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Contenido Descripcin ......................................................................................................................................................... 2 Equipamiento ...................................................................................................................................................... 2 Normas para la correcta toma de muestras micolgicas ................................................................................ 2 Consejos generales para optimizar la recoleccin de muestras: ..................................................................... 3 5.- Durante la toma de muestras, debe seguirse todas las medidas de seguridad necesarias, ..................... 3 tanto para el personal como para la muestra. ................................................................................................. 3 Material necesario para la toma de muestras ...................................................................................................... 3 Muestras de lesiones superficiales ...................................................................................................................... 3 escamas y/o costras ....................................................................................................................................... 3 Pelos y cabellos .............................................................................................................................................. 4 Uas ............................................................................................................................................................... 4 Muestras subcutneas ..................................................................................................................................... 4 Muestras de rganos profundos .......................................................................................................................... 5 Esputo ............................................................................................................................................................ 5 Orina .............................................................................................................................................................. 5 Liquido cefalorraquideo ................................................................................................................................. 5 Exudados trasudados y sangre ....................................................................................................................... 5 Muestras de mucosas ..................................................................................................................................... 5 Heces fecales .................................................................................................................................................. 5 Biopsias de tejidos ......................................................................................................................................... 6 Muestras de animales ..................................................................................................................................... 6 Examen directo micolgico ................................................................................................................................ 6 Objetivo.- ....................................................................................................................................................... 6 Tcnica.-......................................................................................................................................................... 7 Estructuras fngicas observadas en el examen directo................................................................................... 7 Micelio septado ......................................................................................................................................... 7 Micelio cenoctico ..................................................................................................................................... 7 Parasitismos pilosos .................................................................................................................................. 7 Estructuras levaduriformes ........................................................................................................................ 7 Clulas fumagoides ................................................................................................................................... 7 Esfrula ..................................................................................................................................................... 7 Cultivos, subcultivos, medios empleados, tcnica .............................................................................................. 8 BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................................................ 9

LABORATORIO DE MICOLOGA - DIAGNOSTICO MICOLGICO Descripcin

El laboratorio de Micologa es una seccin de los laboratorios de Microbiologa, dedicado al estudio, aislamiento e identificacin de hongos agentes de micosis, micotoxicosis, micetismo y alergias fngicas, de actinomicetos causantes de pseudomicosis y de algas patgenas. Un buen Laboratorio de Micologa debe tener adems de la infraestructura para realizar el estudio micolgico (examen directo y cultivo), una muy buena coleccin de hongos, es decir, una micoteca para estudiar las caractersticas micro y macromorfolgicas, la fisiologa y la estructura antignica de los hongos patgenos, saprfitos (contaminantes) y oportunistas. Debe tener una seccin de Micopatologa para conocer la respuesta tisular de los rganos y sistemas atacados por los hongos, tambin una seccin de Micoserologa para realizar las distintas pruebas serolgicas para el diagnstico y el control de curacin, especialmente de las micosis sistmicas, adems, el miclogo no puede prescindir de una biblioteca formada por libros y revistas especializadas actualizadas para conocer informacin cientfica de utilidad en su actividad diaria, finalmente en los ltimos aos, el Internet, se ha convertido en una fuente de informacin cientfica de gran valor, por lo que se hace imprescindible su utilizacin. Para un correcto funcionamiento de un laboratorio de Micologa es necesario en primer lugar contar con un ambiente fsico muy bien aireado, que ser dividido en 3 secciones primordiales y 2 secciones opcionales, las secciones primordiales son : 1) Laboratorio propiamente dicho, 2) Micoteca, 3) Oficina biblioteca, las opcionales son: 1) Micopatologa y 2) Micoserologa.

