menor importncia, nos ltimos anos, vem assumindo maior destaque para algumas culturas de interesse econmico. Culturas como soja, pepino, tomateiro e mamoeiro tm sofrido danos expressivos. O objetivo deste trabalho foi avaliar e identificar diferenas morfolgicas e patognicas de 15 isolados de C. cassiicola originados de diversos hospedeiros e regies do Brasil. Os isolados foram avaliados quanto s caractersticas das colnias, taxa de crescimento micelial, esporulao, formao de clamidsporos, dimenses de condios (comprimento, largura e nmero de pseudo-sptos), bem como a forma e curvatura destes. Alm disso, a patogenicidade dos isolados foi avaliada atravs de inoculaes em 12 diferentes hospedeiros. A severidade de diferentes isolados de C. cassiicola em quatro hbridos de pepino tipo japons tambm foi avaliada. As colnias apresentaram colorao que variaram de cinza-claro a olivceo e diferenas significativas na taxa de crescimento micelial e esporulao. Dentre os isolados analisados, sete foram capazes de produzir estruturas de resistncia (clamidsporos) em meio de cultura artificial. Os condios dos diferentes isolados de C. cassiicola apresentaram dimenses de 48,1-125,4 x 5,8-8,1m, nmeros mdios de pseudo-septos de 2,9-9,7, forma cilndrico a obclavado e curvatura reto a curvado, quando produzidos em meio de cultura BDA (batata-dextrose-gar). Os condios de um isolado quando produzidos in vivo foram caracterizados. Esses apresentaram dimenso mdia de 9,2-181,8m, nmero mdio de pseudo-septos de 10,5, forma cilndrico a obclavado e curvatura reto a curvado. De acordo com as caractersticas de condios, todos os isolados se enquadraram na espcie C. cassiicola. A grande maioria dos condios vii

apresentou a base arredondada e poucos com base truncada quando produzidos em meio de cultura BDA. A patogenicidade dos isolados foi avaliada atravs de inoculaes de suspenso de condios (1 x 104 condios/mL). Todos os isolados foram capazes de infectar seu hospedeiro de origem; no entanto, a maioria dos isolados demonstrou elevada

inespecificidade. Isolados de cucurbitceas apresentaram maior gama de hospedeiros (9 espcies), enquanto os isolados de alface e trapoeraba as menores (2 espcies). Isolados de pepino japons no diferiram quanto capacidade de infectar outros hospedeiros, ao contrrio dos isolados de soja. Isolados originados de pepino japons foram significativamente mais agressivos aos hbridos de pepino japons testados, sendo, o hbrido tsuyataro que apresentou maior suscetibilidade aos isolados. Os hbridos de pepino, hokushin e samurai, foram suscetveis a quatro dos sete isolados testados, enquanto os hbridos natsubayashi e samurai foram suscetveis a todos. Devido s diferenas na agressividade dos isolados aos hbridos de pepino, uma maior adaptao dos isolados de pepino para os hbridos sugerida, uma vez que foram significativamente mais agressivos que os demais isolados. Dois padres de leses foram observados em quatro hbridos de pepino inoculados com sete isolados de C. cassiicola. Leses com encharcamento s foram causadas por isolados de pepino japons e leses com aspecto spero (ausncia de tecidos encharcados) por isolados originados de outras espcies hospedeiras.

viii

ABSTRACT

OLIVEIRA, Ricardo Ribeiro de. MORPHOLOGYCAL, PHYSIOLOGYCAL AND PATHOGENIC CHARACTERIZATION OF Corynespora cassiicola (BERK. & CURT) WEI. ISOLATES. Universidade Estadual de Maring, february 2005. Adviser: Joo Batista Vida. Co-adviser: Dauri Jos Tessmann

Corynespora cassiicola, a fungal plant pathogen initially having minor importance to agriculture in Brazil, has increased his damages to several crops, such as soybean, cucumber, tomato and papaya, in the last decade. The objective of this study was to characterize the morphology and pathogenic variability among 15 isolates of C. cassiicola originated from several hosts and collected in several regions of Brazil. The morphological characterization was based on colony morphology, mycelial growth, sporulation in vitro, formation of chlamydospores, and shape, size and septation of conidia. For evaluating pathogenicity, the isolates were inoculated on 12 different hosts under controlled conditions, through a conidial suspension (1 x 10 conidia/mL). Additionally, the severity of isolates was evaluated on four cucumber hybrids. The morphology and cultural features of isolates were evaluated on potatodextrose-agar medium. The colonies of C. cassiicola showed variation on colony color ranging from gray-clear to olivaceous, and significant differences on mycelial growth and sporulation. Only seven isolates produced
4

chlamydospores in culture. The size of conidia were 125-48 x 8-5m, with average numbers of pseudo-septa of 9,7-2,9. The conidial shape varied from cylindrical to obclavate, and from straight to curved. Conidia of one isolate were also characterized when produced in vivo. These showed the size of 181 x 9m, 10 pseudosepta, and shape ranging from cylindrical to obclavade, straight to curved. Based on the characteristics of conidia, all isolates were identified as C. cassiicola. The majority of conidia had the base cell rounded, not truncate. All fungal isolates were pathogenic to their original hosts; however, the pathogenicity of most of isolates were not specific to their hosts of origin. The Isolates from cucurbits showed larger host range, while isolates from lettuce

ix

and Commelina bengalensis had minor host range. All isolates from cucumber were pathogenic to the same hosts. The Isolates from cucumber were significantly more aggressive to the cucumber hybrids that the isolates from other hosts. The hybrid Tsuyataro showed larger susceptibility to the cucumber isolates (P=0.05%). The cucumber hybrids Hokushin and Samurai were susceptible only to four among the seven isolates evaluated; while the hybrids Natsubayashi and Samurai were susceptible to all tested isolates. Based on the fact that the aggressiveness of isolates from cucumber were greater than the other isolates, it may be possible that such isolates are more adapted to their hosts than the other isolates. The cucumber hybrids showed two typical symptoms: wet necrosis, caused only by isolates from cucumber, and non-wet, or dried necroses, caused by the isolates not from cucumber.

1. INTRODUO

O patgeno Corynespora cassiicola foi relatado em associao com mais de 70 espcies de plantas hospedeiras, freqentemente causando manchas foliares, distribudas em diversas regies de clima tropical e subtropical. Devido a ampla gama de hospedeiros e sua distribuio ao longo de todo mundo, C. cassiicola passou a ser considerada uma espcie cosmopolita e inespecfica (Ellis, 1971; Onesirosan et al., 1974; Silva, et al., 1995). O patgeno vem assumindo grande importncia, causando danos em culturas extensivas e tambm em ambientes protegidos. Em 1989, Yorinori relatou que C. cassiicola, agente causal da mancha alvo e da podrido radicular em soja, vem assumindo uma posio de maior destaque para a cultura, principalmente naquelas regies com elevadas precipitaes e que praticam o plantio direto. Verzignassi et al. (2003) constataram a ocorrncia de C. cassiicola em estufas plsticas na regio Norte do Estado do Paran em culturas de pepino tipo japons. Segundo os autores, o patgeno anteriormente relatado como de pouca importncia para a cultura em ambiente protegido, veio a se tornar um dos mais importantes e destrutivos para esta cultura nesta modalidade de cultivo, onde, estimativas de perdas mostraram uma reduo na produo de em torno de 60%. Os autores ainda relataram que fungicidas utilizados para outras doenas foliares, bem como outras prticas de manejo da cultura, no tm apresentado resultados eficientes no controle desta doena. A taxonomia de C. cassiicola baseada em caractersticas morfolgicas de condios e conidiforos (Ellis, 1971). O autor ainda descreve uma ampla variao para as estruturas e coloraes de colnias, que podem variar de cinza ao marrom. Diferenas nas dimenses estabelecidas pelo autor acima citado foram constatadas por Gasparotto et al. (1988) e Ferreira & Alfenas (1980). Os autores atriburam essas diferenas s mudanas nas condies ambientais, citando a umidade relativa como um dos fatores principais. 1

Quanto patogenicidade, isolados de C. cassiicola, em algumas regies do Brasil, tm causado perdas significativas na produtividade atravs de danos em caules, folhas, flores e frutos, tornando este patgeno uma preocupante ameaa para vrias espcies de interesse agronmico. Espcies cultivadas a cu aberto, tais como soja (Gycine max), mamoeiro (Carica papaya), seringueira (Hevea brasiliensis) e aceroleira (Malpighia glabra), e, em ambiente protegido, pepino (Cucumis sativus) e tomateiro (Lycopersicon esculentum), tm sofrido perdas na produtividade e depreciao de frutos. Alm das plantas cultivadas, plantas daninhas comumente associadas s reas de produo comercial, como trapoeraba, assa-peixe e lantana, tambm foram reportadas como possveis hospedeiras e fonte de inculo do patgeno, uma vez que plantas de trapoeraba e assa-peixe foram consideradas suscetveis a isolados de C. cassiicola originados do tomateiro (Gasparotto et al.,1988; Leroy e Lourd, 1989; Siviero et al., 1995; Silva, et al., 1997; Yorinori & Bidia, 1998; Rgo & Carrijo, 2000; Cutrim & Silva, 2003; Verzignassi et al., 2003; Viana et al., 2003). Somando esses relatos possibilidade de um isolado infectar diferentes hospedeiros de interesse econmico (Olive, et al., 1945; Spencer & Walters, 1969; Duarte et al., 1983; Cutrim & Silva, 2003), faz do estudo de patogenicidade uma fundamental ferramenta para se estabelecer estratgias de controle visando o manejo integrado de doenas causadas por C. cassiicola.

1.1. Objetivos

a) Avaliar a variabilidade morfolgica e fisiolgica de 15 isolados de C. cassiicola originados de diferentes espcies de hospedeiros

cultivados e de plantas daninhas. b) Verificar a patogenicidade de 15 isolados de C. cassiicola para diferentes espcies hospedeiras. c) Avaliar a severidade da doena em quatro hbridos comerciais de pepino tipo japons, quando inoculados com sete diferentes isolados de C. cassiicola.

2. REVISO DE LITERATURA

2.1. O patgeno

Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei, uma espcie de fungo tradicionalmente classificada no Filo Deuteromycota, classe Hyphomycetes e famlia Dematiaceae. A literatura mais recente considera a espcie no grupo dos fungos Mitospricos (Hawksworth et al. 1995). As sinonmias para a espcie so: Helminthosporium cassiicola Berk. & Curt., H. papayeae, H. sydow, H. vignae Olive, Cercospora melonis Cooke, C. vignicola Kawamura, Corynespora manzei Gussow e C. melonis (Cooke) Lindau (Wei, 1950; Ellis, 1971; Holliday, 1980, citado por Santos et al., 1997). A fase teleomrfica para C. cassiicola ainda desconhecida (Hawksworth et al., 1995). Este patgeno atualmente se encontra associado a mais de 70 espcies de diferentes hospedeiros distribudos em diversos pases de clima tropical e subtropical (Silva et al., 1995). Devido a sua ampla gama de hospedeiros e distribuio ao longo do mundo, em 1971, Ellis descreveu C. cassiicola como sendo uma espcie cosmopolita e inespecfica, comum e abundante em regies tropicais. Este autor relata ainda as seguintes plantas reconhecidamente hospedeiras do patgeno: feijo-de-corda (Vigna sinensis), pepino (Cucumis sativus), meloeiro (Cucumis melo), gergelim (Sesanum indicum), soja (Glycine max), mandioca (Manihot esculenta), mamoeiro (Carica papaya), seringueira (Hevea brasiliensis) e tomateiro (Lycopersicon

esculentum). Outros autores relataram outras espcies como hospedeiras de C. cassiicola: algodo (Gossypium spp.) (Jones, 1961), berinjela (Solanum melongena) (Onesirosan et al., 1974), fumo (Nicotiana tabacum) (Fajola & Alasoadura, 1973), cacaueiro (Theobroma cacau L.) (Silva, 2000) e pepino (C. sativus) (Blazquez, 1967, citado por Silva et al., 1998).

2.2. A espcie Corynespora cassiicola no Brasil

No Brasil, C. cassiicola foi relatado causando danos em diversas espcies de plantas, algumas com maior destaque, como culturas de grande interesse comercial, algumas ornamentais, hortalias e plantas daninhas, como por exemplo: culturas como soja (Kiihl, 1974, citado por Yorinori & Homechin, 1977; Almeida et al., 1976), pepino (Verzignassi et al., 2003; Martins, et al., 2003), tomateiro (Leroy & Lourd, 1989; Poltronieri, et al., 1994), seringueira (Gasparotto et al., 1988), cacaueiro (Duarte et al., 1978), mamoeiro (Duarte et al., 1983), aceroleira (Malpighia glabra L.) (Silva et al., 1997), gergelim (Wulff & Pascholati, 1997), pimenta longa (Piper hispidinervium C. DC.) (Poltronieri et al., 1997), alface (Lactuca sativa L.) {(Poltronieri (comunicao pessoal)1}, falso-boldo (Coleus barbatus) (Fernandes & Barreto, 2003) e hortnsia (Hydrangea sp.) (Leite & Barreto, 1997). C. cassiicola ainda citado como patgeno em algumas plantas daninhas, tais como, trapoeraba (Commelina benghalensis), assa-peixe (Vernonia cinerea) e lantana (Lantana camara) e, nestes casos, quando no devidamente bem manejado, poder servir como fonte de inculo para outras culturas agronmicas (Pereira & Barreto, 2000; Souza & Silva, 2001;.Cutrim & Silva, 2003).

