REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE AMAR TELIDJI LAGHOUAT

FACULTE DES SCIENCES ET SCIENCES DE LINGENIEUR

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

Rapport de Fin de Stage de Licence

Domain : Sciences de la Nature et de la Vie (SNV) Filire : Biologie Molculaire et Cellulaire Option : Biochimie fondamentale et applique

Par:
BELLAKHDAR Amina & CHAIR Wahiba

THEME

Contribution ltude des fractions protiques de diffrentes sources du lait

Anne Universitaire 2010/2011

Remerciements
On exprime nos remerciements et notre gratitude mademoiselle KHACHEBA Ihcen et mademoiselle BENAROUS Khedidja de nous avoir guid et encourag pendant toute la dure de notre travail, ainsi qua la confiance quelles nous ont attribue tout au long de notre tude. En mme temps nous tenons exprimer notre profonde gratitude au chef de dpartement de biologie Monsieur OUINTEN Mohammed.

Ddicace
Je ddie ce modeste travail mes parents pour leur soutien durant ma vie intellectuelle. Mon chers frre Gana Hafid pour avoir t prsent mes cts de mavoir guid et orient durant mes tudes. Sans oublie : Mes frres : Mohamed, Lakhdar, Boubakeur, Omar, et Belhout. Mes surs : Khaira, Fatima. Khadidja et Naima. Mon binme Wahiba. Tous mes amis.

Amina.

Ddicace
Je remercie Allah de mavoir facilit toute les difficults et dirige vers la bonne voie. Je ddie ce travail aux deux plus chres personnes de ma vie mes parents auxquels je tmoigne toute mes reconnaissances pour ses inquitudes ses sacrifices et ses encouragements durant toute ma vie. A mes frres Ben youcef et Hamza et leurs petits familles. A mes surs Hadja, Houria, Saida Et les petits Mohammed Khalil et Fatima. A toute ma famille. A mon binme Amina. A mes amis.

Wahiba.

Table des matires

Rsum... Liste des figures.. Liste des tableaux... Introduction gnrale.. Bibliographie... Synthse bibliographique Chapitre I : Le Lait I. 1. Dfinition du lait. I. 2. Constituants du lait.. I. 3. Les caractristiques du lait.. I. 4. Le caillage du lait... I. 5. Types de lait I. 5.1. Lait cru I. 5.2 .Lait trait par chaleur. I. 5.3. Lait pasteuris. I. 5.4. Lait concentr.. I. 5.5. Lait sec.. Bibliographie.. Chapitre II : Les protines II. 1. Historique.. II. 2. Dfinition des protines II. 3. Classification des protines... II. 3.1. Classification en fonction de la forme des molcules... II. 3.2. Classification en fonction de la solubilit.. II. 3.3. Classification en fonction de la composition. II. 4. Caractristique physique et chimique des protines.. II. 4.1. Dnaturation... II. 4.2. Solubilit.... II. 4.3. Poids et masse molculaires.. II. 4.4. Caractre amphotre.. 11 11 11 11 12 12 12 12 13 13 13 6 6 8 8 8 8 8 8 9 9 10 1 2 3 4 5

II. 4.5. Mobilit lectrophortique-Electrophorse-Electrofocalisation. II. 5. Structure des protines.. II.5.1. La structure primaire... II.5.2. La structure secondaire.... II.5.3. La structure tertiaire. II.5.4. La structure quaternaire... II. 6. Importance biologique des protines. Bibliographie.. Chapitre III : Principales mthodes dextraction et de dosage des protines III. 1. Mthodes dextraction des protines... III. 1.1. Les principales mthodes dextraction des protines.. III. 1.2. Principes de purification dune protine.. III. 2. Mthodes de dosage des protines... Bibliographie.. Partie exprimentale

14 14 14 14 14 14 15 16

17 17 18 19 21

I. Extraction des protines I. 1. Echantillon du lait... I. 2. Extraction des protines. I. 3. Rsultats et discussions... Bibliographie.. II. Dosage des protines II. 1. Principe de la mthode.. II. 2. La courbe dtalonnage de lalbumine.. II. 3. Mise en uvre du dosage.. II. 4. Rsultats et discussions. Bibliographie.. Conclusion gnrale.. 26 26 27 27 30 31 22 22 22 25

: . . . . 4,72 6,71% / . : / 42764 4276,4 /. . . :

Rsum: En nutrition, la composition du lait est importante. Tout compos qui s'y trouve possde priori une utilit nutritionnelle ou immunitaire. C'est donc la composition du lait qu'il importe de bien connatre en nutrition. Les protines laitires font parties du groupe des trois lments de base de la nutrition. Cette prsente etude rentre dans le cadre dune contribution ltude de la composition en protines de deux types de lait de la rgion de Laghouat (lait de vache et de chvre) et un lait commercial Candia. Dans un premier temps, nous avons ralis une extraction de la fraction protique totale par prcipitation acide, les rsultats montrent clairement que les teneurs en extrait bruts varient entre 4,72 6,71 % m/m. Dans un second temps, nous avons procd la quantification des protines par une mthode spectrophotomtrique : la mthode de Biuret, en utilisant l'albumine comme talon. Le contenu en protines est exprim en mg/ml dont les valeurs sont comprises entre 21,42 et 271,42 mg/ml quivalent en albumine. L'ensemble de ce travail a permis de connatre de manire globale le contenue en protine chez les trois types de laits tudis, ce qui nous encourage approfondir la recherche pour caractriser les protines et les acides amin prsent dans le lait. Mots cls: Lait, protine, lait de chvre, lait de vache et lait commercial.

Abstract: In nutrition, the composition of milk is important. Every compound in it has in evidence a nutritional or immune useful. So the composition of milk that is important to know in nutrition. Milk proteins are among the group of three basic elements of nutrition. The present study falls within the framework of a contribution to the study of protein composition of two types of milk in the region of Laghouat (cow and goat milks) and a commercial milk, "Candia". Initially, we performed an extraction of total protein by acid precipitation, the results clearly show that the levels of crude extract ranged from 4.72 to 6.71% w/w. In a second part, of this work, we performed a quantification of proteins by a spectrophotometric method: the Biuret method, using albumin as a standard. The protein content is expressed in mg / ml with values ranging from 21.42 to 271.42 mg/ml of albumin equivalent. All this work has comprehensively determined the protein content among the three types of milk studied, which encourages us to further research to characterize proteins and amino acids in milk. Key words: Milk, protein, cow milk, goat milk and commercial milk.

