2.

Esterilizao
2.1 Histrico A Antiguidade O conhecimento a respeito do assunto esterilizao foi obtido ao longo dos tempos, estando intimamente relacionado ao desenvolvimento da microbiologia, tornando-se praticamente impossvel o estudo do primeiro sem nos referirmos ao ultimo. Como se atribui o surgimento da microbiologia tentativa de solucionar o problema da existncia da vida e da morte, o conhecimento e o desenvolvimento da esterilizao acompanhou passo a passo a soluo deste problema. Desde o incio dos nossos tempos o homem parece ter desenvolvido e
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

aplicado, de alguma forma, processos de purificao e desinfeco, sendo este ltimo o precursor da esterilizao. Anticpticos tais como o piche ou alcatro, resinas e aromticos foram largamente empregados pelos egpcios no embalsamento de corpos mesmo antes da existncia de uma linguagem escrita. Do trabalho de Herdoto (484 424 a.c), h indicaes de que os egpcios eram familiarizados com os valores anticpticos do ressecamento resultante da utilizao de certos produtos qumicos como o sal comum. A fumaa originada da queima de produtos qumicos tambm era utilizada pelos mais antigos com o propsito de desodorizar e desinfetar. A purificao de ambientes e a destruio de materiais nocivos e infecciosos atravs do fogo parece ter se originado tambm entre os egpcios. A cremao de corpos de animais e de pessoas, especialmente nos casos de guerras, sempre foi pregado pelos mais antigos como forma de descarte, assim como uma maneira de se eliminar odores desagradveis. Moiss foi o primeiro a prescrever um sistema de purificao atravs do fogo e, dos livros Levtico e Deuteronmio, podemos perceber que o mesmo foi responsvel pelo desenvolvimento de um processo de purificao de ambientes infectados. Os severos mandamentos dados por Moiss (cerca de 1450 a.c.) a

19 respeito do descarte de dejetos, sanitizao, tratamento e preveno da lepra, o toque em objetos sujos e a absoro de alimentos no limpos formam a base do primeiro cdigo sanitrio estabelecido pelos antigos Hebreus. Digno de nota tambm, a proibio da tatuagem (Lev. 19:28) com o intuito de prevenir a transmisso de hepatite atravs da agulha contaminada e o relacionamento das moscas transmisso de doenas. Tomando-se como partida as leis estabelecidas por Moiss, vrios sistemas de purificao foram adotados (Perkins 1983). A Descoberta da Bactria A existncia da bactria foi considerada possvel por muitas pessoas antes mesmo que esta fosse descoberta. A prova de sua existncia, por outro lado, teve que esperar o desenvolvimento e a construo de um equipamento adequado observao e ao estudo das formas de vida microbianas, o microscpio. Em 1863
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

Leeuwenhoek observou e descreveu uma grande variedade de formas microbianas em vrios fluidos corporais, descargas intestinais de animais, gua e cerveja. Leeuwenhoek tambm fez importantes contribuies anatomia microscpica sendo tido, por certas autoridades, como real descobridor dos corpsculos sanguneos. As observaes de Leeuwenhoek e o desenvolvimento do microscpio foram responsveis pela criao da bacteriologia e reabriu a questo concernente fermentao e doena (Perkins 1983). A Doutrina da Gerao Espontnea Seguindo a descoberta da bactria, a questo antiga relacionada gerao espontnea de coisas vivas tornou-se assunto de discusso. Alguns poucos indivduos combatiam a teoria, mas a crena geral era de que as bactrias se originavam espontaneamente e esta crena permaneceu at que Louis Pasteur finalmente colocou fim em 1862.

Louis Pasteur

20 No ano de 1860 Pasteur completou suas pesquisas sobre a causa microbiana da fermentao e estava pronto para iniciar seus estudos sobre o problema da gerao espontnea. Pasteur iniciou seu ataque teoria da gerao espontnea com uma investigao microscpica do ar atmosfrico, e com a ajuda dos dispositivos mais engenhosos da poca, demonstrou que o ar, em diferentes localidades, diferia em seu contedo de microorganismos [Pasteur, L: Memoire sur ls corpuscles organises qui existent dans lattmosphere, examen de La doctrine ds generations spontanees. Ann Chinmie physique 64:5-110]. Com a disciplina que lhe era peculiar, Pasteur comprovou experincias antigas realizadas por Schwann, Schroeder e Von Dusch, mostrando que aps passar o ar atravs de um filtro de algodo, este continha partculas organizadas similares em aparncia a esporos e, se estas partculas fossem introduzidas em fluidos estreis e nutritivos, era induzida a fermentao.
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

A importncia desta fase do trabalho de Pasteur pode ser sumarizada no fato de, onde os investigadores anteriores desenvolviam experimentos visando demonstrar a ausncia da fermentao em infuses estreis em contato com o ar livre de germes, Pasteur no apenas fez isso, como tambm provou que os microorganismos presentes no ar eram, de forma inquestionvel, responsveis pelas mudanas que ocorriam em suas solues estreis. Um dos ltimos defensores da doutrina da gerao espontnea foi o mdico ingls Bastian. Em 1876, Bastian atacou o trabalho anterior de Pasteur, o qual estabelecia que a urina, esterilizada atravs da fervura, no era suscetvel fermentao e nem mostrava evidncias de crescimento bacteriano aps incubao. Bastian afirmava que esta esterilidade era obtida apenas sob certas condies e, se a urina fosse tornada alcalina no incio, seria observado, freqentemente, algum crescimento bacteriano. Como resultado disso, ficou demonstrado que lquidos cidos poderiam ser tornados estreis atravs da fervura, uma vez que certos organismos no destrudos pelo processo de fervura eram incapazes de se desenvolverem em meios cidos. Por outro lado, se o meio fosse tornado levemente alcalino, as bactrias sobreviventes cresceriam e se multiplicariam livremente.

21 Esta controvrsia com Bastian finalmente levou ao estabelecimento do fato de certos micrbios existentes na natureza serem capazes de resistir a prolongados perodos de fervura a 100oC. Anteriormente acostumado a ferver seus lquidos a uma temperatura de 100oC, Pasteur viu-se forado a ferv-las agora a temperaturas de 108oC a 120oC, visando assegurar a esterilidade. O costume de levar os lquidos temperatura de 120oC a fim de garantir a esterilidade data deste conflito com Bastian. Visando alcanar as exigncias de mtodos mais efetivos e eficazes de esterilizao, a temperaturas mais elevadas do que a de ebulio, Pasteur foi levado a desenvolver novos dispositivos e equipamentos. Durante este perodo (1876-1880) de avanos nas tcnicas bacteriolgicas, Charles Chamberland, pupilo e colaborador de Pasteur, foi responsvel por desenvolver o primeiro esterilizador presso de vapor, ou autoclave, com o qual era possvel alcanar
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

temperaturas iguais ou superiores a 120oC (Metchnikoff, 1989). O equipamento desenvolvido por Chamberland era equipado com uma vlvula de segurana e um dispositivo na tampa, que poderia ser aberto para aliviar a presso gerada pelo aquecimento. O equipamento continha ainda uma pequena quantidade de gua e os materiais a serem esterilizados ficavam suspensos acima da gua atravs de prateleiras. Este equipamento pode ser considerado o precursor de nossos esterilizadores modernos. A Descoberta da Resistncia ao Calor da Bactria. O fsico ingls John Tyndall completa a histria com a descoberta das fases de resistncia ao calor das bactrias. Em 1876 ele fez a sua entrada neste campo com uma srie de pesquisas devotadas aos fenmenos da fermentao e da putrefao (Tyndal, 1986). Antes desta poca Tyndall estava voltado para o problema dos germes e poeiras na atmosfera. Ele acreditava firmemente que os microorganismos presentes no ar estavam associados a partculas de poeira. Com o auxlio de uma engenhosa cmara de madeira equipada com uma frente e janelas laterais em vidro, atravs das quais era passado um feixe de luz, ele demonstrou