2.3. Danos econmicos no Brasil

Em lavouras de soja, o patgeno foi identificado pela primeira vez no Estado de Mato Grosso (Kiihl, 1974, citado por Yorinori & Homechin, 1977). No Estado de So Paulo, foi identificado por Almeida et al. (1976), que constataram tambm a presena de possveis danos causados pelo patgeno. Durante a safra de 1995/96, essa doena foi observada por Yorinori (1996) em diversas propriedades nos municpios de Cascavel, Castro, Ponta Grossa e Pitanga, no Estado do Paran. O autor ainda relata que a cultivar FT-Estrela foi a mais afetada e que, no Municpio de Pitanga, apresentou desfolha prematura aos 25 dias aps a emergncia e perda de rendimento estimada entre 40 e 45%. Em levantamentos realizados nas safras de 1996/97 e 1997/98, foram

Comunicao pessoal em Novembro/2003.

constatados danos significativos causados por C. cassiicola (Yorinori & Bidia, 1998). Segundo os autores, a mancha alvo, at ento uma doena sem importncia econmica para a soja, naquelas safras as perdas somaram cerca de 50.000t e 125.000t de gros, respectivamente. Um dos principais problemas associados cultura do pepino reside no fato dela ser assolada por diversos patgenos, entre os quais se pode destacar C. cassiicola, principalmente quando ocorrem cultivos sucessivos na mesma rea. O cultivo subseqente, somado adoo de prticas inadequadas de manejo, tem favorecido o surgimento progressivo da doena, anteriormente reconhecida como de menor importncia econmica para a cultura (Verzignassi et al., 2003). Os autores, em 2003, identificaram o fungo em estufas plsticas no Norte do Paran cultivadas com pepino tipo japons no perodo de primavera-vero de 2002, causando epidemias de manchas foliares e acarretando perdas quantitativas, de at 60%, e qualitativas na produo. O patgeno tambm foi constatado causando danos em folhas de pepino do hbrido Hishi Nari na regio de Indaiatuba-SP (Martins et al.; 2003). Segundo Rgo & Carrijo (2000), o patgeno pode ser encontrado em diversas espcies de cucurbitceas, embora seja mais severo em pepino. Perdas significativas na cultura do tomateiro e seringueira na regio Norte do Brasil tambm foram relatadas por Poltronieri et al. (1994) e Gasparotto et al. (1988), respectivamente, causando danos s folhas e, conseqentemente, perdas de produtividade. Em tomateiro, a mancha alvo apresentada como a principal doena foliar do tomateiro na regio de Manaus e tem preocupado os tomaticultores e tcnicos responsveis pelo

desenvolvimento da cultura na Regio (Leroy & Lourd, 1989; Siviero et al., 1995). Em 1972, Duarte et al. (1978) constataram, em plantas de cacaueiro em viveiro, a presena do patgeno causando danos nas folhas.

Posteriormente, os danos passaram a serem evidentes em condies de campo (plantios definitivos). Os autores destacaram que este foi o primeiro relato da enfermidade, em carter endmico, em regies produtoras de cacau no mundo. No Norte do Esprito Santo, a mancha de Corynespora em mamoeiro tem se tornado preocupante, devido alta severidade da doena nas folhas e 5

nos frutos, depreciando-os comercialmente (Andrade et al., 2002). Em 2001, no Estado do Cear, tambm foram observados danos causados por este patgeno na cultura, caracterizados por apodrecimento do caule, com posterior queda dos frutos e morte das plantas. A incidncia da doena na regio afetou mais de 80% das plantas, com significativo comprometimento da produo (Viana et al., 2003). Duarte et al. (1983) citaram o patgeno como de grande importncia em condies de viveiro de mudas de mamoeiro, causando danos em folhas e hastes. Silva et al. (1997), realizando levantamentos de doenas em frutferas em So Luiz (MA), identificaram C. cassiicola infectando folhas de plantas de aceroleria. Os autores relatam que a doena tem progredido rapidamente nesta cultura e manifestaram preocupao com a possibilidade de epidemias futuras e risco para o cultivo de aceroleiras no Estado. Generoso et al. (2002) identificaram a doena no Municpio de Junqueirpolis (SP), em cultivos comerciais de aceroleiras com sistema de irrigao. Os autores ainda relataram a ocorrncia de severa desfolha, que refletiu na produo da safra 2001/02, sendo 38% menor que a safra anterior.

2.4. Crescimento, esporulao e mtodos de inoculao

Condies para crescimento e esporulao de C. cassiicola j foram discutidas por alguns autores. Almeida e Yamashita (1976), estudando a interferncia de seis meios de cultura (alimento infantil Gerber, V-8, extrato de soja, BDA (batata-dextrose-gar), Czapek-gar e malte-gar) e dois regimes de luminosidade (luz contnua e escuro contnuo), sobre o crescimento e a esporulao de um isolado do patgeno oriundo de folhas de soja, concluram que os meios de cultura V-8 e alimento infantil induziram maiores esporulaes, 3,3 x 105 esporos/mL e 3,4 x 105 esporos/mL, respectivamente, sugerindo que fatores de crescimento e vitaminas estejam presentes em maior dosagem nestes meios. Desenvolvendo o mesmo tipo de trabalho, Olive et al. (1945) constataram maior esporulao de C. cassiicola em meio BDA e Czapek-gar. Jayasinghe & Silva (1992), citados por Silva et al. (1998), relataram que o melhor meio para crescimento e esporulao de C. cassiicola foi BDA. Almeida e Yamashita (1976) destacaram que a presena de luz 6

contnua favoreceu o crescimento micelial e a esporulao, concordando com os resultados obtidos por Onesirosan et al. (1975). Roim (2001) relatou que a esporulao de isolados de C. cassiicola de razes e de folhas de soja foi favorecida sob condies de fotoperodo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro. O autor ainda constatou que o crescimento micelial de isolados de folha foi maior em condies de fotoperodo 12 horas de luz e 12 horas de escuro e de isolados de razes o maior crescimento na ausncia de luminosidade. Awoderu (1969) trabalhando com dois isolados de seringueira e um de mamoeiro, e Duarte et al. (1983), dois isolados, sendo um de mamoeiro e outro de cacaueiro, avaliaram a interferncia de meios de cultura na esporulao e obtiveram resultados semelhantes. Ambos autores relataram que a produo de esporos foi mais abundante nos meios Czapek Dox e BDA + 0,1% de extrato de levedura e que a esporulao foi favorecida pela presena de luz contnua. Almeida (1977), avaliando a influncia do pH em meio BDA, sobre o crescimento e esporulao de isolados de soja, em diferentes perodos de incubao, constatou que os valores mximos de crescimento micelial e de esporulao ocorreram na faixa de pH de 6,5 a 7,5 aps 4, 8 e 16 dias de incubao. Spencer & Walters (1969), em estudos para a determinao da faixa ideal de temperatura para o crescimento micelial de isolados de C. cassiicola em meio BDA, observaram que o crescimento mximo ocorreu temperatura de 28 e o mnimo a 40 C C. Almeida e Yamashita (1978) determinaram que a tcnica de inoculao, por atomizao, com suspenso de condios, numa concentrao de 5,0 x 104 esporos/mL, em 3 cultivares de soja, apresentou os melhores resultados, quando comparado com a tcnica de verter junto ao hipoctilo a suspenso de esporos.

2.5. Sobrevivncia e disseminao

Em funo dos relatos de ocorrncia de C. cassiicola infectando plantas daninhas, tais como trapoeraba, assa-peixe e lantana (Pereira & 7

Barreto, 2000; Souza & Silva, 2001; Cutrim & Silva, 2003), e da comprovao da suscetibilidade de plantas de trapoeraba e de assa-peixe a isolados de tomateiro (Souza & Silva, 2001), sugere-se que estas possam servir, no apenas como fonte de inculo, como tambm potenciais hospedeiros alternativos do patgeno. Diferenas na patogenicidade de isolados e severidade da doena, ou seja, a capacidade de infectar diferentes hospedeiros com diferentes nveis de agressividade pode ser de grande importncia quando se objetiva o controle de doenas causadas por C. cassiicola em espcies agronmicas suscetveis. Em um levantamento em sementes de gergelim, armazenadas em diferentes regies do Brasil, por longo perodo, atravs do teste de papel filtro, foi identificado a presena de Corynespora sp. (Faiad et al., 1988). No trabalho, os autores concluram que as sementes podem servir como veculo de disseminao do patgeno. Roim (2001) verificou que o fungo pode ser disseminado atravs de sementes de soja, constituindo-se, portanto, uma alternativa vivel de fonte de inculo e de veiculao do patgeno. Em trabalhos realizados no Laboratrio de Fitopatologia da Universidade Estadual de Maring (UEM), Vida et al. (2004) (Comunicao pessoal)2, atravs do teste de papel de filtro e do teste de transmisso em areia, relataram a presena do patgeno em sementes e a transmisso para plntulas de quatro hbridos de pepino tipo japons. Segundo os autores, o nvel de contaminao chegou a 35% nas sementes do lote do hbrido tsuyataro. Semelhantemente, Hasama et al. (1993), no Japo, verificaram que C. melonis (C. cassiicola) encontrava-se associado interna e externamente s sementes de pepino. Os tipos de associaes encontrados foram o ectoparasitismo ou adeso simples (patgeno na superfcie de semente) e endoparasitismo, onde o fungo estava presente internamente semente na forma de miclio dormente. As sementes infectadas foram responsveis por baixa germinao nos lotes e damping-off em plntulas. Os autores concluram que a transmisso por semente deve ser considerada quando se objetiva o controle da doena no campo. Segundo Wulff & Pascholati (1997), tratando de doenas do gergelim, relataram que o patgeno C. cassiicola pode sobreviver em restos de cultura

Comunicao pessoal em Maro/2004.

por at 10 meses e em hospedeiros alternativos. A sobrevivncia do patgeno em restos culturais, por no mnimo dois anos, em cucurbitceas e em plantas daninhas, tambm foram relatadas por Rgo & Carrijo (2000). Os autores ainda citaram que a disseminao dos esporos do fungo ocorre por correntes de ar, dentro e entre culturas. Avaliando a sobrevivncia de patgenos em restos de culturais de soja, em sistemas de plantio direto e convencional, Almeida et al. (2001) relataram a ocorrncia de C. cassiicola sobrevivendo nestas condies. Olive et al. (1945) relataram a formao abundante de clamidsporos, intercalares e terminais, em colnias velhas e em transferncias sucessivas para meios de cultivo. Clamidsporos, de acordo com Amorim (1995), podem sobreviver por longos perodos de tempo no solo na ausncia do hospedeiro.

2.6. Sintomatologia

Breton et al., em 2000, na Frana, atravs de estudo histolgico, verificaram penetrao rpida de C. cassiicola (12 horas aps a inoculao) atravs da epiderme inferior, em plantas de seringueira. Resultados anlogos foram obtidos por Oluma & Amuta (1999), os quais observaram que a infeco pelo patgeno foi mais rpida e severa quando as folhas de mamoeiro foram inoculadas na face abaxial, quando comparadas com inoculaes na face adaxial. Os locais de ocorrncias de sintomas nas plantas so variveis, bem como o padro de leso apresentado. Essas caractersticas so particulares para cada patossistema formado. Leses em folhas so descritas para maioria das interaes positivas, variando de colorao marrom a marrom-escura, com centro claro, de formato circular com presena de crculos concntricos, irregular a angular, com ausncia ou presena de halos (clorticos, marromavermelhado ou marrom-escuro), e presena de reas com aspecto encharcado, podendo abranger um a 20mm de dimetro. Em alguns casos, podem ocorrer manchas no caule de at 15cm de dimetro e no pecolo, podendo evoluir para cancros de tamanhos variados. Os sintomas ainda podem ocorrer em frutos de mamoeiro (podrido carpelar) e de tomateiro, em vagens de soja e em flores de tomateiro e de hortnsia, sendo ainda, as podrides radiculares descritas em soja (Duarte et al., 1978; Gasparotto et al., 9

1988; Leroy & Lourd, 1989; Almeida et al., 1997; Silva et al., 1997; Trindade & Furtado, 1997; Wulff & Pascholati, 1997; Santos & Freire, 1998; Oluma & Amuta, 1999; Verzignassi et al., 2003).

