Separao e Anlise de componentes celulares por centrifugao Diferencial

Bioqumica Experimental I
Departamento de Qumica e Bioqumica Licenciatura em Bioqumica

Docente: Francisco Pinto Trabalho realizado por:

Alexandra Salvado, n 40267 Andreia Sousa, n 40261 Telmo Paiva, n 40243 PL 3

17 e 18 de Outubro de 2011 Ano Lectivo 2011/2012

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

ndice

Resumo ......................................................................................................................... 4 Material e Mtodos ....................................................................................................... 6 Preparao do homogenato de fgado de porco e centrifugao diferencial ................ 6 Determinao da actividade do succinato: citocrmo c oxidoreductase ...................... 8 Determinao da actividade do fosfatase cido .......................................................... 9 Doseamento de protenas pelo mtodo do biureto com desoxilato ........................... 10 Anlise da fraco nuclear isolamento do DNA .................................................... 11 Resultados e Discusso ............................................................................................... 13 Apresentao do fluxograma do esquema da centrifugao diferencial utilizado no fraccionamento sub-celular do fgado de porco. Identificao da composio esperada para cada fraco. ................................................................................. 13 Doseamento de protenas pelo mtodo do biureto com desoxicolato ........................ 14 Representao da curva de calibrao de doseamento de protena pelo mtodo do Biureto. Clculo da concentrao proteica do homogenato de fgado de porco e de cada uma das fraces isoladas. ........................................................................... 14 Fraco Mitocondrial determinao da actividade do succinato: citocrmo c oxidoreductase ........................................................................................................ 16 Clculo da actividade (U/mL) do succinato: citocrmo c oxidoreductase no homogenato isolado e em cada fraco isolada. ................................................... 16 Representao grfica da actividade especfica (U mg -1) do succinato: citocrmo c oxidoreductase nas diferentes fraces. Comentrio aos resultados obtidos. ........ 20 Fraco Lisossomal determinao da actividade do fosfatase cido ...................... 21 Determinao da actividade (U/mL) do fosfatase cido no homogenato inicial e em cada fraco isolada. ........................................................................................... 21 Representao grfica da actividade especfica (U mg -1) do fosfatase cido nas diferentes fraces. Comentrio aos resultados obtidos ........................................ 26 Pgina | 2

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial Distribuio dos marcadores enzimticos estudados ................................................ 27 Concluso sobre o sucesso do fraccionamento celular realizado. Discusso do impacto do esquema de centrifugao, da tcnica de homogeneizao e dos ensaios enzimticos usados nos resultados experimentais obtidos. ................................... 27 Anlise da fraco nuclear isolamento do DNA .................................................... 30 Apresentao de um fluxograma dos vrios passos envolvidos na preparao do DNA. .................................................................................................................. 30 Clculo da concentrao de DNA na sua preparao (final) e tambm da percentagem de DNA obtido por g de fgado. ...................................................... 31 Comentrio sobre o grau de pureza do DNA obtido e a sua eventual contaminao com protenas. ..................................................................................................... 33 Concluso ................................................................................................................... 34 Bibliografia ................................................................................................................. 36 Anexos........................................................................................................................ 37 Doseamento de protenas pelo mtodo do biureto com desoxicolato ........................ 37 Clculo das concentraes das solues padro ................................................... 37 Clculo da concentrao proteica das fraces ..................................................... 38 Fraco Mitocondrial: Determinao da actividade do succinato: citocrmo c oxidoreductase ........................................................................................................ 40 Grficos obtidos - curvas de calibrao................................................................ 40

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Resumo
A actividade laboratorial realizada teve como objectivo o isolamento de vrias fraces subcelulares a partir de um homogenato, neste caso, de fgado de porco por centrifugao diferencial e a determinao da sua caracterizao bioqumica, ou seja, foram determinadas as actividades de dois marcadores enzimticos: o succinato (pellet 2) e o fosfatase cido (pellet 3) e ainda se procedeu ao doseamento de protenas pelo mtodo do Biureto e ao doseamento de DNA (pellet 1). As fraces obtidas foram a fraco nuclear (pellet 1), a mitocondrial pesada (contm maioritariamente os mitocndrios, pellet 2) e leve (contm maioritariamente lisossomas, pellet 3) e uma quarta fraco contendo os restantes organelos celulares e o citosol (fraco solvel ou citoslica, que contm a parte solvel da clula como as protenas solveis, sobrenadante 3). A primeira fraco recolhida foi a nuclear, na qual se procedeu ao isolamento do DNA a fim de ser feita a determinao da sua concentrao, cujo valor obtido foi de 0,289 g.mL-1, cerca de 0,39% (m/m) presente na amostra. Nas duas fraces seguintes, pellet 2 e pellet 3, foram determinadas as actividades de succinato e de fosfatase cido, respectivamente, a partir da lei de Lambert-Beer. A actividade especfica do succinato no pellet 2 foi de 0,0410 U.mg-1 e esta foi a actividade especfica mais elevada observada nesta fraco, o que era de esperar uma vez que este enzima especfico da fraco mitocondrial. A actividade especfica de fosfatase cido foi de 3,5510-3 U.mg-1 para o pellet 3, que tambm foi a actividade mais elevada, o que tambm era de esperar, pois este enzima especfico para a avaliar a presena de lisossomas. Atravs da realizao de uns grficos com as actividades de ambos os marcadores enzimticos, succinato e fosfatase cido, foi possvel concluir que, na amostra de homogenato, a quantidade de mitocndrios foi muito superior quantidade de lisossomas, dado que a actividade especfica do enzima succinato desidrogenase foi muito superior actividade especfica do enzima fosfatase cido.

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Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial Nesta actividade experimental procedeu-se, igualmente, ao doseamento de protenas atravs da aplicao do mtodo do Biureto. Neste estudo concluiu-se que a concentrao de protenas no homogenato era de 66,66 mg.mL-1, no pellet 1 foi de 130,11 mg.mL-1, no pellet 2 foi de 60,72 mg.mL-1, no pellet 3 de 137,24 mg.mL-1 e finalmente, no sobrenadante 3 verificou-se uma concentrao proteica de 40,70 mg.mL-1.

