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3.3 TAXONOMA DEL AGENTE CAUSAL DEL CARBN DE LA PAPA

Gastn Muoz V. Rafael Galdames G. Orlando Andrade V. Al agente causal del carbn de la papa se le considera integrante de un grupo de hongos particular denominados genricamente como carbones ("smuts" en ingls). El trmino carbones delimita la organizacin y estrategia de vida de un grupo de hongos y no corresponde a un concepto taxonmico. A pesar que el concepto fue acuado en referencia a parsitos de plantas, muchos de estos hongos causantes de carbones presentan fases saprofticas.

Figura 3.20 Esquema del ciclo de vida de los carbones (Ustilaginomycetes).

En la figura 3.20 se presenta un esquema del ciclo de vida de un carbn. En estos hongos el cuerpo o soma est compuesto de clulas haploides y micelio dicaritico. El primero, en algunas especies, puede producir crecimiento levaduriforme, mientras que el micelio dicaritico es usualmente parastico y casi sin excepcin sobre especies angiospermas. El micelio es ramificado, a menudo desarrolla haustorios dentro de las clulas del hospedero y normalmente no induce sntomas de su presencia en las plantas. Esto ltimo ocurre despus de la formacin de las esporas (clamidosporas, teliosporas o ustilosporas), las que representan los rganos de diseminacin y resistencia. Las esporas se forman en una cavidad del hospedero denominada soro, constituido por tejido del hospedero,

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una masa de esporas y en algunos casos, clulas de tejido fngico modificado. Los carbones producen una amplia variedad de sntomas en sus hospederos, desarrollando soros de aspecto variable en diferentes rganos: races, tallos, hojas, inflorescencias, flores, anteras, ovarios. Las esporas pueden ser simples, en pares o agregadas en grupos variables (aglomerado de esporas o "spore-balls") y ms o menos persistentes pudiendo germinar e infectar a sus hospederos despus de 13-15 aos, en el caso de algunos ustilaginomycetes. La germinacin de las esporas diploides produce un promicelio (basidio o ustidio), que luego de divisiones meiticas del ncleo genera esporidias haploides (basidiosporas) u, ocasionalmente, hifas haploides. Posteriormente, ocurre una fusin celular (plasmogamia), restaurando el estado dicaritico generndose el micelio parastico. La infeccin de los carbones puede ser localizada, restringida a un cierto rgano o parte del hospedero o generalizado (sistmico). Las plantas infectadas usualmente no son distinguibles de las sanas hasta que se forman las esporas. 3.3.1 Sistema de clasificacin de los carbones Se estima que existiran alrededor de 1200 especies de hongos considerados carbones, distribuidos en alrededor de 50 gneros. El sistema de clasificacin de los carbones ha ido variando con el tiempo tomando en cuenta diversos aspectos o caracteres que permiten la diferenciacin o agrupamiento de los mismos. Inicialmente, se consideraban caractersticas identificables visualmente tales como: color, tamao, forma y ornamentacin de las esporas, esterilidad de las clulas, estructura de los aglomerados de esporas, estructura del soro y tipo de germinacin de las esporas. El esquema de clasificacin actualmente aceptado fue propuesto por Bauer, Oberwinkler y Vnky en 1997 (Fig. 3.21) y se ha desarrollado en base a caracteres ultra estructurales tales como interacciones celulares con el hospedero, caractersticas del poro septal, modalidad de desarrollo de las esporas y forma de las paredes de las mismas. De este modo, se considera que los carbones han evolucionado en dos clases de la divisin Basidiomycota: Ustilaginomycetes y Urediniomycetes, siendo la primera la clase donde se presenta el mayor nmero de hongos causantes de carbones. En la actualidad y con el objeto de comprender mejor la diversidad de especies, no slo se toma en cuenta la taxonoma, sino tambin informacin filogentica, ecolgica e incluso paleontolgica. En este contexto la filogenia molecular o la reconstruccin de la historia evolutiva de los individuos basados en las diferencias de la secuencia nucleotdica de determinados genes, ha contribuido a corroborar los sistemas de clasificacin propuestos en bases a caracteres fenotpicos y, a su vez, han propuesto nuevas relaciones en algunas especies.

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Figura 3.21 Esquema del sistema de clasificacin taxonmica de hongos que involucra a los carbones hasta llegar a la familia Glomosporiaceae que agrupa al gnero Thecaphora. Entre parntesis se mencionan gneros conocidos de hongos clasificados en esos grupos (adaptado de Bauer, Oberwinkler y Vnky, 1997; y Bauer, Begerow, Oberwinkler, Piepenbring y Berbee, 2001).

