GUA FONTE DA VIDA

1.

INTRODUO

A gua encontra-se disponvel na natureza sob vrias formas e uma das substncias mais comuns, cobrindo cerca de 70% da superfcie do planeta. encontrada principalmente no estado lquido, constituindo um recurso natural renovvel por meio de ciclo. Cerca de 97,4% da gua do planeta est presente nos oceanos e mares, 2% est armazenada nas geleiras e apenas 1% est disponvel para o uso, armazenada nos lenis subterrneos, lagos, rios e na atmosfera. A gua essencial vida, o que significa que todos os organismos vivos, incluindo o homem, dependem dela para sobrevivncia. Mas fundamental que os recursos hdricos apresentem condies fsicas e qumicas adequadas para utilizao pelos organismos. Disponibilidade de gua significa que ela esteja presente, no somente em quantidade adequada em uma dada regio, mas tambm que sua qualidade seja satisfatria para suprir as necessidades de um determinado conjunto de seres vivos. Atravs dos sculos, a complexidade dos usos mltiplos da gua pelo homem aumentou e produziu enorme conjunto de degradao e poluio. Por outro lado, os usos excessivos e as retiradas permanentes para diversas finalidades tm diminudo muito a disponibilidade de gua e produzindo inmeros problemas de escassez.

O desenvolvimento industrial, o crescimento demogrfico e a ocupao do solo de forma intensa e acelerada vm provocando o comprometimento dos recursos hdricos disponveis para consumo humano, recreao e outras atividades, aumentando consideravelmente o risco de doenas de transmisso hdrica. Um dos grandes problemas ambientais da atualidade a qualidade da gua, que tem sido intensamente deteriorada em pases desenvolvidos e em desenvolvimento, apresentando, desta forma, um risco potencial de

comprometimento sade e ao bem-estar do homem. Certamente, o melhor mtodo de assegurar gua adequada para consumo consiste no desenvolvimento de polticas de proteo, evitando as contaminaes que podem ocorrer e a exposio das pessoas a riscos de doenas. A qualidade de vida dos seres humanos est diretamente ligada gua, pois ela utilizada para o funcionamento adequado de seu organismo, preparo de alimentos, higiene de pessoas e utenslios. A gua usada para abastecimento domstico deve apresentar caractersticas sanitrias e toxicolgicas adequadas, deve estar isenta de organismos patognicos e de substncias txicas, para prevenir danos sade e favorecer o bem estar das pessoas. As doenas transmitidas pela gua so responsveis por mais da metade das internaes hospitalares no Brasil e por quase a metade das mortes de crianas at um ano de idade.

2. OBJETIVO

O ensaio Presuntivo e Confirmativo realizado tem por objetivo analisar, detectar e quantificar a presena/ausncia do grupo Coliforme, sejam eles Totais ou Termotolerantes (Fecais) em uma determinada amostra, utilizando-se da Tcnica dos Tubos Mltiplos e quantificao pelo NMP Nmero Mais Provvel. As guas de abastecimento apresentam o risco de serem poludas por guas residurias e excretas de origem humana ou animal, podendo, desta forma, conter organismos patognicos, tornando-se assim um veculo de transmisso de doenas.
2

Por isso, impe-se a necessidade de exames rotineiros das mesmas, para determinar seu grau de segurana do ponto de vista bacteriolgico. Embora j existam mtodos desenvolvidos para deteco de vrios organismos patognicos de veiculao hdrica, os mesmos no so aplicados na rotina devido ao alto custo e necessidade de pessoal especializado. Alm disso, uma vez que o lanamento de organismos patognicos nos esgotos intermitente e est na dependncia das condies de sade da populao, possvel que, em determinadas ocasies, no se detectem esses organismos na gua, porm sua ausncia no indica que a mesma seja segura. Para a avaliao das condies sanitrias de uma gua, utilizam-se bactrias do grupo coliforme, que atuam como indicadores de poluio fecal, pois esto sempre presentes no trato intestinal humano e de outros animais de sangue quente, sendo eliminadas em grandes nmeros pelas fezes. A presena de coliformes na gua indica poluio, com o risco potencial da presena de organismos patognicos, e sua ausncia evidncia de uma gua bacteriologicamente potvel, uma vez que so mais resistentes na gua que as bactrias patognicas de origem intestinal. Como o grupo dos coliformes totais inclu gneros que no so de origem exclusivamente fecal, isto limita sua aplicao como indicador especfico de contaminao fecal. O reconhecimento deste fato levou ao desenvolvimento de mtodos de enumerao de um subgrupo de coliformes denominados coliformes fecais (coliformes termotolerantes), os quais so diferenciados dos coliformes totais pela sua capacidade de fermentar a lactose em temperatura elevada (44,50C). Embora a utilizao dos coliformes fecais, em substituio aos totais, tenha determinado uma melhoria significativa na deteco da contaminao fecal, logo se tornou evidente a existncia de outros coliformes

