2.09.07. Listeria Monocytogenes

CAPTULO 2.9.7.
LISTERIA MONOCYTOGENES
RESUMEN
Listeria monocytogenes puede infectar a una amplia variedad de especies animales, pero la listeriosis clnica es esencialmente una enfermedad de los rumiantes, con casos espordicos y ocasionales en otras especies. Las principales manifestaciones clnicas de la listeriosis animal son la encefalitis, la septicemia y el aborto, y se trata de una enfermedad transmisible, sobre todo a travs de los alimentos. Los hallazgos post-mortem y la histopatologa dependen de la presentacin clnica. La listeriosis es una de las enfermedades ms importantes transmitida por los alimentos. Las manifestaciones de la enfermedad en el hombre comprenden la septicemia, la meningitis (o meningoencefalitis) y la encefalitis, habitualmente precedidas de sntomas parecidos a los de la gripe, incluida la fiebre. En las mujeres gestantes, las infecciones intrauterinas o cervicales pueden provocar abortos espontneos o nacidos muertos. Tambin se ha asociado Listeria monocytogenes con las manifestaciones gastrointestinales acompaadas de fiebre. Aunque la morbilidad de la listeriosis es relativamente baja, la mortalidad de la enfermedad sistmica/encefaltica puede ser muy alta, con valores cercanos al 30%. Se considera que los ancianos, las mujeres gestantes, los recin nacidos y los individuos inmunodeprimidos corren un grave riego de contraer la enfermedad. Se han identificado varios determinantes moleculares y celulares de la virulencia de este patgeno intracelular y, aunque existen evidencias de polimorfismo entre las distintas especies de L. monocytogenes respecto a algunos de estos determinantes de virulencia, dicha heterogeneidad no se puede correlacionar con la capacidad o la incapacidad de este microorganismo para producir la enfermedad. Por tanto, todas las cepas de L. monocytogenes se consideran patgenas potenciales. Identificacin del agente: se dispone de una variedad de mtodos convencionales y rpidos para la deteccin e identificacin de L. monocytogenes en muestras de alimentos y en muestras clnicas procedentes de animales con listeriosis. Los mtodos convencionales siguen siendo el patrn de oro con el que se comparan los restantes mtodos. Habitualmente, son muy sensibles. En estos mtodos se utilizan agentes selectivos y procedimientos de enriquecimiento para reducir el nmero de microorganismos contaminantes y permitir la multiplicacin de L. monocytogenes. Aunque no se necesite con fines reglamentarios, se dispone de diferentes niveles de tipificacin de las cepas de L. monocytogenes, entre los que se incluyen la serotipificacin, la fagotipificacin, la electroforesis de enzimas multilocus, los patrones de digestin del ADN mediante enzimas de restriccin (mediante electroforesis convencional o electroforesis en gel de campo pulsado, la tipificacin basada en la secuencia de los cidos nucleicos y la amplificacin aleatoria del ADN polimrfico). Pruebas serolgicas: las pruebas serolgicas utilizadas para la deteccin de anticuerpos no se han utilizado tradicionalmente para el diagnstico de la listeriosis. Se han probado varios formatos y todos han resultado ser poco fiables y carentes de sensibilidad y de especificidad. Los ensayos serolgicos experimentales basados en la deteccin de anti-listeriolisina O se han empleado en algunas investigaciones epidemiolgicas y como apoyo al diagnstico de infecciones del sistema nervioso central con resultado de cultivo negativo. La identificacin inmunohistoqumica de los antgenos de L. monocytogenes es una herramienta til para el diagnstico de la forma encefaltica de la enfermedad.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Captulo 2.9.7. Listeria monocytogenes
Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: se ha comprobado que es muy difcil desarrollar vacunas efectivas contra L. monocytogenes que, al ser un organismo intracelular, necesita la participacin de los linfocitos T efectores para desencadenar una respuesta inmune efectiva. Se han estudiado vacunas experimentales utilizando animales de laboratorio con el fin de conferir proteccin frente a la infeccin por L. monocytogenes mediante una serie de enfoques diferentes, incluyendo la inmunizacin con ADN plasmdico, la sealizacin de los CD40 junto con L.monocytogenes inactivada por calor, el empleo de mutantes deficientes en listeriolisina O inoculados junto con listeriolisina O encapsulada en liposomas, y la inmunizacin con antgenos de Listeria y IL-12.
A. INTRODUCCIN
L. monocytogenes puede infectar a una amplia gama de especies animales, entre las que se encuentran los mamferos, las aves, los peces y los crustceos, aunque la mayora de casos de listeriosis clnica tienen lugar en rumiantes; los cerdos raras veces desarrollan la enfermedad y, generalmente, las aves son portadoras subclnicas del microorganismo. La mayor parte de las infecciones en animales son subclnicas, pero la listeriosis puede producirse espordicamente o de forma epidmica. Adems del impacto econmico de la listeriosis en animales, existe una conexin entre los animales y su papel como fuente de infeccin para el hombre, debida en primer lugar a la consumicin de productos animales contaminados. La infeccin puede deberse al contacto directo con animales infectados, especialmente durante el parto de las vacas o las ovejas (65); sin embargo, estas infecciones son muy raras. La importancia relativa de la transmisin zoonsica de la enfermedad al hombre no est clara, y aparentemente es ms relevante para la Salud Pblica la contaminacin a partir del ambiente en el que se procesan los alimentos (50). Las manifestaciones clnicas de la listeriosis en los animales incluyen encefalitis, septicemia y aborto, especialmente en ovejas, cabras y vacas. La forma septicmica es relativamente poco comn y por lo general, pero no de manera invariable, se produce en el recin nacido. Se caracteriza por depresin, inapetencia, fiebre y muerte. La forma encefaltica se denomina a veces enfermedad en crculo debido a la tendencia a dar vueltas en una direccin, y es la manifestacin ms comn de la enfermedad en los rumiantes. Los sntomas comprenden depresin, anorexia, cada de la cabeza o torsin de la cabeza hacia un lado y parlisis facial unilateral. El aborto se produce, por lo general, en la ltima etapa (despus de 7 meses en vacas y 12 semanas en ovejas) (33, 64). Normalmente, solo tiene lugar una forma clnica de listeriosis en un grupo particular de animales. Tambin se han descrito la oftalmitis bovina y ovina (63). En raras ocasiones se ha asociado la mastitis de rumiantes con la infeccin por L. monocytogenes. En raras ocasiones pueden ocurrir infecciones gastrointestinales en ovejas (20). Cuando se produce listeriosis en cerdos, la manifestacin primaria es la septicemia y son menos frecuentes los casos de encefalitis y raros los abortos. Aunque las aves son portadoras subclnicas habituales, se han descrito casos espordicos de listeriosis, siendo ms frecuente la septicemia y mucho menos comn la aparicin de meningoencefalitis. La listeriosis aviar puede ser el resultado de una infeccin secundaria en condiciones de enfermedad vrica y salmonelosis (65). Los hallazgos post mrtem y la histopatologa, en la listeriosis animal, dependen de la presentacin clnica. En la forma encefaltica, el fluido cerebroespinal puede estar turbio y los vasos menngeos congestionados. Son raras las lesiones patolgicas globales del cerebro. En ocasiones, la mdula muestra reas de reblandecimiento. Sin embargo, la enfermedad muestra una histopatologa caracterstica que consiste en focos de clulas inflamatorias con manguito perivascular adyacente, predominando los linfocitos e histiocitos, las clulas plasmticas y ocasionalmente los neutrfilos. Los microabscesos en el tronco cerebral a menudo afectan ms gravemente a un lado del cerebro. Puede presentarse una patologa ms amplia de tipo malcico. La mayora de las veces estn implicadas la mdula y la protuberancia. En la forma septicmica, pueden detectarse focos mltiples de necrosis en el hgado y, con menor frecuencia, en el bazo. Los fetos abortados de los rumiantes muestran muy pocas lesiones globales, pero puede producirse autolisis si el feto estuvo retenido antes del parto (47, 64). Las pruebas indican que la listeriosis animal es, sobre todo, una enfermedad relacionada con el almacenamiento de forraje y con el medio ambiente como fuente principal de contaminacin. El ensilado es la fuente ms frecuente (27, 66). La mucosa intestinal es la va de entrada principal, despus de la ingestin oral, en el caso de una listeriosis septicmica abortiva. El periodo de incubacin puede ser de tan solo 1 da. El periodo de incubacin de la forma encefaltica es normalmente de 23 semanas y el curso de la enfermedad es normalmente corto en las ovejas y en las cabras, entre 1 y 4 das (50), aunque puede ser ms prolongado en el ganado vacuno. Aunque Listeria monocytogenes se ha considerado durante muchos aos como un microorganismo patgeno de los animales, su papel significativo como patgeno humano transmitido por los alimentos solo se hace evidente a partir de 1980, cuando comienzan a aparecer en la literatura informes documentados sobre brotes de listeriosis
relacionados con el consumo de alimentos contaminados (54). Hoy en da, L. monocytogenes se considera uno de los agentes ms importantes de enfermedades de transmisin por alimentos. La posible explicacin de la emergencia de la listeriosis humana transmitida por alimentos como un asunto del mximo inters de Salud Pblica ha de buscarse en los importantes cambios en la produccin, procesamiento y distribucin de los alimentos, la utilizacin cada vez mayor de la refrigeracin como principal medio de conservacin de los mismos, los cambios en los hbitos alimenticios de la poblacin, particularmente respecto a la comodidad de los alimentos ya preparados, y un incremento del nmero de personas con un gran riesgo de sufrir la enfermedad (ancianos, gestantes, recin nacidos e inmunodeprimidos) (51, 60). La manifestacin primaria de la listeriosis humana puede incluir la presencia de septicemia, meningitis (o meningoencefalitis) y encefalitis, habitualmente precedida de sntomas parecidos a los de la gripe, incluida la fiebre. Tambin se presentan manifestaciones gastrointestinales acompaadas de fiebre. A pesar de que la morbilidad de la listeriosis es relativamente baja, la mortalidad puede alcanzar valores de alrededor del 30%. En embarazadas, la infeccin puede dar lugar a abortos, nacidos muertos o nacimientos prematuros (51, 58). Listeria monocytogenes es un bacilo Gram-positivo responsable de la mayor parte de las infecciones por Listeria que afectan al hombre, aunque se han publicado algunos casos raros de infeccin debidos a L. ivanovii y L. seeligeri. En animales, L. monocytogenes es responsable de la mayora de las infecciones, pero tambin se han registrado infecciones por L. ivanovii y L. innocua. Listeria ivanovii ha sido relacionada con abortos y se la ha considerado como causa de la meningoencefalitis en ovejas. Aunque L. monocytogenes posee un potencial zoonsico evidente, tambin es un importante contaminante medioambiental, de relevancia a nivel de salud pblica. Se dispone de una tipificacin de cepas de L. monocytogenes establecida mediante una variedad de mtodos y con fines de investigacin epidemiolgica, pero an no ha sido resuelta la cuestin de si todas las cepas de L. monocytogenes son o no capaces de causar la enfermedad (30, 41, 44, 45). Se han identificado diversos determinantes moleculares de virulencia que juegan un papel en la infeccin celular por L. monocytogenes y el hecho de que todava no sea conocido su mecanismo de accin, hace de L. monocytogenes uno de los modelos ms interesantes de interaccin patgeno-hospedador, tanto a nivel celular como molecular. Estos determinantes de virulencia comprenden, entre otros, las internalinas, la listeriolisina O (LLO), la protena Act A, dos fosfolipasas, una metaloproteasa, la protena Vip, un sistema de exclusin de la bilis (BilE) y una hidrolasa de sales biliares (17, 21, 24, 28, 57). Aunque existe polimorfismo entre diferentes cepas de L. monocytogenes para algunos de estos determinantes de virulencia, este hecho no puede correlacionarse con la capacidad o la incapacidad del organismo para producir la enfermedad (41).
B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1. Identificacin del agente
