Fitoqumica y ensayos Farmacolgicos in vitro de Lippia citriodora

Astudillo Machuca Adelina, 1Lpez Cisneros Carmen Luca2

1

Universidad de Cuenca, Laboratorio de Farmacognosia. 2Universidad de Cuenca, Laboratorio de Microbiologa.

1

adelina52_2@hotmail.com 2carlulopez@yahoo.com,

RESUMEN Se realiz la investigacin bibliogrfica sobre el uso y las acciones farmacolgicas de Lippia citriodora utilizada con frecuencia en infusn por la medicina tradicional y por la poblacin debido a su agradable aroma y sabor. No se encontr su uso como antifngica ni como antibacteriana. Se procedi a trabajar el tamizaje fitoqumico y se evalu la actividad antimicrobiana (bactericida)y antifngica (fungicida) con el extracto etanlico y las fracciones clorofrmicas y acuosas. Se demostr que el extracto etanlico, la fraccin acuosa, las fracciones clorofrmicas B y C, y la fraccin acuosa residual E manifestaron actividad antimicrobiana frente a Stafilococo aureus. Esta ltima fraccin indic actividad tambin para Escherichia coli. La fraccin clorofrmica C seal actividad para Cndida krusei y la fraccin clorofrmica B, la acuosa E y la etanlica fueron inhibidoras para Cndida albicans. El screening fitoqumico determin la presencia de: Taninos, Triterpenos y esteroides, compuestos fenlicos, Aminocidos, Resinas, Glcidos, flavonoides, quinonas y alcaloides. Finalmente se relacion la actividad farmacolgica con los metabolitos encontrados. Este trabajo contribuye al conocimiento de nuestra flora y ampla la posibilidad de utilizacin de esta especie. Palabras clave: Lippia citriodora, fitoqumica, actividad antimicrobiana y antifungal. INTRODUCCIN Las plantas han evolucionado desde hace millones de aos y como consecuencia de ello las ms evolucionadas son poseedoras de una maquinaria enzimtica potente que les permite utilizar novedosas rutas metablicas para la biosntesis de metabolitos secundarios que les facilite adaptarse mejor a las condiciones adversas y competitivas del medio ambiente. Estas plantas por lo tanto estn en mejores condiciones de producir fitocompuestos para interactuar de manera ms eficiente y agresiva contra los depredadores. El Ecuador es un pas rico en plantas medicinales, la medicina tradicional utilizada desde la antigedad ha ido acumulando conocimientos prcticos, de generacin en generacin, por medios orales y escritos, constituyendo hoy en da el uso de plantas medicinales una gran alternativa para preservar y recuperar la salud sobre todo en comunidades que estn geogrfica o culturalmente aisladas. Esta prctica mdica ha sido reconocida por la OMS y se han desarrollado programas para que sea incorporada a la atencin primaria de salud. Por otra parte los ingentes recursos naturales existentes requieren ser estudiados, y en especial las especies nativas de Amrica y del Ecuador en particular, ya que son muy apreciadas por la poblacin debido a sus propiedades teraputicas. (Soejarto 1995, Veerporter1998) Se han hecho miles de estudios de actividades antibacteriana y antifungal, pero aun as no son suficientes, frente a la necesidad urgente de combatir enfermedades infecciosas cuyos agentes etiolgicos han creado resistencia a los antibiticos existentes. En la presente investigacin, se ha estudiado una especie de la familia Verbenaceae, Lippia citriodora, (Aloysia triphylla), cuyo nombre comn es Cedrn. El Cedrn es una planta arbustiva que puede medir entre 1,50 y 2,50 metros de altura. Sus tallos son largos, leosos, redondos o angulosos, ramificados en la parte superior, provistos de finas rayas lineares. Las hojas son simples, rugosas, reunidas en verticilos de tres, raro cuatro, su limbo, entero o un poco dentado, de color verde plido, presenta una