22 que ar livre de poeira, que no espalhasse o feixe de luz no iniciaria o crescimento em tubos de infuso fervida expostos a ele. Estudos seguintes realizados por Tyndall revelaram que infuses preparadas com feno velho e seco eram mais difceis de serem esterilizadas por fervura do que aqueles preparados com feno fresco. Esta observao o levou a investigar extensivamente a resistncia ao calor das bactrias. Atravs de inmeros experimentos, Tyndall finalmente concluiu que em certos perodos na histria da vida de organismos, estes desenvolvem fases de resistncia ao calor nas quais fica mais difcil mat-los, mesmo com fervura prolongada. O estgio de resistncia ao calor da bactria, fase conhecida como esporo, tambm foi detectado por Pasteur e descoberto independentemente pelo botnico alemo Ferdinand Cohn, em 1876 [Ford, W. W.; Clio medica, Bacteriology. New York, Hoeber, 1939, p. 88].
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

Tyndall deu origem ao mtodo de esterilizao fracionada atravs do aquecimento intermitente. Este mtodo foi originalmente desenvolvido como um meio prtico de esterilizar infuses contendo formas de bactrias resistentes ao calor. O processo consistia no aquecimento de infuses at seu ponto de ebulio em cinco etapas consecutivas com intervalos apropriados de espera temperatura ambiente. O propsito dos intervalos de espera entre os perodos de aquecimento era permitir o tempo suficiente para os esporos bacterianos resistentes mudarem, ou germinarem em um estgio vegetativo mais susceptvel. A esterilizao fracionada, que mais tarde ficou conhecida como Tyndalizao, foi a precursora do esterilizador por vapor sem presso idealizado por Robert Koch e seus associados em 1880-1881. O processo de Tyndalizao constituiu-se em um importante avano no desenvolvimento de mtodos prticos de esterilizao. Sua utilidade e popularidade podem ser comprovadas pelo fato de, nos dias de hoje, este procedimento ser seguido por muitos laboratrios visando a esterilizao de meios sensveis ao calor por 30 minutos, em trs dias consecutivos. Tyndall concluiu que na histria de vida das bactrias podem haver duas fases distintas: Uma termo-sensvel e outra incrivelmente termoestvel.

23 Contribuio da Escola Alem As pesquisas de Koch e seus associados, em 1881, sobre as propriedades desinfetantes do vapor e do ar quente marcam o incio da cincia da desinfeco e esterilizao. Em colaborao com Wolffhgel, Koch demonstrou que havia uma diferena marcante no efeito do calor quente sobre uma bactria, em contraste com o calor mido. Estes investigadores determinaram que o calor seco a uma temperatura de 100 oC destrua bactrias vegetativas em 1 1/2 hora, porm os esporos mais resistentes (Anthrax) exigiam uma temperatura de 140 oC por 3 horas, a fim de assegurar sua destruio. Em conjunto com Loeffler, Koch investigou a ao germicida do calor mido (Koch e col. 1881). Este estudo mostrou que os esporos de Anthrax eram destrudos em gua fervente a 100oC em um intervalo de 1 a 12 minutos.
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

Desinfeco Area ou Gasosa O termo desinfeco area foi empregado para significar o uso do ar como um veculo para a difuso de um germicida gasoso em todas as superfcies expostas de um ambiente e seu contedo. A partir da descoberta do gs formaldedo por Von Hoffman, de 1867 at 1888, os nicos agentes gasosos utilizados na desinfeco eram o cido sulfrico, cloro, cido hidrocinico, oxignio, oznio e cido ntrico. Em 1888, Blum e Loew demonstraram as propriedades desinfetantes do formaldedo (Barnes, 1903). Mais tarde, Buchner descobriu que uma soluo a 10% do gs destruiria esporos de Anthrax. Este perodo pode ser definido como o incio da desinfeco por formaldedo. A Esterilizao Nos Dias Atuais O ano de 1933 tido como o incio da moderna esterilizao cientfica. Nesta poca a empresa American Sterilizer introduziu o primeiro esterilizador por presso de vapor no qual o controle do processo inteiro de esterilizao era centrado na medio da temperatura atravs de um termmetro de mercrio

24 localizado no dreno da cmara, situado no fundo da mesma. Os esterilizadores fabricados e instalados antes de 1933 eram operados tendo como parmetro de controle apenas a presso, sem opo de medio da temperatura desenvolvida pelo vapor. A introduo do controle por temperatura tirou a esterilizao de um perodo marcado por trabalhos cientficos de quase adivinhao, remetendo-os a um perodo de esterilizao mais confivel, que permanece praticamente inalterado at os dias de hoje, excetuando-se os modernos controles de automatismo. Praticamente todos os esterilizadores atuais apresentam o mrito de possurem termmetros capazes de, sob quaisquer condies, indicarem com boa exatido, a temperatura do vapor aplicado s cargas. Faz-se mister destacarmos que as trs primeiras dcadas do sculo XX
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

testemunharam avanos importantes na cincia e na metodologia da esterilizao. Muitos destes desenvolvimentos contriburam de forma importantssima para a segurana dos pacientes e do pessoal envolvido na rea de sade. Alm disso, a partir destes avanos implementados, finalmente surgiu um claro entendimento e distino dos princpios cientficos envolvidos na esterilizao. 2.2 Crescimento e Morte de Microorganismos Do ponto de vista biolgico o processo de crescimento representa um aumento ordenado de todos os componentes de um organismo. Isto significa que uma clula viva um sistema dinmico com um padro especfico de organizao, imposto por sua estrutura gentica, o qual perpetuado atravs da assimilao de nutrientes e a habilidade de se reproduzir. No estudo do fenmeno do crescimento, a taxa na qual o organismo dividido, ou melhor, o nmero de geraes ocorridas em um determinado perodo, apresenta um interesse maior do que simplesmente determinar o nmero atual de organismos vivos a cada hora. As espcies bacterianas so caracterizadas por uma taxa de crescimento excepcionalmente alta. Como a taxa de crescimento est

25 diretamente relacionada taxa de metabolismo, pode-se dizer que quanto maior for o organismo, mais lento o crescimento. Na prtica, comum expressar a taxa de crescimento em termos do nmero de geraes por hora. A gerao definida como a duplicao do nmero de clulas ou, em outras palavras, o tempo necessrio para a cultura duplicar em concentrao ou massa, tambm conhecido como Tempo Mdio de Gerao, comumente chamado de Tempo de duplicao. Uma vez que organismos unicelulares multiplicam-se em progresso geomtrica em um determinado perodo de tempo, a populao total aumenta como uma potncia de 2. Se partirmos do pressuposto de que nenhuma clula morrer durante o processo, essa relao pode ser expressa da seguinte forma: 20 21 22 23 24 . . . 2n
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

Os expoentes representam o nmero de geraes. Se os logaritmos dos nmeros de organismos em uma cultura em crescimento exponencial for plotado em relao unidade de tempo, uma relao em linha reta pode ser observada, conforme a figura 1 abaixo:

Figura. 1: Crescimento Exponencial tpico de microorganismos. O logaritmo do no de clulas plotado em relao ao tempo. [[Perkins, John J., Principles and Methods of sterilization in Health Sciences, p. 58]]