termotolerantes alm de E.coli (principalmente Klebsiella), os quais, por no serem de origem exclusivamente fecal, comprometiam a especificidade deste subgrupo para a finalidade proposta. Em decorrncia disto, as tendncias atuais se direcionam para a deteco especfica de E. Coli, que o nico componente do grupo coliforme de origem exclusivamente fecal.

Como o grupo dos coliformes totais inclui gneros que no so de origem exclusivamente fecal, isto limita sua aplicao como indicador especfico de contaminao fecal. O reconhecimento deste fato levou ao desenvolvimento de mtodos de enumerao de um subgrupo de coliformes denominados coliformes fecais (coliformes termotolerantes), os quais so diferenciados dos coliformes totais pela sua capacidade de fermentar a lactose em temperatura elevada (44,5C). A determinao do Nmero Mais Provvel (NMP) de coliformes em uma amostra efetuada a partir de aplicao da tcnica de tubos mltiplos. Esta tcnica baseada no princpio de que as bactrias presentes em uma amostra podem ser separadas por agitao, resultando em uma suspenso de clulas bacterianas, uniformemente distribudas na amostra. Consiste na inoculao de volumes decrescentes da amostra em meio de cultura adequado ao crescimento dos microrganismos pesquisados, sendo cada volume inoculado em uma srie de tubos. Atravs de sucessivas diluies da amostra, so obtidos inculos, cuja semeadura fornece resultados negativos em pelo menos um tubo da sria em que os mesmos foram inoculados e a combinao de resultados positivos e negativos permite a obteno de uma estimativa da densidade das bactrias pesquisadas, atravs da aplicao de clculos de probabilidade. Para anlises de guas, tem sido utilizado preferencialmente a fator 10 de diluio, sendo inoculados mltiplos e submltiplos de 1 mL da amostra, usando sries de 5 tubos para cada volume a ser inoculado.

3. DEFINIES

3.1 ORGANISMOS PATOGNICOS Organismos patognicos so aqueles que transmitem doenas pela ingesto ou contato com gua contaminada, como: bactrias, vrus, parasitas e protozorios.

3.2 COLIFORMES TOTAIS Grupo de bactrias constitudo por bacilos Gram-negativos, aerbios ou anaerbios facultativos, no formadores de esporos, oxidase-negativos.
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capazes de crescer na presena de sais biliares ou outros com postos ativos de superfcie (surfactantes), com propriedades similares de inibio de crescimento, e que fermentam a lactose com produo de cido e gs a 350C em 24-48 horas. No caso da tcnica de tubos mltiplos, so considerados coliformes os organismos que fermentam a lactose com produo de gs a 35 0C. O grupo inclui os seguintes gneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella.

3.3 COLIFORMES FECAIS (TERMOTOLERANTES) So os coliformes capazes de se desenvolver e fermentar a lactose com produo de cido e gs a temperatura de 44,5 +- O,20C em 24 horas.

O principal componente deste grupo Escherichia coli, sendo que alguns coliformes do gnero Klebsiella apresentam tambm essa capacidade.

