XV Congresso Regional dos Estudantes de Engenharia Qumica 18 a 24 de julho de 2010 Macei, Alagoas, Brasil

CARACTERIZAO DO SISTEMA AQUOSO BIFASCO PEG 10000/FOSFATO DE POTSSIO PARA APLICAO NA CONCENTRAO DE POLIGALACTURONASES
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PALOMA L. DE OLIVEIRA, 2 LBIA DE S. CONRADO, 3 ISRAEL N. DE OLIVEIRA,4 JARDES J. CAIARA, 5 CARLOS A. B. DE SOUSA Universidade Federal de Campina Grande, discente do curso de Engenharia Qumica Universidade Federal de Campina Grande, docente do curso de Engenharia Qumica

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Universidade Federal de Campina Grande. Av. Aprgio Veloso, 882, Bloco CX, LEB, Campus I, Campina Grande-Pb CEP: 58429-140.
1 2

1,2,3,4,5

palomalima_eq@yahoo.com libiaconrado@yahoo.com.br

RESUMO Os sistemas aquosos bifsicos (SABs) so uma alternativa atraente para a recuperao e concentrao de biomolculas. O objetivo deste trabalho foi determinar os diagramas de equilbrio de fases em SABs formados por Peg 10000 e fosfato de potssio e caracteriz-los quanto composio, para serem aplicados na partio de poligalacturonases. A curva binodal de cada sistema foi obtida por tcnica turbidimtrica. A composio foi determinada por mtodos gravimtricos. Foram comparados sistemas preparados com gua pura e com adio de extrato enzimtico. Os resultados mostraram que, embora as curvas apresentem o mesmo perfil, verifica-se um deslocamento da curva produzida com o meio fermentado para os menores valores de concentrao dos componentes formadores das fases, o que sugere uma ampliao da regio de trabalho em relao curva construda com gua. De posse das concentraes de Peg e sal presentes nas fases dos SABs foi possvel construir as tie-lines. Palavras-Chave: SABS, EQUILBRIO DE FASES, POLIGALACTURONASES.

1. INTRODUO
Os sistemas aquosos bifsicos (SABs) formam-se pela adio de solues aquosas de dois polmeros hidroflicos, como PEG (polietileno glicol) e dextrana, ou de um polmero e um sal, como Peg e fosfato de potssio. A fase mais leve rica em polietileno glicol, e a mais pesada, rica em dextrana ou sais. Os polmeros e os sais so solveis em gua, mas incompatveis entre si, e se separam em duas fases (ALBERTSSON, 1986).

Uma das caractersticas importantes dos SABs sua elevada composio em gua (cerca de 85-99%), o que permite a partio de biomolculas e de partculas celulares em condies no desnaturantes. As propriedades fsicas dos SABs podem ser modificadas variando a concentrao e composio dos polmeros e sais. Deste modo, a partio de molculas e de partculas biolgicas pode ser explorada para obteno de separaes, que de outro modo seriam difceis ou mesmo impossveis de serem realizadas (GAVASANE & GAIKAR, 2003).

As principais vantagens na purificao de biomolculas pelos SABs so: a facilidade no aumento da escala; rpida transferncia de massa; equilbrio alcanado com recursos a baixa energia na forma de mistura mecnica; possibilidade de operao rpida e seletiva; possibilidade de operao temperatura ambiente, com economia em relao a outros processos de separao (ALBERTSSON, 1986). Apesar das potenciais aplicaes dos SABs, os recentes avanos em obter elevados fatores de purificao para a separao de protenas alvo de seus contaminantes, foram bem sucedidos na escala de laboratrio e em operaes industriais. Isto , em parte, devido ao conhecimento da engenharia bsica e do entendimento dos sistemas (MERCHUK et al., 1998). O desenvolvimento de extraes lquido-lquido utilizando ao sistema bifsico aquoso em grande escala est muito limitado aos sistemas de Peg-dextrana e Peg-sal. Estes possuem propriedades fsicas favorveis, especialmente no que se refere viscosidade e a diferena de densidades entre as fases. Esta escolha bastante influenciada por questes legais a que os processos de produo tm que obedecer, tanto o Peg como a dextrana so substncias atxicas e no causam distrbios ao ambiente (SARMENTO et al., 1994). O objetivo deste trabalho foi determinar os diagramas de equilbrio de fases em SABs formados por Peg 10000 e fosfato de potssio e caracteriz-los quanto composio, para serem aplicados na partio de poligalacturonases.