26 Quando a representao grfica do crescimento exponencial for plotada em uma escala semi-logartmica, a inclinao da linha registra a taxa de crescimento da cultura. Quanto maior a inclinao da reta, maior a taxa de crescimento da cultura. Da mesma forma, quanto menor for a inclinao da reta ou quanto mais prxima do eixo horizontal, menor a taxa de crescimento. Quando se conhecido o nmero de clulas presentes em uma cultura em crescimento exponencial em dois determinados perodos, o tempo de gerao pode ser calculado diretamente por meio da equao 1: G (no de geraes) = (log N1 log N0) / log 2 (1) onde: N0 nmero de clulas no tempo t0
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

N1 nmero de clulas no tempo t1 Se, por exemplo, a cultura inicial contivesse 100 clulas e seguisse crescendo exponencialmente at que chegasse a 100.000.000, o nmero de geraes seria: (log (108) log (102)) / log 2 = (8-2) / 0,3 = 20 geraes. Se este aumento da populao ocorrer no perodo de 10 horas, a taxa de crescimento seria de 20/10, ou 2 geraes por hora. A Curva de Crescimento Estudos realizados com diferentes espcies de microorganismos

mostraram que o poder reprodutivo completo das clulas no pode ser mantido por um perodo longo de tempo. A populao microbiana torna-se limitada pela escassez de nutrientes essenciais, ou quando se desenvolve um equilbrio inico desfavorvel (pH) ou pela acumulao de substncias txicas no ambiente.

27 A histria de qualquer cultura marcada por uma srie de fases de crescimento relativamente distintas e consecutivas que, quando plotadas, mostram uma curva de crescimento tpica (figura 2). Esta curva pode ser dividida em vrias sees ou fases como mostradas abaixo e representadas pelas letras de A a H no grfico.

PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

Figura 2: Ciclo de crescimento e morte de uma cultura de bactrias. Os logaritmos dos nos viveis de clulas so plotados em relao ao tempo [[Perkins, John J., Principles and Methods of sterilization in Health Sciences, p. 59].

Fase Estacionria Inicial Em seguida inoculao de clulas microbianas viveis em um meio lquido, ocorre um perodo estacionrio, com durao entre 2 e 3 horas, durante as quais o nmero de clulas no mostra nenhum aumento em relao ao nmero de clulas inicialmente inoculadas. Esta fase conhecida como Fase Estacionria e representa um perodo de ajuste e adaptao das clulas ao seu novo ambiente. A fase estacionria estende-se por uma poro da curva de crescimento designada A B. Fase Exponencial O perodo logartmico ou exponencial de crescimento caracterizado por uma taxa mxima e contnua de multiplicao celular em um ambiente especfico.

28 Nesta fase, certos fatores governam a taxa de crescimento, tais como a espcie microbiana, a natureza e a concentrao de nutrientes no meio, o pH e a temperatura de incubao. Em culturas lquidas normais, a fase de crescimento exponencial no dura mais do que 2 a 4 horas, podendo ser prolongada atravs do processo de aerao. Geralmente, quando a concentrao de clulas se torna superior a 1 x 107 0u 10.000.000 por ml, a taxa de crescimento decair, salvo a adio de oxignio por meio do processo de agitao ou borbulhamento de uma corrente de ar atravs do meio. Durante esta fase, o nmero de organismos aumenta exponencialmente com o tempo, e quando os logaritmos dos nmeros de clulas so plotados com relao ao tempo, uma relao em linha reta resulta. Esta caracterstica mostrada na seo C D da curva de crescimento representada na figura 2. Ao longo do crescimento exponencial todas as clulas produzidas so viveis.
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

Fase Estacionria Mxima A fase de incremento logartmico seguida por uma fase chamada estacionria, durante a qual o nmero mximo de organismos viveis permanece constante. Esta fase corresponde seo E F da curva de crescimento. Durante este perodo a taxa de mortalidade e a taxa de formao de novas clulas se equilibram. A exausto do suprimento de alimentao, possvel super populao e o acmulo de substncias txicas oriundas do metabolismo so fatores que contribuem para a reduo do crescimento e o aparecimento da fase estacionria mxima. Em relao ao tempo, uma cultura pode permanecer nestas condies por horas, talvez dias, antes da morte das clulas ser verificada. No caso do organismo ser capaz de produzir esporos resistentes, a fase estacionria pode ser prolongada indefinidamente. Fase de Morte Com o aumento progressivo na taxa de mortalidade, a cultura entra na fase de morte ou na fase de declnio, mostrada na seo F H na curva de crescimento. To logo uma taxa de mortalidade constante seja estabelecida, a cultura comea a

29 morrer exponencialmente, at finalmente ocorrer a esterilidade, estando o ciclo de crescimento completo. Precisamos perceber, no entanto, que desvios da ordem exponencial de morte no so incomuns. Por exemplo, depois da maioria das clulas ter morrido, a taxa de mortalidade pode mostrar um decrscimo marcado pelo fato de um pequeno nmero de clulas continue a sobreviver por alguns meses. O crescimento continuado desta pequena populao de sobreviventes pode ser atribudo disponibilidade de nutrientes oriundos de clulas que morrem e se decompem lentamente. O Significado da Morte Morte microbiana um fenmeno estatstico. Como aplicada a uma clula individual, a morte representa uma reduo irreversvel do processo vital, essencial para o crescimento e a reproduo. A morte de microorganismos pode
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

ser medida apenas pela determinao do nmero de clulas viveis na populao. Por esta razo, o nmero vivel ou o nmero de sobreviventes remanescentes depois do contato com uma influncia destrutiva o nico meio vivel para a determinao da morte.

Critrio de Morte O diagnstico da morte em uma populao de organismos unicelulares no um processo simples. O nico critrio prtico a falha do organismo em se reproduzir quando plantado em um meio adequado ou quando sujeito a um ambiente timo. A escolha do meio de cultura e as condies de incubao so fatores crticos no teste de viabilidade ou de morte. Um organismo ferido pode crescer em um tipo de meio de cultura, mas no em outro, ou mesmo exibir uma prolongada fase estacionria. Aps a exposio a raios-x, luzes ultravioletas ou a certos produtos qumicos txicos, os organismos podem perder sua habilidade de reproduo, e ainda continuar a sua funo de forma normal por um longo perodo. Estas condies demandam que o meio selecionado para sobrevivncia seja especificado cuidadosamente, incluindo propriedades que auxiliem no reparo

30 de danos celulares adquiridos na exposio a agentes letais, e o tempo de incubao necessrio para o crescimento ocorrer. Mesmo adotando o critrio de morte acima estabelecido, necessrio reconhecer que uma clula microbiana pode ser considerada morta apenas quando as condies de teste so mantidas invioladas e permitem a determinao factual da viabilidade ou no. Um ponto que merece destaque a adaptabilidade da clula microbiana, seu poder de reparo e recuperao e o impacto destas caractersticas biolgicas sobre a habilidade humana de desenvolver mtodos seguros de esterilizao, desinfeco e sanitizao. Destruio Trmica de Microorganismos Tomando-se por base o fato de que a temperatura ideal para o
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

desenvolvimento e crescimento de organismos vivos vai de 5oC a 80oC, podemos concluir que a exposio a temperaturas alm desta faixa resultar, provavelmente, na morte destes organismos, com exceo dos esporos resistentes ao calor. Acredita-se que o limite superior desta faixa de temperatura seja determinado pela instabilidade dos constituintes qumicos da matria viva, mais precisamente as protenas e os cidos nuclicos, sendo estas substncias rapidamente destrudas, ou desnaturadas, a temperaturas na faixa de 50oC a 90oC. O mecanismo responsvel pela morte dos microorganismos quando sujeitos ao calor ainda no claramente entendido. A teoria tradicional prega que a morte de bactrias a temperaturas elevadas esteja intimamente relacionada a alteraes em protenas, gerando alteraes protoplasmticas irreversveis no interior da clula da bactria. Alguns pesquisadores afirmam que a morte est associada inativao por calor de algumas enzimas ou sistemas enzima-protena na clula. Os outros mecanismos que atuam quando a bactria destruda a altas temperaturas tiveram avano graas aos trabalhos de Chick (1906). As medies quantitativas originais de Chick contriburam enormemente para a evoluo de uma ferramenta muito til conhecida como ordem logartmica da morte de bactrias.

