DESARROLLO DE UNA PRCTICA DE BACTERIOLOGA EN EL LABORATORIO DE UN INSTITUTO DE SECUNDARIA

GALLEGO RUIZ, M Carmen; CARO VERGARA, M Rosa; SALINAS LORENTE, Jess; ORTEGA HERNNDEZ, Nieves; CUELLO GIJN, Francisco; Universidad de Murcia, Departamento de Sanidad Animal, U.D. Microbiologa e Inmunologa. Facultad de Veterinaria. Email M Carmen Gallego Ruiz: cgallego@um.es RESUMEN La mayora del alumnado que opta por la asignatura de Biologa en segundo curso de Bachillerato tiene idea de acceder a un Grado Universitario del grupo de Ciencias de la Salud o, en menor proporcin, a un Ciclo Formativo de Grado Superior de las familias Sanidad o Industrias Alimentarias. En el primer caso es muy probable que tengan como asignatura obligatoria Microbiologa, donde se hace un estudio ms o menos pormenorizado de bacterias, virus y hongos, agentes de enfermedades que afectan a humanos y animales (Grados de Medicina y Veterinaria, respectivamente), responsables de acciones beneficiosas o perjudiciales en los alimentos (Grado de Tecnologa de Alimentos, Grado de Farmacia y Grado de Nutricin Humana y Diettica), como seres vivos que forman parte del ecosistema e integrados en el mismo (Grado de Biologa y Grado de Ciencias Ambientales), o como factoras para fabricacin de enzimas y otras sustancias (Grado de Bioqumica y Grado de Biotecnologa). Por su parte los Ciclos formativos de Tcnico Superior en Laboratorio de Diagnstico Clnico que se cursa en tres Institutos de Educacin Secundaria de la Regin y Tcnico Superior de Industria Alimentaria en dos Centros Integrados de Formacin y Experiencias Agrarias, imparten respectivamente los mdulos de Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgicos (330 horas) y Microbiologa y qumica alimentarias (190 horas). Por ello es conveniente que estos estudiantes tengan, adems de unos conocimientos tericos, habilidades generales en el manejo, observacin e identificacin morfolgica de algunos microorganismos. En la actualidad la Unidad Docente de Microbiologa e Inmunologa de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Murcia realiza puntualmente dos tipos de colaboraciones desinteresadas con sendos Centros de Enseanzas Medias de la Regin. En lo que respecta a la asignatura de Biologa de segundo curso de Bachillerato, un total de 20-25 alumnos del I.E.S. Alquibla (La Alberca), han acudido al laboratorio de Microbiologa de esta Unidad y han realizado una prctica, de dos horas de duracin, sobre tcnicas bsicas de Bacteriologa y Micologa. En cuanto a los Ciclos Formativos, y puesto que el volumen de prcticas es muy alto, la colaboracin consiste en el mantenimiento y control de cepas bacterianas procedentes de la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo para el mdulo Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgicos del Ciclo Tcnico Superior en Laboratorio de Diagnstico Clnico, impartido en el I.E.S. Miguel de Cervantes (Murcia). A principio de cada curso acadmico, las distintas cepas potencialmente patgenas se reconstituyen, se controlan asegurndose que no est contaminadas y se envan al Centro de Secundaria en condiciones de bioseguridad adecuadas para que el alumnado haga las prcticas programadas a lo largo del curso. Igualmente se les provee de preparaciones fijadas de microorganismos patgenos y se les asesora a la hora de poner en marcha tcnicas microbiolgicas.