En la actualidad existen varios mtodos convencionales y rpidos disponibles para la deteccin e identificacin de L. monocytogenes en muestras de alimentos y en muestras procedentes de listeriosis animal. Los mtodos bacteriolgicos convencionales son importantes por varias razones: su empleo permite obtener el microorganismo en cultivo puro, lo que ser til para fines reglamentarios. Siguen siendo el los mtodos de referencia frente a los cuales se comparan y validan otros mtodos. Normalmente, estos mtodos son muy sensibles y no requieren un equipamiento sofisticado o caro. Algunas desventajas de este grupo de mtodos incluyen el periodo de tiempo relativamente largo que se necesita para completar los protocolos, la experiencia prctica que se precisa en varias manipulaciones, la necesidad de productos qumicos, reactivos y medios muy diferentes, la posibilidad de que algunos microorganismos contaminantes enmascaren la presencia de las bacterias diana, incluyendo una posible falta de deteccin de variantes atpicas del microorganismo diana y la subjetividad relativa que supone la interpretacin del crecimiento bacteriano en placas de agar con un medio selectivo y diferencial (1). El aislamiento e identificacin de L. monocytogenes a partir de alimentos, muestras medioambientales y muestras clnicas procedentes de animales, requiere el uso de agentes selectivos y procedimientos de enriquecimiento que mantengan los niveles de microorganismos contaminantes en valores razonables y permitan la multiplicacin de L. monocytogenes hasta niveles que sean suficientes para poder detectar este microorganismo. Con este fin, en los primeros tiempos de la bacteriologa clnica de Listeria, se utilizaba regularmente el enriquecimiento en fro (31), explotando la capacidad del microorganismo de multiplicarse a temperaturas de refrigeracin, mientras que las bacterias contaminantes no se desarrollaran bajo estas condiciones. Sin embargo, dicho procedimiento necesita tiempos de incubacin muy largos, a menudo meses, por lo que resulta inadecuado para las investigaciones actuales de brotes de transmisin alimentaria y de casos espordicos, as como para la puesta en prctica de programas efectivos de anlisis de riesgos y control de
puntos crticos (HACCP) en las plantas de procesamiento y produccin de alimentos. Se han incorporado compuestos selectivos en los medios de cultivo que permiten el crecimiento de L. monocytogenes a temperaturas de incubacin normales; de este modo se acorta el tiempo requerido para el desarrollo selectivo del microorganismo. Ejemplos de estos compuestos selectivos son la cicloheximida, colistina, cefotetan, fosfomicina, cloruro de litio, cido nalidxico, acriflavina, feniletanol, ceftazidima, polimixina B y moxalactam (3, 8, 34, 38, 62). El diagnstico bacteriolgico de la listeriosis animal ha consistido tradicionalmente en la siembra directa de las muestras en placa con medio de agar sangre o en otros medios de enriquecimiento y, en paralelo, el empleo de la tcnica de enriquecimiento en fro, con subcultivos semanales durante 12 semanas (31, 49, 64). La deteccin inmunohistoqumica de antgenos de L. monocytogenes en tejidos fijados en formalina ha resultado ser ms sensible que la siembra directa en placas y el cultivo bacteriano enriquecido en fro para el diagnstico de la variante encefaltica de la enfermedad en rumiantes (20, 43). La introduccin de procedimientos alternativos de enriquecimiento y agentes selectivos para el aislamiento de L. monocytogenes a partir de alimentos y de muestras medioambientales ha abierto la posibilidad de utilizar algunas de estas tcnicas para el anlisis bacteriolgico de muestras procedentes de animales con listeriosis. A pesar de los avances conseguidos en el aislamiento de L. monocytogenes a partir de alimentos, todava existe la posibilidad de mejorar en diversas reas. Ningn procedimiento se puede considerar lo bastante sensible para detectar L. monocytogenes a partir de todos los tipos de alimentos (22). Adems, pueden encontrarse clulas de L. monocytogenes en estado subletal en alimentos procesados debido a la refrigeracin, calentamiento, acidificacin y otros tipos de tratamientos fsicos o qumicos. Estas bacterias en estado subletal necesitan condiciones especiales de cultivo para reparar el dao, antes de poderse detectar en el cultivo.
a)
Mtodos de aislamiento
Los mtodos convencionales para el aislamiento de L. monocytogenes a partir de alimentos que han ganado aceptacin con propsitos reglamentarios internacionales son el mtodo de la Administracin de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) (34), el mtodo oficial de la Asociacin Oficial de Qumicos Analistas (AOAC) (8), las Normas ISO 11290 (38, 40), el mtodo del Servicio de Inspeccin y Seguridad Alimentaria (FSIS) del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) (62) y los Estndares franceses (3, 4). Dependiendo de la naturaleza de la muestra, un mtodo particular puede ser ms adecuado que otro. El Comit Tcnico de la Organizacin Internacional para la Estandarizacin ISO/TC 34, Subcomit SC 9, Microbiologa, de Productos Agroalimentarios, afirma que la Norma ISO 11290, partes 1 y 2 (38, 40) puede utilizarse para la deteccin de L. monocytogenes en una gran variedad de alimentos y productos alimenticios. Aunque reconocen que este estndar puede no ser el ms apropiado en ciertos casos, recomiendan que se lleve a cabo el mximo esfuerzo para aplicar este mtodo en la medida de lo posible. Los mtodos de la FDA y de la AOAC pueden utilizarse para el anlisis de la leche y los productos lcteos. El mtodo del USDA-FSIS se recomienda para la carne roja y la carne de ave (cruda o lista para comer), los huevos y derivados y las muestras medioambientales. El procedimiento tradicional de aislamiento de L. monocytogenes a partir de tejidos animales consiste en la siembra directa de las muestras en placas con medio agar sangre de oveja u otro medio de cultivo rico y la utilizacin en paralelo de la tcnica de enriquecimiento en fro, con subcultivos semanales durante 12 semanas (31, 49, 64). El aislamiento mediante siembra directa en placa es relativamente fcil si el microorganismo est presente en gran nmero en un lugar normalmente estril, como sucede en el caso de la forma septicmica de la enfermedad, pero, sin embargo, el aislamiento es difcil cuando el microorganismo est presente en nmero reducido, como sucede en el caso de la forma encefaltica o si las muestras estn fuertemente contaminadas con otros microorganismos. La comparacin de la eficacia de la siembra directa en placa, el enriquecimiento en fro y una ligera modificacin de lo que se convirti en el mtodo de la AOAC, ha permitido establecer la superioridad de este ltimo sobre los otros dos para el aislamiento de L. monocytogenes a partir de una amplia variedad de material procedente de la necropsia animal, tanto en trminos de tiempo requerido para el aislamiento e identificacin del microorganismo como en tasas de aislamiento (25). Para la enumeracin de L. monocytogenes se aplica la Norma ISO 11290, parte 2 (39), as como los protocolos opcionales mencionados en los mtodos de la FDA y del USDA-FSIS (34, 62). En el caso de la listeriosis animal, las muestras deberan escogerse de acuerdo a la presentacin clnica de la enfermedad: material procedente de lesiones del hgado, riones y/o bazo, en el caso de la forma septicmica; fluido espinal, protuberancia y mdula, en el caso de la forma encefaltica; y placenta (cotiledones), contenido del abomaso fetal y/o secreciones uterinas, en el caso del aborto. Se deben emplear temperaturas de refrigeracin (4C) para la manipulacin, conservacin y transporte de muestras. Si la muestra ya est congelada, se debera mantener congelada hasta su anlisis.
El protocolo recomendado para el aislamiento de L. monocytogenes de material de necropsias de animales se describe ms adelante como el primero en publicarse (25). Es posible que este protocolo pueda mejorarse incorporando las actualizaciones recientes del mtodo de la AOAC y nuevos avances para la identificacin y confirmacin de aislamientos de Listeria, pero an no existe evidencia publicada en apoyo de esta hiptesis.
i)
Procedimiento para el aislamiento a partir de material de necropsias de animales Se inoculan 1025 g o ml de muestra (dependiendo de la cantidad de muestra disponible) en 225 ml de caldo de enriquecimiento para Listeria. Cuando se trate de muestras de listeriosis animal, el tamao de la muestra para el inculo puede ser limitado y menor que el recomendado para las muestras de alimentos (25 g o ml). Si ese es el caso, debe inocularse la mayor cantidad posible de material de muestra (1025 g o ml) (25). (Caldo base de enriquecimiento para Listeria: caldo de triptona y de soja (Oxoid), 30 g; extracto de levadura Difco, 6 g; agua, 1 litro; agentes selectivos: acriflavina, 2,3 mg; cido nalidxico, 9,2 mg; cicloheximida, 11,5 mg; se aaden agentes selectivo a 225 ml de caldo base). Se incuba el caldo a 30C durante 48 horas. Se extiende 0,1 ml de cultivo con caldo para enriquecimiento sobre placas con agar de Oxford. Se incuban las placas a 37C. Se observa el crecimiento de bacterias transcurridas 24 y 48 horas. Se ensayan cinco colonias (o todas si se dispone de pocas) con apariencia tpica de L. monocytogenes para observar la forma celular, la reaccin de Gram, la actividad hemoltica en agar sangre (sangre de caballo desfibrinada), la movilidad en agitacin a 20C, la fermentacin de la glucosa (+), la ramnosa (+) y la xilosa (), la hidrlisis de la esculina y la produccin de catalasa.
ii) iii) iv) v)
Todos los medios de cultivo preparados tienen que someterse a un control de calidad y ser capaces de mantener el crecimiento del microorganismo objeto de la prueba a partir de un inculo pequeo. La cepa de referencia debera cultivarse en paralelo a las muestras sospechosas para asegurar que las pruebas se estn realizando correctamente. Las muestras utilizadas en el anlisis deben ser representativas del alimento, incluyendo la superficie externa y el interior del mismo. Los mtodos de cultivo convencional conllevan un procedimiento de enriquecimiento basado en la utilizacin de medios de cultivo lquidos que contengan agentes selectivos. La naturaleza de los medios y los agentes selectivos varan con el mtodo. Los mtodos de la FDA (34) e ISO incluyen una etapa de preenriquecimiento para tratar de recuperar las clulas de L. monocytogenes en estado subletal, mientras que en los mtodos del USDA-FSIS (62) y de la AOAC (8) las muestras se procesan directamente en caldo de enriquecimiento. En el caso del mtodo de la FDA, el preenriquecimiento se lleva a cabo a 30C durante 4 horas en caldo tripticasa-soja con extracto de levadura (TSB YE) sin agentes selectivos. El protocolo ISO emplea un enriquecimiento primario durante 24 horas a 30C en presencia de agentes selectivos, pero a un medio de su concentracin (caldo Fraser a un medio). Las muestras se enriquecen durante 2472 horas a 30C, 35C 37C, dependiendo del mtodo. El mtodo de la FDA emplea TSB YE con acriflavina, cido nalidxico y cicloheximida. El mtodo del USDAFSIS utiliza dos etapas de enriquecimiento: el enriquecimiento primario se realiza en medio de la Universidad de Vermont (UVM) y contiene cido nalidxico y acriflavina; el enriquecimiento secundario se lleva a cabo en caldo Fraser con cido nalidxico, cloruro de litio y acriflavina. La Norma ISO indica el caldo Fraser para el enriquecimiento secundario con agentes selectivos a la concentracin normal, mientras que el enriquecimiento primario se lleva a cabo en caldo Fraser a un medio, como se indica anteriormente. El mtodo EOAC considera el enriquecimiento selectivo en caldo triptona de soja que contenga acriflavina, cido nalidxico y cicloheximida (medio de enriquecimiento selectivo). Despus del enriquecimiento selectivo, los cultivos se siembran en placas de agar con un medio selectivo/diferencial para el aislamiento de las colonias presuntivas de L. monocytogenes. En todos los mtodos, a excepcin del mtodo de la Norma ISO, se utiliza el agar de Oxford o una modificacin, el agar MOX (USDA-FSIS). El agar de Oxford contiene cloruro de litio, cicloheximida, colistina, acriflavina, cefotetan y fosfomicina como agentes selectivos, y las colonias de Listeria spp. son pequeas, negras y rodeadas de un halo negro. Adems del agar de Oxford, el mtodo de la FDA incluye cloruro de litio/feniletanol/moxalactam (LPM) o agar PALCAM, que contiene cloruro de litio, polimixina B, acriflavina y ceftazidima. El agar MOX, empleado en el mtodo del USDA-FSIS, contiene cloruro de litio, colistina y moxalactam. Los dos medios selectivos de siembra en placa utilizados en el mtodo estndar ISO son: Agar Listeria de Ottaviani y Agosti (ALOA), que contiene cloruro de litio, cido nalidxico, ceftazidima, plimixina B y anfotericina B (o cicloheximida), y cualquier otro medio selectivo elegido por el laboratorio, tales como Oxford o PALCALM. Las colonias tpicas de L. monocytogenes en agar ALOA son de color verde azulado, rodeado por un halo opaco (40). Los laboratorios Bio-Rad han desarrollado el RAPIDL.Mono, un medio cromognico selectivo, para la deteccin directa y enumeracin de L. monocytogenes, basado en el aislamiento selectivo, la deteccin
cromognica de fosfolipasa C especfica para fosfatidilinositol (PI-PLC) y el uso de xilosa. Listeria monocytogenes se desarrolla en colonias azules (positivas a la PI-PLC) sin halo amarillo (negativo a la xilosa); L. ivanovii produce colonias verde-azuladas (positivas a la PI-PLC) con halo amarillo (positivo a la xilosa). Otras colonias de Listeria spp. son blancas (negativas a la PI-PLC).
b)
Mtodos de identificacin convencional