31 Estudos mais recentes nos levam a crer que o modo de ao do calor sobre a bactria bastante semelhante coagulao de protenas pelo calor. Suportando este ponto de vista, Amaha e Sakagushi concluram que a causa da morte dos esporos bacterianos submetidos ao calor mido possa ser atribuda desnaturao de uma molcula protica essencial clula do esporo (Amaha e Sakagushi, 1957). Deste modo, bastante razovel concluirmos que o efeito da umidade sobre a temperatura de coagulao da protena precisa guardar alguma relao com a temperatura na qual a bactria destruda. Este ponto de vista foi investigado por Lewith, que detectou o fato das protenas serem coaguladas pelo calor a temperaturas mais baixas quando estas contm uma quantidade maior de gua (Lewith, 1890). Alm disso, quando o vapor encontra-se presente, as bactrias so destrudas sob temperaturas bem menos elevadas e em perodos bem mais curtos, diferentemente de quando h ausncia de vapor. Este fenmeno pode ser explicado se levarmos em conta que todas as reaes qumicas, incluindo aqui
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

a coagulao de protenas, so catalisadas pela presena de gua. Se a freqncia de citaes na literatura for um critrio, justo dizermos que hoje amplamente aceito o conceito de que a morte bacteriana por calor mido causada pela desnaturao e coagulao de uma rea protica crtica no interior da estrutura gentica da clula conforme a figura 3.

(a)

(b)

Figura 3: a) Bacillus Colon tpico, em lquido para cultura aps 1 hora, ampliado 28.000 X. Verifica-se a uniformidade aparente do protoplasma celular. b) Bacillus Colon aps aquecimento em cultura salina por 10 min a 50oC, ampliado 16.000 X. Verifica-se a granulao do protoplasma de forma irreversvel [Perkins, John J., Principles and Methods of sterilization in Health Sciences, p. 64].

32 Desnaturao As protenas das clulas bacterianas, muitas das quais enzimticas, existem em um estado coloidal perfeitamente disperso. Quando submetidas a agentes anti-microbianos tais como: calor mido, alcois ou fenis, a protena coagula, se precipita, tornando-se anti-funcional, como no caso do enrijecimento da clara de ovo. Esta transformao envolve uma importante reao caracterstica de protenas, conhecida como desnaturao e implica em mudanas nas propriedades fsicas ou qumicas da protena, como a solubilidade, incluindo ainda algumas alteraes na estrutura molecular da mesma. Se a exposio ao calor no for prolongada, a desnaturao pode ser revertida, retornando-se s condies nas quais a protena estava estvel. Desta forma, isto significa que preciso distinguir-se entre a desnaturao reversvel ou irreversvel de protenas. Alm do calor, outros agentes capazes de promover a desnaturao das protenas so: radiao, ultra-som, congelamento, presso e uma variedade de agentes qumicos (cidos, alcalides, alcois, uria e detergentes). As reaes envolvidas no processo de desnaturao so complexas e ainda pouco entendidas. A importncia da desnaturao de protenas para a esterilizao a ao letal do calor sobre os esporos bacterianos a qual foi registrada por Chick e Martin, que caracterizaram a desnaturao protica como uma reao mononuclear com gua [Chick, H., e Martin, C. J.: On the Heat Coagulation of proteins. J. Phisiol (london), 40:404-430, 1910]. Ordem de Mortalidade Quando uma populao de microorganismos exposta a determinada influncia esterilizante, a taxa ou velocidade na qual os organismos individuais morrem diretamente proporcional concentrao ou ao nmero por unidade de volume em um dado tempo. Geralmente, a ordem de mortalidade, como pode ser determinada experimentalmente, segue um curso uniforme e consistente e descrita comumente como sendo logartmica. Isto significa que quando uma populao microbiana est em contato com um meio esterilizante, o nmero de clulas vivas decresce gradualmente, de maneira tal que o logaritmo do nmero de

PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

33 clulas sobreviventes em um dado momento, quando plotado em relao ao tempo, decresce em uma linha reta como pode ser verificado na figura 4. Apesar de haver evidncias que suportem ordens de mortalidade no logartmicas, os dados coletados desde as medies iniciais de Chick, at a presente data, mostram que a morte de clulas vegetativas, bem como de esporos essencialmente logartmica [Chick, H.: The processo f desinfection by chemical agencies and hot water. J Hyg (camb), 10:237-286, 1910].

PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

Figura 4: Curva de sobreviventes. O nmero de sobreviventes plotado em relao ao tempo de exposio temperatura constante. O valor D = 0,666 min (Perkins 1983).

O conhecimento da ordem logartmica importantssimo, pois permite ao microbiologista computar a taxa de mortalidade constante, designada por K. Este termo expressa, atravs de um simples nmero, a Taxa de Mortalidade, que apresenta uma relao direta com a eficincia do processo de esterilizao. A constncia da taxa de mortalidade significa que o nmero de bactrias que so mortas a cada minuto ou unidade de tempo um percentual constante do nmero de bactrias vivas no incio de cada novo minuto. comum expressarmos K atravs da equao 2:

1 No K = log t Nt

34

Onde, t = tempo em minutos ou tempo de exposio, N0 = Nmero inicial de organismos no incio do intervalo de tempo e Nt = Nmero de organismos sobreviventes no final do intervalo de tempo. A determinao da taxa de mortalidade possibilita a comparao da resistncia ao calor de diferentes organismos mesma temperatura, ou a resistncia de um organismo em particular a diferentes temperaturas. Alm disso, possibilita descrever o efeito quantitativo de fatores, como o pH, sobre a esterilizao. importante perceber que a caracterstica logartmica da ordem de mortalidade implica na morte do mesmo percentual de bactrias vivas a cada minuto. Teoricamente isto significa que a esterilizao completa nunca obtida. A tabela 1 ilustra o caso terico baseado na premissa de que quando uma suspenso de 1 milho de bactrias por mililitro submetida a uma influncia esterilizante,
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

90% dos organismos so mortos a cada minuto de exposio. Minuto Logaritmo de Bactrias Bactrias Bactrias vivas no mortas em 1 sobreviventes sobreviventes ao final de 1 incio do minuto minuto primeiro minuto 1.000.000 100.000 10.000 1.000 100 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,0001 90% = 900.000 = 90.000 = 900 = 90 =9 = 0,9 = 0,09 = 0,009 = 0,0009 = 0,00009 = 0,000009 = 0,0000009 1000.000 10.000 1.000 100 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 0,000001 5 4 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6

Primeiro Segundo Terceiro Quarto Quinto Sexto Stimo Oitavo Nono Dcimo Dcimo primeiro Dcimo segundo

Tabela 2: Exemplo terico da ordem de mortalidade de uma populao bacteriana

Na coluna de sobreviventes, nos casos de 0,1 ou 0,01 bactria/ ml, nos d a informao de que apenas 1 bactria permanece viva em 10 ml ou em 100 ml da