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Material e Mtodos
Preparao do homogenato de fgado de porco e centrifugao diferencial
Material Bisturis Tesouras Pinas Homogeneizador de Potter-Elvehjem Papel de filtro Tubos de centrfuga Supercentrfuga refrigerada

Solues utilizadas Meio de Isolamento: tampo HEPES (pH 7,4) 10 mM com sacarose 0,25

M e EDTA 1 mM KOH 0.1 M Tampo Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM contendo NaCl 150 mM e EDTA 100

mM (200 mL) Mtodos

Transferiu-se o fgado lavado para um gobel pr-tarado

Pesou-se o fgado, cortou-se em pequenos pedaos e adicionou-se meio de isolamento gelado

Transferiu-se pores dessa mistura para um homogeneizador de Potter-Elvehjem pr-arrefecido

Manteve-se o copo do homogeneizador em gelo at ao fim deste processo. Moveuse para cima e para baixo entre 5-10 vezes, durante 5 segundos cada.

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Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial Transferiu-se o fgado j homogeneizado para um erlenmeyer pr-arrefecido e colocado em gelo

Dividiu-se o homogenato de fgado por tubos de centrfuga pr-arrefecida e centrifugou-se a 1000 x gav durante 10 minutos a 4C

O pellet P1, obtido corresponde fracco nuclear. Manteve-se os tubos em gelo.

Removeu-se o sobrenadante cuidadosamente para outros tubos de centrfuga com o auxlio de uma pipeta de Pasteur

Suspendeu-se o pellet P1 em soluo tamponada Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM; NaCl 150 mM e EDTA 100 mM. Manteve-se os tubos em gelo. Guardou-se uma amostra para medir a absorvncia

Centrifugou-se o sobrenadante, S1, a 3000 x gav durante 10 minutos a 4c (centrifugao 2 - C2)

Retirou-se o sobrenadante da C2 para outros tubos de centrfuga

Suspendeu-se o pellet P2, que constitui a fraco mitocondria "pesada" em meio de isolamento e manteve-se em gelo. Guardou-se uma amostra para medir a absorvncia

Centrifugou-se o sobrenadante S2 a 10000 x gav durante 20 minutos a 4C - C3

Guardou-se o sobrenadante S3

Suspendeu-se o pellet P3, que constitui a fraco mitocondrial "leve" meio de isolamento e manteve-se em gelo. Guardou-se uma amostra para medir a absorvncia

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Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial Nota: Todo o procedimento seguiu o protocolo, excepto a suspenso do pellet P2 e do pellet P3, que foi efectuada em 0,5 mL de meio de isolamento. Procedeu-se desta forma, uma vez que se usou fgado de porco em vez de fgado de rato, pelo que se diluiu menos, de forma a no reduzir a actividade enzimtica.

Determinao da actividade do succinato: citocrmo c oxidoreductase

Material Espectrofotmetro UV-Vis Cuvettes de plstico

Solues utilizadas Mtodos Ajustou-se o zero do espectrofotmetro a 550 nm com gua destilada Tampo de fosfatos (pH 7,2) 10 mM Citocromo C 1 mM em tampo de fosfatos (pH 7,2) 10 mM KCN 0,3 M em tampo de fosfatos (pH 7,2) 10 mM Succinato de sdio 0,5 M em tampo de fosfatos (pH 7,2) 10 mM

Adicionou-se tampo de fosfatos (pH 7,2) 10 mM, soluo de citocrmo c 1 mM, KCN 0,3 M e a fraco pretendida a um tubo de ensaio

Agitou-se bem a mistura e transferiu-se quantitativamente para uma cuvette

Iniciou-se a reaco com a adio de soluo de succinato 0,5 M clula amostra

Agitou-se a mistura por inverso, tapando a cuvette com parafilm. Seguiu-se a reduo do citocrmo c pelo aumento de absorvncia ao longo do tempo, 1 minuto

Repetiu-se o procedimento anterior para o homogenato, para as vrias fraces colectadas e para o sobrenadante final

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Determinao da actividade do fosfatase cido

Material Espectrofotmetro UV-Vis Cuvettes de plstico

Solues utilizadas Desoxicolato de sdio 0,5% (m/v) Tampo acetat de sdio (pH 5,0) 0,5M pNPP (p-nitrofenilfosfato) 10 mM NaOH 0,5M

Mtodos

Preparam-se 2 tubos de ensaio de acordo com o quadro abaixo (Quadro 1) para o homogenato, para as vrias fraces colectadas e para o sobrenadante final

Preparou-se um tubo controlo igual aos anteriores, mas em que o volume de fraco celular foi substitudo por gua

Adicionou-se a cada tubo desoxicolato de sdio 0,5% (m/v), misturou-se bem e adicionou-se tampo acetato de sdio (pH 5,0) 0,5 M

Incubaram-se as amostras a 37C durante 10 min e pararou-se a reaco com a adio de NaOH 0,5 M

Leu-se a absorvncia dos vrios tubos a 400 nm, usando o contedo do tubo controlo como branco

Repetiu-se o procedimento para o homogenato, para as vrias fraces colectadas e para o sobrenadante final

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Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial Quadro 1. Doseamento da actividade do fosfatase cido Reagente Fraco (mL) Fraco diluda H2O (mL) em Tubo A 0,1 B 0,1

Doseamento de protenas pelo mtodo do biureto com desoxilato

Material Espectrofotmetro UV-Vis Cuvettes de plstico

Solues utilizadas Mtodos Retirou-se uma alquota de cada fraco e adicionou-se 1 volume de TCA 10% (m/v) Reagente do biureto com desoxicolato Albumina srica bovina (BSA) 5,0 mg/mL TCA 10% (m/v)

Centrifugou-se a 600 X g durante 7 min e decantou-se o sobrenadante

Adicionou-se gua destilada para suspender o pellet.

Preparou-se uma curva-padro para o mtodo do biureto segundo as indicaes do quadro abaixo, Quadro 2

Aqueceu-se os tubos de ensaio num banho de gua fervente durante 1 min

Arrefeceu-se e leu-se a absorvncia a 540 nm

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Quadro 2. Doseamento de protena pelo mtodo do biureto com desoxicolato. Tubo BSA 5 mg mL-1 (mL) H2O (mL) Reagente do Biureto (mL) 0 0,0 1,0 2,0 1 0,05 0,95 2,0 2 0,1 0,9 2,0 3 0,2 0,8 2,0 4 0,3 0,7 2,0 5 0,4 0,6 2,0 6 0,5 0,5 2,0 7 0,6 0,4 2,0 8 0,8 0,2 2,0 9 1,0 0,0 2,0