3.4 ESCHERICHIA COLI

Bactria do grupo coliforme que fermenta a lactose e manitol, comp r o d u o d e c i d o e g s a 4 4 , 5 0 , 2 C e m 2 4 h o r a s p r o d u z i n d o l a p a r t i r d o t r i p t o f a n o oxidase negativa, no hidrolisa a ureia e apresenta atividade das enzimas -galactosidase e -glucoronidase, sendo considerado o mais especfico indicador de contaminao fecal recente e de eventual presena de organismos patognicos;

3.5 CALDO LACTOSADO(COM PRPURA DE BROMOCRESOL-C.L.) (CONCENTRAO SIMPLES) Meio de enriquecimento, no qual as concentraes de lactose e peptona fornecem condies timas para o crescimento de bactrias do grupo coliforme.
5

FRMULA:
INGREDIENTES EXTRADO DE CARNE PEPTONA LACTOSE GUA DESTILADA pH FINAL 6,9 +- 0,2 a 25oC QTDE 3,0 5,0 5,0 1000 g. g. g. mL

PREPARO: Pesar 13,0 g do meio desidratado (Caldo Lactosado e 0,01 g de prpura de bromocresol e acrescentar 1 000 mL de gua destilada fria, aquecer, agitando frequentemente, at a completa dissoluo do meio, tomando cuidado para que no seja atingida a temperatura de ebulio. Em tubos de ensaio de 16 mm x 150 mm, contendo em seu interior tubos de Durharn invertidos. distribuir volumes adequados para que o volume final, aps esterilizao, seja de 10 mL. Tamponar e esterilizar em autoclave a 121oC, durante 15 minutos.

ARMAZENAMENTO: O meio preparado poder ser estocado temperatura ambiente, em local limpo e livre de poeira, durante, no mximo, urna semana.

3.6 CALDO LACTOSADO COM VERDE BRILHANTE E BILE A 2% (CLVBB) Meio seletivo, em que ocorre inibio de bactrias Gram-positivas e de bactrias esporuladas fermentadoras da lactose, permitindo um bom desenvolvimento de bactrias do grupo coliforme. FRMULA:
INGREDIENTES PEPTONA LACTOSE BILE DE BOI DESITRADA VERDE BRILHANTE GUA DESTILADA pH FINAL 7,2 +- 0,2 a 25C 6 QTDE 10,0 10,0 20,0 0,0133 1000 g. g. g. g. mL

PREPARO: Pesar 40,0 g do meio desidratado Caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2% e acrescentar 1000 mL de gua destilada fria, aquecer, agitando frequentemente, at a completa dissoluo do meio, to mando cuidado para que no seja atingida a temperatura de ebulio. Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio de 16 mm x 150 mm, contendo em seu interior tubos de Durharn invertidos. Tamponar e esterilizar em autoclave a 121C, durante 15 minutos.

ARMAZENAMENTO: O meio preparado poder ser estocado temperatura ambiente, em local limpo e livre de poeira, durante, no mximo, uma semana.

3.7 MEIO EC Meio seletivo para deteco de coliformes fecais, em que os sais biliares inibem o crescimento de formas esporuladas e de Gram-positivas e cuja incubao a 44,5 O,20C permite a seleo dos coliformes de origem fecal (coliformes termotolerantes).

FRMULA:

INGREDIENTES TRIPTOSE OU TRIPTICASE LACTOSE MISTURA SAIS BILIARES FOSFATO DIPOTSSICO ((K2HP04) p.a FOSFATO MONOPOTSSICO CLORETO DE SODIO GUA DESTILADA pH FINAL 6,9 +- 0,2 a 25oC

QTDE 20,0 5,0 1,5 4,0 1,5 5,0 1000 g. g. g. g. g. g. mL

PREPARO: Pesar 37,0 g do meio EC desidratado e acrescentar 1 000 mL de gua destilada fria, aquecer, agitando frequentemente, at a completa dissoluo do meio, tomando cuidado para que no seja atingida a temperatura de ebulio. Distribuir volumes de 5 rnL. em tubos de ensaio de12 mm x 120 mm, contendo em seu interior tubos de Durham invertidos. Tamponar e esterilizar em autoclave a 121oC. durante 15 minutos

ARMAZENAMENTO: O meio preparado poder ser estocado temperatura ambiente, em local cal limpo e livre de poeira, durante, no mximo, uma semana.

3.9 NMERO MAIS PROVVEL (NMP) a estimativa da densidade de bactrias em uma amostra, calculada a partir da combinao de resultados positivos e negativos, obtidos atravs da aplicao da tcnica de tubos mltiplos.