nervadura mediana, saliente en la cara inferior, de la cual se destaca una serie de nervaduras secundarias paralelas, que se renen para formar una especie de cordn paralelo al borde foliar, y despiden, al ser restregadas, un agradable olor a limn, lo mismo que las flores; stas son pequeas, con la corola ensanchada superiormente y bilabiada, blancas por fuera y azul violceo por dentro, y se ubican al extremo de los tallos en espigas agrupadas en panojas. El fruto es una drupa que encierra dos granos que a veces no llegan a la madurez. Las hojas al frotarlas entre los dedos desprenden un delicado y riqusimo olor a limn y por eso se ha usado en perfumera, cosmtica e incluso en pastelera. Su floracin tiene lugar en verano. Lus Cordero describe a esta planta como originaria de Uruguay, Argentina y Chile, en algunas partes se la puede encontrar silvestre. Se la cultiva en numerosas partes del mundo en Amrica desde Estados Unidos hasta Argentina, Europa (sur), frica norte y sur. (Berdoncs s/a, White 1985). La parte utilizada son las hojas y sumidades floridas. Es una droga Oficial, monografiada desde la 5a. edicin de la Farmacopea Nacional Argentina. Como antecedente se hizo una investigacin bibliogrfica para conocer las virtudes medicinales, usos y algunos compuestos qumicos que se indican a continuacin. Las obras consultadas se exponen en orden cronolgico para apreciar que conforme se han ido desarrollando las tcnicas de anlisis, van asomando datos sobre los compuestos qumicos presentes en Limppia citriodora. AUTOR CORDERO Lus. Estudios Botnicos. Publicaciones del Departamento de Difusin Cultural. Cuenca. 1984 WHITE Alan. Hierbas del Ecuador. Ediciones Libri Mundi. Quito. 1985. KOSEL Carlos. Gua de la Medicina Natural.: Editorial De la Misin La Verdad Presente. Colombia. 1988. QUEZADA Alberto, et al. . La Prctica mdica Tradicional. IDICSA, segunda edicin. Cuenca. 1992 Prez Arbelez Enrique. Plantas tiles de Colombia. . Quinta Edicin. Fondo FEN Colombia.1996 BERDONCES i Serra Josep Llus. Gran Enciclopedia de las Plantas Medicinales. Ediciones Tykal. s/a Madrid (2001, fecha de adquisicin) USOS Estomacal, carminativa, antiespasmdica COMPUESTOS

Febrfugo y sedante, estomquico y antiespasmdico, indigestin y flatulencia. Digestin, enfermedades de los nervios, arterioesclerosis, mordeduras de animales, histerismo, abatimiento. Carminativa

Aceites esenciales

Varios autores. Plantas que

Tnico pectoral y calmante, antiespasmdico y sudorfico suave, antilegaoso. Lippis significa legaas Eupeptica, estomacal, febrfuga, expectorante, espasmoltica Sistema respiratorio bronquitis y tos espasmdica, sedante y expectorante, indigestin y debilidad estomacal. Las hojas para cataplasmas del dolor de muela Propiedades estomacales,

Aceite esencial(0,10,2%): contiene ms de 120 principios diferentes, entre los que destaca el citral(35%), limoneno, linalol y terpineol, cneol, cariofileno

Curan. Remedios Milenarios y otras terapias alternativas. Cultural Librera Americana S. A. Argentina. 2003 AGAPITO Teodoro, Sung Isabel. Fitomedicina. 1.100 Plantas Medicinales. Tomo I. Editorial Isabel I.R.L. Per. 2005

estimulantes y antiespasmdicas. Digestiones lentas y difciles, inapetencia. Nerviosismo y decaimiento. Estimulante del apetito, mejora las digestiones lentas, el mal aliento y la flatulencia. Para tratar el stress. Carminativo, antiespasmdico. Febrfuga, hipotensivo, problemas respiratorios. Antirreumtico, El extracto alcohlico es acaricida y bactericida contra Escherichia coli, Micobacterium y Estafilococo aureus.

Aceite esencial contiene: Cneol, citral(20-39%), sesquiterpenos(4045%), linalol (4-11%), geranial. Las hojas contienen: cidos fenlicos, flovonoides, taninos, flavonas y alcaloides.