Las colonias tpicas de Listeria spp., una vez crecidas en el medio selectivo diferencial, se seleccionan para la identificacin adicional de L. monocytogenes. La prueba ChristieAtkinsMunchPeterson (CAMP) es una herramienta muy til que facilita la identificacin de las especies de Listeria spp a partir de los aislamientos. Se emplea en los protocolos ISO y de la AOAC y se considera opcional en los mtodos de la FDA y del USDA-FSIS. La prueba es fcil de realizar e interpretar. Consiste en sembrar en estra una cepa -hemoltica de Staphylococcus aureus (ATCC cepa 49444 o 25923, NCTC cepa 7428 o 1803) y de Rhodococcus equi (ATCC cepa 6939, NCTC cepa 1621) formando unas nicas lneas rectas y paralelas, en una placa de agar sangre de oveja o en una placa por la tcnica de la doble capa de agar, con la capa de agar sangre superior muy delgada. Las estras deben tener la suficiente separacin para permitir que las cepas de Listeria de prueba y de control se puedan sembrar perpendicularmente, entre los dos microorganismos indicadores, sin que los toquen (separados 12 mm). Despus de una incubacin de 2448 horas a 3537C (1218 horas si se emplea la doble capa de agar), se considera una reaccin positiva la aparicin de una zona destacada de -hemlisis en la interseccin de las cepas de prueba/control con las cepas indicadoras. L. monocytogenes es positivo con la siembra de S. aureus y negativo con la de R. equi, mientras que la prueba con L. ivanovii produce las reacciones inversas (49). Cuadro 1. Diferenciacin de especies de Listeria
Especie Hemlisis Produccin de cido Ramnosa L. monocytogenes L. innocua L. ivanovii L seeligeri L. welshimeri L. grayi subsp. Grayi L. grayi subsp. Murrayi + + (+) + V V V Xilosa + + + Prueba CAMP S. aureus + (+) R. equi +
V: variable; (+): reaccin dbil; +: >90% reacciones positivas; : sin reaccin.
La serologa, la tipificacin lisognica y el ensayo de patogenicidad en ratones inmunodeprimidos se consideran como mtodos opcionales.
c)
Mtodos de identificacin rpida