Liste des figures

N 1 2

Intitul Modle noyau enveloppe (Modle de Waugh). Schma reprsentant le phnomne de prcipitation au sulfate dammonium (Koolman, 2005).

Page 7 17

3 4

Schma reprsentant le phnomne de dialyse (Koolman.2005). La courbe dtalonnage de lalbumine.

18 26

Liste des tableaux

N 1

Intitul Composition moyenne en g.l-1des laits de diffrentes espces animales (Alais, 1984 ; Luquet, 1985 ; Belitz et Grosch, 1987).

Page 7

2 3 4 5

Caractres physico-chimique du lait (Bourgeos et al, 1996). Type de lait utiliss et leur pH. Teneur, aspect, couleur et masse des extraits protiques. Teneur en protine de chaque type de lait.

8 22 22 27

Introduction gnrale

Introduction

Aliment biologique par excellence, le lait fut de tous temps un symbole de fertilit, de richesse et d'abondance. Si les sicles passent, le lait demeure(Allali.,2000). Le lait est la seule nourriture consomm par tout jeune mammifre au dbut de sa vie; il doit contenir tous les lments nutritifs ncessaires la croissance. Le lait est en fait un des aliments les plus complets qui soit (Gaumond et Anctil.,2005). La fonction premire du lait est de nourrir la progniture jusqu' ce qu'elle soit sevre, c'est-dire capable de digrer d'autres aliments. Dans la plupart des civilisations humaines, le lait des animaux (eux-mmes mammifres) domestiques (vache, brebis, chvre, jument, dri (yak), chamelle, dromadaire, bufflonne, renne) est couramment consomm.R Le prsent travail, entre dans le cadre dune contribution ltude physico - chimique dune matire premire aux multiples ressources Le lait de quelques mammifres locaux dans la rgion de Laghouat. Les composants majeurs du lait sont : leau, les lipides, les protides, les glucides et les sels minraux. On retrouve galement en quantit moindre : des vitamines, des enzymes, des pigments et des gaz dissous. Le lait est donc un mlange dune grande complexit. Dans le cas prsent, ce sont les protines qui nous intressent. Elles font parties du groupe des trois lments de base de la nutrition : les protines, les glucides et les lipides. Les protines ont plusieurs fonctions : elles soutiennent les tissus, reprsentent la principale composante de nos fibres musculaires, emmagasinent et transportent des substances, transmettent des messages dans le corps, dfendent lorganisme et ont aussi la fonction denzyme. On les retrouve principalement dans la chair et le foie des animaux, le lait, les ufs et dans certaines plantes tels que : le soya et les fves blanches. Notre travail sera ralis selon les tapes suivantes: La premire partie est consacre une tude bibliographique sur le lait un aperu gnral sur les protines ainsi quun rappel sur mthodes dextraction et de dosage des protines. La deuxime partie est rserve la description du protocole exprimental. Linterprtation et la discussion des rsultats obtenus seraient prsentes dans la dernire partie.

Bibliographie

ALLAL1, F., BOUADJAMA, Noureddine., DA SILVA, J., DIA, K., GIRARD, S.,

LE DEZ, F., MUNIER, M., OUALI ALAMY, I., SIMATI, A., VANDREDEUIL, D et ZAMPARI, J., 2000. Le lait. 1 pp. GAUMOND, G., et ANCTIL, F., 2005. Sparation de la casine du lait et isolation

de un ou plusieurs acides amins. 2 pp.

Synthse Bibliographique

I. Le lait

Synthse bibliographique

Le lait

I. 1. Dfinition du lait: Le lait est un liquide scrt par les glandes mammaires des femelles aprs la naissance du jeune. (Sandra et al, 2001). Il sagit dun fluide aqueux opaque, blanc, lgrement bleut, dune saveur doucetre et dun pH (6.6 6.8) lgrement acide, proche de la neutralit (Sandra et al, 2001). Le lait est produit par les mammifres femelles. La lactation, fait pour les femelles de ces espces de produire du lait, est une des caractristiques dfinissant les mammifres. Le lait est produit par les cellules scrtrices des glandes qui chez les thriens sont contenues dans les mamelles. Le lait scrt dans les premiers jours de lactation s'appelle le colostrum (Dillon, 1989). I. 2. Constituants du lait : Le lait, proche du plasma sanguin, est un srum comportant une mulsion de matire grasse, une suspension de matire protique caseuse, du lactose, des sels et minraux, des protines solubles et des traces dlments divers (Sandra et al, 2001). Les principaux constituants du lait sont donc par ordre dcroissant: a. Leau trs majoritairement. b. La matire glucidique (Lactose) : On retrouve essentiellement du lactose environ 50g/l dans le lait de vache. Il est synthtis dans la mamelle partir du glucose sanguin. Il est important dans lindustrie car son utilisation par les bactries permet de former progressivement de lacide lactique (Aurlien., 2010). c. La matire grasse: elle est considre avec les protines comme la matire noble du lait. Elle est compose en majorit de triglycrides (98%), puis de phospholipides (1%) et de cholestrol (1%) (Aurlien., 2010). d. La matire protique : Parmi les protines, on retrouve deux types majeurs : Les protines solubles : Elles reprsentent 20% de la quantit totale de protine en masse. On retrouve les immunoglobulines, les lactoferrines Les casines rassembles en micelles (figure 1) : Ce sont des protines spcifiques du lait, entirement synthtises par mamelle et elles sont majoritaires (80%) (Aurlien., 2010).

