Cromatografa

Objetivos: Separar componentes qumicos de una sustancia para determinar las cantidades de dichos componentes. Introduccin: La cromatografa es una tcnica efectiva muy verstil que se aplica para la separacin, deteccin y cuantificacin de una amplia variedad de sustancias coloreadas e incoloras como: gases, iones inorgnicos, aminocidos, azcares, lpidos, drogas, esteroides, protenas, polisacridos, cidos nucleicos, etc. La cromatografa es un trmino general aplicado a una amplia variedad de tcnicas de separacin basadas en el fraccionamiento de una muestra entre una fase mvil, que puede ser un gas o un lquido y una fase estacionaria que puede ser un lquido o un slido. FASE MVIL + FASE ESTACIONARIA + MUESTRA = SISTEMA CROMATOGRFICO El mtodo consiste en depositar la muestra a analizar o separar, en un lugar de la fase estacionaria (siembra o punteo). El flujo de la fase mvil sobre el sorbente se denomina desarrollo. Luego que las sustancias han sido separadas sobre la fase estacionaria pueden ser detectadas o visualizadas como zonas que constituyen el cromatograma. TIPOS DE CROMATOGRAFA Segn el fenmeno fsico y el estado fsico de las fases que intervienen existen: Cromatografa de Absorcin Cuando la fase estacionaria es un slido la separacin o desplazamiento de las sustancias depende del equilibrio adsorcin desorcin. Para que dos o ms sustancias de una mezcla se separen por cromatografa intervienen varios factores: estructura qumica, solubilidad en el solvente, etc. Cromatografa de Particin El adsorbente o fase estacionaria es lquido que es muy poco miscible con la fase mvil. Cromatografa de Intercambio Inico Se lleva a cabo con capas delgadas de columnas rellenas con resinas. Esta tcnica depende del intercambio de iones entre la fase mvil y los iones de la fase estacionaria. La fase estacionaria es un slido insoluble el cual puede intercambiar reversiblemente cationes y aniones con una solucin. Una mezcla de iones es sorbida en la fase estacionaria y desarrollada con una fase mvil inica, los iones son atrados mediante fuerzas electrostticas. Hay dos tipos de resinas de intercambio inico: catinicas y aninicas.

TCNICAS DE CROMATOGRAFA Cromatografa en Columna En este tipo de cromatografa se aplica una capa uniforme de adsorbente inerte, ejemplo slica o almina sobre una placa o soporte de vidrio, aluminio o plstico y se seca en condiciones estndar (activacin de la placa). La muestra en solucin se aplica en un solvente voltil como una pequea mancha cerca de un borde de la placa, luego el solvente es el eliminado dirigiendo una corriente de aire caliente sobre la mancha. Luego seca se coloca la placa dentro de una cuba adecuada (cuba de desarrollo) con el borde inferior sumergido en la fase mvil seleccionada. El nivel del solvente dentro de la cuba de desarrollo debe estar por debajo de la zona donde se aplic la muestra. La fase mvil ascender por capilaridad resolviendo la mezcla. Al final se retira la placa, se marca el frente del solvente, se lleva la placa para evaporar el solvente y luego se localiza e identifican las manchas. Cromatografa en Papel En cuanto a su operacin es muy similar. La fase estacionaria es una capa de agua sobre las fibras de papel. El procedimiento general consiste en colocar una gota de solucin de la mezcla a separar cerca del borde inferior de una hoja o una tira de papel filtro (Watman N1). Cuando la mancha est seca el papel se coloca en un recipiente adecuado (cuba de desarrollo). Se tapa. El papel debe estar sumergido en el solvente o fase mvil pero sin tocar la zona donde se aplic la muestra. El desarrollo puede ser ascendente o descendente. Por capilaridad, la fase mvil se desplazar a lo largo del appel y desplazar a los componentes de la mezcla. Los componentes de la mezcla que son separados pueden ser detectados por varios mtodos fsicos o qumicos, dependiendo de la naturaleza de la sustancia. Rf = relacin entre la distancia de la muestra sobre la distancia de migracin del solvente Rf= Frente de la muestra / Frente del solvente