Anlise da fraco nuclear isolamento do DNA

Material Espectrofotmetro UV-Vis Cuvettes de quartzo

Solues utilizadas NaOH 10 M Tampo Tris-HCI (pH 8,0) 1M (1 L) NaCI 5 M (500 mL) EDTA 0,5 M pH 8,0 (500 mL) SDS 10% (m/v) (250 mL) NaClO4 5 M (500 mL) Tampo de citratos de sdio (pH 7,0) 0,15 M (1L) Tampo citrato (pH 7,0) 0,015 M contendo 0,15 M NaCl Clorofrmio: lcool isoamlico (24:1, v/v) (250 mL) Etanol absoluto

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Mtodos Adicionou-se SDS 10% (v/v) ao sedimento j ressuspendido em soluo tamponada Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM, NaCl 150 mM e EDTA 100 mM Misturou-se cuidadosamente por inverso Aqueceu-se a mistura num banho de gua a 60C durante 10 minutos, continuando a agitar Arrefeceu-se o tubo mergulhando-o em gua

Adicionou-se NaClO4 5 M e misturou-se cuidadosamente por inverso Adicionou-se um volume de clorofrmio: lcool isoamlico (24:1, v/v). Tapou-se e misturou-se com cuidado durante 20 minutos Centrifugou-se a 3500 x gav durante 10 minutos

Transferiu-se cuidadosamente a fase aquosa, superior, que continha os cidos nucleicos para um tubo Precipitou-se os cidos ncleicos com etanol absoluto a -20C

Misturou-se por inverso.

Centrifugou-se durante 10 minutos a 600 x gav e desprezou-se o sobrenadante

Dissolveu-se o sedimento de DNA em soluo de citrato (pH 7,0) 0,015 M contendo 0,15 M NaCl
Aps se ter acertado o zero do espectrofotmetro, determinou-se a concentrao de DNA na sua preparao atravs de absorvncia a 260 nm. Registou-se tambm a leitura de absorvncia a 280 nm

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Resultados e Discusso
Apresentao do fluxograma do esquema da centrifugao diferencial utilizado no fraccionamento sub-celular do fgado de porco. Identificao da composio esperada para cada fraco.

Homogenato

Pellet 1 Fraco nuclear

Sobrenadante (S1)

Pellet 2 Fraco mitocondrial "pesada"

Sobrenadante (S2)

Pellet 3 Fraco mitocondrial "leve"

Sobrenadante (S3)

Figura 1. Esquema da centrifugao diferencial

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Doseamento de protenas pelo mtodo do biureto com desoxicolato

Representao da curva de calibrao de doseamento de protena pelo mtodo do Biureto. Clculo da concentrao proteica do homogenato de fgado de porco e de cada uma das fraces isoladas. Para calcular a concentrao proteica das diferentes fraces obtidas do fgado, utilizou-se o mtodo do biureto. O princpio do mtodo de Biureto baseia-se na reaco do reactivo do biureto, que constitudo por uma mistura de cobre (sulfato de cobre pentahidratado) e hidrxido de sdio com um complexante que estabiliza o cobre em soluo, que normalmente tartarato de sdio. Em meio alcalino, o cobre reage com protenas (formando um complexo com ligaes peptdicas) e forma um complexo quadrangular plano de cor roxo. No clculo das concentraes proteicas das fraces obtidas foi necessrio compar-las com solues padro. As solues padro so preparadas com o fim de possurem diferentes concentraes proteicas, conhecidas, em que foi aplicado o mtodo do biureto (para que se encontrem nas mesmas condies que as amostras). Atravs destas solues, sabendo a sua concentrao e a que absorvncia correspondem possvel obter uma recta de calibrao que permitir obter a concentrao proteica das amostras pretendidas. Para a construo da curva de calibrao, realizaram-se trs medies de absorvncia para cada uma das concentraes proteicas tericas (Quadro 3) ver clculos referentes concentrao proteica das solues padro em anexo. . Quadro 3. Concentrao das solues padro e respectivas absorvncias. Tubos 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Pgina | 14 Concentrao proteica (mg mL-1) 0,000 0,083 0,167 0,333 0,500 0,666 0,833 1,000 1,333 1,667 1 medio 0,035 0,057 0,076 0,123 0,166 0,198 0,241 0,285 0,349 0,434 2 medio 0,033 0,056 0,083 0,117 0,169 0,201 0,216 0,281 0,346 0,424 3 medio 0,032 0,058 0,075 0,116 0,153 0,199 0,244 0,277 0,351 0,417

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Curva de Calibrao de doseamento proteico pelo mtodo do biureto

0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 0,333 0,666 0,999 1,332 1,665 1,998 Concentrao Padro (mg mL-1) Absorvncia a 540 nm y = 0,078x + 0,0397 R = 0,9969

Absorvncia Linear (Absorvncia)

Figura 2. Representao grfica da curva de calibrao de doseamento proteico pelo mtodo do biureto.

Com a recta de calibrao obtida (

) agora possvel medir corresponde

a concentrao das fraces atravs das absorvncias medidas, sendo que absorvncia medida e concentrao da soluo, tem-se que:

Para a medio das absorvncias foram retirados a cada fraco 0,5 mL no caso do homogenato e do pellet 1, e 0,75 mL no caso das restantes fraces (volumes correspondentes concentrao da fraco, [fraco]). A estes volumes foi adicionado o mesmo volume (retirado de cada fraco) de TCA 10% (m/v), ou seja, ao homogenato e ao pellet 1 foram adicionados 0,5 mL e s restantes 0,75 mL. Aps centrifugao foram adicionados 4 mL de gua, o que significa que esta soluo ficou com um volume total de 5,0 mL (soluo do homogenato e pellet 1) e de 5,5 mL (solues restantes) a concentrao da suspenso, [suspenso], corresponde concentrao proteica deste volume. A 1 mL das solues anteriores foram adicionados 2 mL de reagente do biureto (a esta soluo corresponde a concentrao da soluo do tubo de ensaio, [tubo de ensaio]) e foram aquecidas num banho de gua fervente durante 1 minuto.

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Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial No quadro seguinte (Quadro 4) possvel observar as concentraes referidas anteriormente e a concentrao na fraco os clculos necessrios ao preenchimento deste quadro encontram-se em anexo.