Synthse bibliographique

Le lait

Figure 1 : Modle noyau enveloppe (modle de Waugh) (in Boughellout , 2007). e. Des sels et minraux : ltat ionique et molculaire. f. Les enzymes : Le lait contient principalement trois groupe denzymes : les hydrolases, les dshydrognases (ou oxydases) et les oxygnases (Amiot et al., 2002, in Abdi., 2009). g. Les vitamines : Le lait est une bonne source en vitamines, on distingue les vitamines hydrosolubles (vitamines : B1, B2, B6 ) et les vitamines liposolubles(Vitamine :A, D,E, K). (Mahaut et al., 2000, in Boufris D,Saadadou ., 2006). Le tableau 1 prsente la composition moyenne du lait de quelques espces. Le lait de chvre a une composition voisine du lait de vache, alors que celle du lait de brebis est nettement diffrente (Mahaut et al., 2000 in Boufris ,Saadadou , 2006). Tableau 1. Composition moyenne en g.l -1 des laits de diffrentes espces animales (Alais, 1984 ; Luquet, 1985 ; Belitz et Grosch, 1987in Rania ABI AZAR.,2007). Lait de Vache Brebis Chvre Chamelle Protines totales 32 55 28 30 Casines 28 45 23 28 Lactose 40 - 60 47 44 - 47 33 Matires grasses 39 71,9 33,8 53,8 Minraux totaux 9 9 5 -8 7

Synthse bibliographique
I. 3. Les caractristiques du lait :

Le lait

Les principales caractristiques physico-chimique du lait sont regroupes dans le tableau 2. Tableau 2. Caractres physico-chimique du lait (Bourgeois et al., 1996 in Boufris , Saadadou ., 2006). Caractres pH Acidit Densit Temprature de conglation I. 4. Le caillage du lait : La coagulation de lait correspond une dstabilisation de ltat micellaire original de la casine. Elle peut tre effectu sur un lait frais au cours dacidification, donnant un gel aux proprits diffrentes.(Baron et al ., 1985 in Abdi ., 2009). o Coagulation naturelle (Aouifat et Zakhrouf.,2008). o Coagulation enzymatique (Aouifat et Zakhrouf.,2008). o Coagulation par acidification (Aouifat et Zakhrouf.,2008). I. 5. Types de lait : I. 5.1. Lait cru : La flore du lait cru est abondante et susceptible dvoluer rapidement. Il faut donc abaisser sa temprature moins de 10C le plus rapidement possible, dans lheur qui suit la traite. La dure de conservation de ce lait est courte en raison de la possibilit du dveloppement des germes psychrophiles (quelque jour) (Guiraud., 1998). I. 5.2 .Lait trait par chaleur : Les traitements industriels peuvent consister en une modification de composition (lait crm ou lait demi crm par opposition au lait entier) et en un traitement thermique destin liminer les ventuels germes pathognes et prvenir laltration rapide et spontane du lait (Guiraud., 1998). I. 5.3. Lait pasteuris : Le lait pasteuris peut tre obtenu de plusieurs faons : Par pasteurisation basse temprature (30 minute 65C) ( peu prs abandonne) :LTLT (Low Temperature, Low Time). Valeurs 6,5 - 6,7 15 -18 D 1,028 1,036 -0,51C -0,55C

Synthse bibliographique

Le lait

Par pasteurisation haute temprature, de 15 secondes 72C quelque secondes 95C : HTST. Ce lait doit tre conserv une temprature inferieur 10C. Sa conservation est limite (quelques jours). Le traitement UHT ( Ultra Haute Temprature) consiste mettre le lait pendant 12 secondes ou moins 140-150C (Guiraud., 1998). I. 5.4. Lait concentr : Aprs pasteurisation, le lait est soit vapor, homognis et strilis dans un emballage tanche, par exemple 2 ,5 secondes 150C (lait concentr non sucr), soit sucr pendant ou avant lvaporation et emball sans strilisation (lait concentr sucr) (Guiraud, JP., 1998). I. 5.5. Lait sec : Le lait peut tre sch sur cylindre ou par atomisation (Il subit au pralable une pasteurisation). Le lait sec nest pas strile, il est stabilise par dshydratation (Guiraud., 1998).

Synthse bibliographique

Le lait

Bibliographie

ABDI K ., 2009. Etude de la coagulation du lait par des extraits enzymatiques partir des graines de chardon, du proventricule de poulet, et de la caillette du jeune chevreau. Thse dingniorat, Universit de Laghouat, 91 pp.

ABI AZAR Rania., 2007. Complexation des protines laitires par les extraits de gousses vertes de caroubier .Proprits technologiques des coagulums obtenu Thse de doctorat, Agroparistech Ecole Doctorale ABIES, 196 pp.

AOUIFFAT K, ZAKHROUF S., 2008.Dtermination par planification exprimentale de leffet de quelques paramtres physico-chimiques et culturaux sur la fermentation lactique du lait par Lactobacillus bulgaricus et Bifidobacterium actiregularis,Thse

dingniorat ,Universit de Laghouat ,63 pp. AURELEIN, V., 2010 .Influence du type dalimentation sur la texture et la flaveur du fromage. . Thse de doctorat, Ecole nationale vtrinaire, 97 pp. BOUFRIS D , SAADADOU L., 2006. Evaluation des risques microbiologique et de la qualit alimentaire : Cas de lenterotoxicose staphylococcique (Staphylococcus aureus ) par le lait cru et le fromage pate molle du commerce de btails de la ville de Laghouat . Thse dingniorat, Universit de Laghouat, 48 pp. DILLON J-C., 1989. Place du lait dans lalimentation humaine en rgion chaudes. I. N. A. PG., PARIS, (FRANCE), p163 168. GUIRAUD, J-P., 1998. Microbiologie Alimentaire, p138 ,139. SANDRA, ISABELLE, ANDREE et SIMONE., 2001. contribution ltude des variations de la composition du lait et ses consquences en technologie laitire. Thse de doctorat, Ecole nationale vtrinaire, 102 pp. 10

II.LES Protines

Synthse Bibliographique

Les protines

II. 1. Historique : La plupart des biologistes de XIXme sicle considraient que les protines n'taient pas des entits chimiques dfinies. A partir des rsultats d'analyse lmentaire de fibrine, d'ovalbumine et srum albumine. Mulder (1838) conclut que tous ces composs contenaient une substance (protine) est quelque atomes de soufre et de phosphore, le terme protine fut introduit en 1838 par BERZE LIUS qui avaient effectu l'analyse lmentaire de plusieurs protines (Jean., 2006). II. 2. Dfinition des protines : Les protines sont des grandes molcules, des macromolcules, formes par la condensation d'un grand nombre d'units appeles: aminoacides ou acides amins. Les protines sont de trs gros bio- polymres forms partir de seulement 20 monomres diffrents ces monomres sont les - aminoacides qui s'unissent par des liaisons peptidiques pour former des chaines polypeptidiques linaires (in Gougue., 2010). Les protines sont plus abondantes : 55% ont plus de poids sec de la cellule. Les plus universelles : prsentes dans les virus, bactries les plantes les animaux suprieurs. Les plus varis : plusieurs milliers de protines ont t caractrises et isoles. Les protines jouent un rle fondamental dans la structure et le fonctionnement cellulaire (Kessous., 2005). II. 3. Classification des protines : Diffrents types de classification ont t proposs II. 3.1. Classification en fonction de la forme des molcules : Protines fibreuses: ainsi appeles sclroprotines, elles sont constitues de fibres ou fibrilles et sont pratiquement insolubles. Les protines fibreuses sont appeles protines structurales car elles constituent le principal matriau de construction chez les Vertbrs. Elles sont linaires, insolubles dans l'eau et d'une grande stabilit (support mcanique aux tissus et rsistance la traction). Les principales protines fibreuses sont le collagne que l'on trouve dans les tissus conjonctifs, la kratine trouve dans la peau et les phanres (cheveux, poils, ongles, plumes)., le fibrinogne et les protines musculaires (Berrada.,2009).