35 suspenso. Ao final de 12 minutos de exposio, teoricamente, apenas 1 bactria ainda permaneceria viva em 1.000.000 de ml, equivalente a 1000 l da suspenso. Como uma medida prtica, o exemplo acima mostra a necessidade de um perodo proporcionalmente maior de tempo de exposio para a esterilizao de um lquido contendo uma alta concentrao de bactrias, do que um lquido contendo alguns poucos organismos. Esta condio verdadeira para a esterilizao por calor, desinfeco qumica ou pasteurizao. A aplicao deste princpio muitas vezes ultrapassada no estabelecimento do perodo de exposio mnimo para a esterilizao de materiais e produtos. Por exemplo, da figura anterior, N0 = 1milho, ou 106 organismos, t = 2 minutos e Nt = 1.000 ou 103 organismos. Desta forma:
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

K=

1 6 6-3 10 - 103 = = 1,50 2 2

Vrias tentativas de explicao da caracterstica logartmica da ordem de mortalidade tm sido feitas. Uma das mais plausveis a proposta por Rahn, onde o processo de morte remonta uma reao unimolecular ou bimolecular de primeira ordem (Rahn, 1945). Com isso em mente, a caracterstica logartmica da ordem de mortalidade matematicamente possvel apenas quando a morte devida a destruio (desnaturao) de uma simples molcula da clula. A ordem logartmica inteiramente impossvel se mais do que uma molcula precisar ser inativada para gerar a morte da clula. A taxa de mortalidade tambm pode ser expressa atravs do valor D ou Tempo de Reduo Decimal. Este princpio, introduzido por Katzin baseado na aplicao da reao unimolecular constante morte microbiana sob condies uniformes (Katzin, 1943). Por definio, o valor D o tempo necessrio, a uma dada temperatura, para destruir 90% dos microorganismos. Da figura anterior, podemos perceber tambm que o valor D representa o tempo necessrio para que a curva de sobrevivncia atravesse um ciclo de log.

36

Quando a taxa de mortalidade exponencial, o valor D torna-se o recproco da taxa de mortalidade constante, K, e ambos D e K representam a inclinao da curva de sobreviventes. importante expressarmos a relao entre estes termos como:
2.303 (3) K

D=

Uma vez que o valor D pode ser determinado para qualquer temperatura, um subescrito normalmente utilizado para designar a temperatura empregada, como D250 ou D150. O Tempo de Reduo Decimal (D) muito importante para a indstria de
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

processamento de alimentos, especialmente na avaliao dos mtodos para a preservao de alimentos pelo processamento trmico e em estudos de pesquisa sobre a microbiologia de alimentos enlatados. Ponto de Destruio Trmica e Tempo de Destruio Trmica H alguns anos atrs, dentre os bacteriologistas, surgiu o conceito de que se uma suspenso com bactrias fosse gradualmente aquecida, seria alcanado um ponto na escala crescente de temperatura no qual todas as clulas na suspenso seriam mortas instantaneamente. Este conceito deu origem ao termo Ponto de Destruio Trmica, sendo este definido como a menor temperatura na qual uma soluo aquosa de bactrias morta em 10 min. Este foi o primeiro padro de comparao de tolerncia ao calor entre organismos de diferentes espcies. O uso deste termo tem sido bastante criticado, tendo em vista o fato de implicar em uma falta de entendimento, pois nos leva a acreditar na existncia de uma determinada temperatura que, uma vez alcanada, causaria a morte instantnea de todas as bactrias, sem levar-se em conta o perodo de exposio, o nmero de organismos, o ambiente a redor dos organismos e seu estado fisiolgico.

37 Em vista da evidncia de que a morte de microrganismos sob a influncia de o calor ser um processo ordenado, uma vez que a coagulao da protena celular um processo irreversvel, precisamos admitir que no existe uma temperatura na qual todas as clulas em suspenso seriam mortas instantaneamente. O processo ocorre como uma funo do tempo dentro de uma determinada faixa de temperatura. Se a temperatura aumentada, o tempo pode ser reduzido, ou se a temperatura for reduzida, o tempo precisa ser prolongado. Em outras palavras, a morte de microorganismos pelo calor uma funo dependente da relao tempo-temperatura empregada. Por estas razes, a expresso Ponto de mortalidade trmica tem dado caminho a uma medio de cunho mais prtica conhecida como Tempo de Morte Trmica. Estes tempos se referem determinao do menor perodo de tempo necessrio para matar toda uma
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

populao conhecida de microorganismos em uma suspenso a uma dada temperatura. A natureza do meio nos quais os organismos esto suspensos tem uma importante ligao com o Tempo de Destruio Trmica. Substncias txicas, se presentes, tornam-se crescentemente germicidas com leves aumentos de temperatura. Alm disso, os produtos do metabolismo mostram toxidade aumentada em altas temperaturas. Um pH cido ou alcalino diminui o Tempo de Mortalidade Trmica, bem como a presena de leos e gorduras retardam a penetrao de calor aumentando o tempo. Curva do Tempo de Destruio Trmica Em ltima anlise, a curva do Tempo de Morte Trmica mostra a resistncia relativa dos organismos a diferentes temperaturas letais. Esta curva pode ser construda atravs da plotagem dos Tempos de Destruio Trmica, determinados experimentalmente, sobre uma escala logartmica e as temperaturas correspondentes em uma escala linear. Tal curva mostrada na figura 5.

38

Figura 5: Curva de TMT com tempos de destruio e sobrevivncia plotados em relao temperatura do calor mido. Z = 20oF (11,2oC) [Perkins, John J., Principles and Methods of sterilization in Health Sciences, p.72]
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

importante percebermos que qualquer valor de Tempo de Morte Trmica no apresenta sentido, a menos que o nmero de organismos originais seja conhecido, tendo em vista o fato de diferentes populaes resultarem em diferentes curvas. A inclinao da curva na figura 5, simbolizada por Z, definida como o nmero de graus necessrios para a curva atravessar um ciclo de log. Este nmero equivalente ao nmero de graus de temperatura que precisam ser aumentados ou diminudos a uma dada temperatura de referncia para gerar um decrscimo ou aumento no tempo de destruio. Com uma inspeo mais detalhada na curva podemos perceber que o valor de Z a medida de como o Tempo de Morte Trmica varia com a temperatura, seguindo da que, se Z for um valor elevado, a temperatura influir menos sobre o TMT do que nos casos onde Z um nmero pequeno. A maioria dos esporos bacterianos resistentes exibe um valor de Z dentro da faixa de 10 a 15 oC. Na confeco da curva de Tempo de Morte Trmica certas condies precisam ser observadas. Estas condies, como estipuladas por Townsend e col (1938) so:

39

Um Ponto de Sobrevivncia considerado um dado positivo e a curva precisa estar acima (temperatura mais elevado ou tempo mais prolongado) de cada um dos pontos de sobrevivncia;

Pontos de Destruio so indicativos, mas no positivos devido ao fenmeno de saltos (sobrevivncia de organismos aps decorrido um tempo alm do prescrito para a obteno de esterilidade). Em geral, uma curva de Morte Trmica deve estar abaixo de tantos pontos de destruio quanto possveis e acima de todos os pontos de sobrevivncia;

A inclinao da curva de morte trmica deve ser paralela tendncia geral dos pontos de sobrevivncia e de destruio. Estudos do Tempo de Morte Trmica so de suma importncia para os

estudos no campo da bacteriologia aplicada, como por exemplo, na indstria de

PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

enlatados. Deve-se lembrar que os Tempos de Morte Trmica so valores falsamente considerados constantes e imprecisos. Todas as informaes a respeito dos Tempos de Morte Trmica apresentam um certo erro associado, cuja magnitude depende dos intervalos de tempo considerados. O nmero de sobreviventes nunca zero, podendo tornar-se muito pequeno, da ordem de 1 em 100 ou 1 em 1000 l. Resistncia de Microorganismos ao Calor A resistncia de microorganismos a agentes destrutivos externos, tais como: calor, produtos qumicos e radiaes ionizantes formam a base para todos os processos de esterilizao e desinfeco. O que precisa ficar claro que, hoje em dia, nosso conhecimento do porqu e de como certas espcies so mais resistentes do que outras muito limitado. Esta situao nos leva ao fato das clulas bacterianas serem compostas por um sistema altamente complexo, responsvel pela habilidade de sobreviver em um ambiente desfavorvel. De acordo com Wyss, quando o estresse levado ao sistema, trs possibilidades se revelam: 1) O sistema entra em colapso e o organismo morre ou deixa de ser vivel para a continuao de sua linhagem;2) O sistema desenvolve mecanismos de resistncia; 3)O sistema se altera, acomodando-se temporria ou