Por lo general los pobladores la usan en forma de infusin, de la planta entera o solo las hojas, o a veces combinadas con otras plantas, como en el agua de frescos conocida tambin como horchata, y raramente en forma de cataplasmas para calmar el dolor de muela. Se puede observar que no es comn la utilizacin como antibacteriana y no se reporta como antifngica. MATERIAL Y MTODOS Material Vegetal Tratamiento de la droga: se realiz la recoleccin de las ramas el da 2 de Marzo del 2007 una zona urbana de la ciudad de Cuenca. Luego se procedi a la seleccin y clasificacin. Se separaron las hojas ms verdes eliminando la mayora de impurezas tales como: ramas y hojas secas, tierra, polvo, insectos, etc. Para el secado se colocaron las hojas entre papel peridico, se sell y se coloc en un tnel de secado con control de circulacin de aire forzado y temperatura de 40C durante una noche. La droga seca, triturada (polvo fino) y tamizada se guard en frascos de vidrio cubierto con papel de aluminio protegido de la luz y etiquetado. Se lo conserv bien cerrado con el fin de evitar el contacto con polvo, insectos, humedad y para de esta forma preservar los principios activos. Durante todo este proceso se siguieron las tcnicas dictadas por la Farmacopea Europea citadas en Trease, 1991 y Kuklinski, 2000. Luego se realiz el control de calidad de la droga con las siguientes determinaciones: Caracterizacin macroscpica, microscpica y organolptica. Determinacin de materia orgnica e inorgnica, determinacin de partes de la propia planta, contenido de humedad (10%). Pruebas histoqumicas y determinacin de aceites esenciales. Se realiz el control microbiolgico para garantizar que la materia prima se encuentre en ptimas condiciones (Dehesa 1996). En todas las determinaciones se consiguieron valores dentro de los estndares permitidos por la farmacopea espaola. Luego el tamizaje fitoqumico y el fraccionamiento se desarrollaron empleando reacciones de coloracin y tcnicas de cromatografa de capa fina, indicadas por Martnez (2004), a fin de identificar los grupos qumicos responsables de la actividad antimicrobiana. Preparacin de los Extractos

Se pesaron 50g de la droga seca y pulverizada, se aadi etanol en una proporcin de 1:3(P/V), se dej en maceracin con agitacin en un shaeker a 210rpm por 24 horas segn la tcnica indicada por el CYTED 1995. A partir de este extracto se procedi al fraccionamiento siguiendo la gua del tamizaje fitoqumico de Martnez, obtenindose las siguientes fracciones: etanlico(EE), el extracto acuoso(FA), extracto clorofrmico proveniente de la acidificacin (FB), extracto clorofrmico procedente del fraccionamiento bsico(FC), extracto clorofrmico(FE) y el extracto acuoso restante (FE). Cada fraccin se llev a sequedad en un rotavapor. Para utilizar se pes el extracto seco y se resuspendi en dimetil sulfxido (DMSO), a una concentracin de 50mg/ml. La concentracin de los productos vegetales que se inocularon en el pocillo, fue de 2.5mg y el volumen de 50 l. Screening Antimicrobiano Microorganismos La actividad antibacteriana y antifungal se prob contra tres cepas de bacterias Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 y 2 cepas de levaduras, Candida albicans CECT 3153A y Candida krusei CECT 10688. Preparacin del inculo Las bacterias fueron cultivadas en caldo de Triptosa soja (MERCK CodVM276159) a 351C con agitacin constante, se estandariz el cultivo en medio lquido utilizando un Standard McFarland # 05 de DO625 entre a 0.8-1, equivalente a 1x108 clulas/ml. Luego se inocularon con aplicador de algodn estril en la superficie de una placa de petri con agar de Muller Hinton (MERCK, cod VL379337) (NCCLS 2006, Prescott, 2004). Las levaduras se cultivaron en medio lquido YPD (Yeast peptona dextrosa), preparado en el laboratorio, a 251C con agitacin constante, se estandariz el cultivo en fase exponencial de crecimiento y luego se cultivaron uniformemente en medio slido de YPD (Astudillo, Lpez, 2002,2003, J. M. Becker 1996). Controles Como controles positivos se utilizaron para S. aureus Penicilina 10UI (Sandoz Lote 141914), para E. coli Amikacina 30mg/ml (Lab. Bristol Lote 07C119), para Ps. aeruginosa Ceftriaxona 30mg/ml (Lab. Vitalis Lote C060711), para C. albicans y C. krusei, Nistatina (Bristol-Meyers-Squibb). Estos antibacterianos se los seleccion consultando la edicin del 2006 de la Performans Standard NCCLS. Se trabajaron tambin controles negativos de DMSO y agua destilada estril. Mtodo de la difusin en agar variante de pocillo Se procedi a cortar el agar mediante un sacabocados estril formando pocillos de 7mm de dimetro separados entre s por 20mm, en cada uno de ellos se coloc 50 l de los productos a ensayar. Las placas de petri fueron incubadas a las temperaturas adecuadas para cada microorganismo por 24 a 48 horas en condiciones aerbicas. Despus de la incubacin se observ un crecimiento microbiano confluente y se pudo determinar claramente los halos de inhibicin (ausencia de crecimiento) alrededor del pocillo, que se pudo medir en milmetros. (Valgas, 2007) Evaluacin de la actividad Para determinar cuantitativamente la actividad antibacteriana y antifngica de los productos ensayados, se utiliz el clculo del Porcentaje de Inhibicin Relativa (PIR) respecto a la inhibicin de los controles positivos. Los dimetros se midieron en milmetros, desde tres puntos diferentes, ya que no siempre el halo es una circunferencia perfecta, el resultado se expres como la media de estas tres mediciones.

