CUESTIONES SOBRE LAS PRCTICAS

1. Comparar el mtodo de mutagnesis por PCR con el utilizado. Cules son las principales diferencias entre los dos mtodos? En la mutagnesis por PCR se incorpora una mutacin mediante el uso de 4 oligonucletidos distintos, 2 terminales y 2 internos que incluyen la mutacin. Adems, durante el proceso es necesario realizar tres PCRs hasta obtener la secuencia mutada final. Sin embargo, en el mtodo utilizado en prcticas, la mutagnesis por Quick Change, slo es necesario el uso de 2 oligonucletidos, ambos internos, y slo hay que realizar una PCR, por lo que se acortan los tiempos. Otra diferencia es que en el primer caso, las polimerasas que se emplean son las Taq, mientras que en el quick change se usan polimerasas Pfu o Phusion que tienen menor tasa de error, por lo que se introducen menos mutaciones, y por tanto mayor rendimiento. 2. Qu inters puede tener la modificacin mediante mutagnesis de una protena? Al modificar la estructura de una protena, estamos modificando su funcin, lo que nos permite controlar su actividad, mediante la modificacin del sitio activo; o su expresin, mediante la modificacin del promotor; o su estabilidad. 3. Localiza la(s) zona(s) de la secuencia del gen ms adecuada(s) para modificar la protena MBP-LacZ mediante mutagnesis dirigida. Explica las diferentes estrategias que se pueden utilizar para inactivar la protena y razona la respuesta en funcin del tipo de mutacin. La zona de la secuencia del gen ms apropiada para realizar la mutacin es aquella que se expresa en la protena uniendo varias subunidades. En nuestro caso, durante el seminario, se observo que esta zona se corresponda con la arginina 13 y el asprtico 15, ya que eran necesarios para que se produjera la -complementacion. Para inactivar la protena se podran seguir varias estrategias: - Inactivacin por sustitucin en algn codn que codifique para un aminocido imprescindible de la conformacin proteica. Se podra modificar una de las argininas (bsica) de la secuencia RRD de la subunidad por un aminoacido que sea apolar o cido, de tal modo que no se podran formar puentes de hidrgeno con el asprtico. - Modificar un codn STOP para que pase a ser codificante. El resultado es una protena ms larga. - Modificar un codn codificante por un codn STOP. Se obtiene una secuencia aminoacdica ms corta. La protena que se obtendra no tendra actividad por no ser funcional. - Cambiar el marco de lectura. Mediante la insercin o deleccin de uno o dos nucletidos. 4. Disea los oligonucletidos adecuados para poder hacer la mutagnesis dirigida en el sitio elegido en la cuestin anterior (en un sitio diferente al

que se lleva a cabo en el laboratorio) por el mtodo quick change.

5. Identifica las regiones a digerir en los plsmidos pMalc2x y pUCTcKm para poder insertar el casete de Km dentro del gen malE-LacZ. La enzima de restriccin seleccionada para realizar las digestiones fue la PstI. Para obtener el gen de resistencia a kanamicina, se digiri el plsmido pUCT: La digestin del plsmido pMal-c2X con la misma enzima tiene lugar a la altura del gen malE, pero en este caso slo corta el plsmido en un punto, de forma que los extremos formados coincidan con los del gen de resistencia a kanamicina obtenido en la digestin de pUCT. El resultado final tras la insercin del casete de resistencia a kanamicina seria el siguiente: 5 CTGCAG.KmR.CTGCAG 3 GACGTC.KmR.....GACGTC 6. Predice la secuencia de la protena que se obtendr tras la introduccin del inserto. qu ocurre con la expresin del gen malE-lacZ? Como ambos plsmidos se cortaron con la misma endonucleasa de restriccin, y por lo tanto sus extremos son compatibles, el gen de resistencia a la kanamicina ha podido insertarse en los dos posibles sentidos. Independientemente, en cualquiera de los casos, su insercin provoca un desplazamiento del marco de lectura del gen MalE, que provoca la aparicin de un codn Stop temprano que hace que la protena obtenida no sea funcional. - Insercin en Orientacin 1, comprobada con los oligos MalEF y Km2R. Se obtiene un fragmento de 419 aminocidos, es decir, de aproximadamente unos 46,1 KDa. - Insercin en Orientacin 2. Se comprueba con los oligos MalEF y Km2. Se obtiene un fragmento de 408 aminocidos y un peso de 44,88 KDa. 7. Disea un experimento (incluyendo la secuencia de los oligonucletidos necesarios) para determinar la orientacin del casete de Km dentro del gen malE-LacZ. Utiliza unos oligonucletidos diferentes a los utilizados en las prcticas.

8. Cual sera la estrategia a seguir si quisieras que el gen de resistencia a Km se introdujese dentro del marco de lectura del gen malE-LacZ?. Describe el mtodo a utilizar incluyendo, si procede, el diseo de oligonucletidos, esquematiza el proceso de forma detallada y muestra la secuencia de nucletidos de la regin correspondiente del plsmido as como la de aminocidos de la protena antes y despus. Detalla cada uno de los pasos a seguir.

9. Tras la reaccin en el termociclador por qu es necesario digerir con la enzima Dpn I en el caso de la mutagnesis por el mtodo quick change? Para digerir el DNA molde y dejar solo el plsmido mutado. Esto ocurre porque las enzimas Dpn I digieren exclusivamente el DNA metilado en GAmTC, y estas metilaciones se encuentran en el sistema Dam de la estirpe DH5, pero no en el plsmido. 10. Crees que la mutacin introducida es la nica que puede tener lugar al llevar a cabo la reaccin en el termociclador?Cmo podras comprobarlo? La mutacin que nosotros incluimos es especifica para un sitio elegido. Puede ser posible que se introduzcan otras mutaciones, debido a la tasa de error de las polimerasas. Para comprobar las mutaciones producidas se tendra que realizar una secuenciacin del ADN. 11. Haz un esquema que explique como afectan las mutaciones introducidas a la capacidad de metabolizar lactosa en nuestro sistema. Partimos de la estirpe DH5 que tiene una mutacin en su gen lacZ, de manera que la B-Galactosidasa que producen no es funcional, por lo que no puede metabolizar la lactosa. El vector pMalc2x contiene el gen MalElacZalpha, que permite 12. Se podra comprobar la eficacia de la mutagnesis llevada a cabo en el gen malE-lacZ en cualquier cepa de E. coli? No. Nuestro experimento se ha basado en que el gen malE-lacZ es capaz de -complementar al gen lacZ de DH5 y as aprovechar la lactosa del medio, lo que hace que si en el medio hay XGal, aparezcan colonias teidas de azul. Si partimos de colonias con el gen lacZ sin deficiencias no seremos capaces de realizar la seleccin, ya que desde el principio produciran este color. As pues solo se podra comprobar la eficacia del procedimiento en cepas con el gen para la B-Galactosidasa mutado.