Dentro de las secuencias utilizadas para analizar las relaciones filogenticas entre los Ustilaginomycetes se encuentra la regin 5' del gen nuclear de la subunidad ribosomal grande (LSU). Dicha secuencia presenta regiones conservadas entre los hongos. Esto ha permitido disear partidores de PCR, tales como los indicados en la Fig. 3.22A, que permiten amplificar dicha regin desde prcticamente cualquier hongo (Fig. 3.22B). Al mismo tiempo, la regin LSU presenta variaciones que permiten establecer la lejana o proximidad evolutiva con otros hongos. Una vez amplificado, el fragmento es secuenciado para obtener el orden de las bases nucleotdicas del mismo (Fig. 3.22C). La secuencia es entonces utilizada en el anlisis filogentico, el que nos describe la historia evolutiva que tienen los organismos analizados. Para esto, inicialmente se establece un alineamiento de las secuencias de los individuos incluidos en el estudio, que evidencian zonas de la secuencia donde hay similitudes y diferencias respecto al resto de las analizadas. En base a esta comparacin se calculan las distancias genticas entre ellos, lo cual se representa finalmente a travs de un grfico o rbol filogentico. En el ejemplo de la Fig. 3.22D, la posicin de cada individuo est relacionada con el resto en base a una distancia evolutiva. As, los individuos I2 e I3 forman un grupo independiente, diferente pero relacionado con I1. Estos tres, a su vez, son diferentes estando menos relacionados con I4.

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Figura 3.22 Regin genmica y etapas involucradas en el anlisis filogentico de hongos Ustilaginomycetes. A. Estructura de los genes nucleares que codifican protenas de las unidades ribosomales, SSU unidad ribosomal pequea; ITS, regin espaciadora interna transcrita; LSU; subunidad ribosomal mayor; IGS, regin espaciadora intergnica. NL1 y NL2 son los partidores que amplifican parte de la regin 5' de LSU utilizada en el anlisis. B. Separacin electrofortica de los productos de la amplificacin de PCR utilizando los partidores NL1 y NL2 de cuatro individuos. La flecha indica la migracin del fragmento de la regin LSU obtenido. C. Ejemplo de la obtencin de la secuencia nucleotdica de la banda amplificada y anlisis de comparacin mediante Blast. D. Ejemplo de un dendograma producto del anlisis filogentico el cual se realiza utilizando los programas ClustalX y MEGA2.1.

Los anlisis filogenticos basados en la regin LSU han contribuido a establecer las relaciones evolutivas entre los Ustilaginomycetes. El ordenamiento obtenido mediante esta va ha sustentado, para la gran mayora de las especies, el actual sistema de clasificacin propuesto para los Ustilaginomycetes (Fig. 3.21). En el sistema actual, el gnero Thecaphora forma parte de la familia Glomosporiaceae, el que se ubica en el orden de los Ustilaginales, subclase Ustilaginomycetidae (Fig. 3.21) posicin que comparte con los gneros Glomosporium y Tothiela. La familia Glomosporiaceae es un buen ejemplo de la dinmica que ocurre en las clasificaciones. Esta familia agrupa los gneros Thecaphora, Sorosporium y Glomosporium ya que los antecedentes disponibles sealaban que los tres gneros estaban relacionados entre si, sin grandes diferencias morfolgicas. En 1997, Sorosporium saponariae fue incorporado al gnero Thecaphora, renombrndolo como T. saponariae, mientras que en 1994