4. EQUIPAMENTOS & VIDRARIAS

4.1 BALANA Com sensibilidade de, no mnimo, 0,1 g ao serem pesados 150 g.

4.2 BANHO-MARIA Equipado com termostato e agitador de baixa velocidade para promover a circulao da gua e manter a temperatura uniforme (44,5 +0,20C) em todos os pontos. O nvel de gua no banho-maria deve ser mantido acima do nvel do meio de cultura nos tubos de ensaio imersos para incubao, sendo recomendada a troca semanal dessa gua para evitar a proliferao de fungos e outros microrganismos.
8

4.3 DESTILADOR DE GUA OU APARELHO PARA DESIONIZAO Devem produzir gua no txica, livre de substncias que impeam ou interfiram na multiplicao bacteriana, cuja condutividade deve ser inferior a 2 S/cm a 250C e o pH estar na faixa de 5,5 a 7,5.

Nota: A densidade de bactrias heterotrficas na gua recm destilada deve ser inferior a 1 000 unidades formadoras de colnias por mL UFC/mL) e a 10000 UFC/mL na gua destilada armazenada, devendo esse controle ser efetuado com frequncia mnima mensal.

4.4 EQUIPAMENTOS PARA ESTERILIZAO 4.4.1 AUTOCLAVE normalmente operada a uma presso de 103.393 Pa (1,05 kgf/cm 2 ou 15 lb/pol2 ), produzindo, em seu interior, uma temperatura de 121,60C ao nvel do mar. Em seu funcionamento, deve-se observar a substituio por vapor de todo o ar existente na cmara e a operao total desse equipamento deve durar no mximo uma hora, sendo recomendvel que a temperatura de esterilizao seja atingida em at 30 minutos.

4.4.2 ESTUFA DE ESTERILIZAO Deve manter a temperatura de (170 +- 100C) durante o perodo de esterilizao (mnimo de 2 horas).

4.4.3 INCUBADORA BACTERIOLGICA TERMOSTATIZADA Deve manter a temperatura na faixa de 35 +- 0,50C e a umidade relativa entre 75 e 85% e ser colocada,em um local onde a temperatura permanea na faixa de 16 a 270C.

4.4.4 MEDIDOR DE PH Deve fornecer exatido mnima de 0,1 unidade de pH e sua calibrao deve ser feita pelo menos duas vezes ao dia, com. no mnimo, duas soluestampo padres (pH = 4,0, pH = 6,86 ou pH = 9,18).

4.5 VIDRARIAS 4.5.1 BALES De borossilicato ou vidro neutro, com capacidade adequada para o preparo de meios de cultura.
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4.5.2 FRASCOS PARA GUA DE DILUIO De vidro neutro, borossilicato, ou plstico autoclavvel, com tampas que permitam boa vedao e sejam livres de substncias txicas solveis; devem ter volume suficiente para conter 90 +- 2 mL de gua de diluio, deixando um espao suficiente para permitir uma boa homogeneizao quando se fizer a agitao.

4.5.3 FRASCO PARA COLETA DE AMOSTRA De vidro neutro ou plstico autoclavvel atxico, com capacidade mnima de 125 mL, boca larga e tampa a prova de vazamento.

4.5.4 PIPETAS Devem ser de borossilicato, tipo Mohr, para 5 mL e 10 mL. com graduao de 1/10 e erro de calibrao inferior a 2,5%, e com bocal para tampo de algodo.

4.5 TUBOS DE DURHAM

De borossilicato ou vidro neutro, com dimetro no inferior a 40% do dimetro de tubo de ensaio em cujo interior sero utilizados.

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Nota: Usualmente so empregados tubos de Durham de 7 mm x 4,5 mm e de 5 mm x 4 mm.

4.5.6 TUBOS DE ENSAIO De borossilicato ou vidro neutro, com capacidade adequada para conter o meio de cultura e o inculo da amostra.

Nota: Usualmente so empregados tubos de ensaio de 18 mm x 180 mm, 16 mm x 150 mm e de 12 mm x 120 mm.

4.6 OUTROS MATERIAIS 4.6.1 ALAS DE INOCULAO Fio de nquel-cromo, platina-irdio ou platina, com 0,5 mm de dimetro e 7-8 em de comprimento, com um aro de 3 mm de dimetro em uma das extremidades, sendo a outra fixada a um cabo metlico (cabo de Kolle).

