Grupo de Investigacin HIBRO , AGR-0170

Microbiologia predictiva
Profa. Rosa Mara Garca Gimeno Dpto. Bromatologa y Tecnologa de los Alimentos Universidad de Crdoba

Qu es y como surge la microbiologa predictiva? Cmo se hacen los modelos? Qu tipos hay? Qu aplicaciones tiene en los alimentos?

Qu es la microbiologa predictiva ?

Qu es?

La microbiologa predictiva comprende el estudio de la respuesta de crecimiento, crecimiento o de inhibicin, de microorganismos que crecen en alimentos, en funcin de factores que les afecten (temperatura, pH, gases, etc.) y a partir de estos datos predecir lo que suceder durante el almacenamiento, procesado, etc

Qu es?

Figura. Teora de los salto de obstculos

Qu es?

Factores intrnsecos Factores implcitos Nutrientes Velocidad de pH y capacidad tampn crecimiento especfico Potencial redox Sinergismo Actividad de agua Antagonismo Constituyentes antimicrobianos Comensalismo Estructuras antimicrobianas Factores de la elaboracin o tratamiento Factores ambientales o extrnsecos Cortado en rodajas Lavado Humedad relativa envasado Temperatura Irradiacin Atmsfera gaseosa Pasterizacin Otros

Cmo se hacen?

DISEO ACUMULACION DE DATOS AJUSTE DE LA CURVA DE CRECIMIENTO / INHIBICIN MODELO VALIDACIN PREDICCIN

Cmo se hacen?

Estrategia para Diseo experimental (Davies 1993):

Definir objetivo experimental Enumerar todas las variables y grado importancia Rango de fluctuacin de variables Seleccin del medio o sustrato Caractersticas del inculo Competencia con otros microorganismos
pH
7.4

6.0 0 4.6 30 17 5 10

NaCl

Temperatura

Cmo se hacen?

2. Acumulacin de datos

log(ufc)/g

tiempo

Cmo se hacen?

2. Acumulacin de datos
Mtodos directos Recuento en placas ! ! material, tiempo y de esfuerzo Mtodos indirectos Mtodos instrumentales

Mtodos elctricos: conductancia, impedancia Turbidimetra Citometra de flujo Bioluminiscencia Espectroscopa de infrarrojos
Ventajas: rapidez, fiabilidad, no destructiva, econmica

Cmo se hacen?

3. Ajuste de la curva
Datos experimentales Log nmero de clulas densidad max poblacin

(yEnd)

AJUSTE

tasa de crecimiento

(max)

MODELOS PRIMARIOS

fase de adaptacin Tiempo (horas)

()

Parmetros de crecimiento

Cmo se hacen?

Parmetros cinticos que estima el modelo Tasa de crecimiento especfica mxima (max) Tiempo de generacin (g) o tiempo de duplicacin (Td) (doubling time) Tiempo de adaptacin ((lag-time)) Tiempo en alcanza X nivel o ufc/ml Tiempo en incrementarse 2 unidades logartmicas .....

Cmo se hacen?

Comportamiento general de microorganismos log nmero de clulas 25 C 15 C 10 C

tiempo (horas)

Cmo se hacen?

Cuando la temperatura aumenta la tasa de crecimiento tambin aumenta log nmero de clulas 25 C 15 C 10 C

tiempo (horas)

Cmo se hacen?

Cuando la temperatura aumenta el tiempo de adaptacin disminuye log nmero de clulas 25 C 15 C 10 C

Lag

tiempo (horas)

Cmo se hacen?

4. Modelizacin
Parmetros de crecimiento Variables

tasa de crecimiento tasa de crecimiento fase de adaptacin fase de adaptacin nivel mximo de crecimiento nivel mximo de crecimiento

Temperatura Temperatura pH pH Conservantes Conservantes Acidos orgnicos Acidos orgnicos CO22 Competencia entre CO Competencia entre microorganismos microorganismos

Modelos secundarios

Ecuacin de Arrhenius Modelo de Raz Cuadrada Modelo de Respuesta en Superficie Redes neuronales

5. Validacin del modelo

1. Validacin matemtica
verifica la precisin de los modelos generados

Cmo se hacen?

