Bioqumica Experimental II, PL2, 2011/2012, Professor: Carlos Farinha

Grupo 1: Alexandra Salvado 40267, Ana Lamy 40279, Andreia Sousa 40261 e Telmo Paiva 40243

Objectivos
Testar a libertao de dioxignio pelos cloroplastos isolados usando

oxidantes de Hill;
Medir o transporte electrnico fotossinttico utilizando a autoxidao de um aceitador terminal de electres (violognio de metilo); Ensaio espectrofotomtrico da reaco de Hill;

Determinao do contedo de clorofila dos cloroplastos.

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Resumo
Isolamento dos cloroplastos

Ensaios usando oxidantes de Hill e violognio de metilo no elctrodo de oxignio

Ensaio espectrofotomtrico da reaco de Hill

Determinao do contedo de clorofila dos cloroplastos
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DQB-Licenciatura em Bioqumica

Determinao do Contedo de Clorofila dos Cloroplastos

Abs652 nm= 0,760 soluo de acetona = 34,5 mg-1 mL cm-1 Abs = l c
0,760 = 34,5 1 c c = 0,022 mg mL-1
Em 25 mL de acetona

Em 0,2 mL de suspenso:

ci Vi = cf Vf ci 0,2 = 0,022 25 ci = 2,75 mg mL-1

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DQB-Licenciatura em Bioqumica

Massa de Clorofila por Ensaio

No ensaio, so colocados:

1 mL de meio de reao 0,1 ou 0,050 mL de suspenso de cloroplastos 0,850 mL de gua mL-1 Concentrao de clorofila na suspenso

cclorofila = 2,75 mg

c clorofila =

mclorofila Vsuspenso

Logo, em 0,1 mL de suspenso:

2,75 =

mclorofila mclorofila = 0,275 mg 0,1

E em 0,050 mL de suspenso:

mclorofila 2,75 = mclorofila = 0,138 mg 0,050

5

Quantidade de oxignio por quadrcula

Adio de Ditionito de Sdio

[O2] (25C) = 0,253 mol/mL Logo, em 2 mL, a quantidade de oxignio :

50 quadrculas

n(O 2 ) n(O 2 ) [O 2] = 0,253 = Vtotal 2 n(O 2 ) = 0,506 mol

Dos 0 aos 100% de oxignio encontramse 50 quadriculas: 50 quadrculas 1 quadrcula 0,506 mol

x 1,012 mol de O2/ quadrcula

Figura 1. Registo obtido pelo elctrodo de oxignio

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Reagentes de Hill
DCPIP Reagentes de Hill Aceitadores artificiais de electres Ferricianeto

Figura 2. Estrutura molecular do DCPIP

Reao de Hill:

H2O + A H2A + 1 O2 2
Figura 3. Estrutura molecular do ferricianeto

2e -

Oxidantes de Hill
DCPIP
Sem Luz

10 L DCPIP

20 L DCPIP

40 L DCPIP

40 L DCPIP

Figura 4. Registo obtido pelo elctrodo de oxignio para o DCPIP.

40 L DCPIP + 50 L DCMU

40 L DCPIP

Oxidantes de Hill
Ensaios com DCPIP
Adio de 40L de DCPIP 1 quadrcula 1012 nmol de O2 y 11 quadrculas
y 1113 nmol de O2

11 quad. 7 mm
Figura 5. Medio do declive do DCPIP.

10 mm 1 minuto x 7 mm x = 0,7 minutos

n O 2) ( v( fotossnte se ) = t m clorofila ) (

1113 v ( fotossnte se) 0,7 0,275 5782 nmol min -1mg -1

DCPIP resultados obtidos

Quadro 1. Registo dos resultados para o DCPIP

Ensaios

V(adicionado) n(O2) /mol /L 10 20 303,6 657,8 1113 1063

Tempo /min 0,5 0,5 0,7 0,5

v(fotossntese) / nmol min-1mg-1 2208 4784 5783 7728

DCPIP

40 50 DCMU + 40 DCPIP

A velocidade de fotossntese aumenta com o volume adicionado de DCPIP Ao adicionar DCMU no devia ocorrer formao de O2

10

Oxidantes de Hill
Ferricianeto

10 L Ferricianeto

20 L Ferricianeto

40 L Ferricianeto

20 L Ferricianeto

40 L Ferricianeto + 50 L DCMU

Figura 6. Registo obtido pelo elctrodo de oxignio para o ferricianeto.