2. METODOLOGIA 2.1 Sistemas Bifsicos

Os SABs foram construdos a partir de solues mes de Peg 10000, fosfato de potssio monobsico e bibsico e extrato fermentado proveniente da fermentao semi-

slida de resduo agroindustrial (casca e albedo) do maracuj amarelo. Preparao dos reagentes: o Peg de massa molecular 10000, de qualidade comercial, em escamas, foi previamente seco em estufa a 50oC at peso constante. Aps resfriamento em dessecador, foi preparada uma soluo de Peg 10000 a 50% (em massa), utilizando-se gua deionizada. A soluo resultante apresentou pH igual a 7,0; medido em pHmetro previamente calibrado com tampes de pH 4,0 e 7,0. Os sais de fosfato foram previamente secos em estufa a 105oC at peso constate. O tampo fosfato de potssio foi preparado utilizando-se uma mistura de Fosfato de potssio bibsico e monobsico, ambos anidros. A relao entre as massas dos sais, , foi de 1,807 para M 1( K 2 HPO 4 ) / M 2 ( KH 2 PO 4 ) obter uma soluo a 40% (em massa) com pH 7,0. Eventuais ajustes de pH foram feitos adicionando-se solues de Fosfato de potssio monobsico ou bibsico a 40%, ao tampo sob agitao e monitorao do pH. O extrato fermentado proveniente da fermentao foi filtrado e centrifugado a fim de se obter uma soluo lmpida. Obteno das curvas binodais: as curvas binodais foram obtidas atravs de tcnica turbidimtrica (CARVALHO 2007, BERTOLUZZO 2005), temperatura de 25 1 0C. Em um tubo de ensaio de 35 ml, adicionou-se cerca de 1,5 g da soluo me de PEG 10000. A esta soluo, foram adicionadas alquotas de 10 l da soluo me do sal, at o surgimento de uma turvao persistente. Aps cada adio de sal, o sistema era agitado em um vrtex e tinha sua massa medida e anotada. As concentraes dos dois componentes imediatamente antes da apario de turbidez foram tomadas como um ponto da curva binodal e foram calculadas a partir das concentraes iniciais das solues, da massa inicial e final do sistema aps cada adio. Ao mesmo sistema, foi adicionado cerca de 0,5 ml de gua deionizada para torn-lo novamente homogneo. A nova massa do sistema foi medida, e a

massa da gua adicionada calculada por diferena. Foram adicionados novos incrementos da soluo salina at nova turvao, seguida pela adio de gua. Esse procedimento foi realizado at obter-se pelo menos 15 pontos. O procedimento foi realizado tambm adicionando-se alquotas de Peg 10000 a uma massa conhecida de soluo salina, para determinar a regio inferior da binodal. Como na aplicao do SAB para concentrao de enzimas o sistema ter outros componentes alm de Peg, gua e sal; a determinao da binodal foi repetida adicionando-se extrato fermentado ao invs de gua deionizada para tornar o sistema monofsico, possibilitando a obteno de dados de equilbrio mais coerentes com a aplicao que ser realizada posteriormente. Preparao dos sistemas aquosos bifsicos: depois da determinao das curvas binodais, foram preparados em tubos de centrfuga graduados de 15ml os sistemas aquosos bifsicos em triplicata, formados por Peg 10000, tampo fosfato de potssio e extrato fermentado, com o objetivo de se determinar os dados de equilbrio dos sistemas. As massas das solues mes tomadas para construo dos SABs est na Tabela 1. Os sistemas tinham cerca de 16g. Aps adio das massas nos tubos, a mistura foi agitada em vrtex e os tubos foram colocados em banho termosttico, para manter sua temperatura controlada em (25 0,1) o C e mantidos em repouso durante 24 horas para a separao das fases. Tabela 1 Formao dos SABs
SAB extrato (g) Sol sal (g) Sol Peg (g)

1 2 3

5,66 6,70 7,54

4,57 4,08 3,69

6,24 5,67 5,17

2.2 Determinao dos SABs

da

Composio

Coleta das fases: aps separao das fases, os tubos de centrfuga foram recolhidos.

Neles foram marcadas as alturas correspondentes interface e a superfcie do sistema. Tal marcao ser utilizada para a determinao dos volumes das fases. A fase superior de cada sistema foi coletada com o auxlio de uma seringa, deixandose uma pequena camada de aproximadamente 5 mm acima da interface, para que a interface do sistema no fosse perturbada. A fase inferior foi recolhida de forma semelhante superior, aps cerca de 1 hora, tomando-se cuidado para a seringa no causar nenhuma perturbao na interface do sistema. A suco foi realizada vagarosamente, deixando-se uma pequena quantidade da fase no sistema para evitar que ocorresse suco da fase superior. As alquotas retiradas dos sistemas foram colocadas em recipientes com tampas e mantidos sob refrigerao em freezer (-18 0C) para posterior quantificao. Determinao do volume das fases: os tubos foram lavados e secos, tendo-se o cuidado de no apagar as marcas feitas anteriormente. Em seguida cada tubo foi tarado na balana e foi preenchido com gua destilada at a altura da interface. A massa de gua foi anotada (massa equivalente fase inferior). Depois, tarou-se o tubo, e colocou-se mais gua at atingir o nvel correspondente a superfcie do sistema. Novamente, a massa foi anotada. O volume ocupado por cada regio do tubo foi determinado utilizando-se o valor da densidade da gua tabelado na temperatura da anlise (260C). Determinao das densidades e massas das fases: alquotas das fases, de volumes conhecidos, foram recolhidos e pesados em balana analtica. Com os valores das massas das alquotas e de seus respectivos volumes, foram calculadas as densidades das fases. De posse do valor de densidade de cada fase e do volume total das fazes calculados anteriormente, calculou-se a massa total de cada fase pela frmula da densidade absoluta. Determinao do teor de gua em cada fase: a quantidade de gua presente na amos-