2.7. Variabilidade morfolgica x ambiente

As estruturas reprodutivas do patgeno (conidiforos e condios), segundo Ellis (1971), so muito variveis quanto s dimenses. Os conidiforos apresentam comprimentos que variam de 110-850m e larguras de 4-11m e os condios apresentam-se solitrios ou em cadeias de 2 a 6, sendo muito variveis quanto ao formato, podendo ser obclavados ou cilndricos e ainda retos ou curvados, com 4-20 pseudo-septos. Quanto s dimenses, os condios podem variar de 40-220m de comprimento e largura de 9-22m. Em meio de cultura artificial, o comprimento dos condios pode alcanar 520m. Assim, essa variabilidade morfolgica observada para as estruturas reprodutivas do patgeno pode ser influenciada no somente por fatores nutricionais, como tambm pelas condies ambientais, como umidade relativa, que pode alterar as dimenses estabelecidas acima. Sob condies naturais, com alta umidade relativa e submetida cmara mida, conidiforos e condios podem ter seus formatos alterados, sendo por vezes difcil a observao dos pseudo-septos dos condios. O fungo, quando cultivado em meio de cultura artificial, pode tambm sofrer variaes das dimenses estabelecidas para a espcie, podendo ser diferente daquelas produzidas in vivo. Ainda em meio de cultura artificial, os conidiforos podem mostrar-se poucos distintos das hifas e dos condios, freqentemente em cadeias, com ampla variao morfolgica individual (Olive et al., 1945; Wei, 1950; Ferreira & Alfenas, 1980; Gasparotto et al., 1988). Em 1945, Olive et al. observaram diferenas morfolgicas entre condios de isolados de feijo-de-corda e soja produzidos em diferentes condies, como meio de cultura artificial, folhas dos hospedeiros em condies naturais e folhas dos hospedeiros colocadas em cmara mida. Eles atriburam essa variabilidade s condies de cada ambiente. Realizando estudos comparativos entre trs isolados de C. cassiicola, dois de seringueira e um de mamoeiro, Awoderu (1969) tambm observou 10

diferenas nas dimenses das estruturas reprodutivas dos isolados. Duarte et al. (1978), estudando as caractersticas morfolgicas das estruturas

reprodutivas do patgeno em cacaueiro, encontraram dois pseudo-septos como nmero mnimo para condios, diferente do descrito na literatura que de quatro. Roim (2001), estudando as caractersticas morfolgicas de condios, de isolados de folhas e de sementes de soja produzidos em meio BDA, tambm verificou diferenas daquelas estabelecidas por Ellis (1971). Isolados de folhas e de razes apresentaram, respectivamente, larguras mdias de 7,85m e 7,13m, enquanto que os valores mdios de pseudo-septos para estes isolados foram de 2,45 e 1,66. Tambm estudando estas caractersticas, em dois isolados, originados de mamoeiro e de cacaueiro, em meio BDA, Duarte et al. (1983) observaram, respectivamente, que os valores mnimos mensurados de comprimento (28 e 32m), largura (8 e 4m) e nmero de pseudo-septos (2) para ambos isolados estavam fora dos limites estabelecidos para a espcie. Semelhantemente, Leroy & Lourd (1989), caracterizando um isolado de tomateiro, em meio BDA, constataram o nmero mnimo de pseudo-septos de 1 e o menor valor de largura de 6m, cujos valores encontram-se fora dos padres para a espcie. Caracterizando morfologicamente 27 isolados de C. cassiicola, Silva et al. (1998) encontraram valores para o comprimento de condios que variaram de 20 a 250m, estando o valor menor fora dos padres descritos por Ellis (1971). Caracterizando um isolado originado de pepino na Coria, Kwon et al. (2003) observaram valores de comprimento (22-300m) e largura (5-10m) para condios que, em parte, esto fora do padro para a espcie. Diferenas na morfologia e nas caractersticas culturais tambm foram observadas por Roim (2001), caracterizando isolados originados de soja. Casos de variabilidades morfolgicas de condios e de conidiforos podem ser observadas em outros trabalhos (Volin & Pohronezny, 1989; Poltronieri et al., 2003). Entretanto, essas diferenas, para nenhum dos autores citados, foram suficientes para que os isolados estudados fossem considerados espcies diferentes ou novas.

11

2.8. Patogenicidade

A patogenicidade de C. cassiicola a dezenas de espcies de plantas citada por outros autores (Ellis, 1971; Silva et al., 1995; entre outros). A capacidade de um isolado do patgeno em infectar diferentes hospedeiros evidencia diferenas de patogenicidade dentro da espcie. Essas diferenas foram utilizadas por Olive et al. (1945) na proposio de duas raas para a espcie, baseando-se nos tipos de leses produzidas nos hospedeiros: a raa 1 isolada de feijo-de-corda e a raa 2, de soja. Spencer e Walters (1969), confirmaram os resultados obtidos por Olive et al. (1945), testando 14 isolados de quatro diferentes hospedeiros, em 24 espcies de plantas. Semelhante a esta situao, Duarte et al. (1983), em estudos com dois isolados de C. cassiicola, um de cacaueiro e outro de mamoeiro, observaram diferenas quanto patogenicidade em inoculaes sobre plantas de mamoeiro, cacaueiro, caupi e seringueira. Estes autores tambm sugerem a existncia de duas raas, baseado na capacidade de infectar diferentes hospedeiros. Ainda, segundo os autores, o isolado originado de mamoeiro foi capaz de infectar plantas de mamoerio, caupi e seringueira. J, o isolado de cacaueiro infectou apenas plantas de cacaueiro. O termo raa, utilizado pelos autores acima citados, no condiz com a concepo da terminologia, pois populaes de fungos fitopatgenos semelhantes na morfologia e separados pela

especificidade que apresentam, em nvel de espcie ou de gnero de hospedeiros, so tratadas como formae specialis (Camargo, 1995). Isolados de soja mostraram-se desiguais quanto patogenicidade em soja, admitindo-se a possibilidade da existncia de bitipos ou de espcies diferentes de C. cassiicola (Roim, 2001). Visando testar um isolado de C. cassiicola de lantana no controle biolgico da planta invasora L. camara, Pereira et al. (2003), em testes de patogenicidade do isolado e de outros trs isolados (hortnsia, trapoeraba e tomateiro), observaram que, a exceo do isolado de tomateiro, todos foram patognicos apenas a seus hospedeiros originais. O isolado de lantana, no foi capaz de infectar todos bitipos de lantana utilizados nos testes. A especificidade do isolado pelo seu hospedeiro original, observado pelos

12

autores, no foi constatada em outros trabalhos envolvendo diversos outros isolados (Olive et al., 1945; Spencer & Walters, 1969; Duarte et al., 1983). Diferenas na patogenicidade de isolados de C. cassiicola tambm foram observadas por Cutrim & Silva (2003), que utilizaram dois isolados de folhas de tomateiro para inocular diferentes espcies de plantas, entre elas duas espcies de plantas daninhas. Os dois isolados de tomateiro inoculados reagiram de forma diferente quanto patogenicidade, causando danos na maioria das espcies. O fato de isolados de tomateiro infectarem diferentes espcies de plantas corroboram, em parte, com os resultados obtidos por Pereira et al. (2003), em que um isolado de tomateiro infectou, alm de plantas de tomate, duas plantas de lantana originadas de diferentes localidades e uma de Vitex trifolia. A avaliao da patogenicidade de um isolado de C. cassiicola, originado de trapoeraba, inoculado em 54 espcies de plantas pertencentes a 30 famlias botnicas, foi realizado por Lustosa (2000). O isolado, alm de trapoeraba, tambm infectou plantas de soja, cultivar UFV-16. Silva et al. (1998), estudando a patogenicidade de 21 isolados de C. cassiicola, dos quais cinco eram procedentes da Austrlia, sendo trs de mamoeiro, um de mimosa e outro de tomilho, e 16 isolados procedentes do Sri Lanka, coletados de diferentes clones de seringueira, constataram diferenas entre eles, quando inoculados em plantas de feijo-de-corda, berinjela, tomateiro e trs clones de seringueira. Todos isolados foram patognicos ao tomateiro (var. Hayslip); porm, foram observadas diferenas na virulncia desses isolados. Somente alguns isolados foram patognicos berinjela, e aqueles isolados mais virulentos em tomateiro tambm o foram para berinjela. Todos isolados de Sri Lanka foram patognicos ao feijo-de-corda, enquanto os isolados da Austrlia no foram patognicos a esta espcie. Alm disso, todos isolados da Austrlia e Sri Lanka foram patognicos aos trs clones de seringueira (RRIC100, RRIC52 e RRIC104); contudo, a agressividade de cada isolado foi varivel para cada patossistema estabelecido. Em 2003, Silva et al., utilizando anlises de RAPD-PCR em 42 isolados de C. cassiicola, de diferentes plantas hospedeiras, identificaram cinco grupos genticos. Os resultados indicaram a existncia de variao gentica entre isolados de C. cassiicola coletados de diferentes plantas.

13

3. MATERIAL E MTODOS

3.1. Local dos experimentos

Os experimentos foram conduzidos no Departamento de Agronomia, (Laboratrio de Proteo de Plantas e casas-de-vegetao), localizado no Campus da Universidade Estadual de Maring (UEM), em Maring, PR, no perodo de janeiro a novembro de 2004. O delineamento estatstico adotado para todos os experimentos foi do tipo inteiramente casualizado (DIC), com o nmero de repeties variando de cinco a seis por tratamento. Os resultados obtidos em cada experimento, quando necessrio, foram submetidos anlise estatstica pelo programa SISVAR, verso 4.6. As mdias das repeties dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Scott-Knott a 5% de significncia.

3.2. Obteno dos isolados de Corynespora cassiicola

Os isolados do patgeno utilizados nos experimentos foram obtidos atravs de isolamentos do prprio hospedeiro, efetuados no Laboratrio de Proteo de Plantas da Universidade Estadual de Maring, ou por cesso realizada por Centros de Ensino e Pesquisa. Os isolados do fungo provenientes do pepino foram obtidos a partir de folhas de hbridos de pepino tipo japons da Regio de Norte do Estado do Paran, em reas de produo comercial, em cultivo protegido. As folhas de pepino apresentando sintomas de mancha alvo foram coletadas e levadas para o laboratrio, onde foram realizados os isolamentos e obtidas as culturas puras do patgeno. Os isolados de C. cassiicola de lantana, trapoeraba e falso-boldo foram cedidos pelo professor Dr. Robert W. Barreto, da Universidade Federal de Viosa. Os isolados de mamoeiro e de assa-peixe, pelo professor Dr. Gilson S. da Silva, da Universidade Estadual do Maranho. Os isolados de alface,

14

tomateiro, aceroleira, abbora e de pimenta-longa, pelo Dr. Luiz Sebastio Poltronieri Pesquisador da EMBRAPA (Centro de Pesquisa Agropecuria do Trpico mido-CPATU. Os isolados de soja, pelo Dr. lvaro M. R. Almeida, Pesquisador do Centro Nacional de Pesquisas de Soja-CNPSo. Todos os isolados foram mantidos em geladeira 82C para serem utilizados durante os experimentos (Quadro 1).

Quadro 1 Isolados de Corynespora cassiicola obtidos de diversos hospedeiros e localidades utilizados nos experimentos. UEM, Maring, PR, 2005

Isolados IA PB JQ 493AA 777AA JMP220 CP03 RWB321 GS01 GS02 LP01 LP02 LP04 LP05 LP07

Hospedeiros Pepino japons Pepino japons Pepino japons Soja Soja Lantana camara Trapoeraba Falso-boldo Mamoeiro Assa-peixe Alface Tomateiro Aceroleira Abbora Pimenta longa

Procedncia Paran Paran Paran Paran Paran Minas Gerais Minas Gerais Minas Gerais Maranho Maranho Amazonas Amazonas Amazonas Amazonas Amazonas

15

3.3.

Espcies de plantas patogenicidade

utilizadas

nos

experimentos

de

Foram utilizadas durante os experimentos diversas espcies de plantas (Quadro 2), que foram selecionadas por serem relatadas como hospedeiras do fungo, como culturas de importncia econmica para a Regio, por estarem constantemente associadas em cultivos consecutivos, consorciadas ou cultivadas em reas prximas. No caso das plantas daninhas, por estarem sempre presentes nos cultivos ou nos arredores. Estas plantas foram utilizadas nos experimentos de patogenicidade com os diversos isolados citados no item 3.2.

3.4. Obteno de isolados

Folhas de pepino, apresentando sintomas de mancha de Corynespora, foram coletadas em propriedades rurais em cultivos protegidos e levadas at o Laboratrio de Proteo de Plantas-UEM. Essas foram incubadas por 48 horas em cmara mida contendo folhas de papel filtro umedecidas com gua destilada. Decorrido o perodo, com o auxlio de um microscpio

estereoscpica, observou-se a formao de estruturas reprodutivas do patgeno nos locais das leses e, com o auxlio de estilete esterilizado, foram coletadas e transferidas para placas-de-Petri contendo o meio de cultura BDA (batata-dextrose-gar). Essas placas foram mantidas em cmaras climatizadas do tipo BOD, numa temperatura de 242C, durante trs dias. Decorrido o perodo, foi observado o crescimento fngico em locais especficos, que foram repicados individualmente para placas contendo BDA e acondicionados nas condies anteriormente descritas, por 15 dias, obtendo-se assim culturas puras.

16

Quadro 2 - Plantas utilizadas nos testes de patogenicidade de isolados de Corynespora cassiicola realizados em casa-de-vegetao. UEM, Maring, PR, 2005

Plantas Pepino Pepino Pepino Pepino Meloeiro Abbora Soja Alface Tomateiro Mamoeiro Trapoeraba Assa-peixe

Hbridos ou variedades ou espcies Hokushin/Cucumis sativus Natsubayashi/C. sativus Tsuyataro/C. sativus Samurai/C. sativus Sunrise/C. melo Exposio/Cucurbita maxima FT-estrela/Glycine max Vera/Lactuta sativa Santa Clara/Lycopersicon esculentum Sunrise-Hawai/Carica papaya Commelina benghalensis Vernonia sp.

3.5. Culturas monospricas

As culturas puras dos isolados, obtidas conforme descrito no item 3.4, com idades variando de 10 a 15 dias, em placas-de-Petri contendo BDA, foram utilizadas para a obteno das culturas monospricas, adicionando-se 8 mL de gua destilada e esterilizada cultura fngica e, com o auxlio de ala de Drigalski, a superfcie da colnia foi raspada e a suspenso obtida filtrada em camada dupla de gaze. O sobrenadante foi coletado em recipiente esterilizado e a concentrao de esporos foi determinada atravs da cmara de Neubauer e ajustada para 1 x 104 esporos/mL. Em seguida, uma alquota de 1 mL foi retirada e transferida para uma placa-de-Petri contendo gar-gua (2%) e espalhada com o auxlio de ala de Drigalski. As placas foram incubadas por trs horas em cmara climatizada do tipo BOD numa temperatura de 242C. Em seguida, com auxlio de um microscpio estereoscpico, quatro condios germinados foram transferidos,

17

com auxlio de pipeta de Pasteur, para placas-de-Petri contendo BDA, de forma que ficassem distribudos equidistantemente. As placas foram novamente incubadas nas condies acima citadas, sob luz fluorescente contnua, por trs dias. Aps esse perodo, foi observado um pequeno crescimento micelial nos locais para os quais os esporos germinados foram transferidos. Fragmentos desse crescimento micelial foram transferidos para placas-de-Petri contendo BDA (um fragmento por placa) e incubados novamente nas condies acima citadas. Aps 10 dias, foi realizada a repicagem dos isolados para tubos de ensaio contendo BDA e incubados por 10 dias, nas mesmas condies citadas anteriormente. Posteriormente, os tubos (trs tubos originados de um mesmo esporo por isolado) foram mantidos em geladeira numa temperatura de 82C para serem utilizados durante os experimentos.