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En ambos casos existe un claro beneficio acadmico por parte del Centro de Secundaria. El estudiante de Bachillerato adems de manipular por primera vez bacterias y hongos en un laboratorio de Microbiologa, toma conciencia de la importancia de la seguridad en el trabajo de laboratorio ante la advertencia de la relativa peligrosidad del material vivo con el que est trabajando, descubre esos seres vivos que precisan microscopio para ser observados, se interesa por las enfermedades y/o beneficios que pueden producir El estudiante de Ciclos Formativos Superiores, por su parte, dispone de una batera de bacterias patgenas con las que se va a encontrar en un futuro profesional y cuyo mantenimiento y conservacin resultara difcil y costoso en el laboratorio del Centro en el que estudian. En cuanto a esta segunda colaboracin no slo pretendemos continuarla sino que tambin podra establecerse con los otros dos Centros que imparten el mismo Mdulo. Sera deseable que todos los estudiantes de la asignatura de Biologa de segundo de Bachillerato de la Regin de Murcia, realizasen esta prctica en alguno de los laboratorios de Microbiologa de la Universidad de Murcia o Politcnica de Cartagena. Dado que es materialmente imposible, ya que supone suspender las prcticas regladas de nuestros alumnos y una dedicacin docente extra de la que no disponemos, disearemos una prctica de bacteriologa utilizando bacterias inocuas y material de laboratorio bsico o sustitutos que no supongan para el Centro un desembolso econmico insostenible. De esta manera salvamos tres obstculos, que probablemente son los que estn impidiendo el desarrollo de la prctica: el primero, y ms importante, la seguridad de alumnos y profesores, pues la utilizacin de material no necesita infraestructura complicada y sin embargo el resultado es el mismo o parecido al que obtienen trabajando con bacterias patgenas, el segundo la igualdad de oportunidades con posibilidad de que el 100% de los alumnos reciban esta enseanza y por ltimo no supondra ningn desembolso econmico. No obstante, y para el cumplimiento de alguno de los objetivos, es interesante que el alumno tome conciencia desde el primer momento de que, a pesar de estar trabajando con bacterias que en teora no producen enfermedad y con materiales que pueden parecer rudimentarios, es necesario rigurosidad y seriedad en el desarrollo de todas las tcnicas, hacindole ver que estn trabajando con seres vivos y una dosis alta del microorganismo o un estado inmunodeprimido del manipulador, podra ser un factor favorable para las bacterias. Unas nociones tericas en el aula sobre las normas de seguridad, reciclado de productos y desechos, uso de material de laboratorio y planteamiento experimental, suponen una buena prctica para el trabajo en los laboratorios de todas las asignaturas de Ciencias (Fsica, Qumica y Biologa) por lo que constituye un tema transversal a tratar conjuntamente por los departamentos implicados. Las partes de que constar esta prctica que se realizar a lo largo de dos sesiones de una hora cada una con el fin de no alterar el horario del resto de asignaturas, son: Material de uso frecuente en el laboratorio de Bacteriologa. Tcnicas de esterilizacin. Medios de cultivo. Tcnicas de siembra. Crecimiento bacteriano. Tincin de bacterias. Tincin simple. Observacin al microscopio de formas bacterianas.

El tamao de grupo de alumnos depender de la infraestructura del laboratorio, pero es recomendable que la relacin profesor alumno no sea inferior a 1/10.

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1. OBJETIVOS QUE SE PRETENDEN ALCANZAR: Conocer y poner en prctica las normas de seguridad en el trabajo en un laboratorio, especialmente en el laboratorio de Bacteriologa donde se trabaja con agentes potencialmente patgenos. Se les indicar la obligatoriedad del uso de bata, no ingerir ningn tipo de alimento ni agua a lo largo de la prctica, trabajar cerca de la llama del mechero y de avisar inmediatamente al profesor en caso de derramar algn cultivo o de algn otro accidente. Familiarizarse con el material que se precisa para el manejo de bacterias, las caractersticas derivadas de su uso y la necesidad de trabajar en condiciones estriles no slo para el cumplimiento del primer objetivo sino tambin para conseguir cultivos puros y que no se contaminen con bacterias u hongos del recinto. Conocimiento de las principales tcnicas de esterilizacin del material. Elaboracin de un medio de cultivo con todas las condiciones que debe reunir de esterilidad y composicin qumica equilibrada para que las bacterias puedan multiplicarse. Adquirir destreza en la siembra de las bacterias, cerca de la llama del mechero y con mximo cuidado, haciendo ver al alumno que desconoce el grado de patogenicidad de las bacterias que hay en la muestra y, por tanto, debe trabajar extremando las precauciones al mximo. Observacin macroscpica del crecimiento bacteriano. El alumno debe relacionar las alteraciones que est produciendo esa poblacin bacteriana en el medio de cultivo, consecuencia del crecimiento, con el deterioro que puede ocasionar en un alimento o las lesiones en el tejido de un rgano y por tanto desarrollo de una enfermedad. Observacin microscpica de bacterias previa tincin simple e identificacin de formas y agrupaciones bacterianas. Conocer como se debe eliminar todo el material del laboratorio de Bacteriologa. Se le informar al alumno que, incluso cuando se utiliza material de un solo uso, es obligatorio someterlo a esterilizacin para no contaminar el medio ambiente o para no provocar la diseminacin de microorganismos potencialmente causantes de enfermedades. El material no contaminado o con bacterias muertas como los portas se puede lavar directamente o tirar al reciclado de vidrio si ya estn demasiado deteriorados.