tra foi determinada por meio de evaporao em estufa a 600C, at peso constante, sendo colocados uma alquota de cada fase em cadinhos de cermica previamente tarados e em seguida postos na estufa para evaporao de gua. Em seguida, os cadinhos foram resfriados em dessecador e pesados. A massa perdida nesse processo foi considerada como a massa de gua presente na amostra. Determinao da concentrao de Sais: os cadinhos utilizados para a determinao do teor de gua presente em cada fase, foram levados mufla para calcinao 500oC por 24h. A massa remanescente foi considerada como a massa de sais presentes na amostra. Determinao da concentrao de Peg: Uma vez determinado o teor de gua e sais presentes na amostra, a concentrao de Peg saiu por diferena. Como os sistemas foram produzidos com extrato fermentado, os solutos orgnicos foram indistintamente determinados como polmeros e os inorgnicos como sais. Determinao das tie-lines: a linha de ligao ou tie-line descreve a composio das duas fases em equilbrio e caracterizada por dois parmetros: comprimento da tie-line e sua inclinao. De posse das composies das fases, calculou-se o comprimento das tielines, utilizando-se a Equao 1.
tie line = w1

tagem do sal na fase superior e inferior, respectivamente.

3.

RESUTADOS E DISCUSSO

3.1 Diagramas de equilbrio dos SABs.

A Figura 1 exibe as curvas binodais obtidas para os sistemas ternrios gua/fosfato de potssio/Peg 10000 e extrato de fermentao/fosfato de potssio/ Peg 10000 a 25 0C.
50 . 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 Fos fato de Pots io (w/w) s

BINODA IS
Semextrato C extrato om

PEG 1 0000 (w ) /w

Figura 1- Curvas de equilbrio com extrato e gua As curvas foram plotadas no mesmo grfico para verificar se a presena do extrato fermentado no sistema alteraria seu equilbrio. Observando-se a Figura 1, percebe-se que as curvas binodais obtidas com o extrato e a gua apresentam o mesmo perfil, mas a curva realizada com o extrato fermentado apresenta um pequeno deslocamento para esquerda, significando, portanto, que so necessrias quantidades ligeiramente menores de sal e Peg para se obter um sistema bifsico. Isto ocorre devido ao fato de o extrato fermentado apresentar em sua composio sais e protenas, os quais se somam aos teores de sais e PEG presentes nos SABs.

[(

sup

w1

inf 2

) + (w

sup

w2

1/ 2 inf 2

)]

(1)

Onde wisup e wiinf representam as porcentagens mssicas de cada componente i nas fases superior e inferior respectivamente. Tambm foram determinadas a inclinao das tie-lines, usando a Equao 2.
STL = Ws ,1 Wi ,1 Ws , 2 Wi , 2

(2)

Onde Ws,1 Wi,1 representam a percentagem do Peg na fase superior e inferior, respectivamente, e Ws,2 e Wi,2 representam a percen-

3.2 Caracterizao dos SABs

A Tabela 2 exibe os valores obtidos para o volume das fases e suas respectivas

massas. Tabela 2 Caracterizao fsica das fases

Fase Peg 1 Sal1 Peg2 Sal2 Peg3 Sal3 Volume (ml) 8,76 6,09 8,99 5,86 9,64 5,31 Massa (g) 9,28 7,25 9,61 6,85 10,27 6,12 Densidade (g/ml) 1,06 1,19 1,07 1,17 1,07 1,15

considerao pde ser feita sem prejuzo dos demais valores, uma vez que representam quantidades relativamente pequenas em relao s demais. Tabela 3 Composio das fases
Fase Peg 1 Sal1 Peg2 Sal2 Peg3 Sal3 gua (%) Sal (%) Peg (%) 61,20 3,01 35,79 19,96 6,01 74,03 65,12 3,69 31,19 77,46 17,54 4,99 68,80 4,53 26,67 78,71 15,42 5,87

Os valores dos volumes e massas das fases dos SABs apresentaram valores semelhantes. Tal fato compreensvel, uma vez que as massas das solues mes apresentadas na Tabela 1 para a formao dos SABs, no eram muito diferentes. Alm disso, os sistemas tinham praticamente a mesma massa total. A Figura 2 exibe um dos SABs produzidos.