Los siguientes protocolos incluyen pruebas convencionales y no convencionales disponibles en el mercado, como por ejemplo Vitek, API, MICRO-ID, kits de enzimoinmunoensayo (ELISA) y de pruebas de cido nucleico para facilitar la identificacin de L. monocytogenes. Se ha descubierto que la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), orientada al gen hly, es sensible y rpida para la confirmacin de la identificacin de L. monocytogenes sospechoso aislado en placas de agar selectivo-diferencial (29). Adems de los agares RAPIDL.Mono y ALOA, descritos con anterioridad, se han elaborado otros medios cromognicos para diferenciar entre las colonias de L. monocytogenes y las de otras Listeriae: agar cromognico (Oxoid) para Listeria (OCLA), y CHROMagar Listeria, fabricado por CHROMagar Microbiology. i) MICRO-ID Listeria
El MICRO-ID Listeria es un sistema disponible comercialmente (Organon Teknika Corp., 100 Akzo Ave., Durham, NC 27712, EE.UU.) que ha sido validado por la AOAC (mtodo 992.18) (4) para la identificacin presuntiva de las especies de Listeria aisladas a partir de muestras medioambientales y de alimentos. Supone una alternativa a las pruebas bioqumicas convencionales de los aislamientos de Listeria spp. mediante los mtodos de la FDA y del USDA-FSIS. Se basa en el principio de que el inculo de la prueba contiene enzimas preformados que pueden detectarse despus de 24 horas de incubacin a 37C. La diferenciacin de las especies de Listeria se basa en un derivado de un cdigo octal despus de introducir
los valores numricos de cada grupo de tres pruebas y en las reacciones obtenidas a partir de la prueba CAMP y las caractersticas de hemlisis, que se ensayan por separado. ii) Sistema de identificacin microbiana automatizada Vitek (Vitek Automicrobic System)
El Vitek Automicrobic System (bioMrieux Vitek, Inc., 595 Anglum Dr., Hazelwood, MO, EE.UU.) es un sistema automatizado de identificacin microbiana que puede emplearse para la identificacin presuntiva de las especies de Listeria de transmisin alimentaria y para la deteccin de aislamientos diferentes a Listeria. La AOAC lo ha validado como mtodo 992.19 (6). El sistema utiliza una cmara incubadora con un lector ptico, una unidad de llenado/sellado para la inoculacin del kit de la prueba y un ordenador. Cada tarjeta de identificacin de las bacterias Gram-positivas (GPI) y de las Gram-negativas (GNI+) contiene 30 pruebas bioqumicas. Los cambios se analizan mediante el ordenador, que asigna al microorganismo problema un gnero y/o una especie. La identificacin de las especies de Listeria requiere la utilizacin de una tarjeta GPI y dos reacciones con la tarjeta GNI+. Sin embargo, para la identificacin de algunas listerias el anlisis debe llevarse a cabo mediante la prueba CAMP, el ensayo de hemlisis y/o la prueba de reduccin de nitratos, como se describe en el mtodo de la FDA. Los microorganismos situados en la categora LM se identifican como L. monocytogenes o L. innocua; en la categora LI, como L. ivanovii o L. seeligeri; en la categora LW, como L. welshimeri; y en la categora LG, como L. grayi o L. murrayi (una subespecie de L. grayi). Los microorganismos de la categora O se clasifican como especies no-Listeria. Se deben realizar pruebas posteriores para identificar las especies dentro de cada categora de acuerdo con el mtodo de la FDA. Otros mtodos disponibles comercialmente para la identificacin de especies de Listeria incluyen el API LISTERIA (bioMrieux), el MICROBACT 12L (Microgen), el Sistema MicroLog (Biolog.), el Sistema de Identificacin Microbiana Sherlock (MIS) (Microbial ID; basado en patrones de cidos grasos) y el Sistema Walk/Away (MicroScan). iii) Mtodos inmunolgicos de deteccin rpida
Se han desarrollado varios mtodos inmunolgicos para identificar L. monocytogenes en alimentos y los siguientes mtodos disponibles comercialmente estn validados por uno o ms sistemas oficiales de validacin (23, 55). Enzimoinmunoensayo colorimtrico monoclonal (Listeria-Tek)
El Listeria-Tek es el mtodo oficial 994.03 de la AOAC (9) y se ha diseado para la deteccin de Listeria spp. en productos lcteos, carnes y mariscos. Como en la prueba se utilizan anticuerpos monoclonales (MAb) pueden producirse reacciones cruzadas con otras Listeria spp., por tanto, la prueba no es confirmatoria para L. monocytogenes. El kit comercial se puede adquirir en Organon Teknika Corp., 100 Akzo Ave, Durham, NC 27704, EE.UU. Los cultivos de enriquecimiento que den positivo siguiendo este mtodo se siembran por estra en medios selectivos y las colonias sospechosas se identificarn mediante pruebas bioqumicas como L. monocytogenes segn el mtodo de la FDA. Solo ser vlido un resultado positivo, si los controles negativo y positivo dan unas lecturas de absorbancia aceptables. Mtodo colorimtrico de deteccin mediante un enzimoinmunoensayo policlonal (TECRA Listeria Visual Immunoassay [TLVIA])
El TLVIA es el mtodo oficial 995.22 de la AOAC (10) y se ha diseado para la deteccin de Listeria spp. en productos lcteos, mariscos, carne de ave y carnes (excepto carne cruda picada) y verduras. Una versin mejorada, con protocolos de enriquecimiento para alimentos adicionales y sin el agente cicloheximida, un antifngico txico, es el mtodo oficial 2002.09 de la AOAC (14), que es un procedimiento analtico para la deteccin de Listeria spp. en carnes crudas, productos agrcolas y verduras frescas, carnes procesadas, marisco, alimentos lcteos procesados o sin procesar, fruta y zumos de fruta. El kit comercial est disponible en TECRA International Pty Ltd, P.O. Box 788, Willoughby, NSW, Australia. Los cultivos de enriquecimiento que den positivo deben sembrarse en medios selectivos y las colonias sospechosas se identificarn de acuerdo a los criterios especificados en los mtodos de la FDA y del USDA. Mtodo Assurance de enzimoinmunoensayo policlonal
El enzimoinmunoensayo Assurance Listeria es el mtodo oficial 996.14 de la AOAC (11) y puede utilizarse para la deteccin de Listeria spp., incluyendo L. monocytogenes, en productos lcteos, carnes rojas, cerdo,
productos avcolas, frutas, frutos secos, mariscos, pastas, verduras, quesos, harina de huesos, chocolate, superficies medioambientales y huevos. Las lecturas por encima del valor de corte se consideran presuntos positivos y a continuacin los cultivos enriquecidos se confirman mediante los procedimientos de cultivo e identificacin que se describen en el mtodo de la FDA. El kit comercial se puede adquirir en BioControl Systems, Inc., 12822 SE 32nd St., Bellevue, WA 98005, EE.UU. Ensayo visual de inmunoprecipitacin (VIPTM)
El ensayo VIPTM es el mtodo oficial 997.03 de la AOAC (12). Puede utilizarse para la deteccin de L. monocytogenes y otras Listeria spp. en productos lcteos, carnes rojas, cerdo, aves y productos derivados, mariscos, frutas, verduras, frutos secos, pastas , chocolate, superficies medioambientales, huevos y harina de huesos. La prueba se lleva a cabo con un cultivo enriquecido de las muestras problema. Las pruebas con resultado presunto positivo deben confirmarse mediante los procedimientos de cultivo e identificacin que se describen en el mtodo de la FDA. Las unidades VIP las comercializa BioControl Systems, Inc., 12822 SE 32nd St., Bellevue, WA 98005, USA. Mtodo de deteccin mediante ensayo VIDAS LIS
Este enzimoinmunoensayo fluorescente (ELFA) es el mtodo oficial 999.06 de la AOAC (13). Tambin ha sido validado por la Asociacin Francesa de Normalizacin (AFNOR) y por el Plan de Evaluacin de los Mtodos Microbiolgicos Europeos (EMMAS) (15). Se emplea para la deteccin de productos lcteos, verduras, marisco, carnes crudas y de ave, as como para la deteccin de antgenos de Listeria spp. en carnes procesadas y de ave. En un estudio multilaboratorial, se evalu una modificacin de este protocolo de enriquecimiento, que consista en el uso de caldos semi-Fraser y Fraser (mtodo oficial 2004.06 de la AOAC) y no se encontraron diferencias significativas entre este mtodo y el mtodo oficial 999.06 de la AOAC (56). El mtodo VIDAS Listeria monocytogenes 2 (LMO 2) incluye MAb especficos para la captura de antgenos de L. monocytogenes y ha sido validado por la AFNOR, incluida su utilizacin con muestras medioambientales. Este inmunoensayo se realiza con un instrumento automatizado VIDAS. El ordenador compara el valor obtenido con un patrn y se genera un informe positivo o negativo. Los resultados positivos deben confirmarse mediante mtodos de cultivo estndar como se describe en el mtodo de la FDA. El sistema VIDAS lo comercializa bioMrieux, Inc., 595 Anglum Rd., Hazelwood, MO 63042, EE.UU. Otros mtodos inmunolgicos disponibles comercialmente han conseguido la validacin mediante sistemas oficiales entre los que se encuentra el VIDAS Listeria species Xpress (bioMrieux), validado por la AFNOR; el Transia Plate Listeria ELISA (Transia, Diffchamb Ltd), validado por la AFNOR; el EIAFOSS Listeria automated ELISA (Foss Electric), validado por el Instituto de Investigacin de la AOAC; el mtodo inmunocromatogrfico REVEAL para Listeria (Neogen Corporation), validado por el Instituto de Investigacin de la AOAC; el mtodo inmunocromatogrfico Clearview Listeria Rapid Test (Oxoid), validado por la AFNOR, el EMMAS y el Instituto de Investigacin de la AOAC, y la prueba Listertest (Vicam) basada en la separacin inmunomagntica validada por el Instituto de Investigacin de la AOAC (15). Otros mtodos inmunolgicos disponibles comercialmente son el Transia Plate Listeria monocytogenes ELISA (Transia, Diffchamb Ltd), la prueba con Dynabeads anti-Listeria (Dynal Ltd) basada en la separacin inmunomagntica, el Listeria UniQueTM ELISA (TECRA), la prueba Microscreen Listeria de aglutinacin en latex (Microgen BioProducts Ltd),y el ensayo Listeria Rapid Test EIA (Oxoid).
d)
Mtodos de reconocimiento de los cidos nucleicos