Equipamiento
El equipamiento se divide en material elctrico y electrnico, material de vidrio, reactivos y/o productos qumicos, muebles y material de escritorio, material de limpieza y otros materiales. Normas para la correcta toma de muestras micolgicas Para alcanzar xito en el diagnstico laboratorial micolgico es fundamental realizar adecuadamente la toma de la muestra, su transporte y procesamiento, realizar el examen microscpico directo, la siembra de la misma en los medios idneos e incubacin a la temperatura adecuada, asi como la identificacin e interpretacin correcta de los aislamientos. El diagnstico de las micosis comienza con su sospecha clnica, por lo que una adecuada obtencin de la muestra a partir de la lesin, su correcta manipulacin para mantener la viabilidad del agente etiolgico y evitar posibles contaminaciones, son aspectos fundamentales que siempre deben tenerse en cuenta para la realizacin de un correcto diagnstico micolgico, a pesar de lo expuesto, los riesgos de no observar el agente etiolgico son muy altos, en el examen directo podemos tener resultados falso negativos y en el cultivo un aislamiento equivocado.

Por tales motivos la recoleccin de estas muestras debe ser tarea de personal con conocimientos y experiencia necesarios para no cometer los errores antes mencionados. Consejos generales para optimizar la recoleccin de muestras: 1.- Debe disponerse de un protocolo de toma de muestras actualizado periodicamente. 2.- Es necesario tomar las muestras aspticamente, utilizando materiales estriles 3.- Las muestras deben tomarse antes de instaurar el tratamiento y si ste esta en curso, debe suspenderse por lo menos 3 das. 4.- Las muestras deben tomarse de la parte activa de las lesiones. 5.- Durante la toma de muestras, debe seguirse todas las medidas de seguridad necesarias, tanto para el personal como para la muestra.

Material necesario para la toma de muestras

12345678Hojas de bistur. 9.- Alcohol comercial 70 grados. Pinzas pequeas de puntas afiladas. 10.- Laminas de vidrio portaobjetos. Pinzas para depilacin. 11.- Jeringas hipodrmicas de 5 y 10 ml Tijeras pequeas de puntas afiladas. 12.- Cajas pequeas de Petri de plstico desechables Curetas dermatolgicas 13.- Sobres pequeos tipo filatelistas Asas de platino redondas. 14.- Papel sabana y bolgrafos Hisopos de algodn estriles. 15.- Guantes de goma. Algodn hidrfilo 16.- Cinta adhesiva (scotch tape).

Muestras de lesiones superficiales

escamas y/o costras La recoleccin de estos materiales no es difcil, deben ser tomadas con la ayuda de bistur o retiradas cuidadosamente una por una de los bordes de la lesin con la pinza de puntas afiladas, si existieran varias lesiones se deben tomar de las ms recientes. Antes de la toma debe acostumbrarse a realizar una limpieza general de la zona con un algodn embebido de alcohol al 80%, esta limpieza debe evitarse cuando se sospecha pitiriasis versicolor o infecciones por Cndida albicans, Se tomar bastante muestra con el objeto de repetir el estudio si fuera necesario, por otra parte si las lesiones estn recibiendo tratamiento local o sistmico, se indica al paciente suspender la terapia por espacio mnimo de 3 das y recin se procede a la toma de muestra; si en las lesiones existen vesculas son tiles los techos de las mismas que son retirados con tijeras finas, deben utilizarse como envases las lminas o portaobjetos limpios y esterilizados, tambin cajas de petri o pequeos sobres de papel tipo filatelista, naturalmente esterilizados. Una tcnica sencilla y de uso corriente en los laboratorios de Micologa es el empleo de la cinta adhesiva o scotch tape especialmente cuando se sospecha pitiriasis versicolor, la tcnica consiste en aplicar directamente la cinta sobre la piel enferma y luego pegarla sobre el portaobjetos para la observacin directa al microscopio, con este mtodo no es posible obtener muestra para cultivo.