2. DESARROLLO DE LA PRCTICA 2.1. Actividades previas El alumno recibir breves instrucciones en el aula, previas a la realizacin de las sesiones en el laboratorio: Elaboracin en casa un medio de cultivo con el fin de que sea utilizado en una prctica de bacteriologa. En grupos de dos o tres fabricarn un caldo o medio lquido mediante disolucin de 2 g/200ml de agua destilada de una pastilla de caldo de pollo. El volumen total de caldo, una vez disuelto al calor, se distribuye en dos frascos de vidrio
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que se puedan cerrar hermticamente, y a uno de ellos se le aadir la proporcin adecuada de agar-agar para la fabricacin del medio slido. El agar-agar se puede adquirir en supermercados de comida china y se puede sustituir por gelatina sin sabor. Ambos frascos cerrados se esterilizarn en un autoclave casero consistente en una olla a presin con agua cubierta por la rejilla que se utiliza para cocinar al vapor y sobre la que se colocarn los frascos. El tiempo de esterilizacin ser de 30 minutos. Tras su enfriamiento se guardar en el frigorfico para su conservacin el da de la prctica. Puede sustituirse la pastilla de caldo por caldo de pollo en envase tetrabrik que est a la venta ya estril, con la ventaja de que se puede utilizar directamente previa distribucin en los tubos de vidrio como se muestra en el apartado 2.2. Toma de una muestra de tierra del suelo en frasco de vidrio con cucharilla de postre. Es conveniente que, tanto la cucharilla envuelta en papel de aluminio, como el frasco tapado, lo esterilicen al mismo tiempo que los medios de cultivo para que el alumno sea consciente de la importancia de que la toma de muestras sea en condiciones estriles, con el fin de que las bacterias que despus sembremos y observemos sean las que tiene la muestra y no las que contaminan el material. Tambin se les encargar la compra de un yogurt por grupo para la observacin de bacterias tiles en alimentacin. Se les informar asimismo de las fechas en que se desarrollar la prctica y la obligatoriedad del uso de bata en el laboratorio.

Figura 1: Esterilizacin de medios y material.

Figura 2: Toma de muestra de tierra.

2.2. Primera sesin de laboratorio: Material de uso frecuente en el laboratorio de Bacteriologa. Tcnicas de esterilizacin: puesto que conocen el material de vidrio que se utiliza en el laboratorio (pipetas, matraces, probetas, placas de Petri) slo ser necesario indicarles que, al igual que han esterilizado su material para la toma de muestras, hay que esterilizar los recipientes para dispensar el medio de cultivo en autoclave. Se les explicarn los mtodos de esterilizacin mediante calor seco (horno y mechero), calor hmedo (autoclave) y filtracin para lquidos sensibles. Medios de cultivo: se observarn caractersticas macroscpicas de los medios elaborados por cada grupo. Es posible que alguno est contaminado porque el tratamiento trmico en casa no ha sido suficiente y/o no los han conservado en frigorfico. Cualquier percance como este debemos aprovechar para hacerles ver la importancia del trabajo riguroso. Estos medios no podrn ser utilizados puesto que en ellos ya han crecido otras bacterias diferentes a las que pretendamos sembrar. A cada grupo se le dar un tubo y placa de

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Petri estril. El profesor puede encargar a un grupo que se responsabilice de sacar el material del Centro y esterilizarlo para todos los compaeros (tubos, placas y pipetas debidamente tapados). El medio slido se pondr a licuar colocando los frascos de todos los grupos en Bao de Mara a ebullicin. Los caldos se dispensarn, entre 5-7 ml en tubos estriles tanto si proceden del caldo esterilizado en casa como el comprado ya estril en tetrabrik. En cualquier caso es necesario realizar el proceso cerca del mechero para evitar contaminaciones.