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Oxidantes de Hill
Ensaios com Ferricianeto
Adio de 40L de Ferricianeto

1 quadrcula
13 quadrculas

1012 nmol de O2

13 quad.

y 1316 nmol de O2
10 mm
16 mm

16 mm
Figura 7. Medio do declive do ferricianeto.

1 minuto

x = 16 minutos ,
v( fotossnte se ) = n O 2) ( t m clorofila ) (

1316 v ( fotossnte se) 1,6 0,275 2990 nmol min -1mg -1

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Ferricianeto resultados obtidos

Quadro 2. Registo dos resultados para o ferricianeto

Ensaios

V(adicionado) /L 20

n(O2) /nmol 404,8

Tempo /min 0,6

v(fotossntese) / nmol min-1mg-1 2450

Ferricianeto

40 50 DCMU + 40 ferricianeto

1316
506,0

1,6
0,2

2990
9200

A velocidade de fotossntese aumenta com o volume adicionado de ferricianeto; Ao adicionar DCMU no devia ocorrer formao de O2
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Comparao entre Ferricianeto e DCPIP

Quadro 3. Comparao dos resultados entre o ferricianeto e o DCPIP

Ensaios

V(adicionado) /L 10

n(O2) /nmol 303,6

Tempo /min 0,5

v(fotossntese) / nmol min-1mg-1 2208

DCPIP 10 mM

20
40

657,8
1113 1063 404,8 1316 506,0

0,5
0,7 0,5 0,6 1,6 0,2

4784
5783 7728 2450 2990 9200

Ferricianet o 10 mM

50 DCMU + 40 DCPIP 20
40 50 DCMU + 40 ferricianeto

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Ensaio espectrofotomtrico
Quadro 4. Valores de absorvncia registados

Reaco de Hill

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Ensaio espectrofotomtrico

Declive

Figura 8. Grfico correspondente ao ensaio 1, da absorvncia de DCPIP em funo do tempo. 16

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Ensaio espectrofotomtrico

Declive

Figura 9. Grfico correspondente ao ensaio 2, da absorvncia de DCPIP em funo do tempo. 17

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Ensaio espectrofotomtrico

Declive

Mdia das absorvncias:

0,0186 + 0,0228 + 0,0364 3

0,0259

Figura 10. Grfico correspondente ao ensaio 3, da absorvncia de DCPIP em funo do tempo. 18

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Ensaio espectrofotomtrico
Clculo da variao da concentrao em funo do tempo: 1 = =
1 []

=
[]

Lei de Lambert-Beer

= 0,0259 160001

1,62 106 M s-1

Volume total dos reagentes que se adicionou na cuvette: V = 1,5 + 0,020 + 1,4 + 0,050 = 2,97 mL

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Ensaio espectrofotomtrico
Nmero de moles de DCPIP reduzido por segundo: 1 = = =

= 1,62 106 2,97 103

4,81 nmol s-1 n=4,8110-9112n2,4010-9 mol 2,4010-9 mol s-1

Pela estequiometria da reaco de Hill: DCPIP 1 mol 4,81 10-9 mol O2

2 2,40 109 mol = 2,40 109 mol s-1

4,81109 1

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Ensaio espectrofotomtrico
Clculo da massa de clorofila: V = 20 L = 2,0 10-2 mL [Clorofila] = 2,75 mg mL-1 = =

= 2,75 2,0 102 0,055 mg

Velocidade fotossinttica:
1,44107 0,055

2,62 mol min-1 mg-1

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Comparao entre valores

Quadro 6. Volumes de DCPIP e respectivas velocidades elctrodo de oxignio

VDCPIP/ L 10 20 40

v / ol min-1 mg-1 2,21 4,78 5,78

-1 -1 Elctrodo de oxignio: v = > 5,78 mol min mg

Mesma ordem de grandeza

Espectrofotometria: v = 2,62 mol min-1 mg-1

Valores em concordncia

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Violognio de metilo (VM2+)

Aceitador terminal de electres; Aceita electres do PS I, ficando reduzido e obtm-se formao de O2 com a estequiometria normal da reaco de Hill.