Com os valores de composio de Peg 1000 e sal (fosfato de potssio) nas fases inferiores e superiores de cada SAB em equilbrio, foram calculados os comprimentos das tie-lines, assim como as suas inclinaes. Os resultados so mostrados na Tabela 4. Tabela 4 Tie-lines e inclinaes
SAB 1 2 3 Tie-line (%) 34,27 29,64 23,44 Inclinao -1,7574 -1,8907 -1,9096

As tie-lines obtidas foram representadas juntamente com a curva de equilbrio construda com extrato em um diagrama ternrio mostrado na Figura 3.

Figura 2 SAB aps separao das fases Na Figura 2, possvel distinguir as duas fases do sistema bifsico: a superior rica em PEG e a inferior, rica em sal. As fases apresentam colorao diferente, um indcio de que substncias presentes no extrato (nica soluo colorida) foram particionadas entre as duas fases, inclusive as protenas presentes. A Tabela 3 exibe a composio das fases. As protenas e demais matrias orgnicas oriundas do extrato foram determinadas como Peg. J os minerais provenientes do extrato, foram includos na determinao dos sais. Tal

Figura 3 Diagrama ternrio, mostrando as tie-lines.

Cada uma das trs tie-lines ou linhas de amarrao exibidas no diagrama da Figura 3, representam a composio de cada um dos SABs produzidos, os quais sero utilizados futuramente para estudos de concentrao de poligalacturonases presentes em extratos fermentados. SABs que apresentavam maiores concentraes de Peg e sal tiveram tie-lines com maiores comprimentos. As inclinaes das tie lines aumentaram medida em que se diminua as concentraes de Peg e sal

*Percentagens mssicas da componente i na fase superior - wisup. *Polietilenoglicol - Peg. *sol - solvente.

6. REFERNCIAS
ALBERTSSON, P. A. Partition of cell particles and macromolecules. WileyInterscience, New York, 346 p., 1986. BERTOLUZZO, M.G., BERTOLUZZO, S. M., RIGATUSO, R., PIC, G. Caracterizacin del Equilibrio Liquido- Liquido en Sistemas Bifasicos Acuosos. Anales AFA vol 17, p 321 324, La Plata 2005. CARVALHO, M. M. Estudo do equilbrio de fases para sistemas aquosos bifsicos compostos por poli(etileno glicol) 6000, sulfato de cobre ou sulfato de zinco e gua, em funo da temperatura. Dissertao de mestrado. UFV, Viosa, Minas gerais, 2007 CASCONE, O.; ANDREWS, B. A.; ASENJO, J. A. Partitioning and Purification of thaumatin in Enzyme Microbiology Technology, v.13, p.629, 1991. Aqueous two-phase system. GAVASANE, M. R.; GAIKAR, V. G. Aqueous two-phase affinity partitioning of Penicillin Enzyme and Microbial Technology, acylase from E. coli in presence of PEG-derivatives. v.32, p. 665-675, 2003. MERCHUK, J. C.; ANDREWS, B. A.; ASENJO, J. A. Aqueous two-phase systems for protein Journal of Chromatography B, v.711, p.285-293, separation . Studies on phase invertion. 1998. SARMENTO, M. J.; PIRES, M. J.; CABRAL, J. M. S.; AIRES-BARROS, M. R. Liquid-liquid extraction of a recombinant protein, cytocromo b5, with aqueous two-phase systems of Journal of Chromatography A, v. 668, polyethylene glycol and potassium phosphate salts. p.117-120, 1994.

4. CONCLUSO
Neste trabalho foram construdos e caracterizados SABs com objetivo da apliclos na concentrao de enzimas presentes em extratos. As curvas binodais produzidas com extrato e com gua no mostraram muitas diferenas entre si. O aspecto visual dos SABs construdos mostrou indcios de que constituintes do extrato foram particionados entre as duas fases, mostrando, portanto que os SABs podem ser aplicados no processo de concentrao de protenas. Com a determinao das composies entre as fases foi possvel construir as tie-lines do sistema bifsico.

5. NOMECLATURA
*Inclinao da tie-line - STL. *Massa do Fosfato de potssio bibsico M1(K2HPO4). *Massa do Fosfato de potssio monobsico M2(KH2PO4). *Percentagem do Peg na fase inferior - Wi,1. *Percentagem do Peg na fase superior - Ws,1. *Percentagem do sal na fase inferior - Wi,2. *Percentagem do sal na fase superior - Ws,2. *Percentagens mssicas da componente i na fase inferior - wiinf.