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4.6.2 BICO DE BUNSEN Devem ter funcionamento adequado, de modo a produzir combusto completa.

4.6.3 CAIXAS OU CESTAS DE AO INOXIDVEL Para esterilizao de materiais.

4.6.4 ESTANTES De tamanho adequado para colocao dos tubos de ensaio empregados na anlise.

4.6.5 ESTOJO PARA PIPETAS Usar, para acondicionamento e esterilizao das pipetas, estojos de alumnio ou ao inoxidvel de tamanho adequado. Opcionalmente, as pipetas podem ser embrulhadas individualmente em papel Kraft para esterilizao.

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5.

PROCEDIMENTO TCNICA DE TUBOS MLTIPLOS

Procedeu-se da seguinte maneira para a realizao do Ensaio:

a)

Identificou-se a amostra a ser analisada e fora definido os volumes da mesma a serem inoculados, em funo da procedncia.

b)

Procedeu-se identificao dos tubos, sendo anotado nestes, o nmero da amostra, o volume de 10 mL a ser inoculado e a data = 04/09/2012.

c) d)

Fora homogeneizado a amostra +- 25 vezes, de forma suave. Fora diluda a amostra at 10-2 de acordo com a metodologia para realizao da diluio em srie, sendo identificado os frascos de diluio com as respectivas diluies.

e)

Fora homogeneizado o frasco com a amostra bruta e com uma nova pipeta fora transferido 1,0 mL em cada um dos tubos de caldo lactosado (srie de 5 tubos).
14

f)

Fora repetido a operao para as diluies 10-1, 10-2, completando portanto o total de 15 tubos, sendo 5 para cada diluio (10, 10-1 e 10-2).

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g)

Aps a inoculao de todos os volumes da amostra, os tubos foram incubados a 35 0,5C, durante 24 horas.

h)

Decorrido este perodo de incubao, realizou-se a 1a leitura, considerando como resultado positivo acidificao do meio, com ou sem produo de gs. Fora registrado os resultados, sendo anotado o nmero de tubos com resultado positivo para cada volume inoculado.

i)

As culturas com resultado presuntivo foram submetidas aos testes confirmativos, para a determinao de coliformes totais e para a diferenciao de coliformes fecais, com auxlio de uma ala de inoculao devidamente flambada, fora retirado um inculo da cultura positiva em caldo CL e fora transferido esse inculo para um tubo contendo caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2% a 35 0,5C, durante 24-48 h e para o meio E.C. a 44,5 0,2C, em banho-maria com agitao, durante 24 h.

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17

j)

Aps o perodo de 24 horas de incubao, realizou-se as leituras, sendo considerado como resultado positivo para coliformes totais a produo de gs a partir da fermentao da lactose no meio caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2%, e para verificao de coliformes fecais se esto presentes, se houver produo de gs no meio E.C (amarelo). Fora anotado os resultados para ser calculado o NMP a partir dos dados obtidos, de acordo com a Tabela 3 da CETESB, em anexo.

QUADRO DE RESULTADOS
I - RESULTADO ENSAIO PRESUNTIVO A) CALDO LACTOSADO (COM PRPURA DE BROMOCRESOL-C.L.) N DE TUBOS COM RESULTADOS POSITIVOS EM CADA SRIE DE 5 TUBOS NOCULADOS COM: 1 10 1 .100 1 .10-1 1 .10-2 1 .10100 .10-3 4 mL. mL mL mL mL mL. mL

VOLUME DECIMAIS NOCULADOS (mL)

1 .100

a 1 .10-2

POSITIVARAM '

18

II - RESULTADO ENSAIO CONFIRMATIVO A) CALDO LACTOSADO VERDE BRILHANTE E BILE A 2% (TUBOS VERDES) ( MEIO DETECTIVO DE COLIFORME TOTAIS) N DE TUBOS COM RESULTADOS POSITIVOS EM CADA SRIE DE 5 TUBOS NOCULADOS COM: 1 10 1 .100 1 .10-1 1 .10-2 1 .10100 .10-3 4 mL. mL mL mL mL mL. mL

VOLUME DECIMAIS NOCULADOS (mL)