+ + + + + +
No entanto, o O2 consumido por outras duas reaces: Autoxidao do violognio de metilo: + + + + . Dismutao do radical superxido: . + + +
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DQB-Licenciatura em Bioqumica

Violognio de metilo (VM2+)

Atravs da soma das 3 reaces anteriores obtm-se a estequiometria de consumo de O2

Foi o que se registou no elctrodo de oxignio +

VM

0,5 mol de O2 so consumidos por par de electres transferidos

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DQB-Licenciatura em Bioqumica

Violognio de metilo (VM2+)

Clculo das velocidades fotossintticas
Foram feitos ensaios com diferentes quantidades de violognio

de metilo at se registar uma estabilizao no consumo de O2

De seguida, adicionou-se azeto de sdio

Inibe o catalase, evitando a sntese de O2 atravs da degradao do H2O2

Azeto de sdio

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DQB-Licenciatura em Bioqumica

Violognio de metilo (VM2+)

1 Ensaio
[O2] / mol 100 = 0,1 25 L VM 7 quadrculas

= 2,75
= 2,75 0,1 = 0,275

10 mm

50 L NaN3

Vpapel / min
Figura 11. Ensaio 1 do Violognio de Metilo.

7 = 7 1,012 108 = 70,84 2

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DQB-Licenciatura em Bioqumica

Violognio de metilo (VM2+)

10 1 10
= 1 Num minuto consome-se 70,84 nmol de O2 70,84 = 258 2 1 1 0,275

3 = 293 2 1 1

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DQB-Licenciatura em Bioqumica

Violognio de metilo (VM2+)

Quadro 7. Valores de velocidade fotossinttica para o violognio de metilo e do azeto de sdio

Ensaio
25 L VM + 50 L NaN3 50 L VM + 50 L NaN3

Vfotossinttica VM / nmol O2 min-1 mg-1 258 373

Vfotossinttica NaN3 / mol O2 min-1 mg-1 293 274

100 L VM + 50 L NaN3

291

323

Aumento do volume de violognio de metilo (aceitador de electres)

Aumento do consumo de oxignio

Maior velocidade fotossinttica

Era o esperado
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DQB-Licenciatura em Bioqumica

Violognio de metilo (VM2+)

Azeto de sdio Inibe o catalase Impede a formao de oxignio

S h consumo de oxignio Pela degradao do H2O2

Aumento do consumo de oxignio com a presena de azeto

Observou-se para os ensaios 1e3

No se observou para o ensaio 2

29

Mais VM Menos NaN3

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Actividade do PS I

VM [O2] / mol Asc - DCPIP DCMU

Vpapel / min
Figura 12. Ensaio da actividade do PS I.

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Actividade do PS I
59,5 + = = 430 2 1 1 0,1375
157 = 1140 2 1 1 0,1375

Antes DCMU

Quantidade de O2 consumida inferior

Depois DCMU Equilbrio entre sntese e consumo de O2

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Sem DCMU

No inibio do PS II

Sntese O2

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Actividade do PS I

Quando se inibiu o PSII (com DMCU) apenas se regista o consumo de O2 e, assim, o declive mais acentuado

Sntese de O2

Figura 12. Transporte electrnico e gerao de NADPH e ATP nos cloroplastos.

PQ: plastoquinona; PC: plastociana; fd: ferredoxina; DCMU: 3-(3,4-diclorofenilo)-1,1-dimetilureia.

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Concluso
A velocidade fotossinttica aumenta com o aumento da concentrao do reagente de Hill;

Era de esperar que com o aumento do volume de VM houvesse uma maior velocidade fotossinttica, devido ao aumento do consumo de oxignio, no entanto isso no se verificou;
Com o azeto de sdio esperado que aumentasse o consumo de oxignio, no entanto este facto s se observou para os ensaios 1 e 3; A velocidade de consumo mais acentuada quando apenas se fornece o substrato ao PS I;

O mtodo do elctrodo de oxignio mais rigoroso que o mtodo espectrofotomtrico.

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Referncias
Lodish, et al. (2008). Molecular Cell Biology, Sixth Edition. New York: W. H. Freeman and Company. Nelson, D., Cox, M. (2008). Lehninger, Principles of Biochemistry, Fifth Edition. New York: W. H. Freeman and Company. Allen, J., & Holmes, N. (1999). Electron transport and redox titration, in Photosynthesis energy transduction: a practical approach. Oxford: IRL Press.

Plummer, D. (1987). An Introduction to Practical Biochemistry . London: McGraw-Hill.

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