Figuras 3 y 4: Licuacin del medio slido y disposicin del material estril.

Figuras 5, 6 y 7: Distribucin de los medios en placas y tubos cerca de la llama del mechero.

Tcnicas de siembra: se sembrar una pequea porcin de tierra en los tubos de caldo con pinzas, y el yogurt zigzagueando con asa de siembra sobre toda la superficie del medio solidificado. Si no se dispone de asa o aguja de siembra puede utilizarse una de fabricacin casera consistente en un clip, enderezado y sujeto a un mango metlico. Todas las siembras se realizan cerca de la llama del mechero y esterilizando en la llama del mismo el asa o pinzas antes y despus de la siembra. Los cultivos pueden incubarse a temperatura ambiente si no se dispone de estufa.

Figuras 8, 9 y 10: Siembras de muestras de tierra en caldo y yogurt en medio slido.

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2.3. Segunda sesin de laboratorio: Crecimiento bacteriano: tras 24 h de incubacin a 37C a temperatura ambiente, segn se disponga de estufa de incubacin o no, se observa macroscpicamente el crecimiento bacteriano. En los caldos deber aparecer un enturbiamiento, a veces burbujas por desprendimiento de CO2 procedente del metabolismo fermentativo, velo en la parte superior, sedimento ms o menos blanquecino son caractersticas interesantes para la investigacin en caso de que el cultivo fuese puro, es decir slo con una especie bacteriana. En los medios slidos el crecimiento macroscpico se manifiesta por la formacin de colonias cuyas caractersticas en cuanto a forma, color, apariencia son tambin importantes. Preparacin de las muestras previa a la tincin: para la observacin al microscopio es necesario teir las bacterias y tener un microscopio con objetivo de inmersin. Los pasos previos a la tincin deben hacerse correctamente sin olvidar que el tamao de las bacterias, pocos micrmetros, no permite una visualizacin como la de otros organismos microscpicos como protozoos. Como material para teir el alumno puede tomar de los cultivos en caldo, de las colonias del medio slido o directamente del yogur. Cerca de la llama del mechero se tomar la muestra con aguja o asa de siembra y se extender sobre la superficie de un porta limpio, esterilizando el aguja o asa antes y despus del proceso. La preparacin se fijar pasando el porta sobre la llama del mechero con cuidado de no superar una temperatura no soportable por el dorso de nuestra propia mano. La fijacin concluye cuando queda, en la superficie del porta, una mancha blanquecina sin restos de lquido. En ese momento las bacterias adheridas al vidrio estn muertas, se apaga el mechero y se procede a la tincin.

Figuras 11 y 12: Extensin de la muestra sobre el porta y fijacin por calor.

Tincin de bacterias: puesto que la finalidad de la prctica es el manejo del material propio del laboratorio de bacteriologa y la observacin morfolgica de las bacterias al microscopio ptico, nicamente se realizar una tincin simple, es decir con un nico colorante. Indicamos la manera correcta de elaborar azul de metileno, el ms utilizado en esta tincin, aunque se puede utilizar, no obteniendo tan buenos resultados, una solucin acuosa de tinte de ropa, comprado en drogueras, al 1%. a) Solucin madre: Azul de metileno..10 g Etanol 96100 ml (filtrar y guardar en frasco oscuro) b) Solucin hija: Solucin madre..10 ml cido fnico.5 g Agua destilada100 ml

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Figuras 13, 14 y 15: Material de tincin, tincin y preparacin con aceite de cedro sobre la platina del microscopio.