Quadro 4. Registo das absorvncias das vrias medies das fraces em que foi aplicado o mtodo do biureto e respectivas concentraes. [tubo de ensaio] (mg mL-1) [fraco] (mg mL-1) VT (Fraco) (mL) Abs540nm Diluio Medies Tubos 1 H Pellet 1 Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3 0,199 0,346 0,269 0,290 0,196 2 3 Mdia [suspenso] (mg mL-1)

m proteica

0,228 0,213 0,457 0,330 0,252 0,245 0,279 0,281 0,175 0,181

0,213 0,378 0,255 0,283 0,184

1:2 -

2,222 4,337 2,760 6,238 1,850

6,666 13,011 8,280 18,714 5,550

66,66 130,11 60,72 137,24 40,70

211 20 7 7 206

14065,26 2602,20 425,04 960,68 8384,20

Fraco Mitocondrial determinao da actividade do succinato: citocrmo c oxidoreductase

Clculo da actividade (U/mL) do succinato: citocrmo c oxidoreductase no homogenato isolado e em cada fraco isolada. Para analisar a pureza das fraces mitocondriais e a sua disperso ao longo de outras fraces, analisou-se a presena de um enzima caracterstico, succinato desidrogenase, dos mitocndrios. Este enzima participa em duas das mais importantes vias metablicas que ocorrem no mitocndrio: a cadeia respiratria e o ciclo do cido ctrico. O succinato desidrogenase tem localizao exclusiva no mitocndrio e como tal pode ser designado por marcador enzimtico. Assim, determinando a sua actividade pode-se determinar a fraco mais pura (em mitocndrios) considera-se que uma dada fraco sub-celular se encontra limpa, quando a actividade especfica do seu marcador enzimtico (succinato desidrogenase) 3 vezes superior das outras fraces. Pgina | 16

(mg)

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial Em condies adequadas, a velocidade da reaco medida proporcional quantidade de enzima presente no extracto (neste caso, succinato desidrogenase) o aumento de absorvncia a 550 nm varia linearmente com o tempo. Para calcular a actividade do enzima partiu-se da velocidade limite da reaco, que corresponde concentrao de substrato que se forma por unidade de tempo:

Sabendo que o declive (m) do grfico da absorvncia a 550 nm em funo do tempo (em segundos) obtido corresponde a:

Pela Lei de Lambert-Beer obtm-se:

Substituindo na equao da velocidade obtm-se:

Como a concentrao dada em M (mol L -1), necessrio multiplicar a frmula anterior pelo volume que se colocou na cuvette para obter as unidades pretendidas, ou seja, mol min-1. O volume que se colocou na cuvette foi . Logo: mL, ou seja,

Como as unidades de U so em por :

, multiplicou-se a equao anterior

Para obter a actividade do enzima divide-se o resultado da equao anterior pelo volume da fraco colocado na cuvette, ou seja, 0,05 mL:

Para obter a actividade total do enzima, multiplica-se a actividade pelo volume total da fraco:

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Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial Sabendo a massa de enzima (calculado no ponto anterior) possvel calcular a actividade de especifica SA nmero de moles que reagem por unidade de tempo e por massa de enzima:

Tome-se como exemplo o Homogenato:

Homogenato de Fgado de Porco

0,515 y = 0,0005x + 0,4818 R = 0,9953

Abs550nm

0,505

0,495

0,485

0,475 0 2 4 6 8 1012141618202224262830323436384042444648505254565860 Tempo (s) Figura 3. Representao grfica da variao de absorvncia com o tempo, durante 1 minuto (60 segundos), do homogenato de fgado de porco. Atravs do grfico anterior (Figura 3) obtm-se o valor do declive da recta, ou seja,

Atravs das equaes deduzidas anteriormente, sabendo que e , tem-se:

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Os clculos para as restantes fraces realizaram-se analogamente os grficos podem ser encontrados em anexo. O quadro abaixo (Quadro 5) resume os resultados das fraces.

Quadro 5. Resumo dos resultados obtidos para o succinato desidrogenase. VT (Fraco) (mL) 211 20 7 7 206 Actividad Actividade e (U mL-1) T (U) 1,036 1,866 2,466 3,110 0,414 218,60 37,32 17,42 21,77 85,28 m proteica
(mg)

Amostra Homogenato Pellet 1 Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadan te 3

Diluio (min-1) 0,0005 0,0009 0,0012 0,0015 0,0002

SA (U mg-1) 0,0155 0,0143 0,0410 0,0227 0,0102

14065,26 2602,20 425,04 960,68 8384,20

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Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial Representao grfica da actividade especfica (U mg-1) do succinato: citocrmo c oxidoreductase nas diferentes fraces. Comentrio aos resultados obtidos.

Actividade Especfica do Succinato:citocrmo c oxidorreductase

0,045 0,04 0,035 0,03 0,025 0,02 0,015 0,01 0,005 0
0,041

0,0227 0,0155 0,0143 0,0102

Figura 4. Grfico representativo das actividades especficas do sucinato:citocrmo c oxidorreductase das diferentes fraces em estudo

A actividade especifica maior no pellet 2, como esperado (Figura 1), no entanto, no 3 vezes superior a todas as outras fraces (em relao ao pellet 3 1,8 vezes superior, 1,8 < 3, pelo que o pellet 2 no limpo em relao ao 3), ainda assim, pode-se considerar que a separao foi bem sucedida. Para a actividade especfica do enzima obtiveram-se valores muito baixos. Para este facto deve ter-se em conta que o fgado utilizado no foi imediatamente congelado aps a morte do animal (porco) pelo que a maior parte das protenas presentes j se encontravam inactivas, o que conduziu a uma menor actividade enzimtica.

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Fraco Lisossomal determinao da actividade do fosfatase cido

Determinao da actividade (U/mL) do fosfatase cido no homogenato inicial e em cada fraco isolada.

A presena dos lisossomas pode ser detectada atravs de um enzima especfico, o fosfatase cido. Este enzima hidrolisa as ligaes ster de fosfato de uma forma no especfica, pelo que vrios compostos que possuam grupos fosfato terminais podem ser usados como substrato. O ensaio a ser utilizado tira vantagem do facto de um substrato artificial, o p-nitrofenilfosfato (pPP), que incolor, ser hidrolisado pelo enzima, produzindo p-nitrofenol, que amarelo, podendo ser determinado

espectrofotometricamente. Nesta parte da experincia foram preparados dois conjuntos de tubos: um conjunto apenas com a fraco de amostra (identificado com a letra A) e outro conjunto de tubos com a fraco da amostra diluda na proporo de 1:10 (identificado com a letra B). Posteriormente procedeu-se leitura das suas absorvncias, que se apresentam no quadro a seguir (Quadro 6).

Quadro 6. Absorvncias medidas a 400nm para os tubos preparados para a fraco lisossomal.

Tubo

Fraco
Homogenato Pellet 1

Abs400nm
1,272 0,482 1,091 2,556 0,908 0,117 0,079 0,120 0,118 -0,001( = 0*)

Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3 Homogenato Pellet 1

B (diluio 1:10)

Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3

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* durante a medio da absorvncia deve ter ocorrido um erro, pois a absorvncia deu negativo, por isso vamos considerar o seu valor como zero.