Pelos y cabellos En las lesiones de cuero cabelludo y en otras zonas pilosas, se debe arrancar con la ayuda de pinzas para depilar, los pequeos muones de los pelos o cabellos que se encuentran en el interior de la lesin pseudoalopcica, los cuales ofrecen poca resistencia al retirarlos y no provocan dolor, tambin sirven las escamas grises que cubren las lesiones y en cuyo interior se encuentran fragmentos de pelos parasitados. Cuando sospechamos tinea capitis microsprica y las lesiones son pequeas y difusas, se examina al paciente en un ambiente oscuro y se ilumina las zonas comprometidas con la lmpara de Wood que emite rayos ultravioletas (longitud de onda de 360 nanmetros), los pelos parasitados presentan una fluorescencia amarilla verdosa, lo que permite individualizarlos, este tipo de muestras se recogen en los mismos envases utilizados para las escamas. Uas La toma de muestras de uas del pie y/o de la mano es muy tediosa cuando se compara con la recoleccin de escamas y pelos. Con la ayuda de una cureta dermatologica u otro objeto de punta roma, se retira el material subungueal que es la muestra mas til, tambin se pueden cortar con tijeras fragmentos de uas de las zonas donde hay prdida del brillo, engrosamiento y desprendimiento del lecho ungueal (oniclisis). En el caso de existencia de perionixis con formacin de lesiones exudativas y purulentas, se recoge el pus con la ayuda de un hisopo estril o asa de platino, aqu tambin se utilizan los mismos envases empleados para las escamas y pelos. Estas muestras epidrmicas o provenientes de los anexos pueden conservarse varias semanas o meses en ambientes frescos sin que sufran deterioro, esto permite que puedan ser enviadas de un lugar a otro utilizando transporte comn (correos). En este caso es preferible emplear pequeos sobres tipo filatelista y no lminas de vidrio (portaobjetos) que se rompen fcilmente durante el transporte. Es menester que las muestras esten bien selladas con adhesivo y rotuladas con identificacin clara sealando el nombre del paciente, tipo de material enviado y la ubicacin de las lesiones, finalmente la sospecha clnica y la direccin donde se enviar el resultado. Muestras subcutneas En general estas muestras provienen de lesiones de las micosis cutneo profundas que adems de la piel comprometen el tejido celular subcutneo, los msculos y frecuentemente los huesos, tienen predileccin por localizarse en las extremidades. Cuando se sospecha Esporotricosis, la mejor muestra es puncionar ndulos cerrados y extraer pus con la ayuda de una jeringa hipodrmica, si no hay ndulos se retiran las escamocostras mediante pinzas y/o material seropurulento con la ayuda de hisopos. En el caso de la Cromomicosis, las muestras de eleccin son las escamocostras que cubren las lesiones, seleccionar aquellas que presentan pequeos puntos negros, la retirada debe hacerse con la ayuda de pinzas, si hay exudado debe retirarse con hisopos. Referente a los Micetomas, se debe tomar material purulento de los trayectos fistulosos presionando la base de los mismos para que salga pus de la profundidad, en algunos casos se

observan ya macroscpicamente la presencia de granos, en caso de no existir pus, se toma material (escamocostras) de los bordes de las fstulas. Las muestras hmedas deben ser procesadas de inmediato o en lo posible dentro de las 24 horas de la toma de la muestra, en cambio las muestras secas pueden conservarse varios das o semanas.

Muestras de rganos profundos

Esputo La muestra tiene que ser representativa de una expectoracin desde los pulmones y no solamente saliva. La recoleccin de esputo de 24 horas es innecesaria en Micologa, los envases deben ser estriles sin conservadores, el procesamiento del esputo debe ser de inmediato, de no ser posible debe conservarse en refrigeracin, mximo durante 12 horas. Otras muestras provenientes de los pulmones son: aspirando y cepillado bronquial, aspirado bronquioalveolar, biopsia pulmonar y lquido pleural. Orina La muestra de orina debe ser de la primera miccin de la maana directamente en un envase estril, debe desecharse el primer chorro, la orina recolectada durante 24 horas, lo aconsejable es procesarla de inmediato. En lactantes y nios pequeos, la orina se recoge en bolsas plsticas colectoras estriles. Liquido cefalorraquideo El L.C.R. habitualmente es recolectado por el mdico que efecta la puncin lumbar, como mnimo son necesarios 3 cc. para realizar el estudio micolgico, si se piensa inocular animales de experimentacin se debe aumentar la cantidad. El L.C.R. Exudados trasudados y sangre Los lquidos que se acumulan como parte de un proceso infeccioso o inflamatorio se denominan trasudados si la densidad es menor de 1.013 y exudados si la densidad es mayor, habitualmente estas muestras se obtienen por aspiracin con una aguja y jeringa estriles, para su recoleccin deben utilizarse frascos estriles y el procesamiento debe ser de inmediato. Cuando se sospecha una septicemia mictica se debe realizar los estudios en la sangre, esta es obtenida mediante una jeringa estril y procesada de inmediato. Muestras de mucosas Las muestras de lesiones localizadas en las mucosas como son: bucal, farngea, nasal, conjuntival, tica, anal, vaginal y prepucial deben tomarse con la ayuda de un hisopo estril o mediante asas de platino circular, en el caso de secrecin vaginal se debe utilizar un espculo y tomar la muestra de los fondos de saco vaginales, en general estas muestras deben ser procesadas de inmediato. Heces fecales