Se han desarrollado varios mtodos basados en el reconocimiento de los cidos nucleicos para identificar L. monocytogenes en alimentos. Algunos se han validado mediante uno o ms sistemas oficiales de validacin y estn disponibles comercialmente (48). Las secuencias diana nuevas, a efectos de diagnstico, incluyen el gen de la metaloproteasa (kit de deteccin LightCycler foodproof Listeria monocytogenes, Roche Applied Science), el gen prfA (51a) y el gen ssrA (48a) en un formato de PCR en tiempo real.
i)
Ensayo GENE-TRAK para Listeria
El ensayo GENE-TRAK para Listeria es un mtodo colorimtrico de hibridacin del ADN para la deteccin de las secuencias de Listeria, que ha sido validado por la AOAC como mtodo 993.09 (7) para ser utilizado con productos lcteos, carnes y mariscos. La AFNOR tambin ha validado este ensayo. Debido a que existe la posibilidad de reacciones falsas positivas, las muestras positivas deben confirmarse mediante mtodos de cultivo estndar. Las partes de la prueba que den resultado positivo en el ensayo de hibridacin del ADN deben confirmarse mediante la siembra en estra en placa de una suspensin microbiana en tampn fosfato salino empleando un medio selectivo para Listeria, seguido de la identificacin bioqumica de los aislamientos presuntos Listeria, como se describe en el mtodo de la FDA. El ensayo GENE-TRAK para Listeria se puede adquirir en GENE-TRAKTM Systems, 94 South Street, Hopkinton, MA 01748, EE.UU. ii) Sistema BAX
El USDA-FSIS ha adoptado el sistema BAX basado en la PCR (Qualicon) (61) como el nuevo mtodo de deteccin de L. monocytogenes en muestras enriquecidas de carne roja y de ave. Este mtodo consigue reducir el tiempo del resultado de las muestras negativas verdaderas en 24 horas y reduce los resultados falsos-positivos, con un lmite de deteccin superior a 1 ufc/g en 25 g de muestra. A continuacin todas las muestras que se identifiquen como presuntas positivas respecto a L. monocytogenes se deben confirmar mediante cultivo segn el mtodo convencional. iii) Prueba GENE-TRAK para Listeria monocytogenes
La prueba GENE-TRAK para L. monocytogenes (GENE-TRAKTM Systems) es un mtodo basado en la hibridacin con una sonda que ha sido validado por la AFNOR (15). iv) Prueba confirmatoria Gen-Probe (AccuProbe) para Listeria monocytogenes
La prueba Gen-Probe (AccuProbe) Listeria monocytogenes Confirmatory Test (Gen-Probe) es otro mtodo basado en la hibridacin con una sonda que ha sido validado por la AFNOR (15). v) Mtodo AD713
La FDA utiliza el mtodo AD713 (32) para detectar L. monocytogenes que consiste en una combinacin de sondas: para el gen de la protena asociada a la invasin y para el de la hemolisina (hly). Este mtodo combina la deteccin del gen de la hemolisina (tambin llamada listeriolisina O) de L. monocytogenes utilizando el oligonucletido sonda AD13 y la deteccin del gen de la protena asociada a la invasin mediante una sonda sinttica, la AD07. Ambas sondas se utilizan en combinacin (se denomina AD713) para evitar los resultados falsos negativos debidos a las mutaciones silenciosas en el gen (cambios de nucletidos que afectan a la capacidad de unin de la sonda al ADN pero no modifican la funcin del gen). Las muestras positivas deben confirmarse mediante procedimientos convencionales como se describe en el mtodo de la FDA. Otros mtodos disponibles comercialmente y que estn basados en el reconocimiento de los cidos nucleicos son el ensayo de la PCR Foodproof Listeria monocytogenes (Biotecon Diagnostics) y el ensayo de la PCR PROBELIATM (L. monocytogenes) (Sanofi Diagnostics). Se ha desarrollado la aplicacin de la PCR en tiempo real como un mtodo de deteccin cuantitativo y especfico para L. monocytogenes (18, 35) demostrando tener un buen potencial para ser utilizado en anlisis de rutina. El kit IQ-Check Listeria monocytogenes (para todos los productos alimenticios y muestras del medio ambiente), elaborado por BioRad, y el GeneDisc (para todo tipo de alimentos, menos los productos lcteos) elaborado por GeneSystems, Francia, estn basados en la deteccin mediante la PCR en tiempo real y han sido validados por la AFNOR (2).
Cuadro 2. Algunos sistemas de tipo comercial convencionales y basados en anticuerpos para la deteccin y confirmacin rpidas de Listeria1
Prueba MICRO-ID Listeria Vitek System API Listeria MicroLog System Nivel ID L. monocytogenes/innocua complejo L. monocytogenes/innocua complejo L. monocytogenes L. monocytogenes Principio Reaccin enzimtica Pruebas bioqumicas Pruebas bioqumicas Uso de sustratos como fuente de carbono Utilizacin de carbohidratos y prueba de microhemlisis Patrones de cidos grasos Aglutinacin con ltex Inmunocromatografa Tiempo aproximado de la prueba2 24 horas 24 horas 24 horas 4 o 24 horas Compaa Organon Teknika bioMrieux bioMrieux Biolog Utilizacin principal Confirmacin Confirmacin Confirmacin Confirmacin
MICROBACT 12L
L. monocytogenes
46 o 24 horas
Microgen
Confirmacin
Sherlock Microbial Identification System (MIS) Microscreen VIP Listeria
L. monocytogenes/innocua complejo Listeria spp. Listeria spp.
90 minutos
Microbial ID
Confirmacin
1 minuto 2 minutos (despus del enriquecimiento) 4872 horas 43 horas 43 horas
Microgen BioProducts BioControl Systems
Confirmacin Deteccin
Dynabeads antiListeria REVEAL para Listeria Clearview Listeria (Prueba rpida para Oxoid Listeria) Listertest
Listeria spp. Listeria spp. Listeria spp.
Separacin inmunomagntica Immunocromatografa Immunocromatografa Separacin inmunomagntica
Dynal Neogen Oxoid
Deteccin Deteccin Deteccin
Listeria spp.
2448 horas
Vicam
Deteccin
1: Adaptado y extendido a partir de la ref. 15. 2: Cuando se emplea para confirmacin, la duracin indicada de la prueba incluye el tiempo de enriquecimiento y aislamiento en placas de agar.
Cuadro 3. Algunos sistemas ELISA de tipo comercial para la deteccin rpida de Listeria
Prueba Listeria Tek Inmunoensayo visual TECRA para Listeria (TLVIA) Assurance Listeria EIA VIDAS Listeria (LIS) VIDAS Listeria monocytogenes (LMO) Transia Plate Listeria Transia Plate L. monocytogenes EIAFOSS Listeria Nivel ID Listeria spp. Listeria spp. Principio ELISA ELISA Tiempo aproximado de la prueba2 50 horas 50 horas Compaa Organon Teknika TECRA Utilizacin principal Deteccin Deteccin
Listeria spp. Listeria spp. L. monocytogenes
ELISA ELISA ELISA
50 horas 50 horas 50 horas
BioControl Systems bioMrieux bioMrieux
Listeria spp. L. monocytogenes Listeria spp.
ELISA ELISA ELISA automtico
50 horas 50 horas 48 horas
Diffchamb Diffchamb Foss Electric
1: Adaptado y extendido a partir de la ref. 15
10
Cuadro 4. Algunos sistemas moleculares de tipo comercial para la deteccin y confirmacin rpidas de Listeria1
Tiempo aproximado de la prueba2 30 minutos
Prueba
Nivel ID
Principio
Compaa
Utilizacin principal Confirmacin
Gen-Probe (AccuProbe) VIT Listeria Kit
L. monocytogenes
Sonda para hibridacin de cido nuclico Sonda para hibridacin de cido nuclico PCR Sonda para hibridacin de cido nuclico Sonda para hibridacin de cido nuclico PCR
Gen Probe
L. monocytogenes/ Listeria spp. L. monocytogenes Listeria spp.
3 horas
Vermicon
Confirmacin
Foodproof Listeria monocytogenes Gene Trak Listeria Assay Prueba Gene Trak para L. monocytogenes BAX para la deteccin de L. monocytogenes BAX para la deteccin de Listeria Genus PROBELIA
48 horas 50 horas
Biotecon Diagnostics Gene Trak
Deteccin Deteccin
L. monocytogenes
50 horas
Gene Trak
Deteccin
L. monocytogenes
48 horas
Qualicon
Deteccin
Listeria spp.
PCR
48 horas
Qualicon
Deteccin
L. monocytogenes
PCR
48 horas
Sanofi Diagnostics Pasteur Roche Applied Science
Deteccin
Kit de deteccin LightCycler foodproof Listeria monocytogenes Kit de deteccin LightCycler foodproof Listeria monocytogenes
L. monocytogenes
PCR en tiempo real
65 minutos3
Deteccin
Listeria spp.
PCR en tiempo real
75 minutos3
Roche Applied Science
Deteccin
1: Adaptado y extendido a partir de la ref. 15. 2: Cuando se emplea para la confirmacin, la duracin indicada de la prueba incluye el tiempo de enriquecimiento y aislamiento en placas de agar. 3. Despus del cultivo de enriquecimiento.
e)
Mtodos de subtipificacin
La identificacin reglamentaria de L. monocytogenes no exige ninguna tipificacin especfica de los aislamientos. Sin embargo, los esquemas de tipificacin pueden ser de utilidad en las investigaciones epidemiolgicas, en el seguimiento de los casos medioambientales y en la vigilancia de los casos de Salud pblica. Listeria monocytogenes puede tipificarse mediante diferentes aproximaciones incluyendo la serotipificacin, la fagotipificacin, la electroforesis de enzimas multilocus (MEE), el anlisis del ADN mediante enzimas de restriccin (empleando enzimas con alta frecuencia de corte y electroforesis en gel convencional o utilizando enzimas con baja frecuencia de corte y electroforesis en gel de campo pulsado [PFGE] para separar los fragmentos), tipificacin basada en la secuencia de los cidos nucleicos, el anlisis mediante hibridacin con microarrays, el polimorfismo del locus intergnico amplificado (AILP) y la amplificacin aleatoria del ADN polimrfico (RAPD). Se recomienda que la tipificacin de los aislamientos de L. monocytogenes se remita al centro de referencia apropiado debido a la necesidad de reactivos especficos, de procedimientos que aseguren una calidad rigurosa y de algn equipamiento sofisticado. Se puede encontrar una lista de centros internacionales y mtodos de tipificacin en la ref. 16 (pp. 258259). i) Serotipificacin
Las cepas de Listeria pueden asignarse a 13 serotipos diferentes, basndose en su combinacin de antgenos somtico (O) y flagelar (H). Aunque todas ellas se consideran patgenos potenciales, la mayora (>95%) de los aislamientos clnicos humanos, pertenecen a tres serotipos: 1/2a, 1/2b, y 4b. Comparado con
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otros mtodos de tipificacin, la serotipificacin presenta un poder de discriminacin bajo, pero puede proporcionar una informacin valiosa para facilitar el descarte de aislamientos que no forman parte del brote. Frecuentemente, los aislamientos procedentes de alimentos o de fuentes medioambientales no son tipificables con los antisueros de tipificacin estndar. ii) Fagotipificacin
La tipificacin por bacterifagos es una tcnica con un buen poder de discriminacin y que puede utilizarse para tipificar un gran nmero de aislamientos. Sin embargo, las colecciones de fagos disponibles en la actualidad no pueden tipificar una proporcin alta de cepas (2051% en el caso de la coleccin internacional de tipificacin de fagos). Debido a los requisitos rigurosos de estandarizacin y a la naturaleza biolgica de los reactivos, esta tcnica se practica solo en laboratorios especializados nacionales e internacionales de referencia y est sujeta a una considerable variabilidad experimental y biolgica. A pesar de estos problemas, la tipificacin con fagos sigue siendo el mtodo ms prctico y adecuado de aplicacin en casos de brotes agudos y extensos (30). iii) Electroforesis de enzimas multilocus