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Synthse Bibliographique

Les protines

Protines globulaires: on les appelle aussi sphroproteines en raison de leur forme sphrique ou ovale, elles sont en gnrale solubles. Elles jouent un rle important dans le mtabolisme. Les albumines, les globulines, la casine et les hormones protiques sont des protines globulaires (Berrada., 2009). II. 3.2. Classification en fonction de la solubilit : Les albumines: qui sont solubles mme dans l'eau distille, elles prcipitent par addition de sulfate d'ammonium entre 70% et 100% de la saturation, leur point isolectrique est en gnral nettement infrieur 7, elles ont donc un caractre acide (Gougue., 2010). Les globulines: qui sont insolubles dans l'eau pure, mais solubles dans les solutions salines dilues (NaCl 5%), elles se prcipitent par addition de sulfate d'ammonium a 50% de la saturation (in Gougue., 2010). Les protamines et les histones: sont des protines solubles de taille relativement petite, caractrises par un trs net caractre basique d la prsence d'une forte proportion de lysine et d'arginine, ce qui leur confre un point isolectrique lev. Les globines: se distinguent par une teneur relativement leve en histidine, elles constituent la partie protique des hmoglobines et des myoglobines. Les prolamines et glutlines: sont des protines vgtales, insolubles dans leau, mais solubles dans les acides et les bases dilues (in Gougue., 2010). II. 3.3. Classification en fonction de la composition : Les holoprotines: qui ne sont constitues que d'acides amins. Les htroprotines: qui comportent d'une part, une ou plusieurs chaines polypeptidiques et d'autre part, une partie non protique appele groupement prosthtique qui est lie de manire covalente (in Gougue., 2010). II. 4. Caractristiques physiques et chimiques des protines : II. 4.1. Dnaturation : Une protine est dnature lorsque sa conformation tridimensionnelle spcifique est change par rupture de certaines liaisons sans atteinte de sa structure primaire. Il peut s'agir, par exemple, de la dsorganisation de zones en hlice . La dnaturation peut tre rversible ou irrversible. Elle entrane une perte totale ou partielle de l'activit biologique. Elle produit trs souvent un changement de solubilit de la protine.

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Synthse Bibliographique
Les agents de dnaturation sont nombreux :

Les protines

agents physiques : chaleur, radiations, pH ; agents chimiques: solution d'ure qui forme de nouvelles liaisons hydrogne dans la protine, solvants organiques, dtergents... (in Gougue., 2010).

II. 4.2. Solubilit : Les relations des protines avec l'eau sont complexes. La structure secondaire des protines dpend dans une large mesure de l'interaction des liaisons peptidiques avec l'eau par l'intermdiaire de liaisons hydrogne. Des liaisons hydrogne se forment galement soit entre radicaux de la protine (structures alpha et bta) soit entre ses radicaux hydrophiles libres et l'eau. La solubilit des protines dans une solution aqueuse contenant des sels dpend de deux effets antagonistes lis d'une part aux interactions lectrostatiques ("salting in"), et d'autre part aux interactions hydrophobes ("salting out"). A basse force ionique, la solubilit des protines augmente lorsque la concentration en sels croit, jusqu' un certain seuil. Au-del, elle diminue avec l'addition de sels. Influence du pH : la solubilit est minimale au pH isolectrique (Voet.,2004). II. 4.3. Poids et masse molculaires : C'est une caractristique fondamentale de chaque protine. Elle se dfinit par deux expressions quivalentes qui doivent tre distingues :

Le "poids molculaire" ou "masse molculaire relative", Mr est sans dimension. La "masse molculaire" (symbole m), gnralement exprime en daltons (Da) pour les protines.

Pour les protines, on utilise souvent la Mr. Cette caractristique est estime par diverses mthodes, par exemple:

la filtration sur gel, ou chromatographie d'exclusion strique. L'lectrophorse sur un gel de polyacrylamide en gradient.

Le poids molculaire des protines varie de quelques milliers 1 million ou plus (Stenesh..,1998). II. 4.4. Caractre amphotre : Cependant, les peptides sont des molcules porteuses de charges au pH physiologique cause des charges sur les groupements C et N terminaux et sur les groupements fonctionnels des carbones alpha des acides amins polaires.

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Synthse Bibliographique

Les protines

La charge varie avec le pH : en milieu acide, les protines s'ionisent comme des bases et sont chargs positivement. En milieu alcalin, elles forment des anions. Il existe un point de pH pour lequel les charges + et - sont quivalentes, la charge nette tant donc nulle ; c'est le point isolectrique, ou pHi, de la protine qui alors ne se dplace plus dans un champ lectrique (Borel et al.,1997). II. 4.5. Mobilit lectrophortique - Electrophorse Electrofocalisation : Soumises un champ lectrique, les protines se dplacent plus ou moins suivant leur charge : c'est la mobilit lectrophortique qui permettra donc, s'il y a un mlange de protines de les sparer par lectrophorse Coutouly et al.,2004). II. 5. Structure des protines: Les protines sont des squences linaires d'acides amins lis entre eux par des liaisons peptidiques (liaison covalente) ( Hames, et al.,1999). II.5.1. La structure primaire: La squence linaire d'acides amins unis par liaisons peptidiques constitue la structure primaire de la protine ( Hames, et al.,1999). II.5.2. La structure secondaire : La structure secondaire d'une protine fait rfrence des rgions de repliement rgulier de la chaine polypeptidique .les deux types de structure secondaire les plus communs sont l'hlice et le feuillet -pliss. L'hlice a un arrangement hlicodal des acides amins dans la chaine polypeptidique maintenue par des liaisons hydrognes parallles l'axe de l'hlice. Dans un feuillet , les liaisons hydrognes se forment entre des rgions adjacents du polypeptide qui soit ont la mme orientation (feuillet parallle) soit sont orientes dans des directions opposes (feuillet antiparallle) ( Hames, et al.,1999). II.5.3. La structure tertiaire : Dans une protine, la structure tertiaire dcrit l'arrangement tridimensionnel de tous les acides amins situs dans la chaine polypeptidique .cette conformation native ,biologiquement active ,est maintenue par de multiples liaisons non covalentes ( Hames, et al.,1999). II.5.4.La structure quaternaire: Si une protine est constitue de plus d'une chaine polypeptidique, elle est considre comme ayant une structure quaternaire . Ceci se rfre l'arrangement spatial des sous-units du polypeptide et la nature des interactions existant entre elle ( Hames, et al., 1999).