40 permanentemente presena da influncia indesejvel. [Wyss, O.: Bacterial resistance and dynamics of antibacterial activity. In G. F. Reddish (Ed): Antiseptics, Desinfectants, Fungicides and Sterilization, 2a ed. Philadelphia, Lea & F, 1957, p. 210] Esporos Bacterianos Esporo um estgio latente no ciclo de vida de certos grupos de organismos e constitui uma fase da vida bacteriana, na qual o processo da clula viva levado a um grau mnimo. Isto no significa que os esporos bacterianos possuem um sistema metablico inerte. J se demonstrou que esporos latentes intactos contm um grande nmero de enzimas ativas, as quais tornam possvel a transformao da clula passiva dormente em uma clula vegetativa crescente em um curto perodo de tempo em contato com um ambiente favorvel. Inicialmente
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

acreditava-se que a esporulao era estimulada por condies adversas como: temperaturas extremas, aridez ou o acmulo de produtos txicos do metabolismo. Atualmente, parece que vrias espcies de bactrias esporulam em ambientes favorveis.

41

PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

Figura 6: Curvas de resistncia trmica. A representa padres de pasteurizao do leite. B, curva do Tempo de Morte Trmica para M. tuberculosis, var. Bovis, com uma populao de clulas viveis de 104/ml de leite. Z= 8,6oF. [Perkins, John J., Principles and Methods of sterilization in Health Sciences, p.78, 1983]

Longevidade Os esporos bacterianos so reconhecidos como os mais resistentes organismos vivos, tendo em vista sua capacidade de suportar agentes externos destrutivos. Os esporos de Anthrax, por exemplos, ressecados em filetes de leite, so viveis mesmo decorridos 60 (sessenta) anos. O tempo mximo que os organismos podem sobreviver em um estado dormente de interesse dos bilogos em geral. Tal informao pode servir de guia para a preservao de culturas, para auxiliar na explicao do mecanismo de dormncia, alm de auxiliar a responder a questo da transmisso da vida atravs do espao

42 Explicao da Resistncia dos Esporos A partir do estudo da estrutura de formas bacterianas atravs do microscpio eletrnico, somos levados a crer que os esporos so concentraes densas de protoplasma bacteriano. Existem duas regies no interior dos esporos: um ncleo de protoplasma denso, e uma casca, ou crtex, de material menos denso. A regio interna compreende o bacillus dormente. Como esta pequena massa de protoplasma difere em suas propriedades qumicas e fsicas do protoplasma de clulas vegetativas no claramente entendido. No entanto, a resistncia trmica dos esporos, geralmente, atribuda ao reduzido contedo de gua ou ao relativamente pequeno contedo de sal. Certos pesquisadores mantm a opinio de que a maior parte da gua presente nos esporos limitada, mantendose intimamente associada aos colides da clula, e como tal, menos reativa e mais resistente aos agentes qumicos e fsicos.
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

Uma das mais destacveis caractersticas dos esporos bacterianos a sua resistncia inativao pelo calor. O mecanismo especfico e as propriedades bioqumicas para esta resistncia assunto de suma importncia e foco de pesquisas com implicaes prticas na rea mdico-cirrgica e na preservao de alimentos e outros materiais perecveis. A partir de estudos realizados desde 1932, fotomicrgrafos ultravioletas de bactrias em esporulao revelaram que os esporos em desenvolvimento absorvem luz ultravioleta de forma mais intensa do que as clulas vegetativas normais. H cerca de 20 anos atrs, Powel descobriu a substncia responsvel por essa absoro de luz como sendo o cido dipicolnico (DPA) [Powel, J. E.: Isolation of dipicolinic acid from spores of B. megaterium. Biochem J, 54:210-211, 1953]. Desde a identificao do DPA de esporos aerbicos, este composto tem sido encontrado em todos os esporos examinados em uma quantidade de 5 a 15 por cento do peso seco. Apesar do DPA ser ter uma importncia especial na termoresistncia, este no vem a ser um fator determinante da diferena de resistncia ao calor das espcies. O DPA sintetizado durante o processo de esporulao e completamente perdido, presumivelmente como quelato de clcio, durante o processo de germinao. Quando uma soluo de esporos bacterianos submetida inativao

43 trmica, ocorre uma progressiva perda de DPA, protenas e outros constituintes da clula. A relao exata entre a inativao dos esporos por calor e a perda deste material celular ainda carece de explicao. A resistncia dos esporos parece variar enormemente de espcie para espcie. Na busca de uma explicao para o mecanismo de resistncia, Curran destacou a natureza dos nutrientes no meio produtor de esporos [Curran, H. R.: Symposium on the biology of bacterial spores. V. Resistance in bacterial spores. Bact Ver, 16:111-117, 1952]. Um meio deficiente em certos ons metlicos como fosfato, clcio, magnsio e ferro produz esporos com baixa resistncia trmica. O clcio parece ser um fator de destaque na resistncia trmica dos esporos, visto o fato destes possurem cerca de 10 vezes mais clcio do que as formas vegetativas. Esporos produzidos em meios pobres em clcio, mas rico em outros nutrientes parecem ser mais sensveis ao calor.
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

Quanto maior a concentrao de esporos em um meio, maior sua resistncia e, proporcionalmente, mais calor e maior perodo de tempo ser necessrio para a esterilizao efetiva. Em grandes populaes de 107 ou 108 esporos, uma pequena frao destes pode apresentar uma extrema resistncia ao calor. Descendentes de esporos sobreviventes aps tratamento com calor extremo, no apresentam uma tolerncia aumentada. A reao do meio outro importante fator a afetar a resistncia ao calor. O pH de mxima tolerncia ao calor pode variar de 6.0 a 8.0. Alm disso, quando os esporos esto suspensos em materiais oleosos, sua resistncia marcadamente aumentada. Germinao Nos ltimos anos tem surgido um novo quadro sobre o processo de transformao de esporos dormentes em clulas vegetativas. Pelo menos 3 (trs) diferentes tipos de eventos seqenciais so reconhecidos na transformao. Estes eventos so conhecidos como ativao, germinao e frutificao. O primeiro passo na quebra da dormncia conhecida como ativao ou choque trmico um processo na qual condiciona o esporo a germinar em um ambiente apropriado. Uma forma comum de ativar um esporo submet-lo ao calor. Curran e Evans