Esta tcnica se basa en las diferencias en la secuencia de nucletidos que provocan distintas movilidades electroforticas de ciertos enzimas metablicos seleccionados en geles de almidn y puede emplearse en la tipificacin de cepas bacterianas relacionadas. Sin embargo, la MEE solo es moderadamente discriminatoria cuando se utiliza en investigaciones epidemiolgicas que involucran a L. monocytogenes. Algunas cepas pueden carecer de ciertas actividades enzimticas y, por tanto, la tcnica puede resultar complicada. Debido precisamente a su naturaleza, los resultados procedentes de diferentes laboratorios son muy variables (30). iv) Anlisis del ADN cromosmico mediante endonucleasas de restriccin
El anlisis del ADN cromosmico mediante endonucleasas de restriccin (REA) es un mtodo til de tipificacin de L. monocytogenes. Como estas enzimas son muy especficas en el reconocimiento de las secuencias de nucletidos, los fragmentos resultantes de la digestin del ADN, de tamaos y movilidad electrofortica diferentes, reflejan las diferencias genmicas, lo que resulta en unas huellas dactilares especficas para cada una de las distintas cepas relacionadas. El mtodo presenta un grado alto de reproducibilidad debido a la especificidad de las endonucleasas de restriccin. De las endonucleasas de restriccin probadas con L. monocytogenes en un estudio multicentro de la Organizacin Mundial de la Salud (WHO), las ms utilizadas fueron HaeIII, HhaI y CfoI (30). Sin embargo, debido al nmero elevado de sitios potenciales de reconocimiento enzimtico en el genoma bacteriano, a veces las huellas dactilares complejas se desarrollan con baja resolucin o con solapamiento de las bandas, lo que dificulta su interpretacin. La tcnica no es adecuada, por tanto, para comparar un gran nmero de patrones de cepas o para elaborar bases de datos dinmicas (30). Cuando se combina el REA con un anlisis de hibridacin de tipo Southern, que emplee sondas cromosmicas marcadas, solo se detectarn los fragmentos de restriccin especficos asociados con los loci cromosmicos correspondientes, por lo que se analizar un nmero significativamente reducido de fragmentos de ADN. Esta tcnica se conoce como anlisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP). Cuando se utilizan sondas de ADN correspondientes a los RNA ribosmicos, se detectan nicamente los fragmentos de restriccin concretos asociados con los loci cromosmicos de los ARNr. Esta tcnica se denomina ribotipificacin y se utiliza ampliamente en la tipificacin de L. monocytogenes, principalmente con la endonucleasa de restriccin EcoRI. Sin embargo, esta tcnica tiene un poder de discriminacin menor que la fagotipificacin, el REA o la MEE. La compaa Qualicon ha diseado un sistema de ribotipificacin automtico, el RiboPrinter, que genera, analiza y almacena los patrones de huellas de ribotipificacin de diversas bacterias, incluida Listeria. Si se emplean endonucleasas de restriccin con baja frecuencia de corte para digerir ADN cromosmico ntegro, tales como los enzimas ApaI, SmaI, NotI o AscI, se obtienen fragmentos muy grandes. A causa de su tamao, estos fragmentos grandes no se pueden separar cuando se someten a una electroforesis convencional en gel de agarosa. Sin embargo, aplicando cambios peridicos de la orientacin del campo elctrico a lo largo del gel, a travs de pulsos, los fragmentos grandes pueden avanzar lentamente en la matriz de agarosa y separarse de acuerdo a sus diferencias de tamao. Esta tcnica se conoce como electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y ha revolucionado la separacin precisa de los fragmentos de ADN de tamao superior a 40 kilobases. La PFGE se aplica en la tipificacin de L. monocytogenes y se ha visto que es un mtodo muy reproducible y discriminatorio. Particularmente, la PFGE es til para la tipificacin de los aislamientos del serotipo 4b, los cuales no se tipifican de forma satisfactoria mediante la mayor parte de los mtodos de tipificacin disponibles. Las principales desventajas de la PFGE son el tiempo de duracin del procedimiento (23 das) y el gasto de grandes cantidades de enzimas de restriccin, que son caras, al igual que el equipamiento especializado necesario para llevarlo a cabo (30). El Centro para la Prevencin y Control de Enfermedades (CDC) de los EE.UU. ha establecido la PulseNet, una
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red informtica de laboratorios reguladores de los alimentos y de la salud pblica que tipifica de manera rutinaria mediante PFGE las bacterias patgenas de transmisin alimentaria. Los laboratorios de la PulseNet emplean protocolos estandarizados rigurosos que pueden comparar rpidamente los patrones obtenidos por PFGE procedentes de lugares diferentes, va Internet. Listeria monocytogenes se incorpor a la red PulseNet en 1999 (60). v) Tipificacin basada en la secuencia de los cidos nucleicos
Aunque se han publicado trabajos acerca del anlisis de la secuencia de genes nicos como medio para tipificar las cepas de L. monocytogenes, la determinacin de la variacin allica de genes mltiples se presenta como una metodologa de tipificacin muy prometedora para este microorganismo. Este enfoque se ha descrito para un grupo reducido de otros microorganismos y se conoce como tipificacin basada en la secuencia multi locus (MLST) (59). Se han utilizado con un buen grado de discriminacin entre las cepas analizadas la amplificacin directa y la secuenciacin de nucletidos (19, 53) as como una aproximacin alternativa que apunta a los cambios genticos variables directamente en un formato de micromatriz de ADN (52). Debido a que la MLST se basa en la secuencia de nucletidos, es muy discriminatorio y proporciona resultados precisos. Los elementos de secuencia corta repetitiva estn ampliamente distribuidos entre las bacterias y las unidades palindrmicas, conocidas como palndromes extragnicos repetitivos (REP), constituyen la familia mejor caracterizada de secuencias bacterianas repetitivas. Los elementos REP estn presentes en L. monocytogenes y se ha utilizado con xito una PCR basada en la secuencia de estos elementos (repPCR) para tipificar cepas de dicho microorganismo. Los cuatro principales grupos de cepas identificados por este mtodo coincidieron con el origen de su aislamiento (42). vi) Amplificacin aleatoria del ADN polimrfico
Cuando en la PCR se emplean cebadores seleccionados de forma arbitraria bajo condiciones de baja estringencia, con ADN cromosmico de L. monocytogenes como molde, los perfiles de los productos de la amplificacin generados son tiles para la tipificacin de las cepas. La RAPD es una alternativa viable a la fagotipificacin y presenta un grado elevado de discriminacin. Sin embargo, a pesar de su simplicidad relativa y su capacidad discriminatoria, su desventaja principal es la reproducibilidad irregular de los perfiles. Las condiciones de baja estringencia para templar los cebadores provoca una polimerizacin con eficiencias diversas y, por tanto, las cantidades de ADN producidas pueden variar ampliamente entre los diferentes productos de la amplificacin procedentes de un aislamiento concreto, lo que dificulta la comparacin e interpretacin de los perfiles de la RAPD. La tcnica requiere un gran acuerdo de estandarizacin y regularidad para obtener resultados fiables (30). Basndose en los resultados del estudio multicentro de tipificacin de L. monocytogenes de la WHO (26), que compara diversos mtodos de tipificacin diferentes mediante la utilizacin de una coleccin bien definida de aislamientos, se seleccionaron para la estandarizacin en Fase II, la serotipificacin, la fagotipificacin, el REA, la PFGE y la RAPD. Finalmente este esfuerzo debera resultar en una coleccin seleccionada de mtodos estandarizados de tipificacin de L. monocytogenes (30).
2.
Pruebas serolgicas
Tradicionalmente las pruebas serolgicas para la deteccin de anticuerpos no se han utilizado para diagnosticar la listeriosis. Han sido poco fiables, carentes de sensibilidad y de especificidad. Se han intentado sin xito varios formatos, incluyendo la tcnica ELISA, la fijacin del complemento y la microaglutinacin, en el diagnstico de casos de listeriosis humana demostrada en cultivo, incluso en ausencia de inmunosupresin. Se ha observado una considerable reaccin cruzada con determinantes antignicos de otros organismos Gram-positivos. Por otra parte, L. monocytogenes es un microorganismo ubicuo y es muy comn la exposicin habitual de los animales y del hombre a este microorganismo. Muchos individuos sanos son portadores intestinales (26%) y en el hombre se ha descrito la prevalencia de anticuerpos sricos anti-L. monocytogenes en un nivel tan alto como del 53%. El nivel de portadores en los animales es similar al de humanos, con algunas diferencias dependiendo de la especie y una tasa algo mayor durante la estacin de estabulacin en comparacin con la de pastoreo de los animales (36, 37). El descubrimiento reciente de que la hemolisina de L. monocytogenes, la listeriolisina O (LLO), es el principal factor de virulencia y que puede estimular una respuesta de anticuerpos, ha hecho reanudar el inters acerca de la posibilidad de utilizar las pruebas serolgicas para el diagnstico de la listeriosis, en particular en los pacientes afectados en el sistema nervioso central, con lquido cerebro espinal y sangre estriles, y en los casos de listeriosis perinatal. En el diagnstico de la listeriosis experimental de ovejas se aplica un ELISA indirecto basado en la deteccin de los anticuerpos anti-LLO (46). Sin embargo, la LLO est relacionada antignicamente con varias citolisinas, entre ellas la estreptolisina O (SLO) de Streptococcus pyogenes, la pneumolisina de S. pneumoniae y la perfringolisina de Clostridium perfringens. Los problemas de reactividad cruzada de los anticuerpos anti-LLO con las citolisinas, particularmente con la SLO y la neumolisina, han obstaculizado el desarrollo de pruebas serolgicas especficas y fiables basadas en la deteccin de anticuerpos anti-LLO. Adems, los anticuerpos anti-LLO se encuentran en una proporcin de individuos sanos y pacientes con
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infecciones producidas por otras bacterias, hongos o virus (27%, en conjunto), aunque con ttulos inferiores a los presentados por pacientes con listeriosis. La absorcin de los antisueros que se van a diagnosticar con la SLO es solo parcialmente efectiva para eliminar la reactividad cruzada completa. Estos ensayos experimentales se han utilizado en algunas investigaciones epidemiolgicas y como apoyo al diagnstico de infecciones del sistema nervioso central con resultado negativo en cultivo. Las formas recombinantes de la LLO se han probado como alternativas a la LLO de tipo silvestre como antgeno de diagnstico en ensayos de inmunoelectrotransferencia. Actualmente este es un campo en evolucin y todava tendremos que esperar para conseguir el desarrollo de pruebas serolgicas validadas y fiables para el diagnstico de la listeriosis. La deteccin inmunohistoqumica de antgenos de L. monocytogenes en tejido fijado con formalina ha resultado ser ms sensible que la siembra en placa y el cultivo bacteriano con enriquecimiento en fro para el diagnstico de la forma encefaltica de la enfermedad en los rumiantes (20, 43).
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO

Se ha comprobado que es muy difcil desarrollar vacunas efectivas contra L. monocytogenes que, al ser un microorganismo intracelular, necesita de la participacin de los linfocitos T efectores para desencadenar una respuesta inmune efectiva. Se han estudiado vacunas experimentales utilizando animales de laboratorio con el fin de conferir proteccin frente a la infeccin por L. monocytogenes mediante una serie de diferentes aproximaciones, pero estas todava se encuentran lejos de estar disponibles para ser utilizadas en el hombre o en los animales domsticos. Estos enfoques experimentales comprenden la inmunizacin con ADN plasmdico, la sealizacin de los CD40 junto con L. monocytogenes inactivada por calor, el empleo de mutantes deficientes en LLO inoculados junto con LLO encapsulada en liposomas, y la inmunizacin con antgenos listeriales e IL-12. La modificacin gentica de L. monocytogenes se est considerando como un vector efectivo vacunal para la expresin, secrecin y transporte intracelular de antgenos extraos para inducir respuestas inmunes potentes frente a antgenos vricos y clulas tumorales. Sin embargo, el medio ms prctico y factible de reducir el riesgo de listeriosis en humanos es a travs de medidas dietticas y de preparacin de alimentos que no solo reducen el riesgo de adquirir listeriosis, sino que tambin contribuyen a la prevencin de otras infecciones comunes transmitidas por alimentos tales como las causadas por Escherichia coli O157:H7, Salmonella y Campylobacter. Estas medidas preventivas comprenden la coccin completa de los alimentos crudos de origen animal, el mantenimiento de las carnes no cocinadas alejadas de las verduras, alimentos cocinados y alimentos preparados, el lavado a fondo de verduras frescas antes de comerlas, el lavado de manos, cuchillos y tablas de corte despus del manejo de alimentos no cocinados y evitar leche no pasteurizada o sus productos derivados. Las personas inmunodeprimidas, mujeres gestantes y otros grupos de alto riesgo de contraer la listeriosis deberan evitar los alimentos que se han asociado epidemiolgicamente a esta enfermedad, p. ej. quesos frescos y pat. Estos individuos deberan evitar tambin otros alimentos ya preparados a menos que sean calentados hasta ebullicin antes de ser consumidos. La industria alimentaria y las agencias de salud pblica desempean un papel crucial en la prevencin de la listeriosis transmitida por alimentos mediante el desarrollo y puesta en prctica de programas efectivos HACCP para reducir la presencia de L. monocytogenes en todos los puntos crticos durante la produccin de alimentos y en la cadena de distribucin (desde la granja al mercado). Igualmente, la falta de vacunas bien diseadas y probadas para uso en animales, significa que el control de la listeriosis en animales es ms factible evitando las condiciones medioambientales que favorezcan su presentacin. Existe un nexo bien establecido entre la alimentacin con ensilado y la listeriosis y, como L. monocytogenes se encuentra distribuida ampliamente en la naturaleza, actuando como portadores los animales y las aves, no es infrecuente la contaminacin del ensilado. Por tanto, se tendra que reducir la probabilidad de multiplicacin del microorganismo, lo que sucede con ms frecuencia a valores de pH mayores a 5, en particular en los casos en los que se produce una fermentacin ineficaz o hay un desarrollo concomitante de mohos. Habra que intentar que la produccin del ensilado resultara de buena calidad, con un corte temprano de la hierba, con la contaminacin mnima de tierra o heces y asegurando una fermentacin anaerbica ptima, para garantizar que el pH disminuya hasta quedar por debajo de 5,0; a ese nivel, se inhibe el crecimiento de Listeria spp. Debera seleccionarse el mejor ensilado para la alimentacin, especialmente en el caso de las ovejas, descartando el material con seales claras de contaminacin con hongos. Tambin debe eliminarse el material que ocupa los primeros centmetros de la parte superior, la parte frontal y los costados de la alpaca o bolsa despus de abrirla. Se tendran que eliminar las sobras del ensilado (47).
REFERENCIAS
1. ANDREWS W. (2002). Current State of Conventional Microbiological Methodology for the Examination of Food. In: Workshop 10215. Microorganisms in Foods: Now What? American Society for Microbiology, Washington, DC, USA.
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ii) iii) iv) v)