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Synthse Bibliographique

Les protines

II. 6. Importance biologique des protines : Une dfinition de la fonction d'une protine utilisable d'un point de vue biologique ncessite une description plusieurs niveaux : (Petsko et Ringe., 2009). o Rle dans la croissance et l'entretien des cellules. o Elle est responsable de la contraction des muscles. o Le transport: Lhmoglobine transporte l'oxygne dans le sang; les lipoprotines

transportent les lipides et le cholestrol. o La catalyse: Les enzymes sont essentielles presque toutes les ractions biochimiques de lorganisme. o Le sang contient d'autres protines de transport pour le fer, les hormones strodes et d'autres substances. o La rgulation du pH: Un grand nombre de protines plasmatiques, notamment l'albumine peut servir d'acide ou de base dans un systme tampon, Elles empchent les variations excessives du pH sanguine en captant ou en librant des protons H. o La dfense de l'organisme: Les anticorps sont des protines trs spcialises qui reconnaissent et inactivent les bactries, les toxines et certains virus. Ils participent la rponse immunitaire, qui contribue protger l'organisme contre les substances trangres et les microorganismes. Les protines du complment, en circulation dans le sang, amliorent l'activit du systme immunitaire et stimulant la raction inflammatoire, un mcanisme de rsistance non spcifique de l'organisme. o Les chromosomes, qui transmettent toutes les caractristiques hrditaires sous forme de gne, sont constitus d'acides nucliques et de protines(histones). (Berrada S., 2009)

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Synthse Bibliographique

Les protines

Bibliographie
BERRADA, S., 2009. Biochimie appliqu dans les filires SBSSA (Cours des protines), Academ de mont- pellier, p 1-13. B.D HAMES, , N.M Hooper et J.D Houghton., 1999. LEssentiel en Biochimie, Dpartement de Biochimie et Biologie molculaire, University of Leeds, Leeds, UK, p 27, 28. GOUGUE, F., 2010. Valorisation de l'activit antioxydante des fractions: lipidiques, protiques et phnoliques du mil local magister, Universit de Laghouat, 140 pp. JEAN, B., 2006. Histoire de la science des protines, p 29. KESSOUS, C., 2005.Biochimie structurale, 11eme Edition, p 5. PETSKO et RINGE., 2009.Structure et fonction des protines, p50. VOET, D., et VOET, J., G. 2004. Biochimie. 131 pp. STENESH, J., 1998. Biochemistry. Plenum press. 48 pp. BOREL, J., RANDOUX, A., MAQUART, F. X et GILLERY, P., 1997. Biochimie dynamique. dition de beock & lacier s. a. 177 pp. COUTOULY, G., KLEIN, E et BARBIERI, E. M., 2004. Travaux dirigs de biochimie, biologie molculaire et bioinformatique. 3 me dition. 83 pp. " Pennisetum glaucum". Mmoire de

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III. Principales mthodes dextraction et de dosage des Protines

Synthse bibliographique
III. 1. Mthodes dextraction des protines :

Principales mthodes

III. 1. 1. Les principales mthodes dextraction des protines : a. Prcipitation au sulfate dammonium : La solubilit des protines est fortement dpendante de la concentration en sel (force ionique) du milieu. Les protines sont gnralement peu solubles dans l'eau pure. Leur solubilit augmente avec l'augmentation de la force ionique, car de plus en plus des ions inorganiques bien hydrats (cercles bleus) sont lis la surface de la protine, empchant l'agrgation des molcules (salage,). A trs hautes forces ioniques, le sel retire l'eau des hydrates de protines et conduit ainsi l'agrgation et la prcipitation des molcules (relargage). Figure 2. Pour cette raison, l'ajout de sels tels que le sulfate d'ammonium (NH4) 2SO4, il est possible de mlange sparer les protines selon leur degr de solubilit (fractionnement) (Koolman, 2005).

Figure 2 : Schma reprsentant le phnomne de prcipitation au sulfate dammonium. (Koolman, 2005). b. Dialyse : Les protines peuvent tre spares des petites molcules par dialyse travers une membrane semi-permable dont les pores laissent passer les petites molcules mais pas les protines ( Hames, et al., 1999).

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Principales mthodes

Figure 3 : Schma reprsentant le phnomne de dialyse (Koolman, 2005). c. Ultracentrifugation : Des protines ayant des grandes diffrences de poids molculaire peuvent tre spares par une centrifugation de zone utilisant un gradient dune solution dense telle que le saccharose. . ( Hames, et al.,1999). III. 1.2. Principes de purification dune protine : Le but de la purification dune protine est disoler une protine particulire du reste dun mlange initial complexe. On peut combine diffrentes techniques de fractionnement pour tudier la solubilit, la taille, la charge lectrique et/ou les affinits de liaison spcifiques de la protine tudie ( Hames, et al., 1999). a. Slection dune source de protine : Les protines ayant diffrentes rpartitions suivant les matriaux biologiques, il est important de bien choisir le matriel initial avant de commencer la purification de la protine. Celui-ci sera habituellement une source relativement riche de la protine tudie et doit tre dutilisation aise ( Hames et al., 1999). b. Homognisation et solubilisation : Il faut obtenir la protine sous forme dissoute avant de procder sa purification. Ainsi, les tissus et les cellules doivent tre dtruits par homognisation ou par lyse osmotique, et subir une centrifugation diffrentielle pour isoler la fraction subcellulaire contenant la protine. Pour les protines membranaires, structure membranaire doit tre solubilise avec un dtergent afin de librer la protine ( Hames, et al.,1999).