Asumiendo que el mximo efecto inhibitorio es el producido por el control positivo (CP) se determin el porcentaje del efecto de inhibicin del crecimiento del microorganismo de cada extracto, relativo al CP y se calcul con la siguiente frmula: Dimetro halo inhibicin del extracto PIR = -------------------------------------------------------- x 100 Dimetro halo inhibicin del control El criterio que se sigui para seleccionar las plantas con actividad positiva fue el valor del PIR igual o mayor al 25% (CYTED, 1995) respecto al control qumico (Rivero, 1997). RESULTADOS Y DISCUSIN En el tamizaje fitoqumico se encontraron los siguientes compuestos: aminocidos, compuestos fenlicos, flavonoides, triterpenos y esteroides, quinonas, taninos y alcaloides. En el extracto acuoso se encontraron tambin resinas y glcidos. En el fraccionamiento se encontraron los siguientes metabolitos: Fraccin acuosa A (FA): aminocidos, compuestos fenlicos y flavonoides, taninos Fraccin clorofrmica cida B (FB): triterpenos y esteroides Fraccin clorofrmica alcalina C (FC): triterpenos y esteroides Fraccin clorofrmica D (FD): no se encontr ningn metabolito Fraccin acuosa residual E (FE): Taninos, compuestos fenlicos Fraccin etanlica EE (FEE): quinonas, taninos condensados y alcaloides Se pudo determinar y fundamentar de forma cientfica el uso en la prctica medica popular de Lippia citriodora al relacionar la accin farmacolgica, reportada en la investigacin bibliografica, con los metabolitos encontrados en el tamizaje fitoqumico. Tabla 1. Tabla 1. Relacin de la accin farmacolgica y los metabolitos

ACCION FARMACOLOGICA Aperitivo Digestivo, eupctico Tnico Carminativo, flatulencia Tnico pectoral Sedante Antilegaoso Antiespasmdico

METABOLITO Compuestos fenlicos, alcaloides Taninos Taninos Taninos Resinas Alcaloides Flavonoides Flavonoides