44 foram os primeiros a demonstrar sistematicamente que o calor subletal de 62 a 95oC poderia induzir a germinao de esporos dormentes [Curran, H. R., e Evans, F. R.: Heat activation inducing germination in spores of thermotolerant and thermophilic spores. J Bact, 67:377-378, 1954]. A germinao pode ser considerada como a mudana de uma fase de resistncia ao calor para uma fase de sensibilidade ao calor, a qual pode no ser uma clula vegetativa. Caso a germinao no for ativada aps a ativao por calor, o esporo retorna ao seu estado dormente anterior. No processo de frutificao ocorre a sntese de novas macromolculas, resultando no surgimento de novas clulas vegetativas. Keynan e Halvorson mencionaram o fato da ativao ser um processo frequentemente reversvel, talvez, com a noo de que isso envolva uma desnaturao reversvel de protenas [Keynan, A., e Halvorson, H.: Transformation of a dormant spore into a
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

vegetative cell. Spores III. Symposium, Ann Arbor, Michigan, Amer Soc Microbiol, Oct. 1974, p.176]. Os pontos do esporo ativado desta maneira so no momento desconhecidos. Possivelmente, o desbloqueio de um sistema de enzimas ou a mudana da permeabilidade de alguma estrutura pode ser o responsvel pelos efeitos conhecidos da ativao. Powell, que tem estudado extensivamente a bioqumica dos esporos, resume a hiptese de trabalho da seguinte forma: O esporo adormecido uma estrutura altamente condensada, prova de gua, estabilizada pela incorporao de dipicolinato de clcio e, possivelmente, pela constituio de uma cobertura. Ns imaginamos que uma hidratao e despolimerizao desta estrutura ocorre durante a germinao [Powell, J. F.: Biochemical changes ocurring during spore germination in Bacillus species. J Appl Bact, 20:349-358, 1957]. Resistncias Relativas Da literatura fica evidente que as autoridades nem sempre concordam com o que diz respeito s exigncias para a morte trmica da vida microbiana. Vrias relaes tempo x temperatura tm sido recomendados para a esterilizao por vapor aquecido, alguns dos quais possuem um fator de segurana

45 proporcionalmente maior do que outros, assegurando a destruio dos esporos mais resistentes. A maior parte da literatura clssica de pouca valia no estabelecimento de curvas de tempo de morte trmica, tendo em vista a falta de informaes essenciais como a populao dos organismos utilizados, taxa de aumento da temperatura, pontos de sobrevivncia e mortalidade e outras. 2.3 Processos de Esterilizao A esterilizao, que vem a ser o processo validado usado para prover um produto livre de todas as formas de microorganismos viveis (NBR ISO 11134/2001), pode ser realizada por meio de processos fsicos, qumicos ou fsico-qumicos. Os processos de esterilizao mais utilizados so:
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

Fsicos o Esterilizao por vapor saturado sob presso; o Esterilizao por vapor seco; o Esterilizao por Cobalto 60.

Fsico-Qumicos o Esterilizao por vapor de baixa temperatura e formaldedo (VBTF); o Esterilizao por xido de Etileno (ETO); o Esterilizao por plasma de perxido de Hidrognio; o Esterilizao por pastilhas de para-formaldedo.

Qumicos o Esterilizao por cido peractico; o Esterilizao por glutaraldedo; Como o presente trabalho tem por foco a esterilizao por vapor saturado

sob presso, tal processo detalhado a seguir.

46 2.4 Esterilizao Por Vapor Saturado Sob Presso Segundo as diversas farmacopias, a esterilidade de um produto baseada no fato de que o mesmo tenha sido processado em condies ideais e que a amostra representativa submetida a teste, indique a ausncia de microorganismos viveis. Como o nvel de esterilidade absoluta no pode ser garantido graas a uma srie de variveis, deve-se trabalhar de forma a considerar que a esterilidade um conceito probabilstico. Com isso em mente, considera-se um produto estril quando, depois de submetido a um processo de esterilizao, a probabilidade de sobrevivncia de microorganismos viveis esteja na ordem de 10-6. Este nvel de esterilidade recebe a denominao de SAL (Sterile Assurance Level).
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

Como comentado anteriormente, o resultado de uma srie de pesquisas e estudos indica que o melhor mtodo de esterilizao vem a ser a esterilizao por calor mido, ou seja, na presena de gua. No Brasil, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, a ANVISA, atravs da RDC 210/2003, em seu item 17.11.1, cita o seguinte:
A esterilizao pode ser feita mediante a aplicao de calor seco ou mido, agentes gasosos, por filtrao esterilizante com subseqente enchimento assptico dos recipientes finais estreis, ou atravs da irradiao com radiaes ionizantes. Cada mtodo tem suas aplicaes e limitaes particulares. Quando for possvel e praticvel, a escolha do mtodo deve ser a esterilizao por calor.

A preferncia por este tipo de esterilizao pode ser justificada por apresentar uma srie de vantagens como eficcia, velocidade, disponibilidade de metodologias de validao amplamente difundidas, menor risco operacional, boa relao custo/benefcio e baixo impacto ambiental. Ainda na RDC 210/2003, observamos a recomendao pela esterilizao por vapor saturado sob presso 17.17.1 Sempre que possvel, os produtos devem ser esterilizados nos recipientes finais, preferencialmente por esterilizao por calor mido....

47 Vapor saturado vem a ser o vapor dgua, em uma temperatura correspondente ao ponto de ebulio do lquido original a uma determinada presso (NBR ISO 11134). Alm disso, o vapor saturado a camada de vapor mais prxima da superfcie lquida, estando no limiar entre os estados lquido e gasoso, podendo apresentar-se seca ou mida para esterilizao. O vapor representa um estado fsico da gua, tal qual o gelo, mas como gs, pode estar prximo ou distante de sua temperatura de condensao ou liquefao. Vapor saturado o vapor dgua na condio na qual gerado pela gua com a qual est em contato. O vapor saturado no pode obter uma reduo de temperatura sem uma reduo na sua presso, bem como no pode ter a temperatura aumentada exceto pelo acompanhamento de uma elevao na presso. Desta forma, dada a presso de vapor na qual formado, sua temperatura pode ser considerada fixa e vice-versa, sendo a presso e a temperatura itens
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

conversveis. Desta forma pode-se falar em vapor saturado a uma certa temperatura ou a uma certa presso. A relao entre presso e temperatura de vapor pode ser verificada na figura 7.

Figura 7: Relao entre temperatura e presso no vapor [ Perkins, John J., Principles and Methods of sterilization in Health Sciences, p.101, 1983]

48 Mecanismo da Gerao De Vapor A figura 8 a seguir mostra um tpico gerador de vapor eltrico. O aparato consiste de um vaso de presso feito de ao, parcialmente cheio com gua e munido de medidor de presso, termmetro, vlvula de segurana, vlvula de ajuste de sada de vapor, entrada de gua, porta para retorno de condensado e uma fonte de calor.

PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

Figura 8: Gerador de vapor eltrico (Perkins, 1983).

A aplicao de calor gua contida no vaso de presso, caso a sada de vapor esteja aberta para a atmosfera, aumentar a leitura de temperatura do termmetro at 100 oC. Esta temperatura permanecer constante enquanto o vapor escapa para a atmosfera atravs da vlvula de descarga. Se a taxa de entrada de calor for aumentada ou reduzida, a taxa de descarga de vapor ser alterada de forma correspondente, permanecendo, porm a temperatura constante em 100 oC, se a presso no vaso permanecer constante e igual presso atmosfrica de 14,7 psi (96,53 kPa). Durante o processo de aquecimento, bolhas de vapor so formadas na superfcie do elemento aquecido. Essas bolhas emergem atravs da gua, atravessam a superfcie do lquido e aliviam o vapor no espao acima da superfcie do lquido. O vapor no espao livre acima do lquido conhecido como vapor saturado. Caso a fonte de calor seja interrompida temporariamente fazendo com que todas as bolhas de vapor retornem superfcie da gua, a gua livre de