3.6. Avaliao das caractersticas culturais

3.6.1. Avaliao do crescimento micelial e da colorao das colnias

Os isolados monospricos de C. cassiicola, acondicionados em tubos e mantidos em geladeira, como descrito no item 3.5., foram transferidos para meio de cultivo. Com o auxlio de uma ala, fragmentos de miclio foram retirados dos tubos e transferidos para placas-de-Petri contendo BDA, que foram incubadas por cinco dias em cmara climatizada do tipo BOD, sob luz fluorescente contnua, numa temperatura de 242C. Aps o perodo, discos de meio de cultura contendo miclio de 0,5 cm de dimetro foram retirados e transferidos novamente para placas-de-Petri contendo BDA, que foram incubadas nas mesmas condies citadas anteriormente. As mensuraes do crescimento micelial foram realizadas com o auxlio de uma rgua milimetrada a cada 24 horas, em sentidos diametralmente opostos, at o dcimo dia, quando o primeiro isolado atingiu a borda da placa-de-Petri. Neste momento, considerou-se a avaliao do crescimento micelial encerrada. O experimento foi instalado em DIC (delineamento inteiramente casualizado), com cinco repeties por tratamento, sendo que uma placa-de-Petri foi considerada uma

18

unidade experimental. Paralelamente foram realizadas avaliaes quanto colorao das colnias.

3.6.2. Avaliao da esporulao

Aps a ltima avaliao do ensaio descrito no item 3.6.1., foi procedida contagem de esporos de cada repetio e de cada isolado do referido ensaio. Foram adicionados 8 mL de gua destilada e esterilizada por placa e a superfcie do meio de cultivo raspada com o auxlio de uma ala de Drigalski, obtendo-se, assim, suspenso de fragmentos de miclio e condios. Em seguida, a suspenso foi filtrada em camada dupla de gaze. As suspenses de condios foram homogeinizadas e, em seguida, uma alquota foi depositada na cmara de Neubauer (hemacitmetro), para a determinao da concentrao de condios (condios/mL) de cada repetio e para cada isolado. Foram realizadas duas leituras de concentrao para cada isolado.

3.6.3. Avaliao da formao de clamidsporos

Para a avaliao da formao de clamidsporos, os 15 isolados de C. cassiicola, citados no Quadro 1, mantidos conforme o item 3.4., foram transferidos para placas-de-Petri e incubados por cinco dias em cmara climatizada do tipo BOD, sob luz fluorescente e contnua, numa temperatura de 242C. Aps o perodo de incubalo, discos de meio de cultura, contendo miclio, de 0,5 cm de dimetro, foram transferidos para placas-de-Petri com BDA e incubadas nas mesmas condies citadas anteriormente, durante 15 dias. Posteriormente, lminas foram preparadas com fragmentos de miclio obtidos de diversos pontos das colnias e observadas em microscpio ptico. Foram mensurados 50 clamidsporos, casualizadamente entre os isolados que apresentaram as estruturas. O experimento foi instalado em DIC (delineamento inteiramente casualizado), com cinco repeties por tratamento, sendo que uma placa-de-Petri foi considerada uma unidade experimental.

19

3.6.4. Caracterizao morfolgica de condios

3.6.4.1. Caracterizao morfolgica de condios produzidos in vitro

Aps a ltima avaliao do experimento descrito no item 3.6.1. (antes da avaliao da esporulao), com o auxlio de uma ala, fragmentos de crescimento micelial foram retirados (de quatro diferentes pontos da colnia), que foram transferidos para lminas de microscopia. Em seguida, procedeu-se fixao com azul de algodo e observao ao microscpio ptico, dotado de ocular micromtrica, no aumento de 400-1000x, para a mensurao das dimenses dos condios dos diferentes isolados. Foram mensuradas as seguintes dimenses dos condios:

comprimento, largura (regio mediana) e nmero de pseudo-septos. Quanto ao formato, foram divididos quanto forma (obclavado ou cilindrico) e curvatura (reto ou curvado). Para cada repetio, foram mensurados 50 condios, perfazendo um total de 250 condios para cada isolado. Somente foram mensurados condios soltos dos conidiforos, unitrios e com septao bem definida.

3.6.4.2. Caracterizao morfolgica de condios produzidos in vivo

Os isolados do patgeno, originados de hbridos de pepino japons, foram coletados como descrito no item 3.2. na regio de Maring, PR. Para observar possveis diferenas entre as caractersticas morfolgicas de condios produzidos em meios de cultura e em hospedeiro vivo suscetvel, um isolado de pepino (JQ) foi utilizado a caracterizao. Fragmentos de miclio de cultura monosprica acondicionados em tubos, conforme o item 3.5., foram transferidos para placas-de-Petri, contendo meio BDA e incubadas por cinco dias nas condies anteriormente citadas. Decorrido o perodo, discos de miclio foram transferidos para novas placas contendo BDA e, novamente, incubadas por 15 dias. Passado o perodo, foi obtida suspenso de esporos do isolado JQ, que foi ajustada para a concentrao de 1 x 104 esporos/mL para serem inoculadas nas plantas de hbridos de pepino tipo japons. Para a produo das plantas, sementes de pepino do hbrido Tsuyataro foram 20

semeadas em bandejas de isopor contendo substrato comercial. As plantas foram transplantadas para sacos plsticos contendo substrato solo:areia na proporo 1:1 (V/V), uma planta por vaso. Utilizando-se atomizador De Vilbs n15, a suspenso de condios foi atomizada sobre seis plantas de pepino at o ponto prximo ao escorrimento e em ambas as faces foliares, abaxial e adaxial, no momento em que estas apresentavam duas folhas definitivas. Em seguida, as plantas foram incubadas em cmara mida por 48 horas em casa-devegetao. Em torno de 48 horas aps a inoculao, foram observadas vrias leses nos limbos foliares inoculados, leses estas caractersticas da doena. As folhas com sintomas foram coletadas aps cinco dias, a contar da inoculao, momento em que as leses estavam bem desenvolvidas, e foram acondicionadas em cmara mida por 48 horas, no Laboratrio de Proteo de Plantas, temperatura ambiente. Aps o perodo, do centro das leses, estruturas do patgeno foram transferidas para lminas de microscopia, fixadas com azul de algodo e observadas em microscpio ptico no aumento de 1000x. A grande quantidade de condios de C. cassiicola formada foi mensurada conforme item 3.6.4.1. Foram mensurados 50 condios de cada planta com sintomas.

3.7. Patogenicidade

Os experimentos foram realizados em casa-de-vegetao no perodo de setembro a dezembro de 2004 e foram utilizados os isolados citados no Quadro 1 e as plantas citadas no Quadro 2. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado (DIC), com seis repeties para cada tratamento, sendo uma planta considerada uma unidade experimental. O preparo das mudas foi realizado conforme descrito no item 3.6.4.2. Aps a inoculao, as plantas foram mantidas sob cmara mida por 48 horas. A testemunha constituiu de plantas atomizadas somente com gua destilada. A cmara mida foi formada com o auxlio de um bolso plstico, no qual as plantas foram mantidas durante o perodo de incubao. Para a confirmao da patogenicidade, folhas exibindo sintomas foram destacadas e mantidas sob cmara mida por um perodo que variou de 48 a 21

72 horas, temperatura ambiente em laboratrio. Decorrido o perodo, com auxlio de um microscpio estereoscpico, foi observado a existncia de crescimento micelial sobre o tecido foliar lesionado. Em seguida, a superfcie das leses foram raspadas e lminas foram preparadas para a observao em microscpio ptico das estruturas coletadas. Nas amostras em que foram observadas leses com presena de estruturas reprodutivas de C. cassiicola (condios e conidiforos), a patogenicidade do isolado foi considerada positiva. Esses testes foram desenvolvidos em etapas, sendo que para cada espcie de planta utilizada nos tratamentos foram produzidas mudas nas quais todos isolados foram inoculados.

3.7.1. Produo de mudas

Para a realizao dos ensaios, foi utilizado o substrato solo:areia na proporo 1:1 (V/V). O solo foi peneirado e misturado areia e desinfestado com brometo de metila (150 cm3/m3 de solo) por um perodo de 72 horas, dentro de tambores plsticos de 250L de capacidade. Decorrido o perodo, o solo permaneceu exposto ao ar livre por mais 24 horas para a volatilizao de resduos do produto. Em seguida, o substrato foi acondicionado em sacos plsticos pretos, com capacidade de 1 L, que, posteriormente, receberam as mudas produzidas em bandejas. Para a produo das mudas, utilizou-se o mesmo procedimento do item 3.6.4.2. Plantas de abbora e de soja foram produzidas atravs do semeio direto nos sacos plsticos.

3.7.2. Preparo do inculo, inoculao e avaliaes

Tanto para o preparo do inculo quanto para a inoculao, utilizou-se o mesmo procedimento do item 3.6.4.2. As espcies inoculadas, com respectivas idades das mudas, esto listadas no Quadro 3. Para a inoculao e incubao das plantas em cmara mida, adotouse o mesmo procedimento citado no item 3.6.4.2. Aps o perodo em cmara mida, as plantas foram mantidas em condies de casa-de-vegetao, onde se procederam as avaliaes. 22

Para cada espcie, inocularam-se seis plantas, cada uma foi considerada uma unidade experimental. O delineamento experimental utilizado foi do tipo inteiramente casualizado (DIC). As avaliaes foram realizadas diariamente at o 15 dia para a maioria dos tratamentos, exceto para trapoeraba e assa-peixe, cujo perodo de avaliao foi at o 30 dia, e soja, at o 20 dia. A reao foi considerada positiva (suscetvel) ou negativa (resistente) em funo da presena ou ausncia de sintomas da doena e de sinais do patgeno nas plantas inoculadas em cada espcie.

Quadro 3 Estdios de desenvolvimento das espcies de plantas inoculadas com Corynespora cassiicola. UEM, Maring, PR, 2005

Espcie vegetal Cucumis sativus/Hokushin C. sativus/Natsubayashi C. sativus/Samurai C. sativus/Tsuyataro C. melo/Sunrise Cucrbita maxima/Exposio Glycine max/FT-estrela Lactuca sativa/Vera Lycopersicon esculentum/Santa Clara Carica papaya/Sunrise Commelina benghalensis Vernonia sp.

Idade (dias) 15-17 15-17 15-17 15-17 15 15 20-25 20 25 30 25 35

Nmero de folhas ou triflios definitivos 2 2 2 2 2 2 3 7 4 5 3 4

23

3.7.3. Agressividade de isolados de Corynespora cassiicola a hbridos de pepino tipo japons Foram realizadas inoculaes com sete isolados de C. cassiicola, oriundos de diversos hospedeiros, citados no Quadro 1 (IA, PB, JQ, LP05, 493AA, 777AA e LP02), em quatro hbridos de pepino tipo japons mais cultivados em ambiente protegido (Natsubayashi, Hokushin, Tsuyataro e Samurai). A produo de mudas, a preparao do inculo, a inoculao, a incubao em cmara mida e a manuteno das plantas em casa-devegetao foram desenvolvidas conforme descrito no item 3.6.4.2. As inoculaes foram realizadas no momento em que as plantas de pepino apresentaram as duas primeiras folhas definitivas completamente expandidas, as quais foram atomizadas com as suspenses at prximo ao ponto de escorrimento, em ambas as faces, abaxial e adaxial. As avaliaes de severidade da doena foram realizadas 13 dias aps a inoculao. Logo aps, as folhas que apresentaram sintomas foram coletadas e colocadas em cmara mida e submetidas aos mesmos procedimentos descritos no item 3.6.4.2., para a constatao da presena de sinais do patgeno. A avaliao da severidade dos isolados foi realizada na primeira folha definitiva, utilizando, como base, a escala Horsfall-Barratt modificada (Campbell e Madden, 1990), levando em considerao a porcentagem de rea foliar com sintomas de mancha alvo (Quadro 4).

24

Quadro 4 Escala de notas utilizada para a avaliao da severidade de Corynespora cassiicola a hbridos de pepino do tipo japons. UEM, Maring, PR, 2005

Nota 0 1 2 3 4 5 6 7

Severidade de Isolados de C. cassicola (% de rea foliar com sintomas) Ausncia de sintomas <1 1a3 3,1 a 6 6,1 a 12 12,1 a 25 25,1 a 50 > 50,1

25

4. RESULTADOS

4.1. Avaliao das caractersticas culturais

4.1.1. Avaliao do crescimento micelial e da colorao das colnias

Somente para alguns isolados utilizados houve diferenas significativas nas taxas de crescimento micelial (Quadro 5). Comparando-se a taxa de crescimento micelial dos diferentes isolados foi possvel a separao dos isolados em cinco grupos. O primeiro grupo foi composto dos isolados RWB321, LP07, JQ e LP04, que apresentaram as maiores taxas de crescimento. O segundo e o terceiro, compreendendo os isolados LP01, GS02, IA, GS01, PB e 493AA e CP03, respectivamente, apresentaram taxa de crescimento intermedirio. E, finalmente, o quarto e o quinto, envolvendo os isolados 777AA e JMP220 e LP05 e LP02, respectivamente, apresentaram as menores taxas de crescimento micelial. Quanto colorao, foram observadas diferenas entre os isolados, com colnias variando de cinza-claro a olivceo (Quadro 5 e Figura 1). Os isolados IA, PB, JQ, LP05, LP02, JMP220, LP04 e GS02 apresentaram colorao de colnia cinza, enquanto que, para os isolados 777AA, GS01 e LP01, a colorao da colnia foi cinza-claro. J, os isolados 493AA e LP07 apresentaram diferenas de colorao entre as repeties variando de cinzaclaro a cinza. O isolado RWB321 formou colnias cuja colorao variou entre cinza-claro a cinza-escuro. O isolado CP03 formou colnias somente com colorao olivcea.