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Glomosporium amaranthi fue redefinido como T. amaranthi. En todo caso, se considera que el gnero Thecaphora no representa un grupo naturalmente homogneo, puesto que la forma de germinacin es altamente variable entre las especies. 3.3.2 Estudios para establecer la posicin taxonmica del agente causal del Carbn de la Papa Hasta el ao 2001, la posicin taxonmica del fitopatgeno no era clara. La primera descripcin del agente causal de la enfermedad fue realizada por Barrus y Muller en 1943 y al ao siguiente, Barrus describi el hongo denominndolo como Thecaphora solani Barrus. Las caractersticas ms relevantes descritas estaban relacionadas con las esporas, las que formaban agregados firmes de 2 a 8 esporas, de aspecto rugoso en su superficie, color caf oscuro y aspecto polvoriento. Estas caractersticas son propias del gnero Thecaphora, cuyo representante tipo es la especie T. seminis-convolvuli (Figs. 3.23C y D). Sin embargo, se omiti una descripcin de las caractersticas del hongo en latn, formalidad fundamental para revindicar la aceptacin de una nueva especie, lo que signific a los autores que se invalidara la denominacin propuesta. En 1972, O'Brien y Thirumalachar reexaminaron el hongo describiendo diferencias con respecto a otras especies descritas hasta ese entonces para el gnero Thecaphora, particularmente el desarrollo del soro locular y la facilidad de separar los agregados de esporas. Basado en dichas diferencias propusieron un nuevo gnero Angiosorus solani Thirum & O'Brien, cumpliendo con la descripcin formal en latn. No obstante, un carcter importante para establecer taxonmicamente el gnero, como es el modo de germinacin de las esporas, no fue descrito en ninguno de los trabajos. Posteriormente en 1988, Mordue y Vanky analizaron las descripciones sobre el fitopatgeno resaltando el hecho que Angiosorus solani no presentaba caractersticas diferenciales con otras Thecaphora. Sin embargo, no existan a esa fecha nuevos estudios que ayudaran a esclarecer esta situacin. El ao 2001 se inici en el Centro de Investigacin INIA-Carillanca, Temuco, Chile, un trabajo de investigacin que permitiera aportar nuevas evidencias con respecto a la posicin taxonmica del fitopatgeno. 3.3.3 Anlisis morfolgicos y estructurales Los aspectos morfolgicos de las teliosporas aisladas de tumores y agallas de la zona norte y sur tales como color, disposicin y tamao de las teliosporas concordaban con lo descrito previamente siendo similar a lo reportado para otras especies de Thecaphora (Figs. 3.23A, B). Sin embargo, se constat que las teliosporas no podan ser desagregadas.

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De hecho, la adhesin parece ser bastante fuerte ya que una suspensin de teliosporas agitada a alta velocidad en presencia de perlas de vidrio no logra la liberacin de las ustilosporas. Tampoco se logra tal separacin cuando se ejerce presin sobre teliosporas dispuestas sobre dos portaobjetos. Ambos hechos estn de acuerdo con lo descrito por Barrus. El anlisis ultraestructural de la superficie de las teliosporas realizado mediante microscopia de barrido mostr una superficie rugosa y la presencia de una pared divisoria entre las ustilosporas (Fig. 3.23B). Tales caractersticas estn presentes en T. seminis-convolvuli (Fig. 3.23D) evidencindose una relacin con el gnero Thecaphora. Una caracterstica importante para la clasificacin de los carbones es el desarrollo del proceso germinativo. Para estudiar esto, las teliosporas fueron sembradas en placas de agar slo con agua o con medio nutritivo malta-levadura y observadas bajo microscopio para detectar la aparicin de las estructuras germinativas. En la mayora de las veces, el hongo en estudio desarroll micelio septado (Fig. 3.24 A y B) similar a lo descrito para T. seminis-convolvuli (Fig. 3.24C).

Figura 3.23 Comparacin morfolgica y estructural de teliosporas de T. solani (A y B) y T. seminisconvolvuli. (C y D). A y C muestran el aspecto al microscopio ptico de aglomerados de teliosporas, mientras que B y D muestra el aspecto de las superficie de las mismas visto mediante microscopia electrnica de barrido. (Figuras C y D reproducidas de: K. Vnky. 1998. Mycol. Res. 102(5):513-526)

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Figura 3.24 Comparacin del proceso germinativo observado en teliosporas de T. solani (A y B) y T. seminis-convolvuli (C). (Figura C reproducida de: M. Woronin. 1881. Naturf. Ges. 12:559-587).

3.3.4 Anlisis filogentico basados en la regin LSU La posibilidad de obtener cultivos puros del hongo en laboratorio permiti obtener biomasa desde donde se extrajo ADN genmico. A partir de este ADN se pudo amplificar la secuencia LSU y realizar un anlisis filogentico tal como se describe en la Fig. 3.22. De este modo, utilizando los aislamientos indicados en el Cuadro 3.2 y los partidores NL1 y NL4 (Fig. 3.22A) fue amplificado un fragmento de la regin 5` LSU mediante PCR. Para todos los aislados se amplific un slo fragmento de ADN de alrededor de 660 pb (pares de bases). Cada fragmento fue clonado y secuenciado, verificndose que todos ellos tenan la misma secuencia nucleotdica. Esto indica que todos los aislamientos analizados, colectados de diversos lugares, hospederos e incluso tipo de tejido fngico (Cuadro 3.2), corresponden al mismo hongo. La secuencia obtenida fue comparada en la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) usando el algoritmo Blast, encontrndose que presentaba homologa con la misma regin ribosomal de otros hongos Ustilaginomycetes. La similitud ms alta se obtuvo con las secuencias de las nicas tres especies de Thecaphora cuya regin LSU es conocida (T. amaranthi, T. saponariae y T. seminis-convolvuli). Esto indica una estrecha relacin gentica con dicho gnero. Para realizar el anlisis filogentico, la secuencia obtenida fue alineada con secuencias LSU de hongos Ustilaginomycetes y Exobasidiomycetes (indicadas en la Fig. 3.25) utilizando el programa ClustalX. Basado en este alineamiento, el anlisis filogentico se realiz mediante el mtodo de "neighbor-joining" usando el programa MEGA2.1 resultando en un dendograma cuya topologa se muestra en la Fig. 3.25. Este resultado muestra claramente que T. solani se agrupa junto a las otras especies de Thecaphora para las cuales se conoce la secuencia LSU, evidenciando definitivamente una estrecha relacin gentica con dicho gnero. 57