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c. stabilisation des protines :

Principales mthodes

Pour empcher une dnaturation et une inactivation des protines par des facteurs physiques ou biologiques au cours de purification, certaines prcautions doivent tre prises. Celles-ci incluent lutilisation de solutions de pH tamponn, la ralisation des expriences une faible temprature et lintroduction dinhibiteur de protases afin de bloquer la protolyse ( Hames, et al., 1999). III. 2. Mthodes de dosage des protines : De nombreuses mthodes ont t mises au point pour doser les protines. Ce sont gnralement des mthodes spectrophotomtriques bases sur diverses caractristiques spectrales ou ractionnelles des acides amins constituant les protines. a. Absorption 280 nm : On mesure l'absorption 280 pour faire un dosage quantitatif ou semi-quantitatif d'une solution protique. On s'en sert aussi souvent pour suivre l'lution des protines lors d'une chromatographie. Le tryptophane absorbe fortement 280 nm de mme que, dans une moindre mesure, la tyrosine. La phnylalanine et la cystine ont aussi de faibles absorptions dans cette rgion de l'U.V. rapproch. Il est donc possible de doser les protines en mesurant l'A280 (Layne, 1957). (Stevens, 1992). b. Mthode du biuret : Cette mthode a t dveloppe par Gornall et al (1949) qui ont appliqu la raction du biuret pour obtenir une mthode quantitative de dosage des protines. Cette raction du biuret est la formation d'un complexe pourpre entre le biuret (NH2-CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques conscutifs en prsence de cuivre en milieu alcalin. Le complexe de coordination rsultant absorbe fortement dans le bleu (Stevens, 1992). c. Mthode de Lowry : Cette mthode a t dveloppe par Lowry et al (1951) qui ont combin une raction au biuret et une raction au ractif de Folin-Ciocalteu. Ce dernier, base de phosphomolybdate et de phosphotungstate, ragit avec les tyrosines et les tryptophanes, pour donner une coloration bleue qui s'ajoute celle du biuret. Cette mthode a t tellement utilise que l'article original de Lowry est un des articles scientifiques les plus cits au monde ! Encore aujourd'hui on publie de nouvelles variantes de cette mthode (Stevens, 1992).

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d. Mthode au bleu de Coomassie :

Principales mthodes

Bradford et al (1976) ont dvelopp une mthode base sur l'adsorption du colorant bleu

de Coomassie G250. En milieu mthanolique acide, ce colorant s'adsorbe sur les protines et cette complexation provoque un transfert de son pic d'adsorption qui passe du rouge au bleu. De nombreuses variantes ont t dveloppes par la suite et on peut se procurer dans le commerce des trousses ("kits") de divers fabriquants. Cette adsorption se fait principalement par des liens ioniques avec des acides amins basiques (arg, his, et lys) et des interactions hydrophobes (acides amins hydrophobes) (Bradford, 1976). e. Mthode de Kejdahl : Cette mthode consiste mesurer la quantit d'azote organique d'un chantillon. Il faut videmment savoir, pour l'chantillon analys, quelle est la relation entre la quantit d'azote et celle de protines. Elle requiert un quipement coteux et complexe. On ne l'applique qu' des chantillons difficiles homogniser. comme du matriel vgtal. (Stevens, 1992).

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Principales mthodes

Bibliographie
B.D HAMES, N.M HOOPER, et J.D HOUGHTON., 1999. LEssentiel en Biochimie, p 41,42. BRDRADFORD, M., 1976. Anal. Biochem, p 72, 248-254. KOOLMAN., 2005. Color Atlas of Biochemistry, 2nd edition Thieme All rights reserved, p 79. STEVENS, L., 1992. Buffers and the determination of protein concentration in R Eisenthal, MJ Danson (diteurs), Enzymes assays, IRL Press, Oxford, p 317-335.

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Partie exprimentale

I. Extraction des protines

Partie exprimentale
I. 1. Echantillon du lait :

Extraction des protines

Dans un premier temps, nous avons commenc par choisir les types de lait selon leur disponibilit sur les marchs de la ville de Laghouat. Les chantillons ont t rcuprs en avril au niveau des principaux points de vente de lait de btail de la ville de Laghouat. Les types de lait et leurs valeurs de pH sont rsums dans le (Tableau 3) Tableau 3 : Types de lait utiliss et leur pH Type de lait Lait commercial Candia . Lait cru de chvre Lait cru de vache I. 2. Extraction des protines : De chaque type de lait cit prcdemment, 250 ml ont t mesur, pes puis macr pendent 24 H en prsence dacide actique pure de concentration 17.48 M (2 ml pour chaque 100 ml).(Benhourma et Boudalaa.,2000) Aprs macration, chaque chantillon a t filtr travers du tissu puis laisser scher pendent une semaine jusqu stabilisation de la masse. I.3. Rsultats et discussions : Chaque type de lait choisi pour lextraction a subi rigoureusement le mme traitement dextraction par macration et de schage. Les extraits protiques obtenus prsentent des aspects et des couleurs diffrentes. Les teneurs des extraits, leurs couleurs et leurs aspects sont consigns dans le (Tableau 4). Tableau 4 : Teneur, aspect, couleur, masse et quantit des extraits protiques.
Types de lait Lait commercial Candia . Lait cru de chvre Lait cru de vache Aspect Trs fin Fin Granuleux Couleur Blanc salle Jaune Blanc Masse (g) 15 12 17 Quantit (g/l) 60 48 68 Teneur (%) 5,88 4,72 6,71

pH 6,74 6 6,26

Selon les rsultats obtenus, les teneurs des extraits protiques varient de 4,72 6,71 % dans les diffrents laits tudies. La meilleure teneur est observe chez lextrait du lait de vache (6,71%; m/m) et la plus faible teneur est enregistr chez le lait de chvre (4,72%; m/m). La majorit de nos extraits nont pas atteint plus de 10 % dextraits. Tous les extraits montrent des couleurs et des aspects diffrents. 22