Em seguida apresentam-se ilustrados os mtodos de clculo para a determinao da actividade do fosfatase cido nos tubos A e B (diluio 1:10). Para estes clculos, de referir que se considerou a variao de absorvncia, Abs 400nm, como sendo a diferena entre o valor lido no espectrofotmetro (valor final) e o valor inicial, zero, uma vez que nesta altura no tinha passado tempo suficiente para ocorrer a reaco. Assim, para os tubos A e B tem-se:

Quadro 7. Valores da variao de absorvncia para o tubo A. Tubo Fraco Homogenato Pellet 1 A Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3 Homogenato Pellet 1 B Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3 Abs400nm inicial 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Abs400nm final 1,272 0,482 1,091 2,556 0,908 0,117 0,079 0,120 0,118 0 Abs400nm 1,272 0,482 1,091 2,556 0,908 0,117 0,079 0,120 0,118 0

Exemplificao dos clculos para o homogenato no tubo A: A variao de absorvncia a 400nm por unidade de tempo, em min-1 obtida atravs do quociente entre a Abs400 obtida em cada ensaio e o tempo de durao da reaco, 10 minutos.

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Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial Para determinar a actividade do fosfatase cido necessrio calcular a velocidade de reaco. A velocidade de reaco do enzima, variao da concentrao (moles por litro) por unidade de tempo, em mol.min -1, obtida pela seguinte equao:

Onde pNPP = 21000 M-1cm-1 e o volume do tubo de4 mL = 410 -3 L. Assim, a velocidade de reaco :

Atravs da velocidade de reaco podemos calcular a actividade do enzima, correspondente ao nmero de moles que reagem por unidade de tempo, U/mL. Neste caso, preciso ter em ateno que U vem expresso em mol.min -1. Podemos, ento calcular esta actividade atravs da equao:

Assim sendo, para o caso particular do homogenato no tubo A tem-se:

A actividade total do enzima, nmero de moles que reagem por unidade de tempo em U, ento dada pela seguinte equao:

Tem-se, assim, para o homogenato:

Sabendo a massa proteica de homogenato (clculos apresentados em anexo) , ento, possvel calcular a sua actividade especfica, SA atravs da expresso:

A actividade especfica para o homogenato, ento:

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Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

Para as outras fraces os clculos so feitos analogamente, portanto, apresentam-se os mesmos no quadro a seguir (Quadro 8).

Quadro 8. Resumo dos clculos realizados para o tubo A VT (Fraco) (mL) 211 20 7 7 206 Actividade ActividadeT (U mL-1) (U) 0,2423 0,2078 0,0918 0,4868 0,1739 51,12 1,84 1,45 3,41 35,82 m proteica
(mg)

Amostra Homogenato Pellet 1 Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3

Diluio (min-1) 0,1272 0,0482 0,1091 0,2556 0,0908

SA (U mg-1) 3,6310-3 7,0710-4 3,4110-3 3,5510-3 4,2710-3

14065,26 2602,20 425,04 960,68 8384,20

Exemplificao dos clculos para o homogenato no tubo B (diluio 1:10): No caso dos tubos B as amostras foram preparadas analogamente s do tubo A, mas diludas em gua na proporo de 1:10. Em seguida esto exemplificados os clculos para o homogenato do tubo B. A variao de absorvncia a 400nm por unidade de tempo, em min-1 dada por:

Para determinar a actividade do fosfatase cido necessrio calcular a velocidade de reaco. A velocidade de reaco do enzima, variao da concentrao (moles por litro) por unidade de tempo, em mol.min -1, obtida pela seguinte equao: Onde pNPP = 21000 M-1cm-1 e o volume do tubo de4 mL = 410 -3 L. Assim, a velocidade de reaco do homogenato para o tubo B :

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Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial Atravs da velocidade de reaco podemos calcular a actividade do enzima, correspondente ao nmero de moles que reagem por unidade de tempo, U/mL. Neste caso preciso ter em ateno que U vem expresso em mol.min -1 e que, como o factor de diluio de 1:10, necessrio multiplicar por 10 o valor da actividade obtida. Podemos, ento calcular esta actividade atravs da equao:

Assim sendo, para o caso particular do homogenato no tubo B tem-se:

A actividade total do enzima, nmero de moles que reagem por unidade de tempo em U , ento, dada pela seguinte equao:

Tem-se, assim, para o homogenato:

Sabendo a massa proteica de homogenato (clculos apresentados nos anexos) , ento, possvel calcular a sua actividade especfica, SA atravs da expresso:

A actividade especfica para o homogenato ento:

Para as outras fraces os clculos so feitos analogamente, portanto, apresentam-se os mesmos no quadro a seguir (Quadro 9).

Quadro 9. Resumo dos clculos realizados para o tubo B (diluio 1:10). VT (Fraco) (mL) 211 20 7 7 206 Actividade (U mL-1) 0,223 0,150 0,228 0,225 0 ActividadeT (U) 47,05 3,00 1,59 1,58 0 m proteica
(mg)

Amostra Homogenato Pellet 1 Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3

Diluio (min-1) 1:10 1:10 1:10 1:10 1:10 0,0117 0,0079 0,0120 0,0118 0

SA (U mg-1) 3,3410-3 1,1510-3 3,7410-3 1,6410-3 0

14065,26 2602,20 425,04 960,68 8384,20 Pgina | 25

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

Representao grfica da actividade especfica (U mg-1) do fosfatase cido nas diferentes fraces. Comentrio aos resultados obtidos

Actividade Especfica do Fosfatase cido

Actividade Especfica U.mg-1 4,27E-03 4,50E-03 4,00E-03 3,63E-03 3,74E-03 3,50E-03 3,34E-03 3,55E-03 3,00E-03 2,50E-03 1,64E-03 2,00E-03 1,15E-03 1,50E-03 1,00E-03 7,07E-04 3,41E-04 5,00E-04 0 0,00E+00

A (fraco no diluda) B (fraco diluda 1:10)

Fraco Figura 5. Grfico representativo das actividades especficas do fosfatase cido das diferentes fraces em estudo