2. Validacin en el alimento
demostrar que predicen con exactitud el comportamiento de microorganismos durante procesado, almacenamiento y distribucin
DATOS OBSERVADOS

Indices
MTODO

Representacin grfica

CRITERIOS DE DECISIN

Evolucin de E. coli O157:H7 en productos crnicos cocidos Evolucin de E. coli O157:H7 en productos crnicos cocidos JAMN COCIDO
Tasa de crecimiento 10C 13.5C
2.3C 6.5C 10C 13.5C 17.7C

10 9 8 7 log N (ufc/g) 6 5 4 3 2 1 0 0 5 10 15 20 25 30

0.0338 h-1 0.0426 h-1 0.0426 h-1

17.7C

tiempo (das)

MTODO DE VALIDACIN

0.600 Tasa de crecimiento PREDICTIVA

y=x

0.400

lado seguro Bf>1

Af

0.200

0.000 0.000

lado peligroso Bf<1

0.200 0.400 0.600

Tasa de crecimiento OBSERVADA

Bf: factor sesgo; Af: factor exactitud

Cmo se hacen?

6. Prediccin

Objetivo prctico final elaborar grficos y predicciones

MODELOS TERCIARIOS
Food MicroModel ? Combase PMP (Pathogen Modelling Program) SSP (Seafood Spoilage Predictor) Chefcad software Decision support system (DSS) Food Spoilage Predictor (FSP) MIRINZ-software Quantitative Risk Assessment (QRA)

Qu tipo hay?

Tipos de modelos matemticos

Segn su finalidad:
Modelos probabilsticos
microorganismos patgenos ej. Cl. botulinum : se calcular la probabilidad de produccin de toxina

Modelos cinticos
microorganismo alterantes ej. Lactobacillus plantarum: se buscar predecir el tiempo de generacin, la tasa especfica de crecimiento o el tiempo de adaptacin

Qu tipos hay?

Tipos de modelos matemticos

Segn el fundamento matemtico
Modelo emprico: ajuste a partir de los datos obtenidos experimentalmente Modelo mecanstico: parte de una base terica biolgica.

Qu tipos hay?
Esquema propuesto por Whiting y Buchanan (1993)

Cambio en el nmero de microorganismos en el tiempo bajo ciertas condiciones ambientales

Modelos PRIMARIOS

Ecuacin Gompertz Ecuacin Baranyi y Roberts Modelo lineal en 3 fases Modelos Raz cuadrada Ecuaciones polinmicas Redes Neuronales Artificiales

Cambios en los parmetros de crecimiento frente a los factores ambientales

Modelos SECUNDARIOS

Modelos TERCIARIOS

Programas informticos

Modelos TERCIARIOS

Food MicroModel ? Combase PMP (Pathogen Modelling Program) SSP (Seafood Spoilage Predictor) Chefcad software Decision support system (DSS) Food Spoilage Predictor (FSP) MIRINZ-software Quantitative Risk Assessment (QRA)

MODELO PRIMARIO

Qu tipos hay?

1 0.9 0.8 0.7 absorbancia 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 20

Lecturas absorbancia Baranyi y Roberts Gompertz

40 60 tiempo (h)

80

100

MODELO SECUNDARIO

Qu tipos hay?

= b (T Tmin )

T (C) Ecuacin de Ratkowsky

MODELO SECUNDARIO

Qu tipos hay?

Respuesta en Superficie

MODELO SECUNDARIO Capa de entrada Capa oculta h1 T h2 pH h3 NaCl h4 NaNO2 h5

REDES NEURONALES ARTIFICIALES

Qu tipos hay?

Capa de salida
N de niveles o capas

Parmetro de N de neuronas crecimiento

por capa Grado de conectividad entre nodos:pesos Tipo de conexin entre neuronas

MODELO SECUNDARIO

Qu tipos hay?

Modelo de probabilidad

MODELO SECUNDARIO

Qu tipos hay?

MODELO TERCIARIO

Direcciones web
FMM: ComBase: http://www.ifr.ac.uk/ComBase/ PMP 6.1: http://www.arserrc.gov/mfs/pathogen.htm Seafood Spoilage Predictor (SSP) http://ww.dfu.min.dk/micro/ssp

Qu aplicaciones tienen los modelos en los alimentos?