Deben ser recolectadas inmediatamente despus de su emisin, se tomar pequeas muestras de diferentes sitios con la ayuda de una cucharilla de material plstico, el procesamiento debe realizarse de inmediato, tambin puede efectuarse un hisopado de la ampolla rectal a travs de un anoscopio. Biopsias de tejidos Es importante que estas muestras sean colocadas en frascos conteniendo suero fisiolgico o agua destilada estriles y no en formol. Muestras de animales Frecuentemente el laboratorio de Micologa es solicitado para efectuar estudios de muestras de animales, especialmente los domsticos, en general estas muestras provienen de piel y anexos, y consisten en escamas, costras o pelos, deben retirarse con la ayuda de pinzas y colocarse en medio de 2 lminas de vidrio (portaobjetos), como son muestras secas pueden conservarse varias semanas, pero es conveniente procesarlas dentro de las 24 horas

Examen directo micolgico

Objetivo.Se llama tambin examen en fresco; el micelio o filamento, las esporas y otras estructuras que presentan los hongos durante su vida parasitaria son fcilmente evidenciables con el microscopio comn mediante el examen directo de las muestras clnicas usando lquidos aclarantes. Las limitaciones y los problemas del examen directo deben ser tomadas en cuenta: 1.- Un examen directo negativo no excluye la infeccin o micosis sospechada 2.- El examen directo puede dar resultados falso positivos, al confundirse ciertas artefactos con estructuras fngicas, ej: gotas de grasa con levaduras gemantes, linfocitos lisados con Cryptococcus neoformans, fibras de colgeno y fibras de algodn de los hisopos con elementos fngicos, el mosaico fngico con hifas de dermatofitos, etc. 3.- Si la muestra es escasa, el cultivo debe ser prioritario. Lquidos aclarantes.Son los siguientes: 1.- Hidrxido de Potasio ( KOH ) solucin acuosa variando la concentracin del 20 al 40%, tiene la propiedad de aclarar y ablandar las muestras slidas. 2.- KOH al 20% + Glicerina al 5%, mezclados a partes iguales, esta combinacin evita que la preparacin se seque rpidamente y aparezcan cristales, fenmenos que ocurren cuando se usa solucin de KOH pura. 3.- KOH al 20 %, a 20 cc. se aade algunas gotas de tinta azul Parker, esta combinacin permite colorear las estructuras fngicas y una mejor visualizacin.