Materiales y Mtodos
Silicagel placas Etanol NaOH 5% Rojo Fenol Bencina Metanol Acetona Hojas de espinaca

Anaranjado de Metilo Rojo de Metilo Cristal Violeta Almina Tiras de papel Watman N1

Probetas o tubos de 20mm dimetro

PARTE EXPERIMENTAL A. Cromatografa en Capa Fina

1. A partir de un cromatofolio (Placa de Slica-gel) de aluminio o plstico, cortamos una tira de 1.5x9.0cm. Trazamos con un lpiz de mina, una lnea a 1cm de distancia de los extremos de la tira.

Fase Estacionaria Cortamos un pedazo del papel Watman N1; trazamos con lpiz una lnea en la parte superior e inferior.

2. Trituramos en un mortero 5-8g de hojas de espinaca con etanol suficiente para obtener 0.5ml. de extracto de lquido. Filtramos el extracto.

En un mortero trituramos hojas de espinaca con etanol, luego filtramos el extracto.

3. Preparamos el solvente de desarrollo (Fase Mvil) benceno-acetona 4.5:0.5. 4. Colocamos en un cuba cmara de desarrollo 2 a 5ml. del solvente preparado en el paso anterior y tapamos.

Fase Mvil
En un cromatofolio colocamos aproximadamente 10ml. de bencina.

BENCINA

5. Aspiramos con un capilar 0.5cm. del filtrado del extracto y depositamos una gota del mismo por encima de la lnea del lpiz en un extremo de la tira de slica gel (sembrar) y secamos la mancha con una fuente de calor.

El capilar lo exponemos al mechero para poder obtener un extremo filudo lo cual facilita la absorcin.

Aspiramos el extracto de espinaca con el capilar.

6. Repetimos el paso anterior depositando una segunda gota de extracto sobre la primera, secamos nuevamente y repetimos con una tercera gota de extracto si es necesario.

7. Colocamos la tira en la cmara de desarrollo en forma vertical. Cuidamos que el solvente no toque la mancha de siembra.

8. Observamos el desarrollo del cromatograma, cuando el frente del solvente que asciende llegue a la lnea del lpiz en el extremo superior, retiramos la tira y secamos inmediatamente.

Colocamos la tira de papel Watman N1 dentro del cromatofolio en forma vertical. Luego retiramos el papel cuando el disolvente llegue hasta la lnea del lpiz en la parte superior, la cual ascendi por capilaridad.

9. Marcamos con lpiz la ubicacin de las manchas observadas bajo luz visible y a la luz ultravioleta. Calculamos los Rf.

Frente del Solvente

Marcamos con lpiz la ubicacin de las manchas observadas bajo luz visible. Calculamos los Rf.

Punto de Siembra

CLCULOS DEL Rf

4.1cm 1.4cm

8.7cm

1.5cm

Rf1 Rf1 = 1.4/8.7 Rf1 = 0.16 Rf3

Rf2 Rf2 = 1.5/8.7 Rf2 = 0.17

Rf3 = 4.1/8.7 Rf3 = 0.47

El valor de Rf1 y Rf2 corresponden a la Clorofila A; y el valor de Rf3 corresponde a la Xantofila.

CUESTIONARIO

1.

Caractersticas

Silica Gel: El gel de slice, tambin conocido como Silicagel, es un producto absorbente, catalogado como el de mayor capacidad de absorcin de los que se conocen actualmente. Es una sustancia qumica de aspecto cristalino, porosa, inerte, no txica e inodora, de frmula qumica molecular SiO2 nH2 O, insoluble en agua ni en cualquier otro solvente, qumicamente estable, slo reacciona con el cido fluorhdrico y el

lcali.