La preparacin se cubre con la solucin hija de azul de metileno o el colorante fabricado y se deja actuar 3-5 minutos. Para dejar el porta durante la tincin, se fabricarn previamente unas paralelas de vidrio enlazadas con dos tubos de silicona y colocadas sobre un recipiente, en cuyo interior caen los restos de colorante y lavado, tal como se muestra en las Figuras 13 y 14. Pasado el tiempo de tincin, el porta se lava con agua y se seca suavemente con papel y al aire. Para la observacin con objetivo de inmersin (100x) es necesario colocar una gota de aceite de cedro sobre la preparacin fijada y teida. Observacin al microscopio de formas bacterianas: para enfocar la preparacin y visualizar con un mximo contraste se abre el diafragma y se sube el condensador del microscopio lo ms alto posible. Una vez enfocada la preparacin el alumno puede observar distintas formas bacterianas teidas de azul, o del color del tinte utilizado, y, particularmente en la preparacin procedente de la muestra de suelo, aparecern unas formas ovales sin teir denominado endosporo, o esporo. En esta preparacin podrn apreciar cocos (formas esfricas), estafilococos (cocos agrupados en racimos), estreptococos (cocos agrupados en cadena), bacilos (formas alargadas) y cocobacilos (formas intermedias). En el caso de la preparacin realizada a partir del yogurt podr observar estreptococos (cocos agrupados en cadena) y bacilos que constituyen la microbiota de este alimento fruto de la fermentacin de la lactosa de la leche por parte de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus.

Estafilococos

Bacilos con endospora

Bacilos en cadena (estreptobacilos)

Cocobacilos

Estreptococos

Figuras 16, 17, 18, 19 y 20: Observacin al microscopio ptico de distintas formas y agrupaciones bacterianas.

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3. ACTIVIDADES POSTERIORES A LA REALIZACIN DE LA PRCTICA: Una vez terminadas las dos sesiones del laboratorio, es importante concienciar al alumno de que el material utilizado para la prctica de bacteriologa no debe tirarse al cubo de basura. Si bien es verdad que este material, en teora, no es patgeno, es necesario tratarlo como si lo fuese y someterlo de nuevo a esterilizacin antes de tirar los cultivos y limpiar el material. Cada grupo llevar a casa los recipientes correspondientes, los esterilizar por el mismo procedimiento seguido para preparar el material y lo limpiar o reciclar en el contenedor adecuado. En el aula se establecer un debate en el que se establecern relaciones entre bacterias que transforman un alimento en otro (fermentaciones lcticas), bacterias que producen alteraciones o se multiplican en los alimentos produciendo toxiinfecciones alimentarias tras su consumo (salmonelosis) y bacterias productoras de algunas enfermedades en hombre. Es preciso que el alumno tome conciencia de la utilidad de la prctica que ha realizado, para produccin a gran escala de microorganismos utilizados en industria alimentaria y diagnstico de enfermedades infecciosas. Al final de esta sesin de presentacin y discusin de los resultados, el profesor entregar un cuestionario para que los alumnos lo respondan y puedan ser calificados. Adems se tendr en cuenta el grado de participacin e implicacin en el desarrollo de la prctica.

4. REFERENCIAS [1] CUELLO GIJN, F.; GALLEGO RUIZ, M.C.; CARO VERGARA, M.R.; SALINAS LORENTE, J.; BUENDA MARN, A.J.; DEL RO ALONSO, L. Microbiologa e Inmunologa: Manual de prcticas. Diego Marn Ed., Murcia. 2000. GAMAZO, C.; LPEZ-GOI, I.; DAZ, R. Manual prctico de Microbiologa. 3 ed. Masson, Barcelona. 2005. GRANADOS PREZ, R.; VILLAVERDE PERIS, M.C. Microbiologa: Bacteriologa. Medios de cultivo y pruebas bioqumicas. Micologa general. Parasitologa general. Paraninfo, Madrid. 1997. SIMEON CEBOLLA, S.A.; COLLADO BELDA, E.F. Prcticas de Microbiologa. Editorial Ecir, S.A., Valencia. 1997.

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