1 .100

a 1 .10-2

POSITIVARAM

B) MEIO E.C. (MEIO DETECTIVO DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES) N DE TUBOS COM RESULTADOS POSITIVOS EM CADA SRIE DE 5 TUBOS NOCULADOS COM: 1 10 1 .100 1 .10-1 1 .10-2 1 .10100 .10-3 4 mL. mL mL mL mL mL. mL 0 1 0

VOLUME DECIMAIS NOCULADOS (mL)

1 .100

a 1 .10-2

POSITIVARAM

6. MTODOS DE EXECUO DO TESTE TCNICA TUBOS MLTIPLOS 6.1 PRINCPIO DO MTODO A determinao do N.M.P. de coliformes em uma amostra efetuada a partir de aplicao da tcnica de tubos mltiplos. Esta tcnica baseada no principio de que as bactrias presentes em uma amostra podem ser separadas por agitao, resultando em uma suspenso de clulas bacterianas, uniformemente distribudas na amostra. Consiste na inoculao de volumes decrescentes da amostra em meio de cultura adequado ao crescimento dos microrganismos pesquisados, sendo cada volume inoculado em uma srie de tubos.
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Atravs de diluies sucessivas da amostra, so obtidos inculos, cuja semeadura fornece resultados negativos em pelo menos um tubo da srie em que os mesmos foram inoculados e a combinao de resultados positivos e negativos permite a obteno de uma estimativa da densidade das bactrias pesquisadas, atravs da aplicao de clculos de probabilidade. Para anlises de guas, tem sido utilizado preferencialmente o fator 10 de diluio, sendo inoculados mltiplos e submltiplos de 1 mL da amostra, usando-se sries de 5 tubos para cada volume a ser inoculado.

6.2 ETAPAS DO MTODO O exame para determinao de coliformes totais se processa atravs de 2 etapas (ensaios presuntivo e confirmativo), de realizao obrigatria para todos os tipos de amostras de gua, as quais so complementadas, quando indicado, por uma terceira etapa (exame completo). A densidade de coliformes fecais obtida a partir de um exame especfico, aplicao do paralelamente ao teste para confirmao de coliformes totais.

6.2.1 ENSAIO PRESUNTIVO Consiste na inoculao de volumes determinados da amostra em sries, de tubos de Caldo lauril-triptose ou Caldo lactosado, com prpura de bromocresol, que so incubados a 35 +- 0,50C. durante 24-48 horas, ocorrendo um enriquecimento de organismos fermentadores da lactose. A acidificao, com ou sem produo de gs, a partir da fermentao da lactose no meio de cultura empregado nesse ensaio, e prova presuntiva positiva para a presena de bactrias do grupo coliforme.

20

6.2.2 ENSAIO CONFIRMATIVO Consiste na transferncia de cada cultura com resultado presuntivo positivo (produo de cido com ou sem gs em C.L. com prpura de bromocresol aps 24 ou 48 h a 35 +- 0,50C) para C.L.V.B.B., sendo a incubao efetuada tambm a 35 - 0,50C, durante 48 horas. A produo de gs a partir da fermentao da lactose neste meio prova confirmativa positiva para a presena de bactrias do grupo coliforme. Esta etapa do exame reduz a possibilidade de ocorrncia de resultados falsos-positivos, decorrentes da atividade de bactrias esporuladas e de bactrias Gram-positivas fermentadoras da lactose.

DETECO COLIFORMES TOTAIS:

DETECO DE COLIFORME FECAIS:

6.2.3 ENSAIO PARA DIFERENCIAO DE COLIFORMES FECAIS Consiste na transferncia de um inculo de cada cultura com resulta do positivo em C.L.T. ou C.L. com prpura de bromocresol incubados durante 2448 horas a 35 +- 0,50C, para tubos contendo o meio E.C., que sero incubados durante 24 +- 2 horas a 44,5 +- 0,2oC em banho-maria, com agitao e temperatura constantes. O resultado ser positivo quando houver produo de gs a partir da fermentao da lactose contida no meio E.C.

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7. RESULTADOS

7.1 CLCULO DO NMERO MAIS PROVVEL (NMP/100 ML) A densidade de coliformes expressa como NMP Nmero Mais Provvel de coliformes por 100 mL, o qual obtido atravs de tabelas da CETESB (em anexo), em que so dados os limites de confiana de 95% para cada valor de NMP determinado.