Bajo diferentes mtodos de fabricacin, se consiguen diferentes tipos de gel de slice con diversas estructuras del poro, pudiendo llegar algunos a absorber hasta un 40% de su propio peso en agua. Gracias a su composicin qumica nica y a su estructura fsica, el gel de slice posee unas caractersticas incomparables con otros materiales similares, por ejemplo la alta absorcin, funcionamiento termal estable, caracterstica fsica estable, fuerza mecnica relativamente alta, etc... Segn el dimetro del poro se categoriza el gel de slice como de poro fino o macro poroso, cada uno de ellos con una capacidad diferente de absorcin en funcin de la humedad relativa, por lo que la eleccin del tipo debe ajustarse segn las condiciones de utilizacin. El gel de slice tambin puede diferenciar la adsorcin de diferentes molculas actuando como un absorbente selectivo. Es un producto que se puede regenerar, una vez saturado si se somete a una temperatura de entre 120-180 C(el gel de slice azul no debe pasar de 120 C) desprender la humedad que haya absorbido por lo que puede reutilizarse una y otra vez sin que ello afecte a la capacidad de absorcin, sta solo se ver afectada por los contaminantes que posea el fluido absorbido.

Rf:

Frente de Solvente:

La mxima altura (h) alcanzada por el disolvente en su avance, se denomina frente del disolvente, y sea dA la distancia recorrida por la sustancia A. Se define Rf como el cociente entre la distancia recorrida por una sustancia desde el origen (d) y la distancia del origen al frente del disolvente (h). Para la sustancia A: RfA = dA/h

El valor mximo que puede tener el Rf es 1, aunque a veces se multiplica por 100 para expresarlo como porcentaje. El Rf es una cifra til porque es constante cuando se reproduce el experimento en todas las condiciones y es tan caracterstico y descriptivo de un compuesto como puede serlo el punto de fusin. Por supuesto, el Rf de un compuesto dado ser diferente para distintos disolventes, pero ello constituye una ventaja, puesto que as es posible caracterizar a un compuesto ms especficamente registrando sus Rfs en varios disolventes. Algunos factores que afectan al Rf son: el grado de pureza del adsorbente, la concentracin del ambiente de la cmara y la temperatura. Eluyente:

Revelador:

2.

Clorofila de pigmentos que se encuentran en (plantas, algas) y algunosprocariotas: y prpuras), las cuales no poseen encuentran en Sistemas de membrana se encuentran en el dominio eubacteria y

Definicin : Las clorofilas son un grupo diversos eucariotas que poseen cloroplastos bacterias (cianobacterias, bacterias verdes cloroplastos, por lo tanto, sus pigmentos se Internos: (Vesculas, Lamelas, Cromatforos) y eucarya.

Tipos: Las distintas formas de la clorofila se distribuyen desigualmente en la diversidad de los fotosintetizadores oxignicos. La tabla siguiente presenta las diferentes formas de la clorofila y resumen su distribucin sistemtica.

Clorofila a Clorofila b

Clorofila c1

Clorofila c2

Clorofila d

Frmula C55H72O5N4 C55H70O6N4Mg emprica Mg

C35H30O5N4Mg

C35H28O5N4Mg

C54H70O6N4 Mg

Grupo C3

-CH=CH2

-CH=CH2

-CH=CH2

-CH=CH2

-CHO

Grupo C7

-CH3

-CHO

-CH3

-CH3

-CH3

Grupo C8

-CH2CH3

-CH2CH3

-CH2CH3

-CH=CH2

-CH2CH3

Grupo C17

-CH2CH2COOCH2CH2CO -CH=CHCOOH Fitil O-Fitil

-CH=CHCOOH

CH2CH2CO O-Phytyl

Enlace C17C18

Simple

Simple

Doble

Doble

Simple

Distribuc Universal in

Sobre Cromoalveolados y Cromoalveolados y Algn alga todo Plantae y a algas rojas (2) algas rojas (2) roja(3) lgas verdes (1)