Los datos que se exponen en la tabla anterior se investigaron en Kuklinski 2000 y Brunetton 2001. Analizando los resultados se concluye que el uso es acertado para las acciones farmacolgicas indicadas en la tabla 1, pero no se encuentra relacin para accin hipotensiva, para la arterioesclerosis, mordedura de animales, febrfugo y sudorfico indicadas en algunos libros de la consulta. Tambin se concluye que se la subutiliza ya que contiene principios activos de carcter antibacteriano y antifngico que se desconocen en la practica mdica tradicional y popular. Los resultados de la actividad antibacteriana encontrados en este estudio se indican en la tabla 2. Tabla 2 .Resultados del ensayo antibacteriano: Extracto Sa en mm 17 20 28 0 0 11 Ec en mm 0 0 0 0 0 15 Ps en mm 0 0 0 0 0 0 Ca en mm 0 11 0 0 11 11 Ck en mm 0 0 12 0 0 0

FA FB FC FD FE EE

Sa: Staphylococcus aureus ATCC 25923 Ec: Escherichia coli ATCC 25922 Ps: Pseudomona aeruginosa ATCC 27853

Ca: Candida albicans CECT 3153A Kc: Candida krusei CECT 10688 : Dimetro de inhibicin en mm

Analizando el resultado del efecto de cada fraccin de concluye que: Ninguna de las fracciones result ser efectiva para Pseudomona aeruginosa ATCC 27853. La fraccin D no dio sensibilidad para ninguno de los microorganismos. De las fracciones positivas se observa que: La fraccin EE da respuesta inhibitoria evidente para tres microorganismos, S. aureus, E. coli, C. albicans. Las fracciones FB y FC evidencian positividad para dos microorganismos y las fracciones FA y FE inhiben el crecimiento de un microorganismo. El ensayo se trabaj simultneamente con los controles positivos qumicos. Tabla 3. Dimetro de inhibicin de los controles en milmetros. MICROORGANISMO S. aureus E. coli Ps. Aeruginosa C. albicans C. krusei CONTROL Penicilina 10U Amikacina 30g/ml Cefalexina 30g/ml Nistatina 500000U/ml Nistatina 500000U/ml POCILLO 50l 21 17 14 30 22

Los resultados del PIR de los extractos calculados de acuerdo a la ecuacin indicada anteriormente nos dan los resultados de la tabla 4 Tabla 4. Porcentaje de inhibicin relativa respecto a los controles correspondientes. Fraccin Sa Ec Ca Ck FA 80 % 0% 0% 0% FB 95 % 0% 36 % 0% FC 133 % 0% 0% 54 % FE 0% 0% 36 % 0% EE 52 % 88 % 36 % 0%
Sa: Staphylococcus aureus ATCC 25923 Ec: Escherichia coli ATCC 25922 Ca: Candida albicans CECT 3153A Ck: Candida krusei CECT 10688

Segn el criterio de seleccin para considerar como positivas las reacciones de inhibicin del crecimiento microbiano y observando los datos, se puede evaluar y definir que la mayor sensibilidad se obtuvo para Staphylococcus aureus en la fraccin C (FC) con un porcentaje de 133% y el menor valor se obtuvo para Candida albicans con el 36%. Los dems extractos con diferentes porcentajes de inhibicin intermedia entre estos dos valores nos dan un total de 9 ensayos positivos, es decir el 45% del total de los extractos estudiados. Se puede observar tambin que cuatro de las cinco fracciones inhiben a Staphylococcus aureus, le sigue Candida albicans, con tres extractos, aunque con porcentajes que se consideraran como valores bajos y Escherichia coli y Candida krusei con un extracto positivo cada uno. La accin farmacolgica bactericida y fungicida relacionada con los metabolitos encontrados en cada fraccin en Kuklinski, 2000 y Brunetton, 2001. La actividad positiva para Staphylococcus aureus, del extracto FA se debe a la presencia de los compuestos fenlicos y taninos; de los extractos FB y FC a la presencia de los Triterpenos y de la fraccin FEE se debe a los compuestos fenlicos, a los taninos y a las quinonas que se reportan con esta accin farmacolgica (fig 1). A los mismos compuestos en esta fraccin se debe la actividad antibacteriana para Escherichia coli(fig.2). La actividad fungicida para Candida albicans, en la Fraccin FB se debe a los compuestos terpenoides y en la fraccin FEE (fig.3), a los compuestos fenlicos, taninos, quinonas y a los flavonoides presentes en esos extractos. En el caso de la

fraccin FE, con un moderado contenido de taninos se observa que el efecto no es fungicida sino fungisttico como se puede ver en la fig. 4 La actividad fungicida para Candida krusei, en la fraccin FC se debe a la presencia de triterpenos del tipo saponsido que se encuentran en esta fraccin. Fig. 5