4.1.2. Avaliao da esporulao

Para a avaliao da esporulao, houve diferenas significativas entre os isolados (Quadro 5). Todos isolados esporularam no meio de cultivo BDA,

26

sendo possvel separ-los em grupos. Os seguintes grupos foram separados em ordem decrescente de esporulao: 1) 493AA e LP02; 2) LP05; 3) LP07; 4) RWB321, CP03, 777AA, IA, JQ e JMP220; 5) LP04, GS01, GS02, PB e LP01. O isolado LP02 apresentou menor taxa de crescimento micelial; no entanto, ele est entre os dois que apresentaram os maiores valores de esporulao. J, os isolados que apresentaram as maiores taxas de crescimento (JQ, LP04 e RWB321) se comportaram com tendncia de menor esporulao, se inserindo nos grupos 4 e 5.

4.1.3. Avaliao da formao de clamidsporos

Alguns dos isolados formaram clamidsporos em meio de cultura BDA (Quadro 5). Todos os isolados provenientes de pepino formaram

clamidsporos. Alm desses, os isolados originados de lantana (JMP220), de aceroleira (LP04) e de assa-peixe (GS02) tambm formaram essas estruturas de sobrevivncia. J, para os demais isolados, no se observou a presena de clamidsporos em meio de cultura BDA. Realizando a mensurao dos clamidsporos, a dimenso mdia encontrada foi 13,78m de comprimento e 13,09m de largura. A formao das estruturas ocorreu tanto de maneira intercalar e terminal como tambm em cadeia de at cinco clamidsporos (Figura 2). O material citoplasmtico das estruturas aparentemente apresentou condensao, que foi observado em funo da opacidade visualizada na parte central.

27

Quadro 5 Taxa de crescimento (mm.d-1) e demais caractersticas de colnias de isolados de Corynespora cassiicola cultivados em meio de cultura batata-dextrose-gar (BDA), temperatura de 242C, aos 10 dias de incubao. UEM, Maring, PR, 2004

Isolado

Origem dos isolados

Taxa de Crescimento (mm.d ) 7,36 d 6,78 d 8,20 e 4,22 a 6,18 c 5,28 b 3,50 a 7,20 d 5,18 b 8,02 e 7,66 d 8,22 e
-1 1

Dimetro da colnia (mm) 73,60 67,80 82,00 42,20 61,80 52,80 35,00 72,00 51,80 80,20 76,60 82,20

Colorao da colnia C C C C CC/C CC C CC C C CC CC/C

3

Esporulao 1x10
4

1,2

Formao de clamidsporos

condios/mL 142,38 b 79,45 a 127,09 b 298,34 d 392,15 e 160,49 b 335,89 e 96,63 a 124,97 b 108,21 a 56,39 a 233,58 c

IA PB JQ LP05 493AA 777AA LP02 GS01 JMP220 LP04 LP01 LP07

Pepino Pepino Pepino Abbora Soja Soja Tomateiro Mamoeiro Lantana Aceroleira Alface Pimentalonga Falsoboldo Trapoeraba Assa-peixe

+ + + + + -

RWB321 CP03 GS02 C.V. (%)

1

8,38 e 5,76 c 7,52 d 8,89

83,80 57,60 75,20

CC/CE O C

189,86 b 161,68 b 93,44 a 26,23

Mdias seguidas de mesma letra minscula nas colunas no diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de significncia. Mdia de cinco repeties. 2 Dados transformados para (x + 0,5)1/2, onde x representa a esporulao de Corynespora cassiicola 3 Colorao da colnia: CC (cinza claro), C (cinza) CE (cinza escuro), O (olivceo)

28

Figura 1 Coloraes apresentadas pelas colnias dos isolados de Corynespora cassiicola em meio BDA (CC=cinza-claro, C=cinza, CE=cinza-escuro e O=olivceo).

29

Figura 2 Estrutura de resistncia (clamidsporos) formada por isolados de Corynespora cassiicola em meio de cultura batata-dextrose-gar (BDA). (A) terminal; (B e C) intercalar; (D) em cadeia. 30

4.1.4. Caracterizao morfolgica de condios

4.1.4.1. Caracterizao morfolgica de condios produzidos in vitro

Os resultados referentes aos limites inferior e superior e mdia das dimenses de condios, bem como forma e curvatura encontrados para cada isolado, esto apresentados no Quadro 6. Neste Quadro possvel observar os limites das caractersticas mensuradas (comprimento, largura e nmero de pseudo-septos) para cada isolado (mnimo mdio mximo), bem como o desvio padro. Os condios produzidos pelos isolados LP05 e LP02 apresentaram limites inferior e superior de comprimento entre 43,75m e 442,50m, estando dentro do padro descrito por Ellis (1971), cuja variao de 40m a 520m. J, para os demais isolados, o limite inferior de comprimento dos condios foi inferior ao descrito para a espcie, chegando a 15,0m para o isolado 493AA. Os valores dos limites inferiores da largura dos condios, como tambm seus valores mdios (mximo de 8,05m) para todos isolados, estavam abaixo daqueles descritos por Ellis (1971) para C. cassiicola, que foi de 9,0m. Para os isolados IA, GS01, LP07, RWB321 e GS02, tambm os limites superiores se encontraram fora do padro descrito para espcie, sendo o valor mximo encontrado de 8,75m. Para todos isolados, a grande maioria dos condios apresentou a base arredondada e poucos truncados (Figura 3-D e E). Ellis (1971) descreve a base dos condios de C. cassiicola como sendo uma base truncada, conforme figura 3-E. Para o nmero de pseudo-septos, tambm foram constatadas variaes fora dos padres descritos para a espcie. Todos os isolados, a exceo do LP02, apresentaram nmero de pseudo-septos fora dos padres descritos por Ellis (1971) para a espcie em seus limites inferiores, que de quatro. Os isolados LP02 e LP01 produziram condios com nmero de pseudoseptos (32 e 21, respectivamente) acima dos descritos para a espcie, que de 20. Quanto forma, a porcentagem de condios cilndricos e obclavados foi varivel entre os isolados. Os isolados JQ e LP01 apresentaram 92,0% e 31

97,6% de condios cilndricos, respectivamente, enquanto os isolados LP04, CP03 e 777AA, 92,8%, 86,0% e 80,4% de condios obclavados,

respectivamente (Figura 3). Para os isolados originados de pepino tipo japons (IA, PB e JQ) e de soja (493AA e 777AA), no foram observadas propores similares quanto forma dos condios, quando comparados quanto ao hospedeiro de origem. Entretanto, para a curvatura, todos os isolados de C. cassiicola apresentaram maiores porcentagens de condios retos. A menor e a maior porcentagem de condios retos foram observadas para os isolados LP04 (73,2%) e PB (100%), respectivamente.

4.1.4.2. Caracterizao morfolgica de condios produzidos in vivo

Os resultados mostraram que os condios produzidos em hospedeiro vivo apresentaram dimenses superiores aos condios produzidos em meio de cultura BDA (Quadro 7). Para a varivel comprimento, os valores mximo, mdio e mnimo para condios produzidos in vitro foram 152,50, 73,21 e 21,25m, respectivamente. Para condios produzidos in vivo, foram 291,40, 181,78 e 89,90m, respectivamente. Resultados anlogos foram obtidos para as variveis largura e nmero de pseudo-septos. Esses resultados mostraram que as maiores dimenses de condios foram obtidas quando produzidos em hospedeiro vivo. Quanto ao formato, a maioria dos condios produzidos, tanto in vitro como in vivo, foi cilndrico, com maior porcentual para condios produzidos formados em meio BDA. No entanto, para a curvatura, em meio de cultivo, a maioria dos condios (96,4%) foi reta. J, para condios formados em hospedeiro vivo, a maioria dos condios foi curvada (81,2%).

32

Quadro 6 Caracterizao morfolgica de condios de isolados de Corynespora cassiicola originados de diferentes hospedeiros, cultivados em meio de cultura batata-dextrose-gar (BDA), temperatura de 242C aps 10 dias de incubao. UEM, Maring, PR, 2004

Isolado IA PB JQ LP05 493AA 777AA LP02 GS01 JMP220

Dimenses (m) Comprimento 73,251 28,09 2 (21,25 181,25) 70,46 24,30 (26,25 142,50) 73,21 25,93 (21,25 152,50) 100,15 33,87 (43,75 231,25) 51,16 17,84 (15,0 115,0) 48,1 15,49 (21,25 107,50) 125,37 48,93 (45,0 442,50) 66,87 18,25 (37,50 106,25) 70,83 27,48 (26,25 180,0)
3

Nmero de Pseudo-septos 4,34 1,74 (1,0 11,0) 4,17 1,71 (1,0 9,0) 4,51 1,94 (1,0 15,0) 7,45 2,80 (2,0 16,0) 3,35 1,68 (1,0 10,0) 2,88 1,15 (1,0 8,0) 9,66 3,95 (4,0 32,0) 3,60 1,16 (2,0 6,0) 4,31 2,0 (1,0 14,0)

Forma (%) Cilndrico 42,8 50,0 92,0 36,8 72,0 19,6 35,2 40,8 62,0 Obclavado 57,2 50,0 8,0 63,2 28,0 80,4 64,8 59,2 38,0

Curvatura (%) Reto 98,0 100,0 96,4 96,0 88,4 96,8 88,8 98,0 82,8 Curvado 2,0 0,0 3,6 4,0 11,6 3,2 11,2 2,0 17,2

Largura 6,42 1,05 (3,75 8,75) 6,50 1,09 (3,75 10,0) 6,40 0,94 (5,0 10,0) 6,83 1,14 (5,0 10,0) 6,66 1,0 (5,0 10,0) 7,55 1,04 (4,38 11,25) 6,78 0,37 (4,38 10,0) 7,03 0,92 (5,0 8,75) 7,47 0,96 (5,63 10,0)

33

Quadro 6, Cont.

LP04 LP01 LP07 RWB321 CP03 GS02

79,44 24,08 (37,50 198,75) 102,36 56,34 (37,20 403,0) 70,55 22,76 (31,25 121,25) 77,61 27,27 (30,0 182,50) 66,03 14,53 (38,75 123,75) 65,36 22,44

7,40 0,89 (5,0 10,0) 8,05 1,36 (5,0 12,40) 5,75 0,81 (3,75 7,50) 6,34 0,84 (5,0 8,75) 6,99 1,08 (5,0 10,0) 5,75 0,70

5,18 1,52 (2,0 10,0) 6,38 3,50 (1,0 21,0) 4,35 1,69 (2,0 9,0) 4,94 2,20 (2,0 14,0) 3,62 1,11 (2,0 6,0) 3,90 1,62

7,2 97,6 24,0 69,2 14,0 60,0

92,8 2,4 76,0 30,8 86,0 40,0

73,2 95,2 83,2 82,4 75,2 97,2

26,8 4,8 16,8 17,6 24,8 2,8

(27,50 127,50) (4,38 7,50) (1,0 9,0) 1 2 3 Mdia de 250 condios, Desvio Padro da mdia, Menor e maior valor

34

Quadro 7 Caracterizao morfolgica de condios do isolado JQ produzidos em meio de cultura BDA (batata-dextrose-gar) e em plantas do hbrido de pepino Tsuyataro. UEM, Maring, PR, 2004 Dimenses (m) Comprimento 73,21 1 25,93 2 (21,25 152,50) 3 181,78 36,61 (89,90 291,40)
2

Substrato

Nmero de Pseudo-septos 4,51 1,94 (1,0 15,0) 10,54 2,39 (5 18)

3

Forma (%) Cilndrico 92,0 Obclavado 8,0

Curvatura (%) Reto 96,4 Curvado 3,6

Largura 6,40 0,94 (5,0 10,0) 9,21 1,12 (6,20 12,40)

Meio BDA

Pepino*
1

76,4

23,6

18,8

81,2

Mdia de 250 condios, Tsuyataro

Desvio Padro da mdia,

Menor e maior valor, * isolado: JQ, produzido em folhas do hbrido

35

Figura 3 Morfologia de condios de isolados de Corynespora cassiicola: (A) condio cilndrico e obclavado em um mesmo isolado; (B) condio cilndrico; (C) condio obclavado; (D) base arredondada; (E) base truncada. Fator de correo da ocular micromtrica 1,25m. 36

4.2. Patogenicidade

Todos os resultados obtidos nos testes de patogenicidade dos isolados de C. cassiicola esto expressos no Quadro 9. As reaes apresentadas pelas espcies de plantas foram

diferenciadas quanto suscetibilidade aos diferentes isolados inoculados; contudo, todas as plantas foram infectadas com seus respectivos isolados. Os isolados IA, PB, JQ, originados de pepino japons, e o isolado LP05, originado de abbora, foram patognicos aos quatro hbridos de pepino (Natsubayashi, Hokushin, Tsuyataro e Samurai), ao mamoeiro (Sunrise), ao meloeiro nobre (hbrido Sunrise), abbora (Cucurbita mxima, hbrido Exposio), soja (cultivar FT-Estrela) e ao tomateiro (var. Santa Clara). Alm disso, os trs isolados originados de pepino infectaram plantas de alface (var. Vera). Os quatro isolados de pepino se comportaram semelhantemente quanto capacidade de causar doenas aos diferentes hospedeiros. Diferentemente, os isolados 493AA e 777AA, originados de soja, apresentaram diferenas quanto patogenicidade. O isolado 493AA foi patognico ao mamoeiro, a dois hbridos de pepino (Natsubayashi e Tsuyataro), ao meloeiro, abbora, soja, alface e ao tomateiro. J, o isolado 777AA foi patognico a um nmero menor de espcies: dois hbridos de pepino (Natsubayashi e Tsuyataro), soja, alface e tomateiro. Todas as espcies que apresentaram suscetibilidade ao isolado 777AA tambm foram suscetveis ao isolado 493AA. Alm do tomateiro, o isolado LP02 (originado de tomateiro) tambm foi patognico a dois hbridos de pepino (Natsubayashi e Tsuyataro) e ao mamoeiro. Os isolados GS01 e RWB321, originados de mamoeiro e falsoboldo, respectivamente, alm de infectar seus prprios hospedeiros, tambm infectaram o meloeiro, a soja e a alface, mostrando serem similares entre si quanto capacidade de causar doenas a diferentes espcies de plantas. O isolado de lantana, JMP220, foi patognico ao mamoeiro, alface, ao tomateiro e planta daninha assa-peixe. O isolado originado de aceroleira (LP04) infectou, alm da aceroleira, o meloeiro, a abbora, a soja e a planta daninha trapoeraba.