7.2 UTILIZAO DA TABELA 3 NMP DA CETESB

No teste realizado foram inoculadas 3 sries de 5 tubos, sendo utilizados os volumes indicados na Tabela (10 mL, 1 mL e 0,1 mL): Quando so inoculadas apenas trs series de 5 tubos, sendo utilizados volumes decimais diferentes daqueles indicados na Tabela 3: Neste caso, procura-se o cdigo formado pelo nmero de tubo com resultados positivos obtidos nas trs series consecutivas inoculadas, verificando-se valor do NMP correspondente a ele. O NMP/100 mL ser dado atravs da seguinte frmula:

NMP CORRESPONDENTE AO CDIGO

10 MAIOR VOLUME INOCULADO

I - RESULTADO ENSAIO PRESUNTIVO A) CALDO LACTOSADO (COM PRPURA DE BROMOCRESOL-C.L.) N DE TUBOS COM RESULTADOS POSITIVOS EM CADA SRIE DE 5 TUBOS NOCULADOS COM: 1 1 100 10 1 .10- 1 .10.100 1 .10-3 2 mL. mL. mL mL mL mL

VOLUME DECIMAIS NOCULADOS (mL)

NMP
COD. CORRESP. AO CDIGO

CLC. NMP 100 NMP /mL.

1 .100 a 1 .10-2

422

26

260

POSITIVARAM ' 22

II - RESULTADO ENSAIO CONFIRMATIVO

A) CALDO LACTOSADO VERDE BRILHANTE E BILE A 2% (TUBOS VERDES) ( MEIO DETECTIVO DE COLIFORME TOTAIS)

VOLUME DECIMAIS NOCULADOS (mL)

N DE TUBOS COM RESULTADOS POSITIVOS EM CADA SRIE DE 5 TUBOS NOCULADOS COM: 100 10 mL. mL. 1 .100 mL 1 1 .10- 1 .10.10-3 1 mL 2 mL mL
COD.

NMP
CORRESP. AO CDIGO

CLC. NMP 100 NMP /mL.

1 .100 a 1 .10-2

001

20

POSITIVARAM

23

B) MEIO E.C. (MEIO DETECTIVO DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES) N DE TUBOS COM RESULTADOS POSITIVOS EM CADA SRIE DE 5 TUBOS NOCULADOS COM: 100 10 mL. mL. 1 .100 mL 1 1 .10- 1 .10.10-3 1 mL 2 mL mL
COD.

VOLUME DECIMAIS NOCULADOS (mL)

NMP
CORRESP. AO CDIGO

CLC. NMP 100 NMP /mL.

1 .100 a 1 .10-2

010

20

POSITIVARAM

8. CONCLUSO Aps realizao da diluio da amostra em diluies 10 0, 10-1 e 10-2 e decorrido o perodo de incubao, das 3 sries de 5 tubos de Caldo Lactosado com prpura de bromocresol, realizou-se a 1a leitura, considerando como resultado positivo os tubos que apresentaram acidificao do meio, com ou sem produo de gs, sendo obtido os seguintes resultados positivos do Ensaio Presuntivo: 100 = 4, 10-1 = 2, 10-2 = 2, e NMP = 260p/100 mL. conforme demonstrado no quadro disposto no item 5 j., sendo considerado de baixa concentrao. Partindo do nmero de tubos com resultado positivo no Ensaio Presuntivo, realizou-se na sequencia o Ensaio Confirmativo, sendo inoculado do Caldo Lactosado (positivos) na mesma sequncia de diluio (diluies 100, 10-1 e 10-2) a mesma quantidade tubos contendo:
24

A.

Caldo Lactosado com Verde Brilhante e Bile a 2% (CLVBB) (tubos com colorao verde) para deteco dos Coliformes Totais existentes na amostra e fora calculado atravs da NMP (Numero Mdio Provvel) a quantidade de estimada de Coliformes Totais, cujo resultado fora demonstrado no quadro disposto no Item 7.2 II A, sendo considerado positivo a amostra que apresentou organismos que fermentaram a lactose com a produo de gs, sendo encontrado os seguintes resultados no Ensaio Confirmativo para Coliformes Totais: 100 = 0, 10-1 = 0, 10-2 = 1, e NMP = 20 p/100 mL., sendo considerado de baixa concentrao de Coliformes Totais.