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Por otro lado, es importante mencionar que el anlisis filogentico muestra al gnero Thecaphora ms cercano al orden de los Urocistales y alejado de los Ustilaginales. Esto se contrapone a lo establecido en el actual sistema de clasificacin basado en caracteres ultra estructurales donde Thecaphora, como miembro de la familia Glomosporiaceae, es parte del orden Ustilaginales (Fig. 3.21). Es necesario incorporar ms secuencias de otros miembros de la familia para clarificar esta discrepancia entre el anlisis taxonmico y el filogentico. Por lo tanto y por el momento, se valida lo descrito en la Fig. 3.21. Cuadro 3.2 Aislamientos de Thecaphora solani utilizados para amplificar la regin LSU para anlisis filogenticos. Aislamiento Ts-5 Ts-15 Ts-16 Ts-21 Ts-21 Ts-22 Ts-23 Tipo celular teliosporas micelio micelio teliosporas micelio teliosporas teliosporas Hospedero S. tuberosum S. tuberosum S. tuberosum S. tuberosum Datura stramonium1 Solanum furcatum2 Regin IV IV VIII IX IV IV

1: chamico; 2: tomatillo.

Figura 3.25 Dendograma del anlisis filogentico basado en al regin LSU de 26 secuencias de LSU rDNA correspondientes a hongos ustilaginomicetes. En cada nodo se presentan los valores de bootstrap mayores a 50%, lo cual indica que tal nodo es significativo. La barra indica los cambios esperados por sitio.

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CONCLUSIONES Los estudios realizados han contribuido a establecer la real posicin taxonmica del agente causal del carbn de la papa. Los datos aportados muestran que el fitopatgeno presenta similitudes morfolgicas y ultra estructurales con el gnero Thecaphora. Esta relacin est slidamente respaldada por los anlisis filogenticos basados en la regin LSU. Por lo tanto, la descripcin inicial de Barrus estara correcta y el patgeno debiera ser llamado T. solani Barrus. Finalmente, hay que hacer notar que T. solani es la nica especie del gnero Thecaphora capaz de desarrollarse en la zona radical de su hospedero. As, esta especie presenta caractersticas fitopatolgicas propias, cuyo mecanismo de accin es an desconocido. El poder elucidar este mecanismo aportar a una mejor comprensin de la enfermedad y por ende a elaborar mejores estrategias de control.

LITERATURA CONSULTADA Barrus, M. F. 1944. A Thecaphora smut on potatoes. Phytopathology 34:712-714. Barrus, M. F., and A. Muller. 1943. An Andean disease of potato tubers. Phytopathology 33:1086-1089. Bauer, R., D. Begerow, F. Oberwinkler, M. Piepenbring, and M.L. Berbee. 2001. In McLaughlin, McLaughlin, Lemke (eds.) The Mycota p. 57-83. VII Part B. Systematics and Evolution.. Springer-Verlag, Belin Heidelberg. Alemania. Bauer, R., F. ,Oberwinkler, and K. Vnky. 1997. Ultrastructural markers and systematics in smut fungi and allied taxa. Can. J. Bot. 75:1273-1314. Begerow, D., R. Bauer, and F. Oberwinkler. 1997. Phylogenetic studies on nuclear large subunit ribosomal DNA sequences of smut fungi and related taxa. Can. J. Bot. 75:2045-2056. Mordue, J. E. 1988. Thecaphora solani. CMI descriptions of pathogenic fungi and bacteria N966. Mycopathologia 103:177-178. Piepenbring, M. and Bauer, R. 1995. Noteworthy germinations of some Costa Rican Ustilaginales. Mycol. Res. 99:853-858. Vnky, K. 1988. Taxonomical studies on ustilaginales III. Mycotaxon 69: 93-115. Vnky, K. 1998. A survey of the spore-ball-forming smut fungi. Mycol. Res. 102: 513 526. Webster, J. 1980. Introduction to fungi. 669 p. 2th ed. Cambridge University Press, Cambridge, UK.

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