37

O isolado originado de alface (LP01) foi patognico alface e ao tomateiro. O isolado de trapoeraba (CP03), alm da trapoeraba, foi patognico abbora. Os isolados LP01 e CP03 apresentaram a menor gama de hospedeiros dentre os isolados avaliados. O isolado LP07, originado de pimenta-longa, foi patognico ao mamoeiro, abbora e ao tomateiro. O isolado de assa-peixe (GS02), alm de assa-peixe, foi patognico ao mamoeiro, soja, alface e planta daninha trapoeraba. O mamoeiro (hbrido Sunrise) foi o hospedeiro que apresentou maior suscetibilidade frente aos isolados inoculados, sendo infectada por 12 dos 15 isolados de C. cassiicola inoculados. Ao contrrio, os hospedeiros trapoeraba e assa-peixe foram os menos suscetveis, sendo infectados por trs e dois isolados, respectivamente. As leses foliares apresentadas pelos diferentes patossistemas formados variaram quanto ao tempo decorrido da inoculao at o surgimento dos primeiros sintomas (perodo de incubao). As reaes foram

consideradas positivas (suscetvel) ou negativas (resistente) em funo da presena ou ausncia de sintomas e de sinais do patgeno. As leses apresentadas pelos patossistemas estabelecidos esto evidenciadas na Figura 4.

4.2.1. Agressividade de isolados de Corynespora cassiicola a hbridos de pepino tipo japons A agressividade de cada um dos sete isolados de C. cassiicola originados de diferentes hospedeiros (IA, PB e JQ, originados de pepino; LP05, originado de abbora; 493AA e 777AA, originados de soja; LP02, originado de tomateiro), quando inoculados em quatro hbridos de pepino tipo japons (Natsubayashi, Hokushin, Tsuyataro e Samurai), est expresso no Quadro 10 e na Figura 5. O perodo de incubao observado para os patossistemas que envolveram os isolados de pepino (IA, PB e JQ) e o hbrido Tsuyataro foi menor do que o apresentado pelos demais patossistemas formados. O perodo,

38

para o hbrido Tsuyataro, foi inferior a 48 horas e, para os outros patossistemas formados, esse intervalo foi superior a 72 horas. Os hbridos de pepino Hokushin e Samurai no foram suscetveis a todos os isolados testados, apenas foram infectados pelos isolados IA, PB e JQ, originados de pepino, e pelo isolado LP05, originado de abbora. Houve diferenas significativas entre a agressividade dos isolados frente aos hbridos de pepino testados. Os isolados de pepino (IA, PB e JQ) mostraram-se significativamente mais agressivos quando inoculados nos quatro hbridos de pepino analisados (Natsubayashi, Hokushin, Tsuyataro e Samurai) em relao aos demais isolados inoculados. Alm disso, o hbrido Tsuyataro mostrou ser mais suscetvel entre os hbridos testados. Entre os patossistemas estabelecidos, foram observadas variabilidades sintomatolgicas (tipo de leso). Foi possvel estabelecer dois tipos de leses distintas. O primeiro tipo de leso foi apresentado pelos isolados originados de pepino (IA, PB e JQ), que se mostraram, inicialmente, como pequenas pontuaes clorticas de formato regular (Figura 6-A), que evoluram para manchas circulares a irregulares, s vezes, com aspecto de encharcadas, halos clorticos e centro de colorao palha (Figura 6-B). Em estdios mais avanados, as leses tornaram-se maiores, com discretos halos clorticos e bordos encharcados de colorao olivcea; em alguns momentos, as manchas se encontravam formando extensas reas necrticas que resultaram no coalescimento das leses e seca do limbo foliar (Figura 6-C). O segundo tipo de leso foi apresentado pelos isolados LP05, 493AA, 777AA e LP02, tendo formato irregular, com aspecto spero, ausncia de tecidos encharcados, discretos halos clorticos e colorao palha (Figura 6-D).

39

Quadro 9 Patogenicidade de isolados de Corynespora cassiicola, originados de diferentes hospedeiros, inoculados temperatura ambiente em casa-de-vegetao. UEM, Maring, PR, 2004
1

Isolado/hospedeiro de origem/reao Espcie vegetal inoculada Carica papaya Sunrise Cucumis sativus Hokushin Cucumis sativus Natsubayashi Cucumis sativus Samurai Cucumis sativus Tsuyataro Cucumis melo Sunrise Cucurbita maxima Exposio Glycine Max FT-estrela Lactuca sativa Vera Lycopersicon esculentum Santa Clara Commelina benghalensis Vernonia sp.
1

IA Pepino + + + + + + + + + + -

PB Pepino + + + + + + + + + + -

JQ LP05 493AA Pepino Abbora Soja + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -

777AA Soja + + + + + -

LP02 Tomateiro + + + + -

JMP220 GS01 Mamoeiro Lantana + + + + + + + +

LP04 Aceroleira + + + + + -

LP07 LP01 PimentaAlface longa + + + + + -

RWB321 Falsoboldo + + + + -

CP03 Trapoeraba + + -

GS02 Assapeixe + + + + +

(-) ausncia de sintomas e sinais do patgeno, (+) presena de sintomas e sinais do patgeno

40

Figura 4 Sintomas apresentados aps a inoculao com diferentes isolados de Corynespora cassiicola. Plantas: assa-peixe (A), tomateiro (B), soja (C), pepino (D), trapoeraba (E), alface (F) e mamoeiro (G).

41

Quadro 10 Severidade da doena em quatro hbridos de pepino tipo japons, inoculados com isolados de Corynespora cassiicola, em condies de casa-de-vegetao. UEM, Maring, PR, 2004 Severidade1,2 Hokushin 2,50 Ac 3 5,33 Ce 3,33 Bd 1,17 Ab 0,0 Aa 0,0 Aa 0,0 Aa 1,76 A Natsubayashi 2,33 Ab 2,0 Ab 2,33 Ab 2,33 Bb 1,33 Ba 1,33 Ba 2,50 Bb 2,02 A 26,00 Samurai 2,33 Ac 2,83 Bc 5,17 Cd 1,50 Ab 0,0 Aa 0,0 Aa 0,0 Aa 1,69 A Tsuyataro 7,0 Bc 6,33 Dc 6,50 Dc 3,0 Ba 3,67 Cb 4,17 Cb 2,67 Ba 4,76 B Mdias 3,54 b 4,12 b 4,33 b 2,0 a 1,25 a 1,38 a 1,29 a

Isolados IA PB JQ LP05 493AA 777AA LP02 Mdias C.V. (%)

1

Escala de notas: 0 = ausncia de sintomas; 1 = < 1% de rea foliar infectada (afi); 2 = 1% a 3% de afi; 3 = 3,1% a 6% de afi; 4 = 6,1% a 12% de afi; 5 = 12,1% a 25% de afi; 6 = 25,1% a 50% de afi; 7 = > 50,1% de afi 2 Dados no transformados 3 Mdias seguidas de mesma letra maiscula na horizontal e minscula na vertical no diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de significncia

42

Figura 5 Severidade da doena causada por Corynespora cassiicola, originados de diferentes hospedeiros, inoculados em quatro hbridos de pepino tipo japons, temperatura ambiente em casa-de-vegetao. UEM, Maring, PR, 2004

8 7 6 Severidade 5 4 3 2 1 0 IA PB JQ LP05 Isolados Hokushin Natsubayashi Samurai Tsuyataro 493AA 777AA LP02

43

Figura 6 Padro sintomatolgico de leses apresentadas por isolados de Corynespora cassiicola quando inoculados em hbridos de pepino japons. (A, B e C) Leses apresentadas pelos isolados de pepino (IA, JQ e PB) e (D) leses apresentadas pelos isolados LP05, 493AA, 777AA e LP02.

44

5. DISCUSSO

Este trabalho procurou evidenciar a variabilidade morfolgica de condios e conidiforos, fisiolgica e patognica de isolados de C. cassiicola e severidade de sete isolados quando inoculados em hbridos de pepino tipo japons. Os isolados foram originados de diferentes espcies de plantas, algumas de grande importncia agronmica. Os isolados testados foram obtidos de diferentes regies do Brasil: Norte, Nordeste, Sudeste e Sul. Diferenas significativas na taxa de crescimento micelial e na esporulao foram observadas entre os isolados, bem como diferenas na colorao de colnias. Essas diferenas, entre os isolados originados de diferentes hospedeiros, podem ser justificadas pelas diferenas individuais quanto exigncia para nutrio, temperatura e fotoperodo e/ou, tambm, pelas caractersticas intrnsecas a cada isolado. Quanto colorao das colnias, houve diferenas entre os isolados analisados, que variaram de cinza-claro a olivceo, o que concordando com a descrio relatada por Ellis (1971) para a espcie. A menor taxa de crescimento micelial foi apresentada pelo isolado LP02, originado de tomate; contudo, ele est entre os dois isolados que apresentaram os maiores valores de esporulao. Ao contrrio, os isolados que apresentaram as maiores taxas de crescimento (JQ, LP04 e RWB321) enquadraram-se nos grupos de menores valores de esporulao. O meio de cultura , reconhecidamente, um determinante de crescimento e esporulao, sendo ainda que, um meio que favorea a esporulao no necessariamente favorecer o crescimento micelial (Tuite, 1969; Dhingra & Sinclair, 1995). Diferenas no comportamento de isolados de

C. cassiicola foram relatadas por alguns autores quando cultivados em

diferentes meios de cultura, temperaturas e regimes de luminosidade (Almeida & Yamashita, 1976; Duarte et al., 1983). Avaliando meios de cultura, Olive et al. (1945) observaram que os maiores valores para a esporulao do fungo foram obtidos em meio BDA e Czapek-gar. Quanto presena de luz, a esporulao

45

e o crescimento micelial do fungo foram favorecidos na presena de luz contnua (Onesirosan et al., 1975; Almeida & Yamashita, 1976; Roim, 2001). Quanto formao de clamidsporos, observaes, utilizando microscopia ptica, evidenciaram, em alguns isolados, a presena de hifas diferenciadas e, em alguns pontos dilataes de formato ovalado a circular com paredes mais espessas. Nesses locais, o material citoplasmtico

aparentemente apresentou condensao, que foi observado em funo da opacidade visualizada na parte central. A formao de clamidsporos foi tambm relatada por Olive et al. (1945) em meio de cultura. A exceo desse relato, a formao de clamidsporos por isolados de C. cassiicola no tem sido mencionada na literatura. As formas de sobrevivncia do inculo mais freqentemente citadas na literatura so atravs de plantas hospedeiras e de atividade saproftica. A sobrevivncia de isolados de C. cassiicola em restos de culturas foi observada por Almeida et al. (2001) em soja. Wulff & Pascholati (1997) relatam o patgeno em restos de culturas de gergelim e Rgo & Carrijo (2000) em restos de cultura de cucurbitceas e plantas daninhas como hospedeiras do patgeno. Plantas daninhas, tais como: trapoeraba, assa-peixe e lantana, so descritas como hospedeiras do patgeno (Pereira & Barreto, 2000; Souza & Silva, 2001; Cutrim & Silva, 2003). A fase que serve para diferenciar o ciclo primrio do secundrio das relaes patgeno-hospedeiro a sobrevivncia do inoculo, sendo

caracterizada por garantir a sobrevivncia do patgeno em condies adversas. Durante o ciclo evolutivo, cada patgeno desenvolveu forma (s) de sobrevivncia, entre elas, estruturas de especializadas de resistncia, atividades saprofticas e plantas hospedeiras (Amorim, 1995). Ellis (1971) relatou os critrios taxonmicos para a caracterizao de isolados de C. cassiicola baseados em caractersticas morfolgicas de condios e conidiforos. No presente trabalho, os conidiforos no foram distintos das hifas que os produziam e, em funo disso, suas estruturas no foram mensuradas. Ferreira & Alfenas (1980), trabalhando com isolados ip em meio de cultura artificial, tambm constataram que os conidiforos mostraram-se poucos distintos das hifas que os produziam. Situao semelhante foi tambm relatada por Wei (1950).