Figura 1 E. aureus

Figura 2 E. coli EE

Figura 3 C. albicans FB

Figura 4 C. albicans con FE

Figura 5 C. krusei con FC

Con este estudio se contribuye a revalorizar el uso de Lippia citriodora, con su aplicacin probada como antibacteriano y antifngico, propiedades que se suman a las anteriormente citadas. As se hace nfasis en el aporte importante de la investigacin de las plantas medicinales para superar las dificultades de salud bsica en nuestro pas al utilizar con fines teraputicos los extractos acuosos y alcohlicos de la planta estudiada. Bibliografa 1. Astudillo A., Lpez C.L. Identificacin de compuestos antifngicos y antitumorales en extractos de plantas, Primera parte: screening Primario. Revista de la Universidad de Cuenca, Anales. Instituto de Investigaciones. 2003; tomo 47;59-69 2. Astudillo, A., Lpez, C.L. Evaluacin del potencial de la actividad antifungal y de inhibicin del ciclo celular, en plantas de la Amazona y el bosque montano de la sierra del Ecuador. Tesis previa a la obtencin del Diploma de Estudios Avanzados de Tercer Ciclo. Universidad Pablo de Olavide. Sevilla. Espaa. 2002. 3. Becker,J.M. Biotecnologa : Curso de prcticas de laboratorio. Zaragoza. Espaa. Editorial ACRIBIA S.A. 1996. 4. BERDONCES i Serra Josep Llus. Gran Enciclopedia de las Plantas Medicinales. Madrid: Ediciones Tykal 5. Brunetton Jean. Farmacognosia. Fitoqumica Plantas Medicinales. Segunda edicin. Barcelona. Editorial Acribia, S. A. 2001. 6. CYTED, Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo. Manual de Tcnicas de Investigacin. Editado por CYTED. 1995. 7. Dehesa M. A., NTE, PROYECTO A1 DE NORMA ECUATORIANA. 1996-07-03. Archivo magntico. 8. Kuklinski Claudia. Farmacognosia. Barcelona. Ediciones Omega. 2000 9. Martnez, A., et al,. Manual de Prcticas de Laboratorio de Farmacognosia y Fitoqumica. Universidad de Antioquia. Facultad de Qumica y Farmacia. Departamento de Farmacia. Medelln. 2004. 10. NCCLS, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing; Sixteenth Informational Suplement. Vol 25 N1, ISSN 0273-3099, 2006. 11. Prescott L. M., Harley J.P., Klein D. A., Microbiologa, Editorail McGraw-HillInteramericana de Espaa, S.A.U., Espaa 2004 12. Rivero Lpez, Alvarez Gonzlez Manuel, et al. Actividad Antifngica in Vitro del Pinus caribaea(Pino Macho). Revista Cubana de Plantas Medicinales. Facultad de Ciencias Mdicas. Sancti Spritus, 1997.

13. Soejarto D. D. La importancia de las plantas en la salud humana. En: Taxonoma y Base Qumica de las Drogas. Un curso de plantas medicinales. Escuela Superior Politcnica de Chimborazo (ESPOCH). Riobamba, Ecuador 1995; Julio 24-28. 14. Valgas C. et. al.. Screening methods to determine antibacterial activity of natural products. Brazilian Journal of Microbiology, 38:369-380. ISSN 15178283, 2007. 15. Verpoorte R. Exploration of natures chemodiversity: the role of secondary metabolites as leads in drug development. En: DDT. 1998; vol 3 mayo, No 5 pp 232-238.