49 bolhas designada gua saturada e esta gua saturada est a mesma temperatura do vapor saturado. Esta temperatura, por sua vez, tambm conhecida como temperatura de saturao. Quando o calor aplicado ao gerador e a vlvula de sada parcialmente fechada, restringindo o escape do vapor saturado para a atmosfera, a presso no vaso aumentar e a temperatura do vapor mostrar um aumento correspondente. Quando esta condio ocorre observa-se que a uma presso especfica, haver apenas uma temperatura de vapor saturado. Quando o calor fornecido ao gerador for tal que a superfcie do lquido esteja apenas levemente perturbada pelas bolhas de vapor estourando, o vapor gerado ser livre de gotas de gua e conhecido como Vapor Saturado Seco. Podemos dizer que um contra senso dizermos que o vapor saturado seco no
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

contem gua, uma vez que o vapor um estado fsico da gua. De um ponto de vista prtico, vapor saturado sempre mido, uma vez que sempre h uma pequena quantidade de gua no vaporizada mantida em suspenso ou misturada com o vapor. O vapor saturado seco, na verdade, vem a ser uma linha terica de demarcao entre as fases de vapor saturado e superaquecido. Referindo-se ao gerador da figura 8, se o calor fornecido for intenso, ou alto, a superfcie do lquido ser violentamente perturbada pelas bolhas de vapor que estouram rapidamente, fazendo com que gotas de gua fiquem misturadas no vapor e descarregadas atravs da vlvula de sada. O vapor produzido desta maneira chamado de Vapor mido. Este vapor estar temperatura de saturao correspondente presso de vapor, uma vez que o vapor saturado e a gua saturada estaro mesma temperatura. 2.5 Esterilizadores ou Autoclaves Os tipos de esterilizadores por vapor saturado, ou autoclaves, disponveis atualmente so basicamente de dois tipos: Gravitacional A injeo do vapor na cmara fora a sada do ar frio por uma vlvula localizada na sua parte inferior. Neste processo pode ocorrer a

50 formao de bolhas de ar no interior do pacote, o que impede a esterilizao. Para que a penetrao do vapor ocorra em todos os materiais, o tempo deve ser mais longo, tornando o ciclo mais demorado. Pr-vcuo Por meio da bomba de vcuo contida no equipamento, o ar removido do material e da cmara, podendo ter vrios ciclos pulsteis, favorecendo assim a penetrao mais rpida do vapor dentro dos pacotes. Aps a esterilizao, a bomba de vcuo faz a suco do vapor e da umidade interna da carga, tornando a secagem mais rpida e completando o ciclo. Os parmetros do processo de esterilizao de maior interesse so: o vapor, a temperatura, a presso e o tempo de exposio. O ciclo de esterilizao varia de acordo com o tipo de equipamento.
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

Assim, o ciclo das autoclaves gravitacionais compreende: entrada de vapor, sada do ar da cmara, exposio dos artigos, exausto do vapor, secagem da carga, retorno presso atmosfrica e entrada de ar filtrado. Os ciclos das autoclaves pr-vcuo compreende: trs pulsos de suco de ar e entrada do vapor na cmara, entrada de vapor saturado, exposio dos artigos, exausto do vapor por suco, secagem da carga, retorno presso atmosfrica e entrada de ar filtrado. As autoclaves, de forma geral, vm de fbrica com ciclos fixos e outros com a opo de serem programados pelo usurio. As possibilidades de parametrizao variam conforme as caractersticas de cada um dos ciclos, mas no geral contemplam: definio da temperatura de esterilizao entre 105 e 134oC (normalmente entre 121 e 134oC); tempo de exposio entre 1 e 999 minutos; nmero de pulsos e nvel de vcuo e presso na fase de acondicionamento da carga; nvel de vcuo e tempo para a fase de secagem, ou temperatura final a ser alcanada no caso de programao lenta. Em um ciclo tpico de esterilizao pode-se distinguir 3 fases principais no processo: acondicionamento da carga; exposio e fase de secagem e resfriamento.

51 Pr-vcuo / Acondicionamento O contato direto do vapor saturado e o produto a ser esterilizado, com temperatura mais baixa que a do vapor, provoca a condensao e a transferncia do calor latente do vapor para estes materiais. a grande quantidade de energia liberada neste processo de condensao do vapor que vaio ser aproveitada para agilizar a destruio ou inativao dos microorganismos. A existncia de ar na cmara e nos pacotes vai interferir neste processo criando bolhas que dificultam o contato direto do vapor com os materiais. Alm disso a mistura ar e vapor no homognea e sempre possui uma temperatura menor que a do vapor saturado para a mesma presso. A principal funo desta primeira fase do ciclo de esterilizao a
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

eliminao, a eliminao, a mais completa possvel, do ar presente na cmara. Isto conseguido atravs de pulsos subseqentes de vcuo e injeo de vapor. Neste processo, alm da eliminao do ar se consegue uma pr umidificao e o aquecimento dos pacotes, o que vai facilitar o alcance dos parmetros definidos para a fase de esterilizao. Exposio / Esterilizao durante esta fase que ocorre a destruio ou inativao dos microorganismos. Para que isto ocorra os materiais devem ser mantidos em contato com o vapor pelo tempo e na temperatura definidos para o processo. A autoclave deve ser projetado para permitir um rgido controle desta fase, devendo iniciar a contagem do tempo de esterilizao quando for atingida a temperatura programada e a presso de vapor correspondente. Para o controle destes parmetros devem ser utilizados um sensor de temperatura e um transdutor de presso. Para a manuteno da temperatura de esterilizao, o comando da autoclave deve checar continuamente as medies de temperatura e presso, controlando assim a abertura e o fechamento da vlvula de admisso de vapor.

52 Secagem e aerao Na fase de secagem e resfriamento a temperatura e a umidade dos materiais expostos no processo devem ser reduzidas a valores que permitam a sua retirada da cmara e posterior manipulao, sem riscos de recontaminao ou de danos ao operador. Isto conseguido atravs da manuteno por um perodo de tempo programado a um determinado nvel de vcuo. No final da fase de secagem e resfriamento aberta a vlvula de admisso de ar na cmara. O Ar admitido atravs de um filtro com capacidade de reteno de partculas maiores que 0,22 micras. A figura 9 a seguir apresenta as fases tpicas de um ciclo de esterilizao com retirada forada de ar.
PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

Figura 9: Ciclo de esterilizao tpico com retirada forada de ar. Perfil da temperatura em relao ao tempo [B. M. Boca, E. Pretorius, R. Chapoullie, e Z. Apostolides. NA overview of the validation approach for moist heat Sterilization, part I. Pharmaceutical Technology, 2002].

A indicao da presso e da temperatura feita atravs de mostradores digitais, tanto no lado da carga como no da descarga, caso seja uma autoclave do tipo de barreira. O sistema de controle de presso e vcuo nas cmeras interna e externa realizado atravs de transdutores de presso eletrnico. Em alguns casos,

53 alm desses transdutores, o equipamento apresenta manmetros para a indicao da presso na linha de suprimento de vapor e na cmara externa e manovacumetro para indicao da presso de vcuo na cmara interna. O sistema de controle de temperatura na cmara interna eletrnico e realizado, normalmente, atravs de termistores do tipo Pt-100. O sensor de controle de temperatura fica junto ao dreno de descarga de vapor da cmara interna. Como todo processo que envolve presso e temperatura elevada, as autoclaves, em via de regra, precisam ser dotadas de sistemas de segurana, com as seguintes caractersticas: O incio do ciclo ou a entrada de vapor na Cmara interna s so liberados com as portas fechadas; O comando no permite a alterao de comandos com o ciclo iniciado, sendo igualmente impossvel a programao de parmetros incompatveis com a estrutura da autoclave; Abertura simultnea de ambas as portas, no caso de modelos que possuam o sistema de barreira; Vlvula de segurana previamente calibrada em 3 bar (300 kPa) e selada.

PUC-Rio - Certificao Digital N 0511083/CA

Atualmente existem diversos fabricantes de esterilizadores por vapor saturado e, no Brasil, adota-se a norma NBR ISO 11816: Esterilizao Esterilizadores a vapor com vcuo para produtos de sade.