1. La clorofila a se encuentra en todos los casos, vinculada al centro activo de los complejos moleculares, llamados fotosistemas, que absorben la luz durante la fotosntesis, difiere de la clorofila b en que el radical de la posicin 3 del grupo tetrapirrlico es -CH3(metilo) en lugar de -CHO (grupo funcional de los aldehdos). 2. La clorofila b caracteriza a los plastos de las algas verdes y de sus descendientes las plantas terrestres (reino Plantae). Esos plastos, y los organismos que los portan, son de color verde. Tambin se encuentran plastos verdes en algunos grupos de protistas que han asimilado algas verdes unicelulares endosimbiontes adquiriendo as plastos secundarios. Podemos citar a las euglenas, a los cloraracnifitos y a algunos dinoflagelados, como Gymnodinium viride. Tambin se encuentra en algunas cianobacterias (lascloroxibacterias), que por ello son de color verde planta en vez de azuladas; hace algn tiempo se les atribuy por este rasgo el carcter de antepasados de los plastos verdes, pero luego se ha comprobado que es un carcter adquirido independientemente en varias lneas separadas. 3. Las clorofilas c1 y c2 son caractersticas de un extenso y diverso clado de protistas que coincide ms o menos con el superfiloChromista y que incluye grupos tan importantes como las algas pardas, las diatomeas o los haptfitos. 4. La clorofila d slo se ha conocido durante decenios por una observacin aislada y no repetida en un alga roja. Luego se ha encontrado en una cianobacteria (Acaryochloris marina), que parece especialmente apta para explotar luz roja cuando crece bajo ciertas ascidias. No debe en todo caso interpretarse de la tabla que su presencia es una caracterstica comn de las algas rojas. Tambin se encuentran clorofilas en animales que albergan dentro de sus clulas o entre ellas algas unicelulares (zooclorelas y zooxantelas). Gracias a esta simbiosis la fotosntesis contribuye de manera significativa a la nutricin de corales, tridacnas, nudibranquios y otros animales marinos. No todos los organismos fotosintetizadores tienen clorofilas. Las bacterias que no son cianobacterias tienen pigmentos muy distintos llamados bacterioclorofilas. Estructura: La estructura de la molculas de clorofila tiene dos partes: un anillo de porfirina (sustituida con pequeos grupos enlazados,sustituyentes) y una cadena larga llamada fitol. es un tetrapirrol, con cuatro anillos pentagonales de pirrol enlazados para

formar un anillo mayor que es la porfirina. La hemoglobina de la sangre y otras protenas contienen tambin una porfirina, que en ese otro caso constituye lo principal de un grupo 'hemo'; y tambin se encuentra porfirina en la estructura de la vitamina B12. El grupo hemo contiene un tomo de hierro (Fe); la porfirina de la clorofila lleva en lugar equivalente un tomo de magnesio (Mg2+). La absorcin de determinados picos del espectro de radiacin (ver grfica ms abajo) es una propiedad de aquellas molculas orgnicas que contienen dobles enlaces conjugados (dobles enlaces alternando con enlaces simples); puede verse en las frmulas desarrolladas contiguas que el anillo porfirnico es rico en tales enlaces. El fitilo (o resto de fitol; llamamos resto o residuo a la parte de una molcula incorporada a la estructura de otra mayor) es una cadena hidrocarbonada con restos de metilo (-CH3) a lo largo. Tiene, como todas las cadenas orgnicas basadas slo en C e H, un carcter hidrfobo; es decir, que repele al agua. La cadena del fitilo sirve para anclar la molcula de clorofila en la estructura anfiptica de los complejos moleculares en que residen las clorofilas.

Conclusin

En este tema hemos conocido ms sobre la cromatografa, la cual nos permite separar los componentes qumicos de una sustancia y determinar las cantidades de dichos componentes.

Bibliografa Qumica. R.Chang y otros. 9 Edicin, Editorial Mc Graw-Hill, 2002

Qumica. Mortimer. Editorial Iberoamrica, 2001