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Extraction des protines

On remarque que les teneurs varient dun lait un autre. Cela veut dire quil y a une diffrence de prcipitation dans ltape de macration et probablement la nature du solvant utilis pour lextraction. Ncartant pas la possibilit dinfluence du temps de macration, il est possible que lun des laits avait besoin de plus de 24 H de macration pour avoir une teneur plus importante. La nature chimique des protines varie du simple aux substances trs polymriss qui incluent des proportions variables de protines. Ils peuvent galement exister sous forme de complexes avec des glucides, lipides et dautre composants, certains de haut poids molculaire de ce fait les protines auront du male se prcipiter et / ou peuvent peut tre tout fait insolubles. Par consquent, les extraits protiques par prcipitation sont toujours un mlange de diffrentes classes de composs dont certaines sont solubles dans le systme de solvant utilis et dautre non. Des tapes supplmentaires peuvent tre ncessaires pour liminer les composs non dsirs et les substances non- protique tels que les graisses et les sucres . etc. La nature chimique des protines est responsable de certaines proprits communes utilises pour les extraire partir dune matire premire, les caractriser chimiquement et les doser. Cependant, il faut noter que ces proprits peuvent sexprimer diffremment selon la complexit de la molcule concerne. Ainsi, bien que la mthode dextraction partir du lait que nous avons choisi dans notre tude (une prcipitation par acidification est utilis par Benhourma et Boudalaa)comme mthode prliminaire pour extraire la totalit des protines, elle devra quelquefois tre modifie pour tre mieux adapte leur nature chimique, leur solubilit et leur degr de liaison avec dautre constituants . Les trois types de lait tudis, ont dvoil presque la mme masse en extrait dont les valeurs varient de 12 17 g. Concernant la quantit en g/l, le lait de chvre a enregistr une quantit de 48 g/l infrieure celle du lait de vache et du lait commercial qui eux ont enregistr des quantits voisine respectivement 68 et 60 g/l. La faible valeur trouve chez le lait de chvre peut tre due la constitution biologique de la chvre qui est diffrente de la vache et lalimentation Comparativement dautres tudes effectues par Benhourma et Boudalaa sur diffrents types de lait de la rgion de Laghouat, nous avons remarqu une grande diffrence 23

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Extraction des protines

par rapport nous rsultat. Dans leur tude, la plus grande quantit en protines a t trouve chez le lait de chvre (62,76 g/l) et la plus faible chez le lait de vache (21,15g/l). Par contre dans notre tude cest le lait de vache qui montr une quantit importante (68g/l) par rapport celle de la chvre (48 g/l). (Benhourma et Boudalaa., 2000) Cette diffrence peut tre due linfluence de nombreux facteurs, Lespce, la race, le stade de lactation, la saison, ltat sanitaire, lalimentation. Si on compare entre la quantit en protine entre le lait de vache cru (naturel) et le lait commercial Candia qui est un lait de vache ayant subi diffrentes tapes de strilisation et de conditionnement, on remarque une lgre diminution dans la quantit en protines denviron 8 g/l, ce qui est peut tre d aux diffrentes tapes de fabrication (lyophilisation et transformation de la poudre en un liquide lors de la confection du lait lusine).

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Extraction des protines

Bibliographie
BENHOURMA, F et BOUDALAA, K., 2000. Etude analytique et comparative de diffrents types de laits locaux (Vache, Brebis, Chvre et Chamelle). Mmoire de DEUA en chimie industrielle.86 pp.

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II. Dosage des protines

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II. Dosage des protines (mthode de Biuret) : II. 1. Principe de la mthode :

Dosage des protines

La mthode de Biuret est dveloppe par Gornall et al (1949), elle repose sur le dveloppement dune coloration violette suite la formation dun complexe entre deux liaisons peptidiques conscutifs et les ions cuivriques en milieu alcalin. Lintensit de la coloration est proportionnelle la concentration en protines. (Kamoun, 1997). Afin de quantifier les teneurs en protines de nos laits, une courbe dtalonnage dune protine talon : lalbumine a t trace. II. 2. La courbe dtalonnage de lalbumine : partir dune solution talon dalbumine bovine prpare dans leau physiologique, 9 solutions dilues ont t prpares dans leau physiologique. 1 ml de chaque solution dilue est plac dans un tube essai suivi par laddition de 4 ml du ractif de Gornall. Les tubes sont ensuite agits lgrement et incubs lobscurit pendant 30 minutes temprature ambiante. La lecture de labsorbance de chaque solution prpare a t mesure laide dun spectrophotomtre UV-Visible de type Jenway 6405, une longueur donde de 540 nm contre un blanc ne contenant dalbumine. Les valeurs de labsorbance de chaque solution ainsi prpare nous ont permis de tracer la courbe dtalonnage de lalbumine. Figure 4

Figure 4 : La courbe dtalonnage de lalbumine

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II. 3. Mise en uvre du dosage :

Dosage des protines

Pour la quantification des protines dans nos laits, nous avons suivi la mme procdure dcrite prcdemment. noter que les extraits ont t dilus dans de leau physiologique pour obtenir une absorbance finale comprise entre 0,5 et 1. II.4. Rsultats et discussions : La teneur en protines de chaque type de lait a t calcule partir de la courbe dtalonnage de lalbumine prcdemment ralise et exprime en mg/ml. Les rsultats obtenus sont rsums dans le tableau 5. Tableau 5 : Teneur en protine de chaque type de lait. Type de laits Commercial Candia Chvre Vache Teneur en protines (mg/ml) 48 ,18 271,42 21,42

Il nexiste aucune mthode permettant de doser de manire satisfaisante et simultane lensemble de protines prsentes dans un extrait non purifi. Un certain nombre de mthodes spectrophotomtriques, pour la quantification des protines dans les substances naturels ont t dvelopp, (Bradford, 1976., Stevens, 1992) ces tests sont bass sur des principes diffrents et sont utiliss pour dterminer les diffrents groupes structurels prsents chez les protines. Nanmoins, une estimation rapide et globale de la teneur totale en protines peut tre obtenue par diffrentes mthodes, en particulier par lutilisation de cuivre en milieu alcalin dnomm ractif de Gornall et / ou de Biuret, que nous avons choisi afin de dterminer la teneur en protines des trois types de lait. La teneur en protines de chaque lait a t calcule partir de la courbe dtalonnage de lalbumine prcdemment ralise par complexation au cuivre en milieu alcalin et exprime en mg/ml. Les rsultats obtenus sont rsums dans le tableau 5. Daprs la synthse de lensemble des rsultats obtenus lors de la quantification des protines dans les laits, on peut constater que les teneurs varient entre 21,42 et 271,42 mg/ml. Le taux en protine le plus lev a t dtect chez le lait de chvre 271,42 mg/ml tandis que, la plus basse teneur est remarques chez le lait de vache 21,42 mg/ml. 27