B.

MEIO EC (tubos com colorao amarela) contendo sais biliares para deteco dos Coliformes Fecais existentes na amostra e fora calculado atravs da NMP (Numero Mdio Provvel) a quantidade de estimada de Coliformes Totais, cujo resultado fora demonstrado no quadro disposto no Item 7.2 II B, sendo considerado positivo a amostra que apresentou organismos que fermentaram a lactose com a produo de gs, sendo encontrado os seguintes resultados no Ensaio Confirmativo para Coliformes Totais: 100 = 0, 10-1 = 1, 10-2 = 0, e NMP = 20 p/100 mL, sendo considerado de baixa concentrao de Coliformes Fecais, porm a partir do momento que fora identificado Coliformes Fecais na amostra, a gua do corpo d'gua de onde fora retirada a amostra est inadequada para o consumo humano e animal, independente do NMP apurado, porm quanto menor for o NMP maior a probabilidade do processo de desinfeco ser mais simples.

Em sntese conclui-se que pela aplicao da Tcnica dos Tubos Mltiplos atravs do Ensaio Presuntivo e Ensaio Confirmativo, fora identificado a presena de Coliformes Totais e Fecais nas amostras e diluies, e atravs dos resultados apurados na qualidade bacteriolgica da gua (amostra), ficou evidenciado que o local onde encontra-se o Corpo Dgua, o qual foi obtidos a amostra, a gua no apresenta as condies mnimas de atender ao consumo Humano e de animais, ou seja o corpo dgua est poludo e contaminado por coliformes fecais, devendo ser tomadas as devidas providencias para correo da condio poluidora.
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9. ESQUEMA SINTETIZADO DE ENSAIO PELA TCNICA DE TUBOS MULTIPLOS:

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9. ESQUEMA SINTETIZADO DE ENSAIO PELA TCNICA DE TUBOS MULTIPLOS:

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10. TABELA 3 - CETESB - NORMA TCNICA L5.202 DE JAN/1993

NDICE DE N.M.P = NMERO MAIS PROVVEL E LIMITES DE CONFIANA = 95%

PARA RESULTADOS POSITIVOS OU NEGATIVOS

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N DE TUBOS QUE APRESENTAM REAO POSITIVA QUANDO UTILIZADOS: 5 TUBOS DE 10 mL. 0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 TUBOS DE 1 mL. 0 0 1 2 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 3 0 0 1 1 2 2 0 0 1 1 1 2 2 3 3 4 0 0 0 1 1 1 2 2 2 5 TUBOS DE 0,1 mL. 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2

NDICE DE NMP POR 100 mL.

LIMITE DE CONFIANA INFERIOR

= 95%

SUPERIOR

<2 2 2 4 2 4 4 6 6 4 7 7 9 9 12 8 11 11 14 14 17 13 17 17 21 26 22 26 27 33 34 23 30 40 30 50 60 50 70 90

<1 <1 <1 <1 1 1 2 2 1 2 2 3 3 5 3 4 4 6 6 7 5 7 7 9 12 9 12 12 15 16 9 10 20 10 20 30 20 30 40

10 10 13 11 15 15 18 18 17 20 21 24 25 29 24 29 29 35 35 40 38 45 46 55 63 56 65 67 77 80 86 110 140 120 150 180 170 210 250 30

5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5

0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5

80 110 140 170 130 170 220 280 350 240 300 500 900 1600 1600

30 40 60 80 50 70 100 120 160 100 100 200 300 600 -

250 300 360 410 390 480 560 690 820 940 1300 2000 2900 5300 -

11. BIBLIOGRAFIA

I.

CETESB - NORMA TCNICA L5.202 JAN/1993 ROTEIRO AULA PRTICA FT / UNICAMP ST207 SET/2012 COLIFORMES TOTAIS E FECAIS DETERMINAO TCNICA DE TUBOS MULTIPLOS

II.

III.

REVISTA ELETRNICA N 32 - USP http://www.cdcc.usp.br/ciencia/artigos/art_32/atualidades.html

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