Conjunto de condiciones en funcin de la temperatura, pH y ClNa bajo las cuales E. coli O157:H7 es capaz o no de crecer

21 21 19 19 17 17 15 T (C) 15 13 13 11 11 7C 8 87 76 8.5 8.5

NO2Na

0200ppm
65 7.5 7.5

54

NaCl (%) 32 21

43

7-8%

10

4.5 4.5

5.5 5.5

6.5 6.5

pH

PREDICCIONES GRFICOS

15C 30ppm NaNO2

0.16 0.14 0.12 0.10 Tas a d e 0.08 -1 crecimien to (h ) 0.06 0.04 0.02 8.5 7.5 6.5
pH

2 5.5 4.5 8 4 6
NaCl(% )

0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.059 0.069 0.079 0.089 0.099 ab o v e

Qu aplicaciones?

Por medio de la computarizacin de los datos

Educacin y formacin: Mostrar a personas no tcnicas o especializadas como sera el comportamiento microbiano segn los factores presentes en el medio.

Escherichia coli O157:H7

E.E.U.U en 1982 por consumo de ternera insuficientemente cocinada

PATGENO EMERGENTE

Buenas Prcticas de Fabricacin (GMP) Sistema de Anlisis de Peligros y Control de Puntos Crticos (APPCC)
ALIMENTOS SEGUROS Evaluacin del Riesgo
1. Identificacin del peligro 2. Evaluacin de la exposicin 3. Caracterizacin del peligro 4. Caracterizacin del riesgo

Anlisis de Riesgos

Control del Riesgo Comunicacin del Riesgo

EVALUACIN DEL RIESGO 1. IDENTIFICACIN DEL PELIGRO 1. Caractersticas generales

se identifica el microorganismo para determinar si constituye un peligro potencial en el alimento

bacilo Gram-negativo flagelos peritricos aerobio/anaerobio facultativo oxidasa y catalasa negativo Serogrupos de E. coli:

Enteropatgenos (EPEC) Enterotoxignico (ETEC) Verocitotoxignico(VETC) Enteroinvasor (EIEC) Enteroagregante (EaggEc) Difusamente adherente (DAEC)

E. coli O157:H7 157 antgeno somtico 7 antgeno flagelar

EVALUACIN DEL RIESGO 1. IDENTIFICACIN DEL PELIGRO

Adherencia Plasmido 60Mda Gen eaeA157 Shiga toxina 1 Shiga toxina 2 Hemolisina EHEC Catalasa KatP Exopolisacarido

2. Factores de virulencia

Shiga toxina

Otros factores de virulencia

1er brote en EEUU en 1982

3. Incidencia de la enfermedad

Canad Japn Europa

Escocia Gales Alemania

Finlandia Italia Espaa

Barcelona

158 afectados

Inglaterra Hungra

Septiembre 2000

EVALUACIN DEL RIESGO 1. IDENTIFICACIN DEL PELIGRO 4. Reservorios Ganado vacuno Ciervos Ovejas Cabras Caballos Perros Pjaros Moscas Personas Nios pequeos Leche Carne Salchichas Hamburguesas Carne guisada Sandwichs Salami Agua Lechuga Rbanos Meln Sidra de manzana Brotes de alfalfa Brotes de judas

Estiercol

EVALUACIN DEL RIESGO 2. EVALUACIN DE LA EXPOSICIN

Estudio de la inactivacin o multiplicacin de E. coli O157:H7 durante el proceso de fabricacin del alimento

Produccin de la materia prima Elaboracin del producto

MODELOS PREDICTIVOS

Envasado Distribucin y venta Consumidor

EVALUACIN DEL RIESGO 3. CARACTERIZACIN DEL PELIGRO 1 Enfermedad producida por E. coli O157:H7 2 Factores que influyen en el crecimiento y supervivencia de E. coli O157:H7
Temperatura pH Aw

3 Relacin dosis-respuesta
Estudios epidemiolgicos 100 CLULAS

EVALUACIN DEL RIESGO 4. CARACTERIZACIN DEL RIESGO Estimacin de la PROBABILIDAD de que ocurra el peligro y de la severidad de los efectos adversos sobre la salud 1. IDENTIFICACIN DEL PELIGRO 2. EVALUACIN DE LA EXPOSICIN 3. CARACTERIZACIN DEL PELIGRO

Incorpora al estudio las estrategias para controlar el riesgo analizado y el estudia el porcentaje de reduccin de la enfermedad