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Dosage des protines

Des tudes ralises par Benhourma et Boudalaa sur de mme types de lait, ayant utiliser la mme procdure dextraction ralise dans notre tude, except lajout dune extraction liquide - liquide lhexane pour liminer les graisses ont montr des teneurs en protines chez le lait de vache (37,39 mg/ml) un peu suprieure la notre qui est de 21,42 mg/ml, par contre la teneur en protines chez le lait de chvre de notre tude (271,42 mg/ml ) est largement plus importante que celles observe de leur tude qui est de 47,75 mg/ml. On peu renvoyer cette diffrence au type de lait, lalimentation et la rgion de pturage de chaque espce. Car pendant le processus normal de croissance et de dveloppement, et ceci lors du paturage les animaux sont soumises diffrents types de stress comme la scheresse, la chaleur, les rayons ultraviolet, la pollution de lair et les attaques des agents pathognes. Les rsultats de ces blessures, se refltent par une rduction de lactation et une variation de la composition et la capacit de croissance. Comme lextraction des protines dans une substance quelconque est influence par leur nature chimique, la mthode dextraction employe, le temps de macration, ainsi que la prsence de substances interfrentes. On ne passer ct du mode dextraction suivi, du type de solvants utilis, de la dure dextraction et du type du contact matire-solvant lors de notre traitement des chantillons. Il faut noter que les teneurs dextraits bruts et les teneurs en protines ne varient pas dans le mme sens, car on remarque que pour des teneurs levs en extraits on enregistre des quantits faibles en protines. Cette constatation est valable pratiquement pour tous les laits notamment chez le lait de vache car ce lait a enregistr la valeur la plus leve en extrait 6,71 %; m/m alors que ce nest pas le cas pour les teneurs en protines totaux o la quantit est la plus faible et est de 21,42 mg/ml seulement. Le test de Biuret est le procd le plus utilis pour la quantification des protines dans diffrentes matires premire. Cette mthode est trs sensible mais malheureusement peu spcifique car beaucoup dautre composes rducteurs peuvent interfrer que les protines telles que les sucres prsent dans le lait. Ce qui peut expliquer la forte teneur en protine observ chez le lait de chvre.

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Partie exprimentale

Dosage des protines

Or les valeurs obtenues nont pas t pour autant trs satisfaisantes car elles restent trs globales et ne donnent aucune indication sur les diffrentes protines prsentes dans nos chantillons, sachant que chacun dentre eux peut ragir de manire diffrente dans la raction colore. Dautres techniques pour la quantification de protines telles que la chromatographie liquide haute performance (HPLC) ou bien dautre mthodes complmentaire ; mthodes spectrophotomtriques bases sur diverses caractristiques spectrales ou ractionnelles des acides amins constituant les protines. Ces analyses permettront la sparation et la quantification des protines ainsi que la connaissance des principales classes dacides amins prsentes dans chaque lait ainsi que leurs quantits relatives. Elle a pour but aussi, didentifier les acides amins en fonction de leurs temps de rtention et de leurs spectres dabsorption UV-visible par rapport aux composs standards correspondants. Llucidation de la structure de la protine est souvent ralise en utilisant la combinaison dHPLC avec lanalyse par spectromtrie de masse, ainsi que dautres techniques pertinentes.

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Dosage des protines

Bibliographie
BENHOURMA, F et BOUDALAA, K., 2000. Etude analytique et comparative de diffrents types de laits locaux (Vache, Brebis, Chvre et Chamelle). Mmoire de DEUA en chimie industrielle, p 26, 32. Bradford, M. 1976. Anal. Biochem, p 72, 248-254. Stevens, L., 1992. Buffers ans the determination of protein concentration in R

Eisenthal, MJ Danson (diteurs), Enzymes assays, IRL Press, Oxford, p 317-335.

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Conclusion gnrale

Conclusion Produit de la vie, le lait continue ainsi de se tailler une place de choix dans notre socit moderne. Voire, grce l'tonnante varit de ses produits drivs, une place primordiale. Dans la variation de la composition du lait et pour initier une intgration dans les banques de donnes de rfrence de la composition physico-chimique du lait travers les diffrentes phases du lait, nous avons choisi dans ce travail de faire une contribution par une tape prliminaire ltude de lun des constituants les plus important de cette riche matire premire qui est le lait afin de mettre en vidence la prsence de protines. Nous nous sommes intresss trois types diffrents de lait savoir : lait commercial Candia , le lait de chvre et le lait de vache, en tenant en compte de leur disponibilit sur le march. Dans un premier temps, nous avons ralis une extraction de la fraction protique totale par prcipitation acide pour les trois types de laits choisis. Dans un second lieu, nous avons procd la quantification des protines par une mthode spectrophotomtrique. Le dosage des protines a t ralis par la mthode de Biuret, en utilisant l'albumine comme talon par complxation au cuivre en milieu alcalin. Les rsultats montrent clairement que les teneurs en extrait bruts varient entre 4,72 6,71 % ; m/m. lanalyse de ces rsultats montre clairement une variation des teneurs dun lait un autre d une diffrence de prcipitation dans ltape de macration, la nature du solvant utilis pour lextraction et probablement au temps de macration. Lanalyse du contenu en protines dans chaque type de lait a t calcule partir de la courbe dtalonnage de lalbumine et exprime en mg/ml. Les valeurs sont comprise entre 21,42 et 271,42 mg/ml, on a pu conclure que cette diffrence de teneurs en protines chez les laits est due lalimentation et la rgion de pturage de chaque espce. L'ensemble de ce travail a permis de connatre de manire globale le contenue en protine chez trois types de laits de la rgion de Laghouat, ce qui nous encourage

approfondir la recherche pour caractriser les protines et les acides amin prsent dans le lait. De mme, il est envisageable d'largir le panel des mthodes dextraction et de dosage, en utilisant d'autres solvants et dautre ractifs substrats. Il reste encore d'autres types de laits locaux consommables par la population de la rgion qui n'ont pas t analyses et qui mriteraient de dterminer leur richesse en cette source de base de la nutrition humaine.

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