4.- Clorolactofenol (cido fnico 1 gr, cido lctico 1 gr, hidrato de cloral 2 gr.) que tiene la propiedad de aclarar pero no ablandar, se emplea para escamas finas y pelos en general. Tcnica.Se colocan 1 o 2 gotas del lquido aclarante elegido sobre el portaobjetos, luego la muestra slida a estudiar (escamas, costras, fragmentos de uas, pelos, etc. ) y finalmente el cubreobjetos, antes de la observacin microscpica se puede calentar la preparacin sin llegar a la ebullicin para acelerar el aclaramiento y ablandamiento de la muestra, o bien se espera 15 a 20 minutos que es el tiempo que se requiere para ablandar y aclarar sin calentar la preparacin, antes de observar se realiza leve presin del cubreobjetos con el fin de extender la muestra. En general se utiliza los objetivos 10, 25 y 40. En las muestras liquidas y semilquidas (esputo, secreciones, exudados, pus, etc.), el examen directo se realiza directamente colocando sobre el portaobjetos una pequea cantidad de la muestra y encima el cubreobjetos, en el caso de orina y LCR se deben centrifugar previamente y observar el sedimento. Espordicamente durante la realizacin del examen directo se requieren de coloraciones especiales, las ms usadas son: la tincin de Gram para levaduras y actinomicetos, la coloracin de Ziehl Nielsen para actinomicetos, la coloracin de Kinjoun para la deteccin de especies del gnero Nocardia , la coloracin de Giemsa para Histoplasma capsulatum y la utilizacin de la tinta china para visualizar Cryptococcus neoformans . Estructuras fngicas observadas en el examen directo Las adaptaciones parasitarias que presentan los hongos en los tejidos atacados son: Micelio septado, el hallazgo de esta estructura con ramificaciones y en algunos casos el micelio se presenta artrosporado Micelio cenoctico, (mucormicosis), en general las hifas son de paredes gruesas y presentan ramificaciones en 90 grados Parasitismos pilosos, estas estructuras permiten confirmar el diagnstico de las diversas variedades de tinea capitis, parasitismo endothrix, parasitismo ectothrix. Estructuras levaduriformes, Se incluyen la Paracoccidioidomicosis, la Histoplasmosis, la Esporotricosis, Blastomicosis Norteamericana, Lobomicosis, Criptococosis, Candidiasis y otras. Clulas fumagoides, Hallazgo en el tejido parasitado da el diagnstico de Cromomicosis Esfrula, Es una estructura redondeada de tamao variable que contiene en su interior endosporas, existen 2 micosis conocidas cuyo estado parasitario esta representado por esfrulas, la Coccidioidomicosis con esfrulas de tamao promedio de 60 micras y paredes medianamente gruesas y la Rinosporidiosis con esfrulas de gran tamao llegando en algunas ocasiones a 300 micras de dimetro y de paredes muy finas.