A partir de um homogenato de clulas de fgado podem ser obtidas 3 fraces, como visvel no esquema da centrifugao (Figura 1). A terceira fraco recolhida, Pellet 3, denomina-se fraco microssomal (ou mitocondrial leve) e nela encontramse ribossomas, polissomas e pequenas vesculas provenientes principalmente do Retculo Endoplasmtico e do Complexo de Golgi. Assim sendo, a fraco onde era esperado obter-se mais actividade enzimtica era no pellet 3. Atravs da observao da representao grfica anterior (Figura 5), para o tubo A, que tem a fraco no diluda, possvel observar que a actividade especfica maior no sobrenadante 3, seguindo-se o homogenato e s depois o pellet 3, pelo que se pode concluir que a separao no foi bem sucedida. Este resultado deve-se s partculas de pequenas dimenses que, por se encontrarem perto do fundo do tubo da centrfuga, pode sedimentar juntamente com as partculas de maior massa, ou at serem Pgina | 26

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial arrastadas por estas, dando origem a pellets impuros, logo a uma centrifugao menos eficiente. Quanto s solues do tubo B, que contm a fraco diluda 1:10, seria de esperar obter uma actividade semelhante do tubo A pois, apesar das solues B terem a fraco diluda, os clculos da actividade especfica (SA) efectuados tiveram em conta esta diluio. A obteno de valores to diferentes nos tubos A e B deve-se a um erro durante a incubao dos tubos que conduziu a que nem todos tivessem 10 minutos at a reaco ser parada com NaOH, assim, tubos que tiveram mais tempo de incubao possuem maior actividade enzimtica e como tal maior actividade especfica.

Distribuio dos marcadores enzimticos estudados

Concluso sobre o sucesso do fraccionamento celular realizado. Discusso do impacto do esquema de centrifugao, da tcnica de homogeneizao e dos ensaios enzimticos usados nos resultados experimentais obtidos.

A avaliao do resultado final no isolamento de um organito subcelular requer um teste para a presena desse organito. Tipicamente, mede-se a actividade de um enzima cuja localizao subcelular exclusiva desse organito. Estes enzimas so designados de marcadores enzimticos. Estes marcadores fornecem informao sobre o grau de pureza bioqumica dos organitos fraccionados. Os marcadores enzimticos desta actividade laboratorial so, nomeadamente, o sucinato: citocrmo c oxidoreductase (fraco mitocondrial) e o fosfatase cido (fraco microssomal). Os resultados obtidos para estes enzimas apresentam-se resumidos no quadro seguinte (Quadro 10).

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Quadro 10. Quadro resumo das actividades dos marcadores enzimticos. Succinato:citocromo c oxidorreductase Actividade SA (U.ml-1) (U.mg-1) 1,036 1,866 2,466 3,110 0,414 0,0155 0,0143 0,0410 0,0227 0,0102 Fosfatase cido Tubo A B A B A B A B A B Actividade (U.ml-1) 0,2423 0,2230 0,2078 0,1500 0,0918 0,2280 0,4868 0,2250 0,1739 0 SA (U.mg-1) 3,6310-3 3,3410-3 7,0710-4 1,1510-3 3,4110-4 3,7410-3 3,5510-3 1,6410-3 4,2710-3 0

Amostra Homogenato Pellet 1 Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3

Vt (mL) 211 20 7 7 206

[protena] (mg.mL-1) 66,66 130,11 60,72 137,24 40,70

Para as concluses a retirar acerca do sucesso do fraccionamento celular realizado, apenas se teve em considerao os valores de actividade especfica obtidos para o caso A (fraces no diludas), mesmo tendo sido calculados os mesmos valores para o caso B (fraces diludas na proporo 1:10). Atravs da observao do grfico e comparando os resultados obtidos para cada amostra e para cada marcador enzimtico, claramente visvel que na amostra de homogenato, a quantidade de mitocndrios (pellet 2) foi muito superior das outras fraces, dado que a actividade especfica do enzima succinato desidrogenase, para uma menor concentrao proteica, foi muito superior comparando com as outras. Tal facto era de esperar, visto que a determinao da actividade especfica deste enzima consiste na medio espectrofotomtrica da reduo do citocrmo c pelo sucinato. Para o caso do fosfatase cido, possvel observar que as maiores actividades especficas obtidas foram para o pellet 3 e para o sobrenadante 3. Era de esperar, no caso do pellet 3, que a actividade especfica fosse mais elevada, uma vez que nessa fraco que se encontram os lisossomas e, visto que a presena dos mesmos detectada atravs do enzima especfico fosfatase cido, a actividade a seria, ento, maior. No caso do sobrenadante 3 no era de esperar actividade do enzima, uma vez que, caso a

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Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial centrifugao tivesse sido eficiente, nesta fraco no se encontrariam lisossomas ou mitocndrios e, por isso, no se observariam actividades dos enzimas especficos. De uma forma global, verifica-se que, na amostra de homogenato, a quantidade de mitocndrios foi muito superior quantidade de lisossomas, dado que a actividade especfica do enzima succinato desidrogenase foi muito superior actividade especfica do enzima fosfatase cido. A eficcia da centrifugao diferencial realizada no foi a esperada, uma vez que se obtiveram amostras heterogneas e com alguns contaminantes. A maioria dos contaminantes surgiu no sobrenadante 3, pois, teoricamente, esperava-se que esta amostra no contivesse lisossomas ou mitocndrios. Deste modo, na separao dos mitocndrios, pode concluir-se que os resultados experimentais correspondem aos previstos, pois obteve-se uma maior actividade destes nos pellets 2 e 3. Tambm para o caso dos lisossomas, os resultados experimentais corresponderam ao previsto porque, apesar de se ter obtido estes organitos em todas as fraces, verificou-se uma maior actividade no pellet 3. A obteno destes resultados foi feita com uma centrifugao diferencial, centrifugao esta que, apesar de ter a vantagem de utilizar uma tcnica simples e rpida, tem como desvantagem a obteno de pellets frequentemente heterogneos, nos quais pode ocorrer a distribuio do mesmo tipo de partculas por diferentes pellets. Neste tipo de tcnicas, necessrio ter tambm em ateno o processo de homogeneizao utilizado. Neste caso especfico foram usados mtodos mecnicos, mtodos estes que geram calor, pelo que necessrio assegurar um arrefecimento de todo o material envolvido no processo. tambm necessrio ter em ateno as dificuldades que existem no manuseamento do material biolgico. Um dos factores importantes assegurar a preservao da integridade das molculas em estudo. Neste caso, usou-se um meio de homogeneizao que continha tampo HEPES (pH7,4) 10 mM para manter as condies de pH fisiolgicas; sacarose 0,25 M de modo a evitar a lise osmtica dos organitos e EDTA 1 mM, por forma a remover os ies metlicos que inactivam as protenas por ligaes dos seus grupos SH e tambm os ies Ca2+ que activam alguns enzimas presentes no homogenato e que poderiam comprometer o estudo da separao e anlise dos componentes celulares do Pgina | 29

Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial fgado de porco. Assim, uma aplicao deficiente destes compostos durante o procedimento poder ter dado lugar a erros nos resultados obtidos.