46

Isolados originados de diferentes hospedeiros de C. cassiicola, quando cultivados em meio de cultura artificial BDA, variaram quanto morfologia de condios e colorao das colnias. Para a maioria dos isolados analisados, as estruturas apresentaram valores de comprimento, largura e nmero de pseudoseptos, em parte, fora daqueles descritos por Ellis (1971). Para a maioria dos isolados, foram observados condios apresentado comprimento, largura e nmero de pseudo-septos abaixo de 40m, 9m e 4, respectivamente, que foram os valores mnimos estabelecidos para C. cassiicola pelo autor acima citado. Os isolados LP02 e LP01 produziram condios com nmero de pseudoseptos (32 e 21, respectivamente) acima dos descritos para a espcie (Ellis, 1971). Ainda neste trabalho, foi realizada a caracterizao morfolgica de condios do isolado JQ, originado de pepino, produzidos em hospedeiro vivo (hbrido Tsuyataro). Foi possvel a constatao de diferenas morfolgicas no mesmo isolado (JQ) quando produzidos em diferentes condies (meio de cultura BDA e hospedeiro suscetvel). Condios produzidos em condies artificiais apresentam dimenses, em parte, fora dos padres descritos para a espcie; ao passo que, os condios do mesmo isolado, quando produzidos in

vivo, os valores foram maiores que quando produzidos in vitro, e dentro dos
limites descritos para a espcie por Ellis (1971), a exceo do menor valor de largura encontrado. Situao anloga foi encontrada por Roim (2001), em meio de cultura, ao caracterizar morfologicamente isolados de C. cassiicola de soja. O autor relatou que o isolado de semente e a maioria dos isolados de folhas, embora apresentassem comprimento dos condios dentro dos limites descritos para a espcie, a largura e o nmero de pseudo-septos no corresponderam aos valores descritos por Ellis (1971). No trabalho de Roim (2001), mesmo os isolados sendo de hospedeiro comum, ainda foram observadas diferenas significativas entre os parmetros analisados (comprimento, largura e nmero de pseudo-septos) entre os isolados de folhas, sementes e razes. Fatores ambientais, como umidade relativa, so relatados como possveis fatores que podem vir a alterar as caractersticas morfolgicas desse fungo. Em ambientes com alta umidade relativa, essa alterao pode modificar o formato de condios e de conidiforos e tambm dificultar a visualizao de

47

pseudo-septos de condios. Quando produzidos em meio de cultura artificial, os parmetros morfolgicos mensurveis para a espcie podem ser alterados, quando comparados s estruturas produzidas in vivo (Olive et al., 1945; Wei, 1950; Ferreira & Alfenas, 1980; Gasparotto et al., 1988). Olive et al. (1945) observaram diferenas morfolgicas entre condios de isolados de feijo-decorda e de soja, produzidos em diferentes condies, como meio de cultura artificial, folhas dos hospedeiros em condies naturais e folhas dos hospedeiros colocadas em cmara mida. Eles atriburam essa variabilidade s condies de cada ambiente. Variaes morfolgicas de condios, oriundos de diferentes isolados e hospedeiros e fora dos padres estabelecidos para a espcie, so relatadas com certa freqncia; contudo, as diferenas no so suficientes para que os isolados estudados fossem considerados espcies diferentes. No teste de patogenicidade, foi demonstrada elevada inespecificidade para a maioria dos isolados. Foram constatadas diferenas entre os isolados quanto capacidade de infectar os diferentes hospedeiros utilizados nos experimentos. Todos os isolados foram patognicos a seus hospedeiros de origem. Os isolados originados de pepino japons (IA, PB e JQ) no diferiram quanto capacidade de infectar outros hospedeiros, ao contrrio do que ocorreu com os isolados de soja (493AA e 777AA). O isolado 493AA foi patognico a oito diferentes hospedeiros, enquanto o isolado 777AA foi patognico a cinco. Todas as espcies suscetveis ao isolado 777AA tambm foram suscetveis ao isolado 493AA. Os isolados de C. cassiicola, originados de pepino japons (IA, PB, JQ) e abbora (LP05), apresentaram maior gama de hospedeiros, dez e nove, respectivamente. Ao contrrio, os isolados de alface (LP01) e trapoeraba (CP03) apresentaram a menor gama de hospedeiros, sendo patognicos a apenas duas espcies de plantas. Esse comportamento tambm variou para os demais isolados utilizados nos experimentos. Os hbridos de pepino hokushin e samurai diferiram dos hbridos natsubayashi e tsuyataro quanto suscetibilidade, sendo os dois ltimos suscetveis a um maior nmero de isolados.

48

A espcie vegetal que apresentou maior suscetibilidade frente aos isolados inoculados foi o mamoeiro, sendo infectada por 12 dos 15 isolados de

C. cassiicola inoculados. Por outro lado, os hospedeiros trapoeraba e assapeixe foram os menos suscetveis, sendo infectados por trs e dois isolados de

C. cassiicola, respectivamente.
A inespecificidade constatada neste trabalho foi tambm observada por outros autores. Duarte et al. (1983), em estudos com dois isolados de C.

cassiicola, sendo um de cacaueiro e outro de mamoeiro, observaram

diferenas quanto patogenicidade. O isolado de mamoeiro foi capaz de infectar plantas de mamoeiro, caupi e seringueira; j o isolado de cacaueiro, apenas plantas de cacaueiro. Cutrim & Silva (2003) relataram diferenas na patogenicidade de dois isolados de tomateiro. Estes apresentaram reaes diferentes quando inoculados em plantas de caupi (isolado 1 no patognico e isolado 2 patognico) e soja (isolado 2 no patognico e isolado 1 patognico). Alm disso, os autores relataram as diferenas na patogenicidade dos diferentes isolados quando inoculados em 12 diferentes espcies de plantas, sendo duas resistentes a ambos isolados. Silva et al. (1998) encontraram reaes semelhantes s acima relatadas, sendo que 16 isolados de seringueira, trs de mamoeiro, um de mimosa e um de tomilho diferiram quanto patogenicidade, quando inoculados em plantas de berinjela. Os isolados de mamoeiro e nove dos isolados de seringueira no foram patognicos berinjela; os demais foram capazes de infectar a espcie. Quando inoculados em feijo-de-corda, apenas os isolados originados de seringueira foram capazes de causar doena. Os resultados alcanados neste trabalho mostraram que o isolado de

C. cassiicola originado de lantana foi patognico as plantas de mamoeiro,

alface, tomateiro e assa-peixe. Este resultado se ope aos resultados obtidos por Pereira et al. (2003), que observaram alta especificidade de um isolado tambm originado de lantana por plantas de L. camara de diferentes origens e consideraram o isolado como uma formae specialis de C. cassiicola. Os autores ainda relataram que no encontraram reaes positivas em inoculaes realizadas em plantas de mamoeiro e tomateiro. Esses resultados diferem dos observados no presente trabalho.

49

Lustosa (2000), avaliando um isolado de trapoeraba quanto especificidade deste para outros hospedeiros, relata que, alm da trapoeraba, o isolado tambm infectou plantas de soja da cultivar UFV-16. Esse fato diverge dos resultados obtidos por Pereira (2001) e Pereira et al. (2003) e dos obtidos neste trabalho. As diferenas na agressividade apresentadas pelos sete isolados de C.

cassiicola aos hbridos de pepino japons estudados sugerem maior

adaptao dos isolados de pepino para os hbridos testados, uma vez que foram significativamente mais agressivos, do que os demais isolados utilizados nos experimentos. Alm disso, maior suscetibilidade e menor perodo de incubao pde ser constatado em inoculaes no hbrido tsuyataro com os isolados originados de pepino japons (IA, PB e JQ). Roim (2001) relatou que isolados originados de razes de soja foram mais agressivos do que isolados originados de folhas quando foram inoculados em razes de soja (o contrrio tambm foi observado), sugerindo adaptao dos isolados. O autor ainda sugere a existncia de um bitipo ou espcie diferente de C. cassiicola infectando razes e folhas de soja. Quanto agressividade, o mesmo autor, avaliando 17 isolados de C. cassiicola originados de soja, inoculados na parte area e nas razes da cultivar FT-Estrela, constatou diferenas significativas de agressividade entre os isolados testados. Essas diferenas tambm foram observadas por Spencer & Walters (1969), onde cinco isolados originados de feijo-de-corda diferiram em agressividade quando inoculados em feijo-decorda. Em 1998, Silva et al. constataram a existncia de diferenas na agressividade de 16 isolados de seringueira quando inoculados em trs diferentes clones de seringueira (RRIC100, RRIC52 e RRIC104). Ainda relataram que trs isolados de mamoeiro, tambm patognicos aos trs clones de seringueira, diferiram quanto agressividade, quando inoculados nos referidos clones. Os mesmos autores, correlacionando estudos moleculares (RAPD-PCR) com os testes de patogenicidade, separaram em dois grupos os isolados de seringueira (W e X) quanto patogenicidade berinjela. Os isolados do grupo W foram capazes de infectar plantas de berinjela; j os pertencentes ao grupo X, no foram patognicos. Atravs dos testes, os autores sugeriram maior adaptao dos isolados do grupo X para infectar

50

berinjela. Em 2000, os mesmos autores, atravs de anlises de RAPD de 42 isolados do patgeno, tambm correlacionando com testes de patogenicidade, observaram diferenas genticas entre os isolados do patgeno de diferentes plantas. Os padres de sintomas para C. cassiicola, observados neste trabalho, para os hbridos de pepino japons, infectados por isolados originados de pepino (IA, PB e JQ), tambm foram observados por Martins et al. (2003) e Verzignassi et al. (2003). O segundo tipo de leso constatada neste trabalho, causada pelos isolados LP05, 493AA, 777AA e LP02 em hbridos de pepino, pode ser explicado devido s diferentes reaes patgeno-hospedeiro. Diferentes tipos de leses tambm foram observados por Duarte et al. (1983) quando dois isolados, um de cacaueiro e outro de mamoeiro, foram inoculados em plantas de cacau, mamoeiro, caupi e seringueira. Situao semelhante tambm foi observada por Spencer & Walters (1969) e Olive et al. (1945).

51

6. CONCLUSES

Embora tenham ocorrido algumas variaes quanto morfologia de condios de C. cassiicola, todos os isolados utilizados nos experimentos, originados de diferentes hospedeiros e regies do Brasil, foram englobados na espcie C. cassiicola. Condios de diferentes isolados de C. cassiicola, produzidos em meio de cultura BDA, apresentaram variaes nas suas dimenses (comprimento, largura e nmero de pseudo-septos), com alguns valores diferentes daqueles citados em literatura taxonmica para esta espcie fngica. Os isolados IA, PB, JQ, JMP220, LP04 e GS02 foram capazes de produzir estruturas de resistncia (clamidsporos); j, os isolados LP05, 493AA, 777AA, LP02, GS01, LP01, LP07, RWB321 e CP03 no produziram. Dentro da espcie C. cassiicola, diferentes isolados podem se diferenciar quanto patogenicidade. Isolados originados de cucurbitceas apresentaram maior gama de espcie de hospedeiros e isolados originados de alface e trapoeraba menor gama de hospedeiros. Os hbridos de pepino, hokushin e samurai, foram suscetveis a quatro dos 15 isolados testados de C. cassiicola. J os hbridos natsubayashi e tsuyataro foram suscetveis a sete isolados. Os isolados de C. cassiicola, originados de pepino tipo japons (IA, PB e JQ) foram os mais agressivos aos hbridos de pepino tipo japons (natsubayashi, hokushin, tsuyataro e samurai). O hbrido tsuyataro apresentou maior suscetibilidade aos isolados de

C. cassiicola dentre os quatro hbridos testados.

As diferenas na agressividade, apresentadas pelos diferentes isolados aos hbridos de pepino tipo japons estudados, sugerem maior adaptao dos isolados de pepino para os hbridos, uma vez que foram significativamente mais agressivos que os demais isolados. Dois padres de leses foram observados em plantas de pepino inoculados com isolados de C. cassiicola: leses com encharcamento, foram

52

causadas apenas por isolados originados de pepino, e leses com aspecto spero (ausncia de tecidos encharcados), causadas por isolados originados de outras espcies hospedeiras.

53

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ALMEIDA, A.M.R. & YAMASHITA, J. Crescimento e esporulao de Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei em diferentes meios de cultivo. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.1, n.3, p.203-206, 1976.

ALMEIDA, A.M.R. & YAMASHITA, J. Efeito da tcnica de inoculao de Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei na reao de trs cultivares de soja. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.3, n.1, p.55-58, 1978.

ALMEIDA, A.M.R. Influncia do pH sobre crescimento e esporulao de Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei em meio de Batata-Dextrose-gar em diferentes perodos de incubao. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.2, n.2, p.175-177, 1977.

ALMEIDA, A.M.R., FERREIRA, L.P., YORINORI, J.T., SILVA, J.F.V. & HENNING, A.A. Doenas da soja. In: KIMATI, H., AMORIM, L., BERGAMIN FILHO, A., CAMARGO, L.E.A., REZENDE, J.A.M. Manual de Fitopatologia doenas das plantas cultivadas, So Paulo, 3 ed., Agronmica Ceres, 1997. cap.61, v.2, p.642-664.

ALMEIDA, A.M.R., MACHADO, C.C., FERREIRA, L.P., LEHMAN, P. S. & ANTONIO, H. Ocorrncia de Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei no Estado de So Paulo. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.1, n.2, p.111-112, 1976.

ALMEIDA, A.M.R., SARAIVA, O.F., FARIAS, J.R.B., GAUDNCIO, C.A. & TORRES, E. Survival of pathogens on soybean debris under no-tillage and conventional tillage systems. Pesquisa agropecuria Brasileira, Braslia, v.36, n.10, p.1231-1238, 2001.

AMORIM, L. Sobrevivncia do inculo. IN: BERGAMIM FILHO, A., KIMATI, H.. & AMORIM, L. Manual de Fitopatologia princpios e conceitos, So Paulo, 3 ed., Agronmica Ceres, 1995. cap.13, v.1, p.246-267.

ANDRADE, J.S., COSTA, A.F., TATAGIBA, J.S., VENTURA, J.A. & COSTA, A.F. Avaliao de manchas de Corynespora em diferentes gentipos de mamoeiro. Fitopatologia Brasileria, Braslia, v.27, supl., p.78, 2002. Resumo n.109.