Cultivos, subcultivos, medios empleados, tcnica

Enseguida o concomitantemente al examen directo se debe realizar el cultivo del material clnico con el objeto de aislar del hongo responsable del proceso patolgico, el medio universalmente utilizado en los laboratorios de Micologa es el medio de Sabouraud que contiene glucosa al 2%, peptona al 1% y agar al 20%, existen de acuerdo a preferencias personales varias modificaciones de este medio y otros para el aislamiento de los hongos, como ejemplo tenemos en medio Lactrimel del Prof. Dante Borelli de Venezuela que contiene harina de trigo 14 gr. miel 7 gr. leche en polvo 14 gr. y agua destilada 100 ml. Dado que muchas muestras clnicas, por no decir todas, se recogen de fuentes no estriles, es necesario aadir a los medios de cultivo inhibidores bacterianos para evitar el crecimiento de bacterias contaminantes, los antibiticos mas usados son el cloranfenicol y la gentamicina debido a que estas substancias son termoestables, de manera que la esterilizacin del medio en el autoclave no modifica su accin bacteriosttica y/o bactericida, tambin se puede utilizar la penicilina y estreptomicina pero como son termolbiles deben ser incluidas despus de la esterilizacin. Los mohos o contaminantes son hongos de crecimiento rpido y en general los patgenos crecen lentamente por consiguiente los medios tienden a llenarse de hongos contaminantes que perjudican y/o inhiben el crecimiento de los patgenos, por lo expuesto se debe incluir en los medios un compuesto antifngico que evite el crecimiento de hongos contaminantes, el ms usado es la Cicloheximide que es comercializada por el laboratorio Upjohn con el nombre de Actidione, este antimictico inhibe la mayora de los contaminantes y deja crecer los patgenos con algunas excepciones como Cryptococcus neoformans, algunas especies del gnero Cndida, Pseudoallescheria boydii, etc. En el comercio existen medios de cultivo deshidratados similares al Sabouraud con antibiticos que solo requieren el aumento de agua, ej. Bacto Mycobiotic Agar de Difco, cuya formula tiene soya, glucosa, agar, cicloheximide y cloranfenicol, para preparar se aade a 1 litro de agua a 36,5 gr. del medio deshidratado. Las tcnicas del sembrado son las habitualmente usadas en los laboratorios de Microbiologa, las muestras secas (escamas, pelos, uas, etc.) se siembran con la ayuda del asa de platino angular y depositando fragmentos de la muestra en la superficie del medio y luego presionarlos ligeramente en el interior del medio, en general se colocan 3 a 4 fragmentos a distancia de 1 cm entre cada uno. Las muestras liquidas, se siembran extendiendo el material sobre la superficie del medio formando estras con la ayuda del asa de platino circular. Los cultivos se incuban a temperatura ambiente (cuando ella varia de 20 a 30 grados C) o en estufas de 25 grados C. Los controles se realizan 2 veces por semana y se mantienen por espacio de 30 das antes de descartarlos como negativos, para los hongos dimrficos la incubacin primaria debe realizarse a 25 grados C y una vez aislada la fase filamentosa se efecta un subcultivo que es incubado a 37 grados C para obtener la fase levaduriforme. Los medios de cultivo pueden utilizarse de acuerdo a criterio personal en tubos de ensayo o en cajas de Petri, cuando se utilizan los tubos estos deben ser grandes de 20 cm de largo y 12 mm de dimetro, el medio debe ser solidificado en pico de flauta con una base de 1 cm aproximadamente, deben ser cerrados con tapones de algodn o con tapas a rosca, si se usan tapas deben aflojarse ligeramente despus del sembrado para dejar que los cultivos respiren, la desventaja de los tubos es que el rea de superficie es limitada para el aislamiento satisfactorio de colonias, en cambio las placas proporcionan una gran superficie donde se observan fcilmente cultivos mixtos y las colonias

tienen mayor aireacin, los tubos tienen la ventaja sobre las placas de ocupar menor espacio para el almacenamiento y la incubacin, en las placas el medio tiende a secarse ms rpido, finalmente el potencial de contaminacin del medio y el riesgo de contraer una infeccin laboratorial son mayores cuando se usan placas. Adems del medio de Sabouraud, en los laboratorios de Micologa se utilizan rutinariamente otros medios de cultivo, as tenemos el medio de Dixon para el aislamiento de especies del gnero Malassezia, el medio BHI agar para la obtencin de la fase levaduriforme de los hongos dimrficos, el medio crema de arroz (rice cream) para estimular el formacin de clamidosporas, micelio y pseudomicelio por Cndida albicans y otras especies de levaduras, los medios Carbn base y Nitrgeno base para la asimilacin de azcares, alcoholes y otras substancias qumicas en las pruebas de identificacin de levaduras, el medio liquido para la fermentacin de azcares por parte de levaduras, el medio Sabouraud al 10% para estimular la esporulacin y la conservacin de los hongos, el medio Sabouraud lquido en la purificacin de levaduras. . Otros medios usados para la conservacin de hongos son el medio Papa-Zanahora y el Extracto de Malta agar, en la identificacin de levaduras se usan los medios con Urea, Arbutina, V8 y de Aschner, en la identificacin de actinomicetos se usan los medios con casena, tirosina, xantina, hipoxantina, rea, gelatina y almidn. Se considera al cultivo micolgico como la prueba gold standard en el diagnstico laboratorial de las micosis en general.

BIBLIOGRAFIA 1.- Arenas Roberto

Micologa Mdica Ilustrada Interamericana-McGraw-Hill, segunda edicin, 2003. Mxico 2.- De Hoog D.S. y Guarro J. Atlas of clinical fungi Centraalbureau voor Schimmelcultures, 1995, Holanda 3.- Da Silva Lacaz C. Porto E. Costa Martins J. E. Micologa Mdica Sarvier, sptima edicin, 1984, Brasil