EVALUACIN DEL RIESGO

EVALUACIN DE LA EXPOSICIN

Produccin de la materia prima Elaboracin del producto Envasado Distribucin y venta Consumidor
2 clulas/g de alimento

MODELOS PREDICTIVOS
Jamn de cerdo cocido pH: 6.35 NaCl: 1.84% NaNO2: 30ppm

T: 13.5C

EVALUACIN DE LA EXPOSICIN MODELO DE REDES

T: 13.5C
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 25 50 75 100 125 tiempo (h)

Tasa de crecimiento 0.0822h-1

Predicciones de crecimiento de E. coli O157:H7 segn redes neuronales

log N (ufc)

 CARACTERIZACIN DEL PELIGRO

55%

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 10 Dosis ingerida (log10ufc)

% Probabilidad de enfermedad

3.57

 CARACTERIZACIN DEL RIESGO

% probabilidad de enfermar

Jamn de cerdo cocido

Prediccin REDES

100 80 60 40 20 0 0 25 50 75 100 Tiempo de abuso de temperatura (h)

T: 13.5 C

TIEMPO ?

Qu aplicaciones?

ESTIMACIN DE VIDA COMERCIAL

VIDA COMERCIAL OBSERVADA ANLISIS SENSORIAL CALIDAD SENSORIAL GLOBAL Korkeala y Bjrkroth, 1997 VIDA COMERCIAL PREDICTIVA MODELOS SECUNDARIOS
Garca-Gimeno y col., 1998

106-108 ufc/g emax A(t) -1 eymax- y0

max
yEnd

Baranyi y Roberts (1994)

y(t)= y0+ max A(t) - Ln 1+

Qu aplicaciones?

ESTIMACIN DE VIDA COMERCIAL

VIDA COMERCIAL PREDICTIVA T (C)
POLLO 10.5 13.5 17.7 PAVO 10.5 13.5 17.7 JAMN 10.5 13.7 17.7

106.5 Vida comercial Vida comercial Vida comercial Vida comercial BAL OBS (das) OBS (das) PRED (das) PRED (das)
27 21 16 25 22 20 31 21 12 23 20 17 24 21 17 22 19 16

Qu aplicaciones?

FORMULACIN DE NUEVOS PRODUCTOS

0.700 Tasa max crecimiento (h-1) 0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 10 12 14 16 18
T= 17.5C

% NaCl

0% NaCl 1.2% NaCl 2.4% NaCl

pH= 6.22 NaNO2= 55 ppm

0.403 h-1 0.234 h-1 0.187 h-1

20

22

24

26

Temperatura (C)

Qu aplicaciones?

TEMPERATURA DE ALMACENAMIENTO DE ALIMENTOS PERECEDEROS

SCOOP

MICROBIOLOGIA PREDICTIVA Y APPCCs

Etapa 1

Qu aplicaciones?

Identificacin de peligros

P ELIGRO

Ejemplo: Materia prima contaminada con diferentes patgenos. a) Cual de ellos tiene mayor capacidad para reproducirse en esas condiciones? Y en su caso, b) Que probabilidad tenemos que crezca en nuestras condiciones? c) Podemos estimar el efecto del procesado sobre estos patgenos sin recurrir al anlisis?

MICROBIOLOGIA PREDICTIVA Y APPCCs

Etapa 1

Qu aplicaciones?

Identificacin de peligros

P ELIGRO

Ejemplo: Efecto de la formulacin del producto en el crecimiento de Aeromonas hydrophila a 7C.

7 6

log N

5 4 3 2 1 0 0 200 400 600 A B C

A: sal 2.3%; pH 6.1; B: sal 4.3%; pH 6.1; C: sal 2.3%; pH 5.6

tiempo (h)

Qu aplicaciones?

Etapa 2

Determinacin de puntos crticos

Ej: Que ocurrira si se perdiera el control de una determinada etapa del proceso consistente en mantener una temperatura de 7C/15 minutos necesarios para mantener a St. aureus a niveles aceptables?. Incremento estimado (%) en el nmero de Staphylococcus aureus para varias combinaciones tiempo-temperatura

T (C) En 15 minutos En 120 minutos

7 15 20 25 30 35

0 3 10 20 35 56

0 30 108 321 978 3386

Podemos valorar las consecuencias microbiolgicas del proceso y determinar objetivamente que etapas son crticas para la calidad y seguridad del producto.