Anlise da fraco nuclear isolamento do DNA

Apresentao de um fluxograma dos vrios passos envolvidos na preparao do DNA. Sumariamente, o processo de extraco do DNA baseou-se na sua libertao para um meio no qual este era solvel, seguida da dissociao dos complexos entre estes e diversas protenas, nomeadamente as histonas. Por fim, apenas foi necessrio separar o DNA dos outros componentes celulares solveis.
Adicionou-se SDS 10% (v/v) ao sedimento j ressuspendido em soluo tamponada.

Misturou-se por inverso.

Aqueceu-se a mistura, continuando a agitar.

Arrefeceu-se o tubo, mergulhando-o em gua.

Adicionou-se NaClO4 5 M e misturou-se por inverso. Adicionou-se clorofrmio: lcool isoamlico (24:1, v/v). Tapou-se e misturou-se. Centrifugou-se. Transferiu-se a fase aquosa, superior, para um tubo.

Precipitaram-se os cidos ncleicos com etanol absoluto.

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Misturou-se por inverso.

Centrifugou-se e desprezou-se o sobrenadante.

Dissolveu-se o sedimento de DNA em soluo citrato. Determinou-se a concentrao de DNA na preparao atravs de absorvncia a 260 nm. Registou-se a leitura de absorvncia a 280 nm.

Clculo da concentrao de DNA na sua preparao (final) e tambm da percentagem de DNA obtido por g de fgado.

Tal como se encontra no protocolo da actividade experimental, considerando que a 1 U.A260nm corresponde uma concentrao de DNA de 50 g/mL possvel calcular a concentrao de DNA dissolvido: 1 U.A260nm 0,867 U.A260nm [DNA]diludo = g/mL = 50 g/mL [DNA]diludo mg/mL

Conhecendo a concentrao de DNA diludo, possvel calcular a concentrao de DNA presente no homogenato, tendo em conta o factor de diluio (1/10): [ ] [ ] mg/mL

Dado que, no final do processo de isolamento, se dissolveu o DNA em 20 mL de tampo, pode calcular-se a massa de DNA. [ ] [ ]

Assim,

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A massa de DNA no homogenato , portanto, de 8,67 mg, em 30 mL de volume de resuspenso. Sabendo que a massa de fgado usado para a preparao do homogenato foi 15,48 g, logo, recorrendo ao volume inicial de homogenato (211,4 mL), calcula-se a massa de DNA total no fgado: 8,67 mg de DNA 30 mL (volume de resuspenso) 211,4 mL (volume de homogenato)

Clculo da concentrao de DNA no fgado recorrendo massa calculada anteriormente e ao volume de homogenato usado inicialmente: [ [ ] ]

Sabendo que a massa de fgado usado para a preparao do homogenato foi 15,48 g, determina-se a percentagem de DNA presente no fgado: ( )

( )

Quadro 11. Resumo dos resultados obtidos na anlise da fraco nuclear. Factor de diluio 1:10 [DNA] (mg/mL) Massa de DNA (mg) 8,67 Massa de DNA no fgado (mg) 61,09 [DNA] no fgado (g/mL) 0,289 % (m/m) de DNA no fgado 0,39

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Comentrio sobre o grau de pureza do DNA obtido e a sua eventual contaminao com protenas.

O grau de pureza do DNA obtido a partir do fgado pode ser avaliado atravs da leitura da sua absorvncia a 260nm e a 280nm. A partir dos valores obtidos, calcula-se o quociente entre eles e, a partir do resultado pode concluir-se acerca da purificao do DNA: O DNA obtido encontra-se com um grau de pureza relativamente contaminado. Experimentalmente obtiveram-se os seguintes resultados: Abs260 = 0,867 Abs280 = 0,430 elevado e, portanto, pouco

Assim, pode concluir-se que o processo de isolamento do DNA foi eficaz, ainda que, no se tenha obtido uma relao entre as duas absorvncias exactamente igual a 2. Este facto deve-se presena de diversos resduos de aminocidos com cadeias laterais aromticas (tirosina, triptofano, fenilalanina), os quais apresentam absorvncia a 280nm, comprimento de onda usado para a medio da absorvncia do DNA isolado. O valor obtido experimental deveria ser comparado com os valores tericos que correspondem quantidade de DNA no fgado. No entanto, como no foi possvel ter acesso a esses valores, esta comparao no pde ser feita e, como tal, no se pode concluir se se purificou uma elevada quantidade de DNA, quando comparada com aquela que existe no fgado do porco.

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Concluso
A base da realizao de todo o trabalho experimental centrou-se na tcnica de centrifugao diferencial, sendo que, atravs dela, se procedeu ao isolamento de vrias fraces subcelulares de fgado de porco, para no final se efectuar a sua caracterizao bioqumica. Assim, conseguiu-se extrair o DNA da fraco nuclear e estudar a distribuio de dois marcadores enzimticos pelas diferentes fraces isoladas com o objectivo de avaliar o seu grau de pureza. de salientar que, em primeiro lugar, foi usado fgado de porco em vez de fgado de rato para preparar o homogenato. Para o clculo da sua concentrao e de cada uma das fraces isoladas utilizou-se o mtodo de doseamento proteico do biureto com desoxicolato. Concluiu-se, assim, que no possvel estabelecer uma relao directa entre a concentrao proteica das fraces recolhidas com a ordem de centrifugao de cada uma delas, pois o pellet 2 apresenta menor concentrao que o pellet 3 e o pellet 1, enquanto este apresenta menor concentrao que o pellet 3. Relativamente massa de protena presente em cada uma das fraces analisadas, esta maior no sobrenadante 3, o que indica que, para alm das protenas recolhidas, o fgado continha ainda outras, as quais ficaram suspensas no sobrenadante. A fraco mitocondrial foi analisada atravs da determinao da actividade do succinato: citocrmo c oxidoreductase, uma vez que o succinato pode ser classificado com um marcador enzimtico do mitocndrio. Tal como esperado, o pellet 2 foi aquele que continha a fraco mitocondrial, pois verificou-se que se trata da fraco cuja actividade especfica do succinato: citocrmo c oxidoreductase foi maior, tendo-se efectuado uma separao relativamente eficaz. A determinao da actividade do fosfatase cido permitiu analisar a fraco lisossomal, bem como a presena de ribossomas, polissomas e vesculas derivadas do complexo de Golgi e do retculo endoplasmtico. Face aos dados obtidos concluiu-se que estes organitos encontram-se, em maior quantidade no sobrenadante 3. Apesar de ser esperado que isto se verificasse apenas no pellet 3, isto no aconteceu, pois os lisossomas possuem um tamanho heterogneo e, durante a centrifugao diferencial, acabam por cosedimentar com outros organitos, da a sua disperso pelas vrias fraces. Pgina | 34

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Atravs da determinao e anlise da actividade especfica dos diversos marcadores enzimticos estudados foi possvel, finalmente, concluir acerca da composio de todas as fraces recolhidas e da comparao com o resultado previsto. Globalmente, apesar da centrifugao diferencial ter sido bem sucedida, no se conseguiu proceder ao isolamento total das protenas correspondentes a cada uma das fraces. Por fim, extraindo o DNA da fraco nuclear foi possvel garantir que, de facto, a primeira centrifugao permitiu separar o contedo nuclear do homogenato de fgado. Concluiu-se que, apesar de este se encontrar relativamente contaminado com outras protenas, foi possvel quantificar o material gentico presente nesta fraco.

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Bibliografia
Alberts B, Bray D, Lewis J, Raif M, Roberts K, Watson J (1989) Molecular Biology of the Cell, 2nd ed, Garland Pub., New York. Alexander R, Griffiths JM, Wilkinson ML (1985) Basic Biochemical Methods, John Wiley and Sons, New York. Bohinski RC (1983) Modern Concepts in Biochemistry, 4th ed., Allyn & Bacon Inc., Boston. Clark JM Jr, Switzer RL (1977) Experimental Biochemistry, 2nd ed. W. H. Freeman & Co, San Francisco. Quintas, A.,Halpern, M.J., Freire, A.P. Eds., Bioqumica Organizao Molecular da Vida, Lidel, Lisboa, 2008

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Anexos
Doseamento de protenas pelo mtodo do biureto com desoxicolato
Clculo das concentraes das solues padro

Atravs do quadro abaixo (Quadro I), pode-se calcular as concentraes de BSA tericas das solues padro.

Quadro I. Preparao das solues padro para a recta de calibrao. TUBO BSA 5 mg mL-1 (mL) H2O (mL) Reagente do Biureto (mL) 1,0 2,0 0,95 2,0 0,9 2,0 0,8 2,0 0,7 2,0 0,6 2,0 0,5 2,0 0,4 2,0 0,2 2,0 0,0 2,0 0,0 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,8 1,0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Tome-se como exemplo o clculo da concentrao proteica do tubo 1. Tubo 1

Pretende-se ento calcular a concentrao final, valor de absorvncia medido. Atravs da equao

, que a concentrao referente ao , obtm-se:

O clculo para os restantes tubos foi anlogo. Os resultados obtidos para cada tubo encontram-se resumidos no Quadro 3.

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Clculo da concentrao proteica das fraces Para o clculo das concentraes proteicas das fraces foi utilizada a equao da recta de calibrao, visvel na Figura 2:

Tome-se como exemplo o clculo da concentrao proteica para o homogenato e para pellet 3.

Homogenato Concentrao no tubo de ensaio Como se realizaram 3 medies de absorvncia, o valor mais correcto a ser utilizado o valor da mdia entre os 3.

Concentrao suspenso

Concentrao da fraco

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Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial [ ]

Como o

Massa da fraco

A massa proteica da soluo : [ ]

Pellet 3 Concentrao no tubo de ensaio Como se realizaram 3 medies de absorvncia, o valor mais correcto a ser utilizado o valor da mdia entre os 3.

Esta soluo teve que ser diluda 1:2 porque os valores de absorvncia medidos estavam acima da recta de calibrao. Assim, para obter a concentrao no tubo de ensaio necessrio multiplicar a concentrao obtida por 2: [ ]

Concentrao suspenso

[ Concentrao da fraco

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Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial [ ]

Como o

Massa da fraco

A massa proteica da soluo : [ ]

Para as restantes fraces (pellet 1, 2 e sobrenadante 3) efectuaram-se clculos anlogos. No Quadro 4 encontra-se o resumo dos resultados obtidos.

Fraco Mitocondrial: Determinao da actividade do succinato: citocrmo c oxidoreductase

Grficos obtidos - curvas de calibrao

Pellet 1 - fraco nuclear

0,9 0,89 0,88 0,87 0,86 0,85 0,84 0,83 0,82 0,81 0,8 0,79 0,78 0,77 0,76 0,75

Abs550nm

y = 0,0009x + 0,7725 R = 0,6319

0 2 4 6 8 1012141618202224262830323436384042444648505254565860 Tempo (s) Figura I. Representao grfica da variao de absorvncia com o tempo, durante 1 minuto (60 segundos), do Pellet 1 fraco nuclear. Pgina | 40

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Pellet 2 - fraco mitocondrial "pesada"

0,68 0,67 0,66 0,65 Abs550nm y = 0,0012x + 0,5833 R = 0,9996

0,64
0,63 0,62

0,61
0,6 0,59 0,58 0 2 4 6 8 1012141618202224262830323436384042444648505254565860 Tempo (s) Figura II. Representao grfica da variao de absorvncia com o tempo, durante 1 minuto (60 segundos), do Pellet 2 fraco mitocondrial pesada.

Pellet 3 - fraco mitocondrial "leve"

1,05 1,04 1,03 1,02 1,01 1 0,99 0,98 0,97 0,96 0,95 0,94 0,93 0,92 0,91 0,9

y = 0,0015x + 0,9086 R = 0,9993

Abs550nm

0 2 4 6 8 1012141618202224262830323436384042444648505254565860 Tempo (s) Figura III. Representao grfica da variao de absorvncia com o tempo, durante 1 minuto (60 segundos), do Pellet 3 fraco mitocondrial leve.

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Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial

Sobrenadante 3
0,37 0,369 0,368 0,367 0,366 0,365 0,364 0,363 0,362 0,361 0,36 0,359 0,358 0,357 0,356 0,355 0,354 0,353 0,352 0,351 0,35 y = 0,0002x + 0,3574 R = 0,9957

Abs550nm

0 2 4 6 8 1012141618202224262830323436384042444648505254565860 Tempo (s)

Figura IV. Representao grfica da variao de absorvncia com o tempo, durante 1 minuto (60 segundos), do sobrenadante 3.

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