54

AWODERU, V.A. A new leaf spot of Par rubber (Hevea brasiliensis) in Nigeria. Plant Disease Report, Beltsville, v.53, n.5, p.406-408, 1969.

BRETON, F., SANIER, C. & D' AUZAC, J. Role of cassiicolin, a host-selective toxin, in pathogenicity of Corynespora cassiicola, causal agent of a leaf fall disease of Hevea. Journal of Rubber Research, Montpellier, v.3, n.2, p.115128, 2000.

CAMARGO, L.E.A. Anlise gentica da resistncia e da patogenicidade. In: Bergamim Filho, A., Kimati, H. & Amorim, L. Manual de Fitopatologia princpios e conceitos, So Paulo, 3 ed., Agronmica Ceres, 1995. cap.24, v.1, p.470-492.

CAMPBELL, L.C. & MADDEN, L.V. Introduction to Plant Disease Epidemiology. New York, John Wiley & Sons, 1990. 532p.

CUTRIM, F.A. & SILVA, G.S. Patogenicidade de Corynespora cassiicola a diferentes espcies de plantas. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.28, n.2, p.193-194, 2003.

DHINGRA, O.D. & SINCLAIR, J.B. Basic Plant Pathology Methods, Lewis Publisher. Boca Raton, Florida, 1995. 448p.

DUARTE, M.L.R., ASANO, S. & ALBUQUERQUE, F.C. Estudos comparativos das caractersticas morfolgicas e fisiolgicas de dois isolamentos de Corynespora cassiicola. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.8, n.2, p.205-214, 1983.

DUARTE, M.L.R., ALBUQUERQUE F.C. & PRABHU, A.S. Uma nova enfermidade foliar do cacauerio (Theobroma cacau L.) causado pelo fungo Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.3, n.3, p.259-265, 1978.

ELLIS, M.B. Dematiaceous hyphomycetes. Kew: Commonwealth Mycological institute. 1971. 608p.

FAIAD, M.G.R., WETZEL, M.M.V. DA S. & MIRANDA, A.R. Levantamentos de fungos e sua sobrevivncia em sementes de gergelim no armazenamento a longo prazo. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.13, n.2, p.110, 1988. Resumo n.82.

55

FAJOLA, A.O. & ALASOADURA, S.O. Corynespora leaf spot, a new disease of tobacco (Nicotiana tabacum). Plant Disease Reporter, Beltsville, v.57, n.4, p.375, 1973.

FERNANDES, R.C. & BARRETO, R.W. Corynespora cassiicola causing leaf spot on Coleus barbatus. Plant Pathology, Oxford, v.52, n.6, p.786, 2003.

FERREIRA, F.A. & ALFENAS, A.C. Nova mancha de folha do ip em viveiros causada por Corynespora cassiicola. Revista rvore, Viosa, v.4, n.1, p.103110, 1980.

GASPAROTTO, L., FERREIRA, E.A. & JUNQUEIRA, N.T.V. Mancha de Corynespora cassiicola em folhas de seringueira (Hevea brasiliensis) no Brasil. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.13, n.3, p.278-280, 1988.

GENEROSO, E.C.S., KONRAD, M., HERNANDEZ, F.B.T. & PAPA, M.F.S. Ocorrncia de fungos patognicos na aceroleira irrigada, no municpio de Junqueirpolis, SP. In: Congresso Brasileiro de Engenharia Agrcola Conbea, 31., 2002, Salvador, 2002.

HASAMA, W., MORITA, S. & KATO, T. Seed transmission of Corynespora melonis, causal fungus of target leaf spot, on cucumber. Annals of the Phytopathological Society of Japan, Oita, v.59, n.2, p.175-179, 1993.

HAWKSWORTH, D.L., KIRK, P.M., SUTTON, B.C., PEGLER, D.N. Ainsworth & Bisbys dictionary of the fungi. 8 ed., Egham: CAB International, 1995, 616p.

JONES, J.P. A leaf spot of cotton caused by Corynespora cassiicola. Phytopathology, St. Paul, v.51, p.305, 1961.

KWON, M.K., KANG, B.H., CHO, B.H. & KIM, Y.C. Occurrence of target spot disease caused by Corynespora cassiicola on cucumber in Korea. Plant Pathology, Oxford, v.52, n.3, p.424, 2003.

LEITE, R.S.V. & BARRETO, R.W. Mancha foliar de hortnsia (Hydrangea sp.) causada por Corynespora cassiicola. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.22, supl., p.276, 1997. Resumo n.255.

56

LEROY, M. & LOURD, M. Doena foliar do tomateiro causada por Corynespora cassiicola em Manaus. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.14, n.1, p.32-36, 1989.

LUSTOSA, D.C. Corynespora cassiicola e Cercospora sp. como agentes potenciais para o controle biolgico de Commelina benghalensis L. 2000. 53p. Dissertao (Mestrado) - Universidade Federal de Viosa, Viosa, 2000.

MARTINS, M.C., FISCHER, I.H., VEIGA, J.S. & LOURENO, S.A. Ocorrncia de mancha-alvo causada por Corynespora cassiicola em pepino (Cucumis sativus) no Brasil. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.28, supl., p.208, 2003. Resumo n.47.

OLIVE, L.S., BAIN, D.C. & LEFEBVRE, C.L. A leaf spot of cowpea and soybean caused by undescribed species of Helminthosporium. Phytopathology, St. Paul, v.35, n.10, p.822-831, 1945.

OLUMA, H.O.A. & AMUTA, E.U. Corynespora cassiicola leaf spot of pawpaw (Carica papaya) in Nigria. Mycopathologia, Netherlands, v.145, n.1, p.23-27, 1999.

ONESIROSAN, P.T., ARNY, D.C. & DURBIN, R.D. Host specificity of Nigerian and North American isolates of Corynespora cassiicola. Phytopathology, St. Paul, v.64, p.1364-1367, 1974.

ONESIROSAN, P.T., ARNY, D.C. & DURBIN, R.D. Increasing sporulation of Corynespora cassiicola. Mycopathologia, Netherlands, v.55, n.2, p.121-123, 1975.

PEREIRA, J.M. Prospodium tuberculatum e Corynespora cassiicola como agentes de controle biolgico de Lantana camara. 2001. 87p. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Viosa, Viosa, 2001.

PEREIRA, J.M. & BARRETO, R.W. Additions to the mycobiota of the weed Lantana camara (Verbenaceae) in southeastern Brazil. Mycopathologia, Netherlands, v.151, n.1, p.70-80, 2000.

PEREIRA, J.M., BARRETO, R.W., ELLISON, C.A. & MAFFIA, L.A. Corynespora cassiicola f. sp. lantanae: a potential biocontrol agent from Brazil for Lantana camara. Biological Control, EUA, v.26, n.1, p.21-33, 2003.

57

POLTRONIERI, L.S., ALBUQUERQUE, F.C., TRINDADE, D.R., POLTRONIERI, M.C. & ROCHA NETO, O.G. Incidncia de doenas em pimenta longa (Piper hispidinervium) nos estados do Acre e Par. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.22, n.4, p.563-564, 1997.

POLTRONIERI, L.S., DUARTE, M.L.R., ALFENAS, A.C., TRINDADE, D.R. & ALBUQUERQUE, F.C. Three new pathogens infecting Antilles Cherry in the State of Par. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.28, n.4, p.424-426, 2003.

POLTRONIERI, L.S., POLTRONIERI, M.C., TRINDADE, D.R. & ALBUQUERQUE, F.C. Ocorrncia de Corynespora cassiicola em tomateiro no Estado do Par. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.19, supl., p.294, 1994. Resumo n.169.

RGO, A.M. & CARRIJO, I.V. Doenas das cucurbitceas. In: ZAMBOLIM, L., VALE, F.X.R. & COSTA, H. Controle de doenas de plantas hortalias. Viosa: Suprema Grfica e Editora Ltda, 2000. cap.16, p.535-598.

ROIM, F.L.B. Comportamento de cultivares e caracterizao cultural, morfologica e patognica de isolados de Corynespora cassiicola obtidos de soja [Glycine max (L.) Merrill]. 2001. 72p. Dissertao (Mestrado) Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, 2001.

SANTOS, A.A. & FREIRE, F.C.O. Ocorrncia da podrido interna do mamo no estado do Cear. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.23, supl., p.278, 1998. Resumo n.388.

SANTOS, A.F., GASPAROTTO, L. & PEREIRA, J.C.R. SERINGUEIRA. Seringueira (Hevea spp.): controle de doenas. In: VALE, F.X.R. & ZAMBOLIM, L. Controle de doenas de plantas: grandes culturas. Viosa: UFV, 1997. cap.20, v.2, p.925-952.

SILVA, G.S., RODRIGUS, A.A.C. & SOARES JUNIOR, A.C. Mancha de Corynespora em acerola (Malpighia glabra). Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.22, n.3, p.452, 1997.

SILVA, W.P.K. New host of Corynespora cassiicola in Sri Lanka. Plant Disease, St. Paul, v.84, n.2, p.202, 2000. Resumo.

58

SILVA, W.P.K., DEVERALL, B.J. & LYON, B.R. Molecular, physiological and pathological characterization of Corynespora leaf spot fungi from rubber plantations in Sri Lanka. Plant Pathology, Oxford, v.47, n., p.267-277, 1998.

SILVA, W.P.K., KARUNANAYAKE, E.H., WIJESUNDERA, R.L.C. & PRIYANKA, U.M.S. Genetic variation in Corynespora cassiicola: a possible relationship between host origin and virulence. Mycological Research, Richmond, v.107, n.5, p.567-571, 2003.

SILVA, W.P.K., MULTANI, D.S., DEVERALL, B.J. & LYON, B.R. RFLP and RAPD analyses in the identification and differentiation of isolates of the leaf spot fungus Corynespora cassiicola. Australian Journal of Botany, Melbourne, v.43, p.609-618, 1995.

SIVIERO, A., NODA, H. & ASSIS, L.A.G. Progresso da mancha alvo do tomateiro. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.20, supl., p.281, 1995. Resumo n.12.

SOUZA, I.M.R. & SILVA, G.S. Fungos associados a plantas daninhas na ilha de So Luiz, Maranho. Summa Phytopathologica, Botucatu, v.27, n.2, p.266-268, 2001.

SPENCER, J.A. & WALTERS, H.J. Variations in certain isolates of Corynespora cassiicola. Phytopathology, St. Paul, v.59, n.1, p.58-60, 1969.

TRINDADE, D.R. & FURTADO, E.L. Doenas da seringueira. In: Kimati, H., Amorim, L., Bergamin Filho, A., Camargo, L.E.A., Rezende, J.A.M. Manual de Fitopatologia - doenas das plantas cultivadas. So Paulo, 3 ed., Agronmica Ceres, 1997. cap.60, v.2, p.628-641.

TUITE, J. Plant pathology methods; Fungi and Bacteria. Mineapolis: Burgess Publishing, 1969, 239p.

VERZIGNASSI, J.R., VIDA, J.B. & TESSMAM, D.J. Corynespora cassiicola causando epidemias de manchas foliares em pepino japons sob estufa no Norte do Paran. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.28, n.5, p.570, 2003.

VIANA, F.M.P., FREIRE, F.C.O., SANTOS, A.A., VIDAL, J.C. & CARDOSO, J.E. Similaridade sintomatolgica de duas novas doenas do mamoeiro no Estado do Cear. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.28, supl., p.234, 2003. Resumo n.163.

59

VOLIN, R.B. & POHRONEZNY, K. Severe spotting of market tomato fruit incited by Corynespora cassiicola after storm-related injury. Plant Disease, St. Paul, v.73, n.12, p.1018-1019, 1989.

WEI, C.T. Notes on Corynespora. Mycological Papers, v.34, n.30, p.1-10, 1950.

WULFF, N.A. & PASCHOLATI, S.F. Doenas do Gergelim. In: KIMATI, H., AMORIM, L., BERGAMIN FILHO, A., CAMARGO, L.E.A., REZENDE, J.A.M. Manual de Fitopatologia - doenas das plantas cultivadas. So Paulo, 3 ed., Agronmica Ceres, 1997. cap.39, v.2, p.427-435.

YORINORI, J.T. & BIDIA, F.L. Reao de cultivares de soja Corynespora cassiicola e variabilidade de isolamentos do fungo de mancha alvo e podrido de raiz. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.23, supl., p.299, 1998. Resumo n.497.

YORINORI, J.T. & HOMECHIN, M. Doenas de soja identificadas no Estado do Paran no perodo de 1971 a 1976. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v.2, n.1, p.108, 1977.

YORINORI, J.T. Epidemia de mancha alvo (Corynespora cassiicola) na cultivar FT-Estrela na safra 1995/96. In: Reunio de Pesquisa de Soja da Regio Central do Brasil, 18., 1996, Uberlndia, 1996. p.319.

YORINORI, J.T. Levantamento e avaliao da situao de doenas da soja na safra 1987/88. In: Resultados de Pesquisa de soja 1987/1988, Londrina, Embrapa-CNPSo, 1989, p.158.

60

8. APNDICE

61

Apndice Esporulao de isolados de Corynespora cassiicola originados de diferentes hospedeiros, cultivados em meio batata-dextrose-gar, temperatura de 242C, aps 10 dias de incubao. UEM, Maring, PR, 2004 Esporulao1 1 x 104 condios/mL 2,40 0,65 1,63 9,58 15,5 2,85 11,33 0,98 1,63 1,2 0,33 5,98 3,73 2,68 0,90

Isolado IA PB JQ LP05 493AA 777AA LP02 GS01 JMP220 LP04 LP01 LP07 RWB321 CP03 GS02
1

Origem dos isolados Pepino Pepino Pepino Abbora Soja Soja Tomateiro Mamoeiro Lantana Aceroleira Alface Pimenta-longa Falso-boldo Trapoeraba Assa-peixe

Dados no transformados

62