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Mtodos de identificacin convencional

V: variable; (+): reaccin dbil; +: >90% reacciones positivas; : sin reaccin.

Mtodos de identificacin rpida

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Mtodos de reconocimiento de los cidos nucleicos

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Ensayo GENE-TRAK para Listeria

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Sherlock Microbial Identification System (MIS) Microscreen VIP Listeria

L. monocytogenes/innocua complejo Listeria spp. Listeria spp.

1 minuto 2 minutos (despus del enriquecimiento) 4872 horas 43 horas 43 horas

Microgen BioProducts BioControl Systems

Listeria spp. Listeria spp. Listeria spp.

Separacin inmunomagntica Immunocromatografa Immunocromatografa Separacin inmunomagntica

Dynal Neogen Oxoid

Deteccin Deteccin Deteccin

Listeria spp. Listeria spp. L. monocytogenes

ELISA ELISA ELISA

50 horas 50 horas 50 horas

BioControl Systems bioMrieux bioMrieux

Deteccin Deteccin Deteccin

Listeria spp. L. monocytogenes Listeria spp.

ELISA ELISA ELISA automtico

50 horas 50 horas 48 horas

Diffchamb Diffchamb Foss Electric

Deteccin Deteccin Deteccin

1: Adaptado y extendido a partir de la ref. 15

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Utilizacin principal Confirmacin

Gen-Probe (AccuProbe) VIT Listeria Kit

L. monocytogenes/ Listeria spp. L. monocytogenes Listeria spp.

Biotecon Diagnostics Gene Trak

Sanofi Diagnostics Pasteur Roche Applied Science

PCR en tiempo real

PCR en tiempo real

Roche Applied Science

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C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO

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