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Alexandra Salvado 40267, Ana Lamy 40279, Andreia Sousa 40261 e Telmo Paiva 40243
Professor: Rodrigo Almeida
Objectivos
Introduo espectroscopia vibracional no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR):
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FTIR (I)
um tipo de espectroscopia de absoro a qual usa a regio do infravermelho do espectro electromagntico da radiao emitida
pelas substncias;
Baseia-se no facto das ligaes qumicas dos compostos possurem frequncias de vibrao especficas, as quais correspondem a nveis de energia da molcula (nveis vibracionais). As frequncias de vibrao dependem: da geometria molecular;
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FTIR (II)
As ligaes podem vibrar de seis modos:
Estiramento Simtrico
Estiramento Assimtrico
Tesoura
Toro
Balano
Rotao
Se a molcula receber radiao eletromagntica com a mesma energia de uma dessas vibraes, ento a luz ser absorvida.
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Procedimento (FTIR)
Pastilha com KBr Branco
Pastilha com
mioglobina em KBr
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KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures
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Banda Amida II 1542,78 cm-1 84,9% T Banda Amida A 3301,55 cm-1 87,46% T 3311,19 cm-1 87,53% T CO2 (interferente) Banda Amida I 1656,56 cm-1 82,12% T
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Estrutura secundria
predominante: hlice
KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures
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KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures
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Banda Amida B
3085,56 cm-1 39,12% T Banda Amida I 1643,06 cm-1 21,89% T
Banda Amida A
3288,05 cm-1 26,03% T
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Estrutura secundria
predominante: folha
KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures
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KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures
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Espectroscopia de Fluorescncia
Espectroscopia de Fluorescncia: tipo de espectroscopia electromagntica que analisa a fluorescncia de uma amostra. Ocorre devido presena de molculas aromticas. Molculas no estado excitado Emisso de foto Molculas no estado fundamental
Aparelhos: Espectrofluormetros
Indole Trp Principal fluorforo das protenas: indole dos resduos de Trp
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Procedimento (Fluorescncia)
Triptofano em tampo
= 350 nm
Triptofano em etanol
= 295 nm
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Triptofano - Emisso
Espectro de Emisso do Triptofano em Tampo e em Etanol
Intensidade de Fluorescncia 50 000 000 40 000 000 30 000 000 20 000 000 10 000 000 Trp. Em Tampo Trp. Em Etanol
0
310 330 350 370 390 Comprimento de onda (nm) 410 430 450
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Triptofano - Excitao
Intensidade de Fluorescncia
Pico de Raman
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Procedimento (Fluorescncia)
Mioglobina comercial (nativa)
= 330 nm
Mioglobina em hidrocloreto de
guanidina (desnaturada)
= 295 nm
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Mioglobina - Emisso
Espectro de Emisso da Mioglobina (nativa e desnaturada)
Intensidade de Fluorescncia
50000000
40000000 30000000
20000000
10000000 0 -10000000
310
330
350
370
390
410
430
450
0,6
0,4 0,2 0 -0,2 310 330 350 370 390 Comprimento de Onda (nm) 410 430 450
Mio Desnaturada
Mio
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Mioglobina - Excitao
Espectro de Excitao da Mioglobina (nativa e desnaturada)
Intensidade de Fluorescncia 30 000 000 25 000 000 20 000 000 15 000 000 10 000 000 5 000 000 0 -5 000 000 250 260 270 280 290 Comprimento de Onda (nm) 300 310 320 Mio Desnaturada Mio
0,6
0,4 0,2 0 250 260 270 280 290 300 310 Mio Desnaturada Mio
-0,2
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0,6
0,4 0,2 0 250 260 270 280 290 300 310 Mio Desnaturada Mio
-0,2
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Medio do pH
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Trp
His
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Trp
His
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His
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Espectro de emisso da Mb de corao de cavalo a pH 7,2 (curva de baixo) e a pH 4,5 (curva de cima).
Gryczynski Z, Lubkowski J and Bucci E. J. Biol. Chem. 1995; 270:19232-19237
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Concluso
Espectroscopia de Fluorescncia vs FTIR
espectros de excitao e de emisso das amostras
Fluorescncia
intensidade de fluorescncia da amostra
FTIR
estrutura secundria da protena
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Referncias
Atkins PW, de Paula J. Physical Chemistry for the Life Sciences. 2006.
Freeman/Oxford;
Jilie KONG et al. Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures. Institute of Biochemistry and Cell Biology, SIBS, CAS. China, 2007; Gryczynski Z, Lubkowski J and Bucci E. J. Biol. Chem. 1995; 270:1923219237; Warren Gallagher. FTIR